專利名稱：一種促肝細(xì)胞生長蛋白質(zhì)的制備工藝及其注射劑制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)藥物的制造。特別涉及促肝細(xì)胞生長素、它的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
促肝細(xì)胞生長素是一種刺激新生的人和動物肝細(xì)胞DNA合成的藥物，該藥物可促進(jìn)肝細(xì)胞再生，加速肝臟組織的修復(fù)，恢復(fù)肝功能，改善肝臟枯否細(xì)胞的吞噬功能，防止來自腸道的毒素對肝細(xì)胞的進(jìn)一步損害，促進(jìn)肝壞死后的修復(fù)。對肝細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。對肝衰竭有明顯的提高存活力的作用。
促肝細(xì)胞生長素目前已經(jīng)有產(chǎn)品上市，是以乳?；蛉樨i的新鮮肝臟器官為原料，經(jīng)過生化加工制備得到的。
目前的促肝細(xì)胞生長素的制備由于大量使用動物臟器，使成本增加，同時由于工藝條件的限制，難以提高產(chǎn)量，生物活性不高。
本發(fā)明采用新的工藝，提高了產(chǎn)率，避免了浪費，提高了生物活性，具有工業(yè)化應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種促肝細(xì)胞生長素的制備方法，該方法是以出生一個月內(nèi)的乳?；蛉樨i的新鮮肝臟為原料，經(jīng)過提取純化工藝制備而成的。
本發(fā)明還提供用本發(fā)明方法制備的促肝細(xì)胞生長素，它是一種混合的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，具備保肝護(hù)肝的生物效應(yīng)?？梢杂糜谥苽浏熜Т_切的治療肝病的藥物。本發(fā)明的促肝細(xì)胞生長素，優(yōu)選的是促肝細(xì)胞生長素，主要活性組份蛋白質(zhì)的分子量為2.1萬道爾頓。
本發(fā)明還提供用本發(fā)明的促肝細(xì)胞生長素作為藥物活性成分制備的注射用藥物制劑，該藥物制劑優(yōu)選的是水針劑或凍干粉針劑。作為水針劑，每2毫升含本發(fā)明的促肝細(xì)胞生長素活性蛋白質(zhì)15～45μg；作為凍干粉針劑，每支含本發(fā)明的促肝細(xì)胞生長素活性蛋白質(zhì)15～45μg。
本發(fā)明的促肝細(xì)胞生長素是以出生一個月內(nèi)的乳?；蛉樨i的新鮮的肝臟為原料制備的，其步驟包括(1)對獲得的乳?；蛉樨i的新鮮肝臟進(jìn)行刺激；(2)分散乳化使細(xì)胞破碎；(3)加入溶劑并加熱；(4)冷凍沉淀雜質(zhì)；(5)離心得到粗提液；(6)柱層析得洗脫液；(7)洗脫液用超濾膜超濾，純化得2～4萬道爾頓區(qū)間的藥物活性蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的注射劑，是通過將上述本發(fā)明的藥物活性物質(zhì)加入藥物可接受的輔料，按照制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)進(jìn)一步加工得到的。
本發(fā)明的促肝細(xì)胞生長素藥物活性物質(zhì)的制備方法具體可以經(jīng)過以下步驟1、對獲得的新鮮肝臟進(jìn)行刺激選取經(jīng)免疫檢驗合格的出生一個月內(nèi)的乳牛或乳豬，其宰殺后應(yīng)立即取肝臟，并用刀立即將肝臟分割成6-8塊、4℃放置1小時進(jìn)行刺激。
2、分散乳化使細(xì)胞破碎。
將分割放置的肝臟用絞肉機(jī)打成0.5cm的小塊，然后以分散乳化機(jī)乳化20分鐘，得到細(xì)膩均勻、呈乳白色的分散乳化液。
3、加入溶劑并加熱將分散乳化液，加入3倍體積PH 3.5的0.84％的鹽水。加入十二烷基肌氨酸鈉使終濃度達(dá)到0.05％，攪拌1小時。對上述液體加熱，至料液溫度80℃恒溫15分鐘，接著加熱至90℃恒溫20分鐘，4、冷凍沉淀水冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入4℃冷庫存放48小時，以沉淀油脂、雜蛋白和十二烷基肌氨酸鈉。
5、離心得到粗提液取上清液，用無紡布過濾，用離心機(jī)離心，得澄清的粗提液。
6、柱層析將粗提液上層析柱，層析介質(zhì)可以是陰離子(如陰離子大孔樹脂、DE32-纖維素、DE52-纖維素、DEAE-Sephadex、DEAE-Sepharose)或陽離子(如陽離子大孔樹脂、CM-纖維素、CM-Sephadex、CM-Sepharose)，然后先后用A洗液和B洗液洗脫收集洗脫液。
7、洗脫液用超濾膜超濾對洗脫液，以分子量為4萬和1萬道爾頓的超濾膜超濾，經(jīng)純化得到2-4萬道爾頓區(qū)間的蛋白質(zhì)，并除鹽。
本發(fā)明制備中所述的A洗液是指含氯化鈉0.20M的0.05mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液；所述的B洗液是指含氯化鈉0.70M的0.05mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液。
本發(fā)明的注射劑，具體可以通過以下方法制備對上述純化的本發(fā)明的促肝細(xì)胞生長素藥物活性物質(zhì)進(jìn)行含量測定，步驟是，調(diào)整液體的PH至6.5-7.0，以福林酚法測定促肝細(xì)胞生長素藥物活性物質(zhì)的含量，并調(diào)整至灌裝濃度。將調(diào)整完濃度的促肝細(xì)胞生長素溶液，過濾除菌、除熱原、加入或不加入輔料，灌裝、制成水針劑，進(jìn)一步的可以經(jīng)過冷凍，制成凍干粉針劑。
本發(fā)明促肝細(xì)胞生長素能促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成，使肝細(xì)胞再生，可用于慢性肝炎、重癥肝炎、病毒性肝炎、中毒性肝炎和肝硬化的治療。
以下通過實驗數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的有益效果1、藥理作用1.1實驗性部分利用本發(fā)明的促肝細(xì)胞生長素，對切除大鼠肝臟后進(jìn)行觀察，10天左右，可使肝臟功能恢復(fù)到原有水平；可明顯刺激單層培養(yǎng)的正常大鼠肝細(xì)胞DNA合成增加。
1.2促肝細(xì)胞生長素的生物效應(yīng)(1)能明顯刺激新生肝細(xì)胞的DNA合成，促進(jìn)損傷的肝細(xì)胞線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，加速肝臟組織的修復(fù)，恢復(fù)肝功能。
(2)改善肝臟枯否細(xì)胞的吞噬功能，防止來自腸道的毒素對肝細(xì)胞的進(jìn)一步損害，抑制腫瘤壞死因子(TNF)活性和Na+，K+，-ATP酶活性抑制因子活性，從而促進(jìn)肝壞死后的修復(fù)。同時具有降低轉(zhuǎn)氨酶、血清膽紅素和縮短凝血酶原時間的作用。
(3)對四氯化碳誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用。
(4)對D-氨基半乳糖誘致的肝衰竭有明顯的提高存活力的作用。
2、臨床應(yīng)用(1)重癥肝炎中國醫(yī)科大學(xué)等單位，在綜合治療的基礎(chǔ)上加用促肝細(xì)胞生長素(PHGF)治療重癥肝炎1687例(對照組1196例)，兩組病死率對比PHGF組36.2％，對照組58.8％(P＜0.01)。認(rèn)為促肝細(xì)胞生長素具有促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成，促使肝細(xì)胞再生修復(fù)。降低內(nèi)毒素血癥及白細(xì)胞介素6(IL 6)，白細(xì)胞介素8(IL 8)水平，減少細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化等作用，并能抑制肝細(xì)胞壞死和炎癥反應(yīng)。PHGF能抑制肝組織損傷時肝細(xì)胞Fas抗原表達(dá)，阻斷CTL細(xì)胞引起肝細(xì)胞凋亡。
(2)慢性活動性肝炎上海市傳染病醫(yī)院等單位應(yīng)用促肝細(xì)胞生長素治療慢性活動性肝炎1668例，對照組1084例，結(jié)果證明PHGF在降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血清膽紅素(SB)的平均復(fù)常天數(shù)均優(yōu)于對照組。這與PHGF促進(jìn)肝細(xì)胞再生，恢復(fù)肝功能，調(diào)節(jié)免疫有關(guān)。
(3)肝硬化應(yīng)用PHGF治療肝硬化34例，治療43d，結(jié)果治療組肝、脾縮小，消除腹腔積液等均優(yōu)于對照組。北京地壇醫(yī)院等15家單位應(yīng)用促肝細(xì)胞生長素治療肝硬化333例，對照組307例，結(jié)果促肝細(xì)胞生長素不僅具有降酶、退黃作用，而且能提高血清清蛋白和消除腹腔積液，明顯優(yōu)于對照組。
(4)甲胎蛋白(AFP)異常升高應(yīng)用PHGF治療AFP升高48例，4周后PHGF治療組有效率82.1％，對照組62.5％，兩組比較差異有顯著性(P＜0.05)。
(5)肝性腦病重癥肝炎血清中存在Na+K+ATP酶活性抑制因子(中分子物質(zhì))，通過抑制Na+K+ATP酶的活性，引起腦細(xì)胞功能紊亂，導(dǎo)致腦水腫和肝性腦病。對4例重癥肝炎治療前后Na+K+ATP酶進(jìn)行測定，分別為3.047±1.624和1.444±0.250。說明用促肝細(xì)胞生長素可緩解血清中中分子物質(zhì)對Na+K+ATP酶活性的抑制作用。應(yīng)用促肝細(xì)胞生長素治療重癥肝炎肝性腦病的病死率53.57％，綜合治療組79.17％。提示促肝細(xì)胞生長素可降低重癥肝炎肝性腦病的病死率。
(6)抗肝纖維化對28例慢性肝病患者用PHGF治療前后進(jìn)行2次肝穿刺，表明促肝細(xì)胞生長素治療后肝細(xì)胞變性(胞漿疏松，氣球樣變、嗜酸性變和各種炎型的壞死)均有不同程度減輕，特別是對慢性活動性肝炎的特征改變-碎屑樣壞死，近半數(shù)縮小。成纖維組織增生明顯減輕，提示PHGF對肝細(xì)胞炎癥性損傷有良好修復(fù)和抗肝纖維化作用。
(7)藥物性肝損傷以硫代乙酰胺(TAA)復(fù)制體外培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞損傷模型，結(jié)果培養(yǎng)遞質(zhì)中加入TAA后，乳酸脫氫酶(LDH)逸出量明顯增加，肝細(xì)胞增生指數(shù)下降，上清液和細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著下降。TAA和促肝細(xì)胞生長素合用，則肝細(xì)胞逸出的LDH明顯減少，增生指數(shù)上升并超過正常對照組，上清液和細(xì)胞內(nèi)SOD顯著升高。說明PHGF能阻止肝細(xì)胞TAA損傷和促進(jìn)肝細(xì)胞再生的作用。
(8)原發(fā)性肝癌輔助治療29例晚期原發(fā)性肝癌患者分別采用肝動脈門靜脈雙置泵化療和靜脈化療，促肝細(xì)胞生長素輔助治療，將單純化療組作為對照組。結(jié)果使用PHGF患者無血細(xì)胞減少和肝功能改變等不良反應(yīng)。置泵組、靜脈組、對照組分別平均生存9.0，6.5，3.6個月。提示促肝細(xì)胞生長素與化療藥物使用后可改善癥狀，減少化療不良反應(yīng)，縮小腫瘤，延長生存期；促進(jìn)外周單核細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫活性。
本發(fā)明采用的新的制備方法，提高了促肝細(xì)胞生長素產(chǎn)率，避免了浪費，同時提高了促肝細(xì)胞生長素的生物活性，降低了副作用，生產(chǎn)成本低，具有工業(yè)化應(yīng)用價值。
具體實施例方式
以下通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。
實施例1促肝細(xì)胞生長素注射劑的制備1、肝臟選取選取經(jīng)免疫檢驗合格的出生一個月內(nèi)的乳豬，其宰殺后應(yīng)立即取肝臟，并用刀立即將肝臟分割成6-8塊、4℃放置1小時進(jìn)行刺激。
2、分散乳化將分割放置的肝臟用絞肉機(jī)打成0.5cm的小塊，然后以分散乳化機(jī)乳化20分鐘，得到細(xì)膩均勻、呈乳白色的分散乳化液。
3、破碎細(xì)胞將分散乳化液，加入3倍體積PH3.5的0.84％的鹽水5。加入十二烷基肌氨酸鈉使終濃度達(dá)到0.05％，攪拌1小時。
4、加熱冷沉對提取液加熱，至料液溫度80℃恒溫15分鐘，接著加熱至90℃恒溫20分鐘，水冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入4℃冷庫存放48小時，以沉淀油脂、雜蛋白和十二烷基肌氨酸鈉。
5、離心澄清取上清液，用無紡布過濾，用離心機(jī)離心，得澄清的粗提液。
6、層析將粗提液上層析柱，層析介質(zhì)為DE-52纖維素。層析后，先后用A洗液(pH8.0含氯化鈉0.20M的0.05mol/LTris-HCl溶液)和B洗液(pH8.0含氯化鈉0.70M的0.05mol/LTris-HCl溶液)洗脫，收集洗脫液。
7、超濾對洗脫液，以分子量為4萬和1萬道爾頓的超濾膜超濾，純化得到2-4萬道爾頓區(qū)間的蛋白質(zhì)；同時除鹽。
8、含量測定對以上得到的純化液，調(diào)PH至6.5-7.0，以福林酚法測定蛋白質(zhì)含量，合格后調(diào)整至灌裝濃度。
9、過濾除菌、除熱原，灌裝將調(diào)整濃度后的促肝細(xì)胞生長素溶液，過濾除菌、除熱原，灌裝，制成水針劑。實施例2福林酚法測定促肝細(xì)胞生長素蛋白質(zhì)含量試劑 堿性銅試液 取氫氧化鈉10g，碳酸鈉50g，加水400ml使溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸銅0.25g，加水30ml使溶解，將兩液混合，作為乙液。
臨用前，合并兩液，并加水至500ml。
操作法(1)對照品溶液的制備 取牛血清白蛋白對照品，加水制成每1ml中含有0.3mg的溶液。
(2)供試品溶液的制備 照各藥品項下的方法制備。
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品溶液0.0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml，分別置具塞試管中，各加水至1.0ml，再分別加入堿性銅試液1.0ml，搖勻，各加入福林酚試液(取福林酚試液中的貯備液1→16)4.0ml，立即混勻，置55℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，置冷水浴中10分鐘，在650nm的波長處測定吸收度；同時以0號管作為空白。以吸收度為縱坐標(biāo)，對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(4)測定法 精密量取供試品溶液1.0ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法，自“加入堿性銅試液”起，依法測定，自標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得供試品溶液的濃度，并乘以稀釋倍數(shù)。
取3個批號的促肝細(xì)胞生長素注射液，每批取5支樣品，依上述方法測得其蛋白質(zhì)含量，促肝細(xì)胞生長素注射液的蛋白質(zhì)含量為15.0～45.0μg/ml。
實施例3促肝細(xì)胞生長素的聚丙烯酰胺疑膠電泳和分子量測定將促肝細(xì)胞生長素經(jīng)12％聚丙烯酰胺凝膠電泳(顯)示產(chǎn)品中有三個蛋白質(zhì)組份，經(jīng)高效液相色譜圖面積計算主帶占總蛋白時的60％以上。
1.試劑的配制(1)分離膠儲備液30g丙烯酰胺(Acr)，0.8g甲叉雙丙烯酰胺(Bis)，加水至100mL，置冰箱4℃保存，備用。
(2)分離膠緩沖液18.2g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，加少量水溶解后用1mol/L，鹽酸調(diào)pH8.8，然后加水至100mL，置冰箱4℃保存，備用。
(3)濃縮膠儲備液Acr 10g，Bis 0.5g，加水至100mL，置冰箱4℃保存，備用。
(4)濃縮膠緩沖液Tris6.0g，加少量水溶解后用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8，然后加水至100mL，置冰箱4℃保存，備用。
(5)電極緩沖液Tris6.0g，甘氨酸28.8g，10％(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)10mL，加水至1000mL，置冰箱4℃保存，備用。用前稀釋10倍。
(6)2倍樣品緩沖液濃縮膠緩沖液2mL，甘油2mL，10％(w/v)SDS4ml，0.1％(w/v)溴酚藍(lán)0.5mL，巰基乙醇1mL，加水至10mL，置冰箱4℃保存，備用。
(7)固定液10％(w/v)三氯乙酸溶液。
(8)染色液0.25％(w/v)考馬斯亮藍(lán)R250水溶液。
(9)脫色液7％乙酸溶液。
所有試劑均為分析純，水為三重蒸餾水。
2.實驗方法樣品液的制備取本品10μl，與等量上樣緩沖液混合，置沸水浴中水浴，備用，取蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(北京鼎國試劑公司)水浴方法同供試品。
制膠灌注凝膠液前，先用滴管吸取少量用電極緩沖液I配制濃度為3％的熱瓊脂溶膠，滴人凝膠腔與電極下槽底部之間所形成的凹型小槽內(nèi)，待瓊脂凝固后開始制備分離膠。
12％分離膠的制備分離膠儲備液10mL，分離膠緩沖液7.5mL，10％SDS0.3mL，四甲基乙二胺(TEMED)20μl，10％過硫酸鉸(AP)0.2mL，加水至30mL，攪拌均勻后，將所配制的分離膠膠液沿著凝膠腔的長玻璃板的一面緩緩倒人凝膠腔內(nèi)，直至9cm左右高度為止。然后用滴管沿凝膠腔內(nèi)壁緩緩加入蒸餾水進(jìn)行水封，水層高度約為5mm，30～40min后聚合完成。
5％濃縮膠的制備濃縮膠儲備液5mL，濃縮膠緩沖液2.5mL，10％SDS 0.1mL，TEMED 10μl，10％AP 0.1mL，加水至10mL，攪拌均勻后，加到吸取表面水層的分離膠上部。小心插入加樣梳，整個操作過程應(yīng)避免氣泡的混入，約20min后聚合完成。聚合完成后，在上下兩槽倒人電極緩沖液I，小心取出加樣梳。
電泳測定上樣，接通電源，開始電泳。開始用120V恒電壓，待澳酚藍(lán)示蹤荊進(jìn)入分離膠后改用200V恒電壓電泳至示蹤劑遷移到凝膠腔下沿約1cm處停止電泳。
固定、染色、脫色取出凝膠板置固定液中固定過夜，然后置染色液中染色12h。染色畢，將凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，然后加入脫色液脫色，經(jīng)常更換脫色液，至凝膠膠板的藍(lán)色背景褪清，蛋白質(zhì)色譜帶清晰為止。
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及樣品分子量測定鑒于各膠帶染色前后的膠柱有變化，所以必須進(jìn)行校正。各樣品和標(biāo)準(zhǔn)品膠柱固定染色前的膠柱長分別記為d1，溴酚藍(lán)遷移距離為d2，脫色后的膠柱為d3，蛋白質(zhì)遷移距離為d4，按下式求得各樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)遷移率Rf，Rf＝dl×c14/d2×d3以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Rf為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)分子量為縱坐標(biāo)，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上作蛋白質(zhì)分子量與其Rf關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品蛋白質(zhì)的Rf在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)的分子量。
實施例4促肝細(xì)胞生長素注射劑的制備1、肝臟選取選取經(jīng)免疫檢驗合格的出生一個月內(nèi)的乳牛，其宰殺后應(yīng)立即取肝臟，并用刀立即將肝臟分割成6-8塊、4℃放置1小時進(jìn)行刺激。
2、分散乳化將分割放置的肝臟用絞肉機(jī)打成0.5cm的小塊，然后以分散乳化機(jī)乳化20分鐘，得到細(xì)膩均勻、呈乳白色的分散乳化液。
3、破碎細(xì)胞將分散乳化液，加入3倍體積PH3.5的0.84％的鹽水5。加入十二烷基肌氨酸鈉使終濃度達(dá)到0.05％，攪拌1小時。
4、加熱冷沉對提取液加熱，至料液溫度80℃恒溫15分鐘，接著加熱至90℃恒溫20分鐘，水冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入4℃冷庫存放48小時，以沉淀油脂、雜蛋白和十二烷基肌氨酸鈉。
5、離心澄清取上清液，用無紡布過濾，用離心機(jī)離心，得澄清的粗提液。
6、層析將粗提液上層析柱，層析介質(zhì)為DE-52纖維素。層析后，先后用A洗液(pH8.0含氯化鈉0.20M的0.05mol/LTris-HCl溶液)和B洗液(pH8.0含氯化鈉0.70M的0.05mol/LTris-HCl溶液)洗脫，收集洗脫液。
7、超濾對洗脫液，以分子量為4萬和1萬道爾頓的超濾膜超濾，純化得到2-4萬道爾頓區(qū)間的蛋白質(zhì)；同時除鹽。
8、含量測定對以上得到的純化液，調(diào)PH至6.5-7.0，以福林酚法測定蛋白質(zhì)含量，合格后調(diào)整至灌裝濃度。
9、過濾除菌、除熱原，灌裝將調(diào)整濃度后的促肝細(xì)胞生長素溶液，過濾除菌、除熱原，灌裝，制成水針劑。
權(quán)利要求
1.一種促肝細(xì)胞生長素的制備方法，其特征在于，經(jīng)過以下步驟(1)對獲得的乳牛或乳豬的新鮮肝臟進(jìn)行刺激；(2)分散乳化使細(xì)胞破碎；(3)加入溶劑并加熱；(4)冷凍沉淀；(5)離心得到粗提液；(6)柱層析得洗脫液；(7)洗脫液用超濾膜超濾，純化得2～4萬道爾頓區(qū)間的藥物活性蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，步驟1中所述刺激是乳?；蛉樨i宰殺后應(yīng)立即取肝臟，用刀立即將肝臟分割成6-8塊、4℃放置1小時。
3.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，步驟2中所述分散乳化使細(xì)胞破碎是，將步驟1刺激后的肝臟用絞肉機(jī)打成0.5cm的小塊，然后以分散乳化機(jī)乳化20分鐘，得到細(xì)膩均勻、呈乳白色的分散乳化液。
4.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，步驟3中所述加入溶劑并加熱是，將步驟2得到的分散乳化液加入3倍體積pH3.5的0.84％的鹽水。加入十二烷基肌氨酸鈉使終濃度達(dá)到0.05％，攪拌1小時，對提取液加熱，至料液溫度80℃恒溫15分鐘，接著加熱至90℃恒溫20分鐘。
5.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，步驟4中所述冷凍沉淀是用水冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入4℃冷庫存放48小時，以沉淀油脂、雜蛋白和十二烷基肌氨酸鈉。
6.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，步驟5中所述離心得到粗提液，是取上清液，用無紡布過濾，用離心機(jī)離心，得澄清的粗提液。
7.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，步驟6中所述的柱層析是將粗提液上層析柱，所述層析柱介質(zhì)是陰離子或陽離子交換樹脂，選自陰離子大孔樹脂、DE32-纖維素、DE52-纖維素、DEAE-SEPHADEX、DEAE-SEPHAROSE陽離子大孔樹脂、CM-纖維素、CM-SEPHADEX、CM-SEPHAROSE。粗提液上層析柱后，先后用A洗液(pH8.0的含氯化鈉0.20M的0.05mol/LTris-HCl溶液)和B洗液(pH8.0的含氯化鈉0.70M的0.05mol/LTris-HCl溶液)洗脫，收集洗脫液。
8.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，步驟7中所述洗脫液用超濾膜超濾，是以分子量為4萬和1萬道爾頓的超濾膜超濾，得到2-4萬道爾頓區(qū)間的蛋白質(zhì)。
9.含有用權(quán)利要求1的制備方法制備的促肝細(xì)胞生長素的藥物制劑，其特征在于，是注射劑，該注射劑用以下方法制備調(diào)整純化并除鹽的促肝細(xì)胞生長素的pH至6.5-7.0，以福林酚法測定蛋白質(zhì)含量，并調(diào)整至灌裝濃度，將調(diào)整濃度后的促肝細(xì)胞生長素溶液，過濾除菌、除熱原、需要時加入輔料，灌裝，制成水針劑或凍干粉針劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促肝細(xì)胞生長蛋白質(zhì)的制備工藝及其注射劑制備方法，步驟是出生一個月內(nèi)的乳牛或乳豬的肝臟用絞肉機(jī)絞碎，采用分散乳化機(jī)分散20分鐘，加入含0.05％的十二烷基肌氨酸鈉，破碎細(xì)胞，加熱、泠沉沉淀雜蛋白，離子交換等純化方法獲得。其中的主要有效成分2.1萬道爾頓蛋白質(zhì)含量大于60％。含量測定、藥效學(xué)和毒理學(xué)實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明的促肝細(xì)胞生長蛋白質(zhì)及其注射劑取材更方便容易，成本降低，藥理藥效與前人研究結(jié)果相當(dāng)。
文檔編號A61K38/27GK1762383SQ20051010835
公開日2006年4月26日 申請日期2005年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月12日
發(fā)明者郭斌閣 申請人:郭斌閣