專利名稱：靈芝咀嚼片的制備方法及產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靈芝咀嚼片的制備方法及其產(chǎn)品，屬于藥品的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
靈芝，是祖國中醫(yī)藥寶庫中的珍品，素有“仙草”之譽(yù)。古今藥理與臨床研究均證明，靈芝確有防病治病、延年益壽之功效。東漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》、明代著名醫(yī)藥學(xué)家李時(shí)珍的《本草綱目》，都對(duì)靈芝的功效有詳細(xì)的極為肯定的記載?？茖W(xué)研究表明，靈芝的藥理成分非常豐富，其中有效成分可分為十大類，包括靈芝多糖、靈芝多肽、三萜類、16種氨基酸(其中含有七種人體必需氨基酸)、蛋白質(zhì)、甾類、甘露醇、香豆精苷、生物堿、有機(jī)酸(主含延胡索酸)，以及微量元素Ge、Fe、Ca、Mn、Zn、等?，F(xiàn)代藥理學(xué)與臨床實(shí)踐進(jìn)一步證實(shí)了靈芝的藥理作用，并證實(shí)靈芝多糖是靈芝扶正固本、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、延年益壽的主要成分。靈芝對(duì)人體具有雙向調(diào)節(jié)作用，所治病種，涉及心腦血管、消化、神經(jīng)、內(nèi)分泌、呼吸、運(yùn)動(dòng)等各個(gè)系統(tǒng)，尤其對(duì)腫瘤、肝臟病變、失眠以及衰老的防治作用十分顯著。最新研究表明靈芝還具有抗疲勞，美容養(yǎng)顏，延緩衰老，防治愛滋病等功效。
在現(xiàn)有的靈芝制劑中，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)收載了靈芝膠囊、靈芝片、靈芝顆粒、靈芝口服液、靈芝糖漿等，但是，這些制劑味苦是它們的共同特點(diǎn)，使患者難于接受；由于靈芝含有特殊的三帖類物質(zhì)靈芝酸、赤芝酸、赤芝酮、赤靈酸，導(dǎo)致靈芝具有苦味，目前所有的口服制劑沒有對(duì)該成分進(jìn)行處理，而是將靈芝提取物直接加入相關(guān)的輔料制成相應(yīng)的制劑，這樣制成靈芝制劑都含有靈芝的特別的苦味，制備成含片或咀嚼片就更加難于讓患者接受。已有制備咀嚼片的方法中，多是單獨(dú)使用蔗糖、乳糖、甘露醇、木糖醇等輔料，靈芝提取物中含有相當(dāng)濃度的靈芝多糖，其粘度較大，這些輔料單獨(dú)與浸膏制?；蚺c糖粉等混合制粒后，不容易壓片，常常發(fā)生粘沖，其壓片成型效果均不理想，壓制后的片子容易吸濕，使成型的咀嚼片軟化，片劑質(zhì)量不穩(wěn)定，為提高靈芝咀嚼片質(zhì)量穩(wěn)定性、成型性，特別是的靈芝咀嚼片的溶化度和釋放度，發(fā)明人進(jìn)行了本發(fā)明的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種靈芝咀嚼片的制備方法及其得到的產(chǎn)品，本發(fā)明將靈芝提取物用乙醇使醇不溶物沉淀后，得到醇溶性的具有苦味的靈芝三萜類物質(zhì)即靈芝酸、赤芝酸、赤芝酮、赤靈酸等，這些物質(zhì)再用β-環(huán)糊精包合，得包合粉，加入醇不溶物沉淀和輔料，制成咀嚼片。解決料靈芝具有苦味、患者不愿口服的問題；直接制備成咀嚼片或含片，不但口感好、服用方便，而且能夠?qū)幮陌采瘢∑⒑臀?，?duì)失眠健忘，身體虛弱，神經(jīng)衰弱等癥具有較好的療效，提高了咀嚼片質(zhì)量穩(wěn)定性、成型性，藥物通過咀嚼或含化，其有效成分通過口腔粘膜或舌下粘膜迅速吸收，吸收快，生物利用度高，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。
本發(fā)明的靈芝咀嚼片是這樣制備的；取靈芝3000mg，加水煎煮1～3次，每次1～5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成稠膏，加乙醇使沉淀完全，沉淀再用乙醇清洗1-3次，沉淀70℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，備用；上清液以及清洗沉淀的清洗液，減壓回收乙醇，加入1-10倍量的β-環(huán)糊精在70℃-90℃下使溶解，于30-50℃包合，攪拌1-7小時(shí)，40℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得環(huán)糊精包合物；取上述靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，加入靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉100％-200％倍量的甘露醇、靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉100％-200％倍量的乳糖及靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉10％-30％倍量的矯味劑以及環(huán)糊精包合物，混合均勻，制成顆粒，最后加入制成顆粒后總量0.5-5％倍量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓制成片，即得。
具體的制備方法是取靈芝3000mg，加水煎煮2次，每次3小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成稠膏，加乙醇使沉淀完全，沉淀再用乙醇清洗2次，沉淀70℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，備用；上清液以及清洗沉淀的清洗液，減壓回收乙醇，加入5倍量的β-環(huán)糊精在80℃下使溶解，于40℃包合，攪拌4小時(shí)，40℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得環(huán)糊精包合物；取上述靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，加入靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉150％倍量的甘露醇、靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉150％倍量的乳糖及靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉20％倍量的矯味劑以及環(huán)糊精包合物，混合均勻，制成顆粒，最后加入制成顆粒后總量1.5％倍量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓制成片，即得。
本發(fā)明是按照上述方法制備而成的靈芝咀嚼片。
本發(fā)明改變了已有技術(shù)中將提取物直接加入輔料制成制劑的方法，在不改變提取成分和療效的基礎(chǔ)上，將靈芝的三萜類成分用乙醇沉淀技術(shù)從水溶性成分中分離出來，并將分離出的三萜類成分用環(huán)糊精包裹，使靈芝酸、赤芝酸、赤芝酮、赤靈酸與環(huán)糊精形成分子膠囊的包合物，掩蓋了靈芝中三萜類成分靈芝酸、赤芝酸、赤芝酮、赤靈酸的苦味，然后用水溶性成分的乙醇沉淀物、環(huán)糊精包合物加上甘露醇和乳糖的混合輔料，最后壓制片；解決了因用靈芝提取物直接壓片具有苦味的問題，也解決了單獨(dú)使用一種輔料容易發(fā)生粘沖，片劑成型效果均不理想問題，避免了壓制成片后的片子容易吸濕，使成型的咀嚼片軟化，片劑質(zhì)量不穩(wěn)定現(xiàn)象，提高了靈芝咀嚼片質(zhì)量穩(wěn)定性、成型性，本發(fā)明的制劑，通過咀嚼或含化，藥物口腔粘膜和舌下豐富的毛細(xì)血管直接吸收入血，迅速起效；同時(shí)避免了肝首過效應(yīng)，提高藥物的利用率。
因此，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有質(zhì)量穩(wěn)定、口感好、吸收快，生物利用度高且便于服用的優(yōu)點(diǎn)。
為證實(shí)本發(fā)明對(duì)環(huán)糊精包裹靈芝三萜類成分的包封效果，申請人采用L9(33)正交試驗(yàn)法，研究了β-環(huán)糊精包合揮發(fā)油的工藝。通過對(duì)包合物得率及包分率兩個(gè)指標(biāo)的考察，優(yōu)選出包合工藝為A2B3C2，即以5倍于揮發(fā)油的β-環(huán)糊精量包合，包合溫度為80℃，包合時(shí)間為4h，并按實(shí)驗(yàn)獲得的最佳工藝進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)如下β-環(huán)糊精包裹揮發(fā)油的包封L9(33)正交試驗(yàn)1材料與儀器1.1材料藥材，經(jīng)鑒定符合《中國藥典》2005版一部各藥項(xiàng)下規(guī)定；β-環(huán)糊精，蘇州味精廠生產(chǎn)，純度＞98％；試劑均為分析純。
1.2設(shè)備電子恒溫水浴鍋，北京靖衛(wèi)科學(xué)儀器廠；SXJQ-1型電動(dòng)攪拌器；Scout11電子天平，奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；101-2型干燥箱，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠。
2方法與結(jié)果2.1靈芝粉碎成粗粒，靈芝3000mg，加水煎煮2次，每次3小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成稠膏，加乙醇使沉淀完全，沉淀再用乙醇清洗兩次，沉淀備用；上清液以及清洗沉淀的清洗液，減壓回收乙醇，收集回收乙醇后剩余的物質(zhì)，得靈芝三萜類成分。
2.2包合物制備工藝的選擇采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法，選擇條件見表1。采用飽和水溶液法-電動(dòng)攪拌的方法制備包合物，經(jīng)試驗(yàn)得知，克分子比對(duì)包合率、收率影響較大，故給靈芝醇溶物β-環(huán)糊精克分子比添加一組水平，以便更全面地考察。采用部分追加法安排實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
表1 正交試驗(yàn)的因素及水平

以實(shí)際包合率和收率為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，所得數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算，得出靈芝醇溶物-β-環(huán)糊精包合物的最佳制備工藝條件如下稱取靈芝醇溶物、靈芝醇溶物6倍量的環(huán)糊精，置于加熱攪拌釜中，加人一定量的蒸餾水，水溶液加熱至80℃，攪拌使環(huán)糊精溶解后，放冷至40℃并保持，用電動(dòng)攪拌器以2000rpm攪拌4h，低溫干燥，稱重并計(jì)算收率，然后后粉碎過60目篩，保存于干燥器中備用。
用確定的方法制備3批包合物，其平均收率為85.75％，RSD＝0.48。
3包合物的質(zhì)量檢查3.1顯微觀察將β-環(huán)糊精按本制備方法，制備不含靈芝醇溶物的空白包合物，將該產(chǎn)品和含藥包合物各取少量，分別置于生物顯微鏡下觀察空白包合物為規(guī)則的板狀結(jié)晶，包合物為不規(guī)則塊狀粉末。
3.2味覺試驗(yàn)將β-環(huán)糊精、靈芝醇溶物及靈芝醇溶物-β-環(huán)糊精包合物分別不作標(biāo)記包裝，有10人(年齡20-24歲)參加品嘗試驗(yàn)，并記錄結(jié)果，結(jié)果包合物完全沒有苦味且略有甜味。
3.3包合物的穩(wěn)定性取靈芝醇溶物、靈芝醇溶物-β-環(huán)糊精包合物粉末分別置于40℃，75％RH恒溫恒濕箱內(nèi)放置3個(gè)月，每月取樣測定1次，結(jié)果放置3個(gè)月的靈芝醇溶物和靈芝醇溶物-β-環(huán)糊精包合物質(zhì)量下降分別為2.06％和1.26％，表明靈芝醇溶物-β-環(huán)糊精包合物在有效期內(nèi)穩(wěn)定4討論4.1制備工藝的優(yōu)化采用正交設(shè)計(jì)對(duì)包合物的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，以包合物的收率、實(shí)際包合率為指標(biāo)評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，靈芝醇溶物-β-環(huán)糊精包合物按1∶5克分子比的主客分子比例，于80℃電動(dòng)攪拌4h較好。
4.2包合物的遮掩效果研究表明，采用包合物技術(shù)完全可以掩蓋苦味，并且β-環(huán)糊精在包合后還可提高穩(wěn)定性。而在模擬的人工唾液中，包合物的釋放速度低于靈芝醇溶物，這可能因靈芝醇溶物是易溶于水的藥物，在10min內(nèi)就達(dá)到穩(wěn)定釋放水平，而包合物β-環(huán)糊精在水中溶解度小子靈芝醇溶物，包合物需先在水中溶解后方能釋放靈芝醇溶物，故有緩釋作用，這也恰好解決了靈芝醇溶物咀嚼片或含片起效快而持續(xù)時(shí)間短的不足。因此，可利用本發(fā)明，為包合物進(jìn)一步制成具有實(shí)用價(jià)值的靈芝咀嚼片或含片提供依據(jù)。
為了證實(shí)本發(fā)明采用甘露醇和乳糖的混合輔料制備靈芝咀嚼片的口感、成型性、穩(wěn)定性，申請人進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下1、樣品處理藥材處理 取靈芝3000mg，加水煎煮2次，每次3小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成稠膏，備用。
樣品1 取上述稠膏，70℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，加入細(xì)粉300％倍量的蔗糖，混合均勻，制粒，最后加入制成顆粒后總量1.5％倍量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓制成片，即得。
樣品2 取上述稠膏，70℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，加入細(xì)粉300％倍量的甘露醇及細(xì)粉20％倍量的矯味劑，混合均勻，制粒，最后加入制成顆粒后總量1.5％倍量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓制成片，即得。
樣品3 取上述稠膏，70℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，加入細(xì)粉300％倍量的乳糖及細(xì)粉20％倍量的矯味劑，混合均勻，制粒，最后加入制成顆粒后總量1.5％倍量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓制成片，即得。
樣品4 取上述稠膏，加乙醇使沉淀完全，沉淀再用乙醇清洗2次，沉淀70℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，備用；上清液以及清洗沉淀的清洗液，減壓回收乙醇，加入5倍量的β-環(huán)糊精在80℃下使溶解，于40℃包合，攪拌4小時(shí)，40℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得環(huán)糊精包合物；取上述靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，加入靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉150％倍量的甘露醇、靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉150％倍量的乳糖及靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉20％倍量的矯味劑，混合均勻，制粒，最后加入制成顆粒后總量1.5％倍量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓制成片，即得。
2、口感檢查將樣品1、2、3、4的靈芝咀嚼片采用雙盲法將藥品分別不作標(biāo)記包裝，優(yōu)選味覺正常10人(年齡20-24歲)參加品嘗試驗(yàn)，并記錄結(jié)果，結(jié)果見表2。
表2

從表2可以看出，樣品1服用后由于蔗糖的關(guān)系，感覺先甜而后苦，樣品2、3服用后感覺有苦口味，而樣品4從服用后一直到溶化沒有感覺苦味，而有甜味；樣品4就是按照本發(fā)明的方法制備的咀嚼片。
3、成型性按照中國藥典2005版一部附錄ID片劑項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行測試壓片、外觀、色澤，結(jié)果見表3。
表3

從表3可以看出，樣品1在壓片時(shí)，由于粘沖，時(shí)壓片成型后片子出現(xiàn)表面粗糙有一些暗斑存在；樣品2與樣品1比較，壓片時(shí)粘沖情況有好轉(zhuǎn)，但仍有粘沖且表面有麻點(diǎn)的情況；樣品3樣品2比較，壓片時(shí)只是偶有粘沖情況，表面光滑；樣品4壓片時(shí)無任何粘沖現(xiàn)象，片子表面光滑、光亮，色澤均勻，而樣品4即是按照本發(fā)明的方法制備的咀嚼片。
4、穩(wěn)定性供試品10g置恒溫密閉容器中，在25℃分別于相對(duì)濕度90±5％條件下放置10天，于第5天和第10天取樣，準(zhǔn)確稱量試驗(yàn)前后供試品重量，以考察供試品吸濕性能，結(jié)果見表4。

從表4中可以看出，樣品1、2在第5天檢測時(shí)其增重已超過5％，樣品3在第5天雖然沒有超過5％，但已經(jīng)接近5％，而在第10天也全部超過5％；只有樣品4在第10天其增重未超過5％。由此表明，樣品1、2、3具有較高的吸濕性，樣品4具有較強(qiáng)的抗?jié)衲芰?，能夠在較長時(shí)間內(nèi)保持顆粒的干燥性。
從三個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析，樣品4的口感、成型性以及抗?jié)衲芰鶅?yōu)于其它樣品，而樣品4是按照本發(fā)明方法制備的咀嚼片，說明本發(fā)明能夠有效的解決靈芝的苦味、咀嚼片的成型以及高吸濕的問題，制成的靈芝咀嚼片能夠確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。
為了證實(shí)本發(fā)明從靈芝提取物中分離出三萜成分后，經(jīng)β-環(huán)糊精包合再加入沉淀物制成靈芝咀嚼片在藥理上的有效性，申請人進(jìn)行了相關(guān)的藥理實(shí)驗(yàn)比較，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下本品靈芝咀嚼片藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究1材料與方法
1.1樣品靈芝咀嚼片，通常人體推薦攝入量相當(dāng)于靈芝3000mg/次。
1.2試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞昆明種小鼠、BALB/C小鼠，體重18-22g；豚鼠、YAC-1細(xì)胞。小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(給0.5％淀粉液)及靈芝膠囊58.5mg/kgbw/d，靈芝片58.5mg/kgbw/d和靈芝咀嚼片58.5mg/kgbw/d 3個(gè)劑型組。靈芝制劑用0.5％淀粉液(煮沸、冷卻后)配制成混懸液。所有試驗(yàn)動(dòng)物均食用顆粒飼料，自由攝食飲水。
1.3試驗(yàn)方法按衛(wèi)生部保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》中免疫調(diào)節(jié)作用檢驗(yàn)方法進(jìn)行。給受試物灌胃體積0.4ml/20gbw，1次/d，連續(xù)28d。
1.3.1醬汁制備ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(MTT法)RPMII640培養(yǎng)液用微孔濾膜過濾除菌，加入10％小牛血清、1％谷氨酰胺(200mmol/L)、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100μg/L)及2-巰基乙醇(5μmol/L)，用無菌HCl(1mol/L)或無菌NaOH(1mol/L)調(diào)pH至7.0-7.2，制成完全培養(yǎng)液；用pH 7.2-7.4的PBS緩沖液作溶劑，現(xiàn)用現(xiàn)配MTT溶液(5mg/ml)；以3.5％的無菌NaHCO3將無菌Hanks液調(diào)pH至7.2-7.4；用雙蒸水配制成100μg/ml的ConA液，過濾除菌后，-20℃保存；在96ml異丙醇中加入4mlHCl(1mol/L)制成酸性異丙醇溶液。各組動(dòng)物(雌性BALB/C小鼠，10只/組)連續(xù)灌胃至第28d，每鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾撕碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，200目過濾，用Hanks液多次洗滌、離心后懸浮于2ml完全培養(yǎng)液中，用臺(tái)酚蘭染色記數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，分兩孔放入培養(yǎng)孔中，每孔1ml，一孔加50μlConA液，另一孔作為對(duì)照，置5％CO2，37℃培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入5050μlMTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束，每孔加入1ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，移入1ml比色杯中，于751分光光度計(jì)，570nm處測定光密度。
1.3.2二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)(耳腫脹法)稱取DNFB 50mg，置潔凈干燥小瓶中，加預(yù)先配好的丙酮麻油溶液(丙酮∶麻油＝1∶1)5ml，密塞后膠布封口，混勻，制得SNFB溶液(臨用前配制，用250μl注射器通過瓶蓋取用)。各組動(dòng)物(雄性昆明小鼠，10只/組)連續(xù)灌胃至第23d時(shí)，每鼠腹部皮膚用硫化鋇脫毛，范圍約3cm2，用50μl DNFB溶液均勻涂抹于右耳兩面進(jìn)行攻擊，攻擊后24h，頸椎脫臼處死小鼠，每鼠用打孔器取下直徑8mm的左、右耳片稱重。
1.3.3抗體生成細(xì)胞檢測(Jeme改良玻片法)取健康綿羊血，經(jīng)脫纖維、生理鹽水洗滌后，用生理鹽水配成2％(v/v)綿羊紅細(xì)胞懸液；采用5只健康豚鼠血，分離血清，混合，每1ml壓積綿羊紅細(xì)胞(脫纖維、多次洗滌制得)加5ml豚鼠血清，置4℃冰箱30min，經(jīng)常振蕩，離心取上清液制成補(bǔ)體(用時(shí)以巴比妥緩沖液按1∶10稀釋)。各組動(dòng)物(雄性昆明小鼠，10只/組)連續(xù)灌胃至第23d時(shí)，每鼠腹腔注射2％(v/v)綿羊紅細(xì)胞懸液0.2ml。5d(期間不停止灌胃)后，每鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，制單細(xì)胞懸液，200目過濾，用Hanks液多次洗滌后于5mlRPMII640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml。將表層培養(yǎng)基(1g瓊脂糖加雙蒸水至100ml)加熱溶解后，45℃水浴保溫，與等量pH 7.2-7.4，2倍濃度的Hank液混合，分裝小試管，每管為0.5ml，再加10％綿羊紅細(xì)胞懸液(v/v，用巴比妥緩沖液配置)50μl，20μl脾細(xì)胞懸液，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，待瓊脂凝固后，玻片水平扣放在片架上，于二氧化碳培養(yǎng)箱溫育1.5h，然后將稀釋的補(bǔ)體加到玻片架的凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1.5h后，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。
1.3.4血清溶血素測定(血凝法)取健康綿羊血，經(jīng)脫纖維、生理鹽水洗滌后，用生理鹽水配成2％、0.5％(v/v)綿羊紅細(xì)胞懸液。各組動(dòng)物(雄性昆明小鼠，10只/組)連續(xù)灌胃至23d時(shí)，每鼠腹腔注射2％(v/v)綿羊紅細(xì)胞懸液0.2ml。5d(期間不停止灌胃)后，小鼠摘除眼球取血于離心管中，放置1h，2000r/min，分離并收集血清，血清于微量血凝試驗(yàn)板內(nèi)用生理鹽水倍比稀釋，每孔100μl，再加入100μl 0.5％(v/v)綿羊紅細(xì)胞懸液，混勻，微量血凝試驗(yàn)板裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于37℃溫箱中孵育3h，觀察血球凝集程度。
1.3.5小鼠碳廓清試驗(yàn)將印度墨汁用生理鹽水稀釋4倍制成注射用墨汁；稱取1.0g Na2CO3加蒸餾水至1000ml配置成Na2CO3溶液。各組動(dòng)物(雄性昆明小鼠，10只/組)連續(xù)灌胃至28d時(shí)，每鼠尾靜脈注入注射用墨汁((0.1ml/10g.bw)，注入后立即計(jì)時(shí)，于注入后2min、10min分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μl，加到2ml Na2CO3溶液中，用751分光光度儀計(jì)在600nm波長處測光密度值，以Na2CO3溶液作為空白對(duì)照。頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟、脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。
1.3.6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)(半體內(nèi)法)取健康公雞血，經(jīng)脫纖維生理鹽水洗滌后，用生理鹽水配成20％(v/v)雞紅細(xì)胞懸液。各組動(dòng)物(雄性昆明小鼠，10只/組)連續(xù)灌胃至28d時(shí)，每鼠腹腔注射20％(v/v)雞紅細(xì)胞懸液1ml，30min后，頸椎脫臼處死小鼠，仰位固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，腹腔注入生理鹽水2ml，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1min，吸出腹腔洗液1ml，分滴于2片載玻片上，放于墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，移至37℃溫箱孵育30min，取出，用生理鹽水漂洗去除未貼片的細(xì)胞，晾干，以1∶1丙酮甲醇液固定，4％(v/v)Giems磷酸緩沖液染色3min，再用蒸餾水漂洗晾干，光鏡下觀察。
1.3.7NK細(xì)胞活性測定[乳酸脫氫酶(LDH)測定法]試驗(yàn)前24h將靶細(xì)胞(YAC-1細(xì)胞)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前用Hanks液洗3次，用RPMII640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml。各組動(dòng)物(雄性BALB/C小鼠，10只/組)連續(xù)灌胃至第28d，每鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，制單細(xì)胞懸液，200目過濾，用Hanks液多次洗滌后于2mlRPMII 640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml。取靶細(xì)胞懸液、脾細(xì)胞懸液各100μl，加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中，靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞的培養(yǎng)液各100μl，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1％NP40各100μl，上述各項(xiàng)均設(shè)三個(gè)復(fù)孔，置5％CO2，37℃培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清液100μl，反應(yīng)3min，每孔加入1mol/L的HCl 30μl，在酶標(biāo)儀490nm處測光密度值。
1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SAS6.12統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析對(duì)各實(shí)驗(yàn)組間所得數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。
2結(jié)果與討論2.1體重、脾臟/體重比值、胸腺/體重比值靈芝制劑對(duì)小鼠體重和體重增重、脾臟/體重比值、胸腺/體重比值的影響結(jié)果見表1-8。其結(jié)果表明靈芝制劑各劑型小鼠體重和體重增重、脾臟/體重比值、胸腺/體重比值與正常對(duì)照進(jìn)行比較，差異無顯著性(P＞0.05)。
表1 脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)小鼠體重及增重 X±SD

表2 遲發(fā)性變態(tài)反映試驗(yàn)小鼠體重及增重 X±SD

表3 溶血空斑試驗(yàn)小鼠體重及增重 X±SD

表4 血清溶血素試驗(yàn)小鼠體重及增重

表5 碳廓清試驗(yàn)小鼠體重及增重

表6 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)小鼠體重及增重

表7 NK細(xì)胞活性試驗(yàn)小鼠體重及增重

表8 小鼠脾臟體重及胸腺體重比值的變化(mg/kg) X±SD

2.2ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(MTT法)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(MTT法)各組ConA孔光密度-不加ConA孔光密度差值結(jié)果見表9。
表9 靈芝制劑對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響 X±SD

*Dunnett’s T檢驗(yàn)，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性，P(0.05)對(duì)表9中ConA孔光密度-不加ConA孔光密度差值進(jìn)行方差分析，組間差異有顯著意義(F＝3.05，P＜0.05)。經(jīng)Dunnett’s T檢驗(yàn)，靈芝制劑各組ConA孔光密度-不加ConA孔光密度差值與正常對(duì)比組比較差異有顯著性(p＜0.05)。說明靈芝制劑相當(dāng)于人體推薦攝入靈芝量3000mg時(shí)，具有增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的作用。
2.3二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)(耳腫脹法)DNFB誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)各組小鼠右耳片-左耳片重量差值結(jié)果見表10。
對(duì)表10中耳片重量差值進(jìn)行方差分析，組間差異有非常顯著意義(F＝13.61，P＜0.01)。經(jīng)Dunnett’s T檢驗(yàn)，靈芝制劑各劑型小鼠右耳片-左耳片重量差值與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。說明靈芝制劑相當(dāng)于人體推薦攝入靈芝量3000mg時(shí)，具有促進(jìn)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞的作用。
表10 靈芝制劑對(duì)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響

*Dunnett’s T檢驗(yàn)，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性，P＜0.052.4抗體生成細(xì)胞檢測試臉(Jeme改良玻片法)本試驗(yàn)各組溶血空斑數(shù)結(jié)果見表11。
表11 靈芝制劑對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)量的影響

*Dunnett’s T檢驗(yàn)，與正帶對(duì)照組比較差異有顯著性，P＜0.05對(duì)表11中溶血空斑數(shù)差值方差分析，組間差異有非常顯著意義(F＝17.79，P＜0.01)。經(jīng)Dunnett’s T檢驗(yàn)，靈芝全粉234mg/kg劑量組溶血空斑數(shù)與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。說明靈芝制劑相當(dāng)于人體推薦攝入靈芝量3000mg時(shí)，具有增加小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)量的作用。
2.5血清溶血素的測定試驗(yàn)(血凝法)血清溶血素的測定 試驗(yàn)各組小鼠血清溶血素抗體積數(shù)結(jié)果見表12。
表12 靈芝制劑對(duì)小鼠血清溶血素抗體積數(shù)的影響

#抗體積數(shù)為對(duì)數(shù)均值，()內(nèi)為幾何均值；*Dunnett’s T檢驗(yàn)，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性，P＜0.05。
對(duì)表12中抗體積數(shù)進(jìn)行方差分析，組間差異有非常顯著意義(F＝26.58，P＜0.01)。經(jīng)Dunnett’s T檢驗(yàn)，靈芝制劑三個(gè)劑型組溶血空斑數(shù)與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。說明靈芝制劑相當(dāng)于人體推薦攝入靈芝量3000mg時(shí)，具有促進(jìn)小鼠抗體生成的作用。
2.6小鼠碳廓清試驗(yàn)小鼠碳廓清試驗(yàn)各組小鼠碳廓清能力結(jié)果見表13。
表13 靈芝制劑對(duì)小鼠碳廓清能力的影響

*Dunnett’s T檢驗(yàn)，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性，P＜0.05。
對(duì)表13中吞噬指數(shù)進(jìn)行方差分析，組間差異有非常顯著意義(F＝2.93，P＜0.05)。經(jīng)Dunnett’s T檢驗(yàn)，靈芝制劑各劑型組吞噬指數(shù)與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。說明靈芝制劑相當(dāng)于人體推薦攝入靈芝量3000mg時(shí)，具有增強(qiáng)小鼠碳廓清能力的作用。
2.7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)(半體內(nèi)法)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率及吞噬指數(shù)結(jié)果見表14。
表14 靈芝制劑對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

*Dunnett’s T檢驗(yàn)，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性，P＜0.05。
對(duì)表14中吞噬率、吞噬指數(shù)進(jìn)行方差分析，組間差異有非常顯著意義(F＝14.45，P＜0.01，F(xiàn)＝11.64，P＜0.01)。經(jīng)Dunnett’s T檢驗(yàn)，靈芝制劑各劑型組吞噬率、吞噬指數(shù)與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。說明靈芝制劑相當(dāng)于人體推薦攝入靈芝量3000mg時(shí)，具有增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的作用。
2.8NK細(xì)胞活性測定試驗(yàn)(乳酸脫氫酶(LDH)測定法)NK細(xì)胞活性測定試驗(yàn)各組小鼠NK細(xì)胞活性結(jié)果見表15。
表15 靈芝制劑對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

*Dunnett’s T檢驗(yàn)，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性，P＜0.05。
對(duì)表15中NK細(xì)胞活性進(jìn)行方差分析，組間差異有非常顯著意義(F＝15.00，P＜0.01)。經(jīng)Dunnett’s T檢驗(yàn)，靈芝制劑三個(gè)劑型組NK細(xì)胞活性與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。說明靈芝制劑相當(dāng)于人體推薦攝入靈芝量3000mg時(shí)，具有促進(jìn)小鼠NK細(xì)胞活性的作用。
3結(jié)論3.1經(jīng)灌胃予小鼠靈芝制劑相當(dāng)于人體推薦攝入靈芝量3000mg靈芝制劑，對(duì)小鼠體重和體重增重、脾臟體重比值和胸腺體重比值未見不良影響。
3.2ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果表明，所試靈芝制劑在相當(dāng)于人體推薦攝入靈芝量3000mg時(shí)，具有增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的作用。
3.3二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果表明，所試靈芝制劑在人體推薦攝入靈芝量3000mg時(shí)，具有增強(qiáng)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞的作用。
3.4抗體生成細(xì)胞檢測試驗(yàn)結(jié)果表明，所試靈芝制劑在人體推薦攝入靈芝量3000mg時(shí)，具有增強(qiáng)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)量的作用。
3.5血清溶血素測定試驗(yàn)結(jié)果表明，所試靈芝制劑在人體推薦攝入靈芝量3000mg時(shí)，具有促進(jìn)小鼠抗體生成的作用。
3.6小鼠碳廓清試驗(yàn)結(jié)果表明，所試靈芝制劑在人體推薦攝入靈芝量3000mg時(shí)，具有增強(qiáng)小鼠碳廓清能力的作用。
3.7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明，所試靈芝制劑在人體推薦攝入靈芝量3000mg時(shí)，具有增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的作用。
3.8NK細(xì)胞活性測定試驗(yàn)結(jié)果表明，所試靈芝制劑在人體推薦攝入靈芝量3000mg時(shí)，具有促進(jìn)小鼠NK細(xì)胞活性的作用。
綜上所述，靈芝咀嚼片和其它靈芝制劑一樣，具有免疫調(diào)節(jié)作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例11.取靈芝3000g，加水煎煮2次，每次1小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成稠膏，加乙醇使沉淀完全，沉淀再用乙醇清洗1次，沉淀70℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，備用；上清液以及清洗沉淀的清洗液，減壓回收乙醇，得靈芝醇溶物；2.加入靈芝醇溶物1倍量的β-環(huán)糊精在70℃下包合，攪拌1小時(shí)，40℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得環(huán)糊精包合物；3.取靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，加入靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉100％倍量的甘露醇、靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉100％倍量的乳糖及靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉10％倍量的矯味劑以及環(huán)糊精包合物，制成顆粒，最后加入制成顆粒后總量0.5％倍量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓制成片，即得。
本發(fā)明的實(shí)施例21.取靈芝3000g，加水煎煮2次，每次5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成稠膏，加乙醇使沉淀完全，沉淀再用乙醇清洗1次，沉淀70℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，備用；上清液以及清洗沉淀的清洗液，減壓回收乙醇，得靈芝醇溶物；2.加入靈芝醇溶物10倍量的β-環(huán)糊精在90℃下包合，攪拌7小時(shí)，40℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得環(huán)糊精包合物；3.取靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，加入靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉200％倍量的甘露醇、靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉200％倍量的乳糖及靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉30％倍量的矯味劑以及環(huán)糊精包合物，混合均勻，制成顆粒，最后加入制成顆粒后總量5％倍量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓制成片，即得。
本發(fā)明的實(shí)施例31.取靈芝3000g，加水煎煮2次，每次3小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成稠膏，加乙醇使沉淀完全，沉淀再用乙醇清洗1次，沉淀70℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，備用；上清液以及清洗沉淀的清洗液，減壓回收乙醇，得靈芝醇溶物；2.加入靈芝醇溶物5倍量的β-環(huán)糊精在80℃下包合，攪拌4小時(shí)，40℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得環(huán)糊精包合物；3.取靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，加入靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉150％甘露醇、靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉150％乳糖及靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉20％矯味劑以及環(huán)糊精包合物，混合均勻，制成顆粒，最后加入制成顆粒后總量2.5％倍量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓制成片，即得。
本發(fā)明的實(shí)施例41.取靈芝3000g，加水煎煮2次，每次3小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成稠膏，加乙醇使沉淀完全，沉淀再用乙醇清洗2次，沉淀70℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，備用；上清液以及清洗沉淀的清洗液，減壓回收乙醇，得靈芝醇溶物；2.加入靈芝醇溶物5倍量的β-環(huán)糊精在80℃下包合，攪拌4小時(shí)，40℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得環(huán)糊精包合物；3.取靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，加入靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉150％倍量的甘露醇、靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉150％倍量的乳糖及靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉20％倍量的矯味劑以及環(huán)糊精包合物，混合均勻，制成顆粒，最后加入制成顆粒后總量1.5％倍量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓制成片，即得。
本發(fā)明的實(shí)施例51.取靈芝3000g，加水煎煮2次，每次3小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成稠膏，加乙醇使沉淀完全，沉淀再用乙醇清洗3次，沉淀70℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，備用；上清液以及清洗沉淀的清洗液，減壓回收乙醇，得靈芝醇溶物；2.加入靈芝醇溶物5倍量的β-環(huán)糊精在80℃下包合，攪拌4小時(shí)，40℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得環(huán)糊精包合物；3.取靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，加入靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉150％倍量的甘露醇、靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉150％倍量的乳糖及靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉20％倍量的矯味劑以及環(huán)糊精包合物，混合均勻，制成顆粒，最后加入制成顆粒后總量1.5％倍量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓制成片，即得。
權(quán)利要求
1.靈芝咀嚼片的制備方法，其特征在于取靈芝加水煎煮1～3次，每次1～5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成稠膏，加乙醇使沉淀完全，沉淀再用乙醇清洗1-3次，沉淀70℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，備用；上清液以及清洗沉淀的清洗液，減壓回收乙醇，加入1-10倍量的β-環(huán)糊精在70℃-90℃下使溶解，于30-50℃包合，攪拌1-7小時(shí)，40℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得環(huán)糊精包合物；取上述靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，加入靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉100％-200％倍量的甘露醇、靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉100％-200％倍量的乳糖及靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉10％-30％倍量的矯味劑以及環(huán)糊精包合物、，混合均勻，制成顆粒，最后加入制成顆粒后總量0.5-5％倍量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓制成片，即得。
2.按照權(quán)利要求1所述的靈芝咀嚼片的制備方法，其特征在于取靈芝加水煎煮2次，每次3小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成稠膏，加乙醇使沉淀完全，沉淀再用乙醇清洗2次，沉淀70℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉，備用；上清液以及清洗沉淀的清洗液，減壓回收乙醇，加入5倍量的β-環(huán)糊精在80℃下使溶解，于40℃包合，攪拌4小時(shí)，40℃以下干燥，粉碎成細(xì)粉，得環(huán)糊精包合物；取上述靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉物質(zhì)，加入靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉150％倍量的甘露醇、靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉150％倍量的乳糖及靈芝水提取物乙醇沉淀細(xì)粉20％倍量的矯味劑以及環(huán)糊精包合物，混合均勻，制成顆粒，最后加入制成顆粒后總量1.5％倍量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓制成片，即得。
3.如權(quán)利要求1或2所述的靈芝咀嚼片的制備方法制備的靈芝咀嚼片。
全文摘要
本發(fā)明是一種靈芝咀嚼片及其制備方法，它由靈芝提取的活性成分與環(huán)糊精及適當(dāng)輔料制備成咀嚼片；本發(fā)明具有寧心安神，健脾和胃的功效，用于失眠健忘，身體虛弱，神經(jīng)衰弱等癥；本發(fā)明采用乙醇分離技術(shù)，將靈芝具有苦味的三帖類物質(zhì)分離出來，用環(huán)糊精包合技術(shù)，將靈芝的三帖類物質(zhì)等包合在環(huán)糊精分子內(nèi)，解決了靈芝制成咀嚼片味苦的問題，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的藥品有服用方便、不影響療效、口感好，溶出和吸收快，生物利用度高且不易吸潮變質(zhì)，質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P25/20GK1765374SQ20051020061
公開日2006年5月3日 申請日期2005年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者陳沙 申請人:陳沙