專利名稱：溪黃草有效成分Nodosin的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及溪黃草有效成分Nodosin的用途，尤其涉及在制藥領(lǐng)域的用途。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，器官移植手術(shù)正日益成為治療各種終末期病變的有效手段之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2000年全球肝臟移植近9萬(wàn)例，最長(zhǎng)存活31年。這令人矚目的成績(jī)除了外科技術(shù)的日臻成熟外，半個(gè)多世紀(jì)來(lái)不斷推出的新型免疫抑制劑及臨床應(yīng)用，對(duì)于解決移植物排斥反應(yīng)、延長(zhǎng)生存時(shí)間所起到的積極作用是不可磨滅的。由于抑制免疫耐受機(jī)制尚未能弄清，而器官克隆、干細(xì)胞移植到臨床實(shí)際應(yīng)用尚需經(jīng)歷漫長(zhǎng)的道路，因此，器官移植后長(zhǎng)期生存的獲得依然依賴免疫抑制藥物。但是，免疫抑制劑的長(zhǎng)期乃至終生應(yīng)用，引發(fā)了一系列的毒副作用，包括過(guò)敏反應(yīng)、過(guò)度免疫抑制繼發(fā)感染及肝腎毒性、神經(jīng)毒性等等，同時(shí)患者還需承擔(dān)高額的費(fèi)用，這些都給移植受者帶來(lái)了十分不利的影響。因此，如何尋找高效低毒的免疫調(diào)節(jié)藥物是擺在器官移植臨床應(yīng)用推廣面前的難題。
目前，有關(guān)中藥治療免疫性疾病取得良好療效的報(bào)道不斷出現(xiàn)。綜合研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥可以具備免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，表現(xiàn)出整體調(diào)節(jié)、多環(huán)節(jié)多途徑的作用；并且毒副作用小，成本低，易于堅(jiān)持長(zhǎng)期服用。溪黃草系唇形科香茶菜屬植物溪黃草Isodon Serra的全草，早年見于1962年編印的《揭陽(yáng)縣民間習(xí)用草藥簡(jiǎn)編》，現(xiàn)作為中藥材廣泛使用，具有清熱利濕，涼血散瘀之功，用于治療癃閉，跌打閼腫等?，F(xiàn)代研究表明，從溪黃草能抑制二甲苯致小鼠耳部炎癥反應(yīng)，曾用于治療急性肝炎。在中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?004100410233，公開了一種消炎利膽新劑型及其制備方法。該藥物不能應(yīng)用于器官移植綜合治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于(1)提供一種溪黃草有效成分Nodosin在制備治療器官移植術(shù)后免疫調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用。
(2)提供一種溪黃草有效成分Nodosin在制備治療器官移植術(shù)后抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞免疫是參與移植物排異反應(yīng)的主要免疫應(yīng)答方式，在異體抗原刺激下，T細(xì)胞致敏并增殖，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，最終造成移植物失功。眾多的免疫抑制劑作用都體現(xiàn)在抑制T細(xì)胞增殖和/或增強(qiáng)T細(xì)胞凋亡方面。相反，一些能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和/或抑制其凋亡的因素將導(dǎo)致移植物的急性排斥。本次研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nodosin可以明顯抑制ConA抗原刺激下的T細(xì)胞增殖，且呈現(xiàn)濃度效應(yīng)依賴性；進(jìn)一步用流失細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比ConA刺激的狀態(tài)，Nodosin能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期的G1期，中高濃度下，DNA合成期(S期)和分裂期(G2/M期)的細(xì)胞比例數(shù)幾乎為零，絕大多數(shù)的細(xì)胞集中于G1期，無(wú)法進(jìn)入分裂周期。提示Nodosin抑制T細(xì)胞增殖的機(jī)制在于誘導(dǎo)T細(xì)胞分裂周期的停滯；另外，值得注意的是我們選用了臨床常用的器官移植后免疫抑制劑FK506作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果提示Nodosin對(duì)于細(xì)胞免疫的抑制作用類似于FK506，且呈現(xiàn)濃度效應(yīng)依賴性，隨著濃度增加，中高濃度時(shí)作用等同于乃至強(qiáng)過(guò)后者。以上結(jié)果均說(shuō)明，Nodosin具備類同于或強(qiáng)于現(xiàn)有免疫抑制劑的抑制細(xì)胞免疫的作用。
移植物浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的發(fā)揮還依賴于其分泌的多種細(xì)胞因子。不同細(xì)胞因子的輔助作用所誘發(fā)的機(jī)體免疫應(yīng)答方向/類型是不同的，可分為誘導(dǎo)免疫激活(Th1方向)和誘導(dǎo)免疫耐受(Th2方向)兩種。其中，IL-2是最主要的Th1方向相關(guān)因子，它主要由致敏T細(xì)胞產(chǎn)生，與T細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合，反饋刺激T細(xì)胞增殖并分泌更多地IL-2，通過(guò)正性循環(huán)激活細(xì)胞免疫，導(dǎo)致排異反應(yīng)發(fā)生。IL-10則相反，通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞活化，抑制T細(xì)胞毒性，以致某些Th1方向反應(yīng)等機(jī)制，減輕免疫排異反應(yīng)，產(chǎn)生免疫耐受。有研究指出，Th2方向相關(guān)因子的過(guò)表達(dá)本身不能達(dá)到抑制后的免疫耐受，只有上調(diào)Th2與抑制Th1相結(jié)合才能達(dá)到在移植物位置的免疫耐受生存環(huán)境。而免疫耐受正是器官移植后首體免疫系統(tǒng)的理想狀態(tài)，既能不排異供體器官，又能對(duì)入侵機(jī)體的病毒、細(xì)菌乃至腫瘤細(xì)胞發(fā)揮防護(hù)作用。我們的結(jié)果提示，Nodosin既能夠降低IL-2的血清表達(dá)水平，同時(shí)不影響IL-10的表達(dá)，具備誘導(dǎo)機(jī)體免疫向Th2方向發(fā)展的可能性，進(jìn)一步研究將從機(jī)制方面證實(shí)這一發(fā)明。
另外，雖然肝癌是肝移植的適應(yīng)癥，但按照Milan標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)大部分肝癌患者都不能進(jìn)入這個(gè)適應(yīng)征。最主要是因?yàn)樾g(shù)后常規(guī)應(yīng)用免疫抑制劑將造成腫瘤的復(fù)發(fā)，綜合治療中增強(qiáng)機(jī)體免疫防治腫瘤復(fù)發(fā)又將引發(fā)移植肝的排異反應(yīng)，這些都將嚴(yán)重影響患者的長(zhǎng)期生存。有報(bào)道術(shù)后復(fù)發(fā)導(dǎo)致3年生存率僅為20-30％，但與此相對(duì)應(yīng)的卻是患者的需求很大，多家臨床肝移植中心的數(shù)據(jù)顯示臨床病例中仍有相當(dāng)比例是肝癌肝移植。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nodosin可以明顯抑制體外人腫瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞集落形成。初步提示Nodosin在調(diào)節(jié)免疫的同時(shí)可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，說(shuō)明在肝癌肝移植術(shù)后的綜合治療中存在潛在價(jià)值。
1、材料Nodosin的獲得來(lái)自溪黃草有效成分的萃取、分離和純化，通過(guò)篩選實(shí)驗(yàn)證實(shí)其作用，并獲得其分子結(jié)構(gòu)。Nodosin分子結(jié)構(gòu)為 人體實(shí)體腫瘤細(xì)胞選擇胰腺癌細(xì)胞株，購(gòu)自中科院上海分院細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)。Balb/c小鼠購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。IL-2、IL-10檢測(cè)ELISA試劑盒購(gòu)自Sigma公司。MTT和二甲亞砜(DMSO)購(gòu)自中科院實(shí)生公司。
2、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫作用觀察體外抑制原代培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的刀豆蛋白A(ConA)增殖模型實(shí)驗(yàn)小鼠脾淋巴細(xì)胞溶液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板。加入ConA100μl；對(duì)照組加培養(yǎng)基100μl；實(shí)驗(yàn)組加梯度濃度的Nodosin(3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/m和25μg/ml)。于5％的CO2，37℃培養(yǎng)48h。MTT法繪制淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，0.25％胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞；加含15％小牛血清的1640培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液(1×105)，接種96孔板培養(yǎng)過(guò)夜；各組取3瓶制成單細(xì)胞懸液，先后加MTT和DMSO后，振蕩10分鐘；酶標(biāo)儀(Bio-Rad Model550，Microplate Reader)490nm波長(zhǎng)下觀察光吸收值(OD值)。
體外抑制原代培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞ConA刺激增殖實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞周期觀察ConA增殖模型實(shí)驗(yàn)按照上述方法，實(shí)驗(yàn)組Nodosin濃度為5.5μg/ml(低)，11μg/ml(中)，22μg/ml(高)三組，設(shè)不加ConA刺激的空白組。收集細(xì)胞，PBS洗滌，70％乙醇固定后PI染液染色，4℃避光30min上機(jī)。運(yùn)用流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，B.D公司)分析細(xì)胞周期，并應(yīng)用B.D公司CELLQUEST軟件處理數(shù)據(jù)。
體內(nèi)抑制小鼠二甲苯誘發(fā)遲發(fā)型超敏免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、Nodosin低劑量組(6.52mg/kg)、Nodosin中劑量組(9.78mg/kg)、Nodosin高劑量組(13.04mg/kg)和FK506組(1mg/kg)。以棉花蘸取二甲苯，涂上在小鼠一側(cè)耳廓的正反兩側(cè)制備遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型，對(duì)側(cè)耳廓作對(duì)照。30分鐘后將小鼠脫頸處死，沿耳廓基線剪下兩耳，然后用打孔器于同一部位各取一個(gè)耳片稱重。腫脹度＝(致炎側(cè)耳片質(zhì)量-對(duì)照耳片質(zhì)量)/體重。
體內(nèi)影響免疫反應(yīng)模型動(dòng)物IL-2、IL-10分泌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模按上述操作。斷頭取血，ELISA法測(cè)定IL-2、IL-10血清水平嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。
3、Nodosin對(duì)人胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞集落形成的影響細(xì)胞培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞株常規(guī)用含體積分?jǐn)?shù)15％小牛血清及1％青、鏈霉素的1640培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)，維持在37℃，5％CO2的濕培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞貼壁后，用胰蛋白酶消化后分瓶，按上述方法培養(yǎng)。噻唑藍(lán)比色法(MTT法)繪制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線方法如上述。Nodosin梯度濃度為15μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和80μg/ml。
4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)。p＜0.05為差異有顯著性。
本發(fā)明所公開溪黃草有效成分Nodosin的新用途，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在(1)本發(fā)明對(duì)溪黃草有效成分Nodosin發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。
(2)本發(fā)明的溪黃草有效成分Nodosin安全無(wú)毒，藥理作用強(qiáng)，預(yù)示著很好的藥用前景。
(3)Nodosin具備類同于或強(qiáng)于現(xiàn)有免疫抑制劑的抑制細(xì)胞免疫的作用。
(4)Nodosin在調(diào)節(jié)免疫的同時(shí)可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，說(shuō)明在肝癌肝移植術(shù)后的綜合治療中存在潛在價(jià)值。


圖1顯示Nodosin影響ConA刺激增殖實(shí)驗(yàn)中T細(xì)胞周期變化(G1期細(xì)胞比例比較)。
圖2顯示Nodosin影響ConA刺激增殖實(shí)驗(yàn)中T細(xì)胞周期變化(S期細(xì)胞比例比較)。
圖3顯示Nodosin影響ConA刺激增殖實(shí)驗(yàn)中T細(xì)胞周期變化(G2/M期細(xì)胞比例比較)。
圖4顯示Nodosin、FK506抑制二甲苯作用下小鼠的耳廓腫脹度*p＜0.05vs空白組；**p＜0.01vs空白組。
圖5顯示Nodosin、FK506調(diào)節(jié)模型動(dòng)物的體液免疫*p＜0.05vs空白組。
圖6顯示Nodosin抑制癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)。
圖7顯示Nodosin抑制癌細(xì)胞的體外集落形成。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1Nodosin調(diào)節(jié)機(jī)體免疫作用觀察體外抑制原代培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的刀豆蛋白A(ConA)增殖模型實(shí)驗(yàn)小鼠脾淋巴細(xì)胞溶液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板。加入ConA100μl；對(duì)照組加培養(yǎng)基100μl；實(shí)驗(yàn)組加梯度濃度的Nodosin(3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/m和25μg/ml)。于5％的CO2，37℃培養(yǎng)48h。MTT法繪制淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，0.25％胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞；加含15％小牛血清的1640培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液(1×105)，接種96孔板培養(yǎng)過(guò)夜；各組取3瓶制成單細(xì)胞懸液，先后加MTT和DMSO后，振蕩10分鐘；酶標(biāo)儀(Bio-Rad Model550，Microplate Reader)490nm波長(zhǎng)下觀察光吸收值(OD值)。
體外抑制原代培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞ConA刺激增殖實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞周期觀察ConA增殖模型實(shí)驗(yàn)按照上述方法，實(shí)驗(yàn)組Nodosin濃度為5.5μg/ml(低)，11μg/ml(中)，22μg/ml(高)三組，設(shè)不加ConA刺激的空白組。收集細(xì)胞，PBS洗滌，70％乙醇固定后PI染液染色，4℃避光30min上機(jī)。運(yùn)用流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，B.D公司)分析細(xì)胞周期，并應(yīng)用B.D公司CELLQUEST軟件處理數(shù)據(jù)。
體內(nèi)抑制小鼠二甲苯誘發(fā)遲發(fā)型超敏免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、Nodosin低劑量組(6.52mg/kg)、Nodosin中劑量組(9.78mg/kg)、Nodosin高劑量組(13.04mg/kg)和FK506組(1mg/kg)。以棉花蘸取二甲苯，涂上在小鼠一側(cè)耳廓的正反兩側(cè)制備遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型，對(duì)側(cè)耳廓作對(duì)照。30分鐘后將小鼠脫頸處死，沿耳廓基線剪下兩耳，然后用打孔器于同一部位各取一個(gè)耳片稱重。腫脹度＝(致炎側(cè)耳片質(zhì)量-對(duì)照耳片質(zhì)量)/體重。
體內(nèi)影響免疫反應(yīng)模型動(dòng)物IL-2、IL-10分泌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模按上述操作。斷頭取血，ELISA法測(cè)定IL-2、IL-10血清水平嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。
Nodosin能夠明顯抑制ConA刺激下的T淋巴細(xì)胞增殖，作用呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)依賴性。(見表1)
表1、Nodosin體外抑制原代培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖(x±s)

**P＜0.01，vs ConA單純刺激組Nodosin抑制ConA刺激下T細(xì)胞的增殖，從細(xì)胞周期角度分析，Nodosin可以誘導(dǎo)T細(xì)胞G1期細(xì)胞比例上升，S期和G2/M期細(xì)胞比例下降，此效應(yīng)成濃度依賴性(見圖1、2、3)。
二甲苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型超敏免疫反應(yīng)表現(xiàn)為受藥側(cè)耳廓的明顯腫脹。臨床常用免疫抑制藥物FK506可以明顯抑制這一效應(yīng)，Nodosin也表現(xiàn)出同樣的效果，使小鼠耳廓腫脹度受到明顯抑制，且隨著低中高劑量的遞增，此效應(yīng)逐步增強(qiáng)(見圖4)。同時(shí)，動(dòng)物模型體內(nèi)IL-2血清水平同樣受到FK506和Nodosin的抑制，IL-10血清水平?jīng)]有受到明顯的影響(見圖5)。比較兩種藥物，Nodosian的抑制作用與濃度有很強(qiáng)的相關(guān)性，隨著濃度增加，中高濃度時(shí)作用等同于乃至強(qiáng)過(guò)FK506。
實(shí)施例2
Nodosin對(duì)人胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞集落形成的影響細(xì)胞培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞株常規(guī)用含體積分?jǐn)?shù)15％小牛血清及1％青、鏈霉素的1640培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)，維持在37℃，5％CO2的濕培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞貼壁后，用胰蛋白酶消化后分瓶，按上述方法培養(yǎng)。噻唑藍(lán)比色法(MTT法)繪制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線方法如上述。Nodosin梯度濃度為15μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和80μg/ml。
Nodosin能夠明顯抑制細(xì)胞株在體外的生長(zhǎng)，在不到一天的時(shí)間內(nèi)抑制體外癌細(xì)胞的集落形成。該作用呈現(xiàn)濃度效應(yīng)依賴性。(見圖6、7)
權(quán)利要求
1.溪黃草有效成分Nodosin在制備治療器官移植術(shù)后免疫調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，溪黃草有效成分Nodosin在制備治療肝、胰腺移植術(shù)后免疫調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，溪黃草有效成分Nodosin在制備治療胰腺移植術(shù)后免疫調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用。
4.溪黃草有效成分Nodosin在制備治療器官移植術(shù)后抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的應(yīng)用，溪黃草有效成分Nodosin在制備治療肝、胰腺移植術(shù)后抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用，溪黃草有效成分Nodosin在制備治療胰腺移植術(shù)后抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及溪黃草有效成分Nodosin的用途，尤其涉及在制藥領(lǐng)域的用途。本發(fā)明提供一種溪黃草有效成分Nodosin在制備治療器官移植術(shù)后免疫調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用。又提供了一種溪黃草有效成分Nodosin在制備治療器官移植術(shù)后抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的溪黃草有效成分Nodosin安全無(wú)毒，藥理作用強(qiáng)，預(yù)示著很好的藥用前景。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1785178SQ20051011027
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月11日
發(fā)明者李濟(jì)宇, 全志偉, 劉建文, 張艷 申請(qǐng)人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬新華醫(yī)院