專利名稱：通過吸引效應(yīng)t細(xì)胞和耗損調(diào)節(jié)性t細(xì)胞治療癌癥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請主要涉及癌癥治療領(lǐng)域，更具體地涉及用于癌癥免疫治療的方法和組合物。
背景技術(shù)：
腫瘤的放射治療和化療并不能完全清除腫瘤細(xì)胞，同時還損傷了免疫系統(tǒng)。殘存的腫瘤細(xì)胞(包括轉(zhuǎn)移腫瘤)往往最終奪取了患者的生命。免疫治療提供了最理想的完全清除殘存腫瘤的方法，但是腫瘤往往因免疫系統(tǒng)的激活不足而逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊。免疫系統(tǒng)的激活不足原因在于浸入免疫組織的腫瘤細(xì)胞不足，或缺乏足夠強的對浸潤腫瘤的淋巴細(xì)胞的活化信號。增加T淋巴細(xì)胞對腫瘤的浸潤常常帶來良好的預(yù)后。如何增加對腫瘤的免疫力成為清除腫瘤而又不損傷免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵。
CD4+CD25+T細(xì)胞亞群是被證明在器官特異性自身免疫和慢性感染中T細(xì)胞應(yīng)答的一種有效調(diào)節(jié)物(Sakaguchi，2004；Shevach，2002；Maloy和Powrie，2001；Casares等人，2003；Golgher等人，2002)。近來的研究支持了這樣的觀點，即疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答的效用受到CD4+CD25+T細(xì)胞的限制(Machiels等人，2001；Sutmuller等人，2001；Steitz等人，2001；Yu等人，2003；Houghton等人，2001；Toes等人，1999)。
因此，存在著對于更好地了解癌癥中涉及的免疫應(yīng)答組分和機制的需要，和對于基于這種了解的其他癌癥療法的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已經(jīng)觀察到CD4+CD25+T細(xì)胞在人和鼠科動物的腫瘤內(nèi)的選擇性聚集。這些細(xì)胞在腫瘤發(fā)展的后期階段構(gòu)成了腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的大部分。在此，本發(fā)明人顯示出，在腫瘤內(nèi)發(fā)現(xiàn)了與CD8+T細(xì)胞緊密接觸的CD4+CD25+T細(xì)胞，這些T細(xì)胞于體內(nèi)在局部的腫瘤部位抑制了CD8+T細(xì)胞的增殖和干擾素-γ產(chǎn)生。阻斷IL-10和TGF-β的作用可以部分地逆轉(zhuǎn)由CD4+細(xì)胞引起的抑制。此外，腫瘤內(nèi)的CD4+細(xì)胞的局部耗損(depletion)導(dǎo)致根除完全形成的高攻擊性腫瘤，和導(dǎo)致形成長期的抗腫瘤記憶。因此，CD4+CD25+T細(xì)胞在腫瘤中保持了這樣的環(huán)境，即該環(huán)境隱藏了腫瘤細(xì)胞的免疫原性。該研究舉例說明了，由T調(diào)節(jié)細(xì)胞引起的抗腫瘤免疫性的抑制主要出現(xiàn)在腫瘤部位，抑制的局部逆轉(zhuǎn)甚至在腫瘤形成晚期階段也可以是對于完全形成的癌癥的有效治療。
本發(fā)明的一個方面涉及這樣的方法，其包括通過向受試者施用至少一種耗損調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(特別是CD4+T細(xì)胞)的第一化合物來耗損患有癌癥的受試者中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(特別是CD4+T細(xì)胞)。在大多數(shù)的實施方案中，該耗損導(dǎo)致受試者的抗癌癥免疫性的激活，和引起導(dǎo)向抗癌癥的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的一些實施方案中，受試者可以具有腫瘤，例如但不限于固體腫瘤。耗損的CD4+T細(xì)胞可以位于癌癥和/或腫瘤的部位。在一些實施方案中，耗損的CD4+T細(xì)胞在腫瘤內(nèi)。在一些實施方案中，耗損的CD4+T細(xì)胞在腫瘤的外部。在其他實施方案中，發(fā)現(xiàn)耗損的CD4+T細(xì)胞位于腫瘤的內(nèi)部和外部。耗損可以僅僅局限于接近腫瘤和/或在腫瘤中的CD4+T細(xì)胞，或者耗損可以是全身性的?！昂膿p(depletion)”表示在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(特別是CD4+T細(xì)胞)的局部化或全身性群體中的任何減少。“耗損”不要求沒有CD4+T細(xì)胞保留在受試者中或者在受試者內(nèi)的一些局部化區(qū)域中。此外，“耗損”不要求消滅在受試者的癌癥部位內(nèi)部或接近癌癥部位的所有或基本上所有的CD4+T細(xì)胞。在本發(fā)明的大多數(shù)實施方案中，“耗損”要求CD4+T細(xì)胞群體的足夠數(shù)量的減少，以引起治療效果。
在某些實施方案中，受試者中的CD8+T細(xì)胞相對于CD4+T細(xì)胞沒有被耗損。在某些實施方案中，CD8+T細(xì)胞參與了導(dǎo)向抗癌癥的免疫應(yīng)答。要注意，“受試者中的CD8+T細(xì)胞相對于CD4+T細(xì)胞沒有被耗損”表示，相對于CD4+T細(xì)胞群體來說，CD8+T細(xì)胞群體的大小相對于受試者中的CD8+T細(xì)胞沒有耗損的情況沒有減少。本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方案將會涉及受試者中的CD8+T細(xì)胞群體相對于受試者中的CD4+T細(xì)胞群體的富集。
第一化合物可以是任何目前已知或稍后測定用于耗損CD4+T細(xì)胞的化合物。在一些實施方案中，第一化合物是抗CD4抗體?？贵w可以是抗人CD4的抗體?？贵w可以是單克隆抗體?？贵w可以是人源化抗體。在另一些實施方案中，第一化合物是抗CD25抗體或者CD4+CD25+的IL-2毒素。IL-2毒素能夠優(yōu)先耗損CD4+CD25+細(xì)胞。
在某些實施方案中，該方法進(jìn)一步定義為向受試者施用至少一種第二化合物。第二組合物可以是CD8+T細(xì)胞的激活劑。CD8+T細(xì)胞的激活劑可以是抗體，包括但不局限于單克隆抗體和/或人源化抗體。CD8+T細(xì)胞的激活劑可以是編碼激活CD8+T細(xì)胞的肽或蛋白質(zhì)的核酸。例如，激活劑可以是編碼LIGHT的核酸。在某些實施方案中，第二化合物為化療藥物?；熕幬锟梢允菍D8+T細(xì)胞基本上無毒的化療藥物?；熕幬锟梢允菍τ贑D8+T細(xì)胞比對于CD4+T細(xì)胞具有更小毒性的化療藥物。第二化合物可以是抗癌疫苗。抗癌疫苗可以是基因疫苗或肽疫苗。第二化合物可以是編碼治療性肽的核酸。在某些實施方案中，第一化合物和第二化合物同時進(jìn)行遞送。在某些實施方案中，第一化合物和第二化合物在不同的時候進(jìn)行遞送。第一化合物根據(jù)腫瘤的大小可以60μg-600μg抗CD4抗體的劑量進(jìn)行施用。這樣不會對于全身的CD4細(xì)胞產(chǎn)生明顯的影響。
受試者可以是哺乳動物，包括但不局限于人。癌癥可以是任何形式的癌癥。例如，在一些情況下，癌癥是固體癌癥，例如但不局限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、頭和頸癌、前列腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌、胃癌、腦癌、黑色素瘤、鼻咽癌、皮膚癌或腎癌。癌癥可以是轉(zhuǎn)移的癌癥，例如轉(zhuǎn)移的乳腺癌。癌癥可以是生血細(xì)胞的癌癥，例如淋巴瘤或白血病。當(dāng)然，熟練技術(shù)人員會理解根據(jù)本發(fā)明可以治療任何數(shù)目的癌癥。
本發(fā)明的另一個方面涉及癌癥的診斷或預(yù)后方法，其包括分析受試者中的CD4+T細(xì)胞群體。CD4+T細(xì)胞可以位于受試者中的腫瘤內(nèi)。在某些實施方案中，腫瘤內(nèi)CD4+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的升高的水平表明對于受試者的不良預(yù)后。在某些實施方案中，該方法進(jìn)一步包括分析患有癌癥的受試者中的CD8+T細(xì)胞群體。相對于正常的CD8+T細(xì)胞水平，受試者中CD8+T細(xì)胞的升高或正常的水平可以是積極的預(yù)后指標(biāo)和/或癌癥的診斷。
本發(fā)明的另一個方面涉及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑在制備藥物中的用途，其中所述藥物通過耗損患者(包括動物，哺乳動物，特別是人類)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而治療或者預(yù)防腫瘤(特別是癌癥，例如實體癌)。
本發(fā)明在另一方面涉及藥物組合物，它包含調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑作為活性成分，所述藥物組合物通過耗損患者(包括動物，哺乳動物，特別是人類)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而治療或者預(yù)防腫瘤(特別是癌癥，例如實體癌)。
調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑是任何一種或多種耗損調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的化合物、組合物、混合物或者聯(lián)合制劑?！昂膿p”一詞在上文有說明。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑包括，但不限于，抗調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抗體，如人源化的抗-CD4抗體；或者此處公開的、現(xiàn)有技術(shù)已知的或?qū)⒁话l(fā)現(xiàn)的耗損調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(特別是CD4+T細(xì)胞)的任何其它化合物或者一個或者多個這種化合物的組合。
在這些方面，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞優(yōu)選是CD4+T細(xì)胞，特別是CD4+CD25+T細(xì)胞。所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以在腫瘤部位處，和/或在腫瘤內(nèi)，和/或在腫瘤外。所述耗損可以是腫瘤局部的，和/或是全身性的。
在一個實施方案中，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抗體，特別是抗CD4+抗體，如抗CD4+CD25+抗體；或者，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑是IL2-毒素。所述抗體優(yōu)選是抗人CD4+抗體。所述抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體。優(yōu)選地，抗體是人源化抗體。
在一個實施方案中，所述患者的CD8+T細(xì)胞不被耗損。優(yōu)選地，CD8+T細(xì)胞參與對腫瘤的免疫應(yīng)答。
在另一實施方案中，所述藥物還包括其它活性成分，并且所述藥物被配制成適于所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑和所述其它活性成分同時給藥或者分開給藥的形式。所述其它活性成分可以是CD8+T細(xì)胞的激活劑。所述激活劑的例子是抗體，尤其是單克隆抗體，人源化抗體等。在一個具體實施方案中，所述激活劑是編碼激活CD8+T細(xì)胞的多肽的核酸。特別地，所述激活劑是編碼LI GHT的核酸，尤其是編碼突變LIGHT的核酸。
在一個實施方案中，所述其它活性成分是包含并表達(dá)編碼突變LIGHT的核酸的腫瘤細(xì)胞或者腫瘤(優(yōu)選地，該腫瘤細(xì)胞或者腫瘤還包含并表達(dá)腫瘤抗原)或者包含腫瘤細(xì)胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。在另一個實施方案中，所述其它活性成分是包含并表達(dá)編碼突變LIGHT的核酸的重組病毒(優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組病毒的藥用組合物。優(yōu)選地，所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是不含LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EKLI(人類中的EQLI)的突變LIGHT。或者，所述突變LIGHT優(yōu)選是具有細(xì)胞外域氨基酸序列和標(biāo)簽序列(例如便于純化的標(biāo)簽)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。
在一個實施方案中，所述其它活性成分是化學(xué)治療藥物，尤其是對CD8+T細(xì)胞沒有實質(zhì)性毒性的化療藥物，或者對CD8+T細(xì)胞的毒性比對CD4+T細(xì)胞的毒性小的化療藥物。例如，所述其它活性成分是放療藥物。
在一個實施方案中，所述其它活性成分是抗癌疫苗，例如基因疫苗或者肽疫苗。
在一個實施方案中，所述其它活性成分是治療性多肽或者編碼治療性多肽的核酸。
在一個實施方案中，所述腫瘤是實體癌，例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、頭頸癌、前列腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌、胃癌、腦癌、黑素瘤、食道癌、皮膚癌或者腎癌，特別是乳腺癌，轉(zhuǎn)移性乳腺癌；或者所述腫瘤是血液癌，例如淋巴瘤或者白血病。
本發(fā)明在另一方面還涉及可用于分析患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(特別是CD4+T細(xì)胞，特別是CD4+CD25+T細(xì)胞)群體的試劑在制備用于癌癥診斷或者預(yù)后的藥劑或者藥劑盒中的用途。優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在患者腫瘤內(nèi)。此時，特別地，腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平升高表明患者預(yù)后不佳。
在一個實施方案中，所述藥劑或者藥劑盒還包含用于分析癌癥患者體內(nèi)CD8+T細(xì)胞群體的試劑。在該實施方案中，特別地，相對于CD8+T細(xì)胞的正常水平，所述患者體內(nèi)CD8+T細(xì)胞水平升高或者正常水平是癌癥的正預(yù)后指標(biāo)和/或診斷。
在另一方面本發(fā)明還涉及包含并表達(dá)編碼突變LIGHT的核酸cDNA的重組病毒，優(yōu)選地，該重組病毒是重組腺病毒或者禽痘病毒。優(yōu)選地，所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是不含LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EKLI(人類中的EQLI)的突變LIGHT。在另一個實施方案中，所述突變LIGHT具有細(xì)胞外域氨基酸序列和標(biāo)簽序列(例如便于純化的標(biāo)簽)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。
在另一方面本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明重組病毒的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。
在另一方面本發(fā)明還涉及本發(fā)明病毒或者組合物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
在另一方面，本發(fā)明還涉及治療癌癥或者破壞腫瘤的方法，包括向癌癥患者給予包含并表達(dá)編碼突變LIGHT的核酸的重組病毒(優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組病毒的藥用組合物；或者向癌癥患者給予包含并表達(dá)編碼突變LIGHT的核酸的腫瘤細(xì)胞或者腫瘤(優(yōu)選地，該腫瘤細(xì)胞或者腫瘤還包含并表達(dá)腫瘤抗原)或者包含這種腫瘤細(xì)胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。在一個優(yōu)選實施方案中，所述給予是向腫瘤內(nèi)給予。
在另一方面，本發(fā)明還涉及包含并表達(dá)編碼突變LIGHT的核酸的腫瘤細(xì)胞或者腫瘤，優(yōu)選地，該腫瘤細(xì)胞或者腫瘤還包含并表達(dá)腫瘤抗原；還涉及包含本發(fā)明腫瘤細(xì)胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。
在另一方面，本發(fā)明還涉及用于篩選或者測試癌癥治療劑的方法，包括通過體內(nèi)或者體外實驗測試候選物質(zhì)是否能夠耗損調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
當(dāng)在權(quán)利要求和/或說明書中與術(shù)語“含有”結(jié)合使用時，使用詞“a”或“an”可以表示“一個”，但是其也是與“一個或多個”、“至少一個”和“一個或多于一個”的含義是一致的。在此處使用的“另一個”可以表示至少第二個或更多個。
可考慮到，在該說明書中所討論的任何實施方案可以就本發(fā)明的任何方法或組合物進(jìn)行實施，反之亦然。此外，本發(fā)明的組合物可以用于獲得本發(fā)明的方法。
在整個該申請中，術(shù)語“大約”用于表明，值包含用于測定該值的設(shè)備、方法的固有誤差變化，或者包含在研究受試者中存在的變化。
在權(quán)利要求中使用術(shù)語“或”是用于表示“和/或”，除非明確地表明只涉及一種選擇，或者兩種選擇是相互排斥的。
在該說明書和權(quán)利要求中使用時，詞“含有”、“具有”、“包括”或“包含”是寬泛的或無限制的，它們不排出另外的、未描述的成分或方法步驟。
本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征和優(yōu)點將會從下面的詳述中清楚地了解到?？墒?，應(yīng)當(dāng)理解，詳述和特殊的實施例雖然指出了本發(fā)明的特殊實施方案，但只是為了舉例說明，因為從該詳述中，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修飾對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說都會是顯而易見的。


下面的附圖形成了本說明書的一部分，包括這些附圖是為了進(jìn)一步證明本發(fā)明的某些方面。通過參考這些附圖中的一幅或多幅并聯(lián)合此處給出的特殊實施方案的詳細(xì)描述可以更好地理解本發(fā)明。
圖1.T細(xì)胞浸潤乳腺癌組織。檢查來自20位患者的乳腺癌樣品，并顯示出具有代表性的圖片。原位(a和b)或侵入的(c和d)乳腺癌組織用蘇木精和伊紅(H&E)(a和c)或者抗CD4(褐色)和抗CD8(藍(lán)色)(b和d)染色。在圖版b和d中的箭頭指明以更高放大倍率顯示的位于右下角的區(qū)域。在隨機挑選的高倍視野(×40)中，在10個原位的和10個侵入的乳腺癌組織中計數(shù)CD8+細(xì)胞和CD4+細(xì)胞的數(shù)量，并對于每個癌癥組織計算CD4+細(xì)胞與CD8+細(xì)胞的比例。
圖2.CD4+CD25+T細(xì)胞在腫瘤內(nèi)部聚集從而抑制腫瘤的排異。a，強抗原Ld不阻止腫瘤生長。將5×105Ag104和Ag104Ld腫瘤細(xì)胞皮下接種至C3B6F1小鼠。檢測腫瘤的生長，并如下計算體積體積＝長×寬×高/2。(b-c)，將106Ag104Ld腫瘤細(xì)胞在尾的基部皮下接種至C3B6F1小鼠，并在腫瘤接種之后的7或16天從小鼠中分離出腹股溝LN、脾和腫瘤組織。通過FACS來測定CD4+CD25+T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的百分?jǐn)?shù)(b)和CD45RB在CD4+CD25+或CD4+CD25-T細(xì)胞上的表達(dá)(c)。(d-e)，在腫瘤接種之后的16天，從這些具有腫瘤的小鼠中收集脾和腫瘤組織。通過使用磁性系統(tǒng)的負(fù)選擇性小珠法而從脾中富集CD4+T細(xì)胞。用磁性系統(tǒng)進(jìn)一步將來自脾的CD4+CD25-T細(xì)胞與CD4+CD25+T細(xì)胞分離開。腫瘤浸潤T細(xì)胞用生物素化的抗Thy1.2抗體并隨后用抗生物素磁性小珠進(jìn)行富集。浸潤腫瘤的CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步用FACS進(jìn)行分離，這是在使用PE綴合的抗CD4抗體進(jìn)行染色之后進(jìn)行分類。d，從這些純化的CD4+T細(xì)胞群體中分離得到總RNA，并對源自RNA的cDNA施行關(guān)于foxp-3的實時PCR。e，將96孔平板中每孔5×104個來自未經(jīng)過試驗的原初小鼠的經(jīng)純化的CD4+CD25-T細(xì)胞用最佳劑量(2μg/ml)的經(jīng)包被的抗CD3抗體刺激72小時?；蛘呒尤?×104個來自具有腫瘤的小鼠的腫瘤組織或脾的CD4+T細(xì)胞，以便與純化的CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)，和在培養(yǎng)的最后24小時加入3H，并測量其的摻入。(f)，在腫瘤接種之后14天給予小鼠抗CD25抗體，2天之后收集脾和腫瘤組織，將在CD4或CD8細(xì)胞中的CD25+或CD25-細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)與未經(jīng)過處理的進(jìn)行比較。當(dāng)在體內(nèi)用抗體耗損CD4+(g)或CD25+(h)細(xì)胞時，監(jiān)測腫瘤的生長。
圖3.CD4+細(xì)胞抑制腫瘤浸潤CD8+T細(xì)胞的增殖和IFN-γ產(chǎn)生。將106Ag104Ld腫瘤細(xì)胞皮下接種至C3B6F1小鼠，并在腫瘤接種之后14天腹膜內(nèi)(i.p.)注射抗CD4抗體(GK1.5)。在CD4耗損之后1星期從小鼠中分離出脾以及腫瘤組織。通過FACS測定腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(a)。用抗Thy1.2磁性小珠系統(tǒng)富集腫瘤浸潤T細(xì)胞(TIL)。脾細(xì)胞和純化的TIL在體外用PMA和離子霉素于布雷菲爾德菌素A的存在下刺激4小時。通過FACS測定腫瘤中總CD8+T細(xì)胞之中的產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。將106MC57-SIY腫瘤細(xì)胞在多個位點皮下注射至處于Rag-1-/-背景的2C TCR轉(zhuǎn)基因小鼠，以激活2CT細(xì)胞。在激活之后96小時分離2C T細(xì)胞，其具有CD62L1o℃D44high表型。將CFSE標(biāo)記的激活的2C T細(xì)胞以寄養(yǎng)的方式轉(zhuǎn)移至這些具有Ag104Ld腫瘤的經(jīng)過或未經(jīng)過CD4耗損的小鼠中。在轉(zhuǎn)移2C T細(xì)胞之后2天從小鼠中收集腫瘤組織。通過FACS監(jiān)測CFSE標(biāo)記的2C T細(xì)胞的增殖。
圖4.CD4+細(xì)胞保持腫瘤內(nèi)部的抗炎環(huán)境。(a-b)，在腫瘤接種之間1天，通過用抗CD4抗體腹膜內(nèi)(i.p.)處理小鼠來耗損CD4+細(xì)胞。將106Ag104Ld腫瘤細(xì)胞皮下接種至C3B6F1小鼠，在腫瘤接種之后2星期從小鼠中收集脾(a)以及腫瘤組織(b)并勻漿。將碎片旋轉(zhuǎn)沉淀，收集上清液并對其施用細(xì)胞計量小珠陣列試劑盒(CBA)。c，將105Ag104Ld腫瘤細(xì)胞皮下接種至C3B6F1小鼠，并在腫瘤接種之前1天和之后7天將100μg阻斷性抗IL-10受體(IL-10R)抗體注射給小鼠。聯(lián)合抗IL-10R處理，在腫瘤接種之后7天，將100μg LPS或100μg對抗性抗CD40抗體以腹膜內(nèi)(i.p.)方式給予小鼠。d，將105Ag104Ld腫瘤細(xì)胞皮下接種至C3B6F1小鼠，并在腫瘤接種之前1天和之后7天將抗CD4抗體或250μg抗TGF-β抗體注射給小鼠。監(jiān)測腫瘤的生長。
圖5.CD4+細(xì)胞的腫瘤內(nèi)耗損導(dǎo)致形成的腫瘤的排異。將105Ag104Ld腫瘤細(xì)胞皮下接種至C3B6F1小鼠，并在腫瘤接種之后14天以腫瘤內(nèi)的方式注射12.5μg抗CD4抗體(GK1.5)。在CD4耗損之后2天，從小鼠中分離出脾以及腫瘤組織。通過FACS測定脾或腫瘤組織中淋巴細(xì)胞之中的CD4+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(a)。監(jiān)測腫瘤的生長(b)。
具體實施例方式
本發(fā)明在某些實施方案中提供了包括耗損CD4+T細(xì)胞在內(nèi)的對于癌癥的治療。某些實施方案中，抗CD4抗體如人源化抗CD4抗體可以用于在腫瘤的部位耗損CD4+T細(xì)胞，因此使得CD8+T細(xì)胞能夠更有效地識別和破壞腫瘤。
人源化抗體本發(fā)明的某些實施方案旨在抗體的使用，包括抗CD4抗體。涉及制備單克隆和多克隆抗體，包括制備人源化抗體的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的(Smith等人，2004；Hinoda等人，2004)。用于制備人源化抗體的方法包括涉及免疫由于基因改變(例如轉(zhuǎn)基因整合入至少一個導(dǎo)致產(chǎn)生人源化抗體的基因)而產(chǎn)生人源化抗體的動物的方法。
此處使用的“人源化”定義為這樣的化合物，即當(dāng)注射入人體中時，不會產(chǎn)生導(dǎo)向抗該化合物的治療上顯著的免疫應(yīng)答。例如，當(dāng)注射入人體中時，人源化抗CD4抗體可以產(chǎn)生抗CD4+T細(xì)胞的顯著的免疫應(yīng)答；可是，在人體中沒有產(chǎn)生抗該人源化抗CD4抗體的治療上顯著的免疫應(yīng)答。
用于產(chǎn)生多克隆抗體的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。多克隆抗體可以通過多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射希望對于其產(chǎn)生抗體的目標(biāo)和佐劑而在動物中形成。在一些情況下，將目標(biāo)或目標(biāo)氨基酸序列的片段與在該待免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)(例如，使用雙官能或衍生化試劑如馬來酰亞胺基苯甲?；腔牾啺孵?、N-羥基琥珀酰亞胺、glytaraldehyde或琥珀酸酐的匙孔血藍(lán)蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)綴合是有用的。然后，可以將動物產(chǎn)生的導(dǎo)向抗目標(biāo)的抗體隨后進(jìn)行純化，并用于治療。
用于產(chǎn)生單克隆抗體的方法在本領(lǐng)域中也是眾所周知的。從基本上均一的抗體的群體中獲得單克隆抗體，即包含該群體的抗體是同一的，除了可以較小數(shù)量存在的可能天然出現(xiàn)的突變。因此，修飾語“單克隆”表明了抗體的特征不是無聯(lián)系的抗體的混合物。用于制備單克隆抗體的方法通常包括使用雜交瘤細(xì)胞。
其他類型的抗體也可以用于本發(fā)明。例如，可以在本發(fā)明的某些實施方案中使用雙特異性抗體，其對于至少兩種不同的抗原具有結(jié)合特異性，和/或雜綴合抗體，其由兩個共價結(jié)合的抗體組成。
藥物組合物本發(fā)明藥物組合物含有有效量的一種或多種耗損CD4+T細(xì)胞的化合物(例如，人源化的抗-CD4抗體；或者此處公開的、現(xiàn)有技術(shù)已知的或?qū)⒁话l(fā)現(xiàn)的耗損CD4+細(xì)胞的任何其它化合物)或溶解或分散于藥物可接受的載體中的額外物質(zhì)。術(shù)語“藥物或藥理可接受的”是指當(dāng)施用于動物(如果合適，例如為人類)時，不產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不想要的反應(yīng)的分子實體和組合物。根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容以及Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.MackPrinting Company，1990(此處引用作為參考)的說明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道如何制備含有至少一種耗損CD4+T細(xì)胞的化合物或額外活性成分的藥物組合物。而且，對于動物(例如人類)施用來說，應(yīng)理解該制劑應(yīng)該滿足FDA的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)所要求的無菌性、熱原性、總體安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。
如此處所用，″藥物可接受的載體″是指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細(xì)菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延緩試劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、凝膠、結(jié)合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、染料、類似物質(zhì)及其組合(參見，例如Remington′sPharmaceutical Sciences，18th Ed.Mack Printing Company，1990，pp.1289-1329，此處引用作為參考)。除非傳統(tǒng)載體與活性組分不相容，否則它們都可以用于所述藥物組合物中。
耗損CD4+T細(xì)胞的化合物可以含有不同類型的載體，這取決于它是以固體、液體還是氣霧劑的形式施用以及它是否需要滅菌以適用于注射之類的施用途徑。本發(fā)明組合物可以如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的經(jīng)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、透皮、鞘內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、直腸內(nèi)、表皮(topical)、肌內(nèi)、皮下、粘膜地、口服、表皮地、局部地、吸入(例如氣霧劑吸入)、注射、輸注、連續(xù)輸注等方式施用，或直接、經(jīng)導(dǎo)管、經(jīng)灌洗器而局部灌注擴散于靶細(xì)胞，或以霜劑、液體組合物(例如脂質(zhì)體)或其它方式或上述的任何組合來施用。參見，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.Mack PrintingCompany，1990，此處引用作為參考)。
用于癌癥的組合療法為了增強耗損CD4+T細(xì)胞的化合物(例如人源化的抗-CD4抗體)的效能，理想的是將本發(fā)明的這些組合物和方法與有效治療過度增生性疾病的物質(zhì)(例如抗癌試劑)聯(lián)用?！翱拱痹噭┠軐κ茉囌咧械陌┊a(chǎn)生負(fù)影響，例如，通過殺死一種或多種癌細(xì)胞、在一種或多種癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、降低一種或多種癌細(xì)胞的生長速率、降低轉(zhuǎn)移的發(fā)生率或數(shù)目、減少腫瘤大小、抑制腫瘤生長、減少對腫瘤或一種或多種癌細(xì)胞的血液供應(yīng)、提高對一種或多種癌細(xì)胞或腫瘤的免疫應(yīng)答、防止或抑制腫瘤的發(fā)展、或者增加癌癥患者的壽命?？拱┰噭┌?，例如，化療試劑(化學(xué)療法)、放療試劑(放射療法)、手術(shù)方法(手術(shù))、免疫治療試劑(免疫療法)、遺傳治療試劑(基因療法)、激素療法、其它生物試劑(生物療法)和/或替代性療法。
更一般地說，這樣的試劑將與耗損CD4+T細(xì)胞的化合物一起以有效殺死癌細(xì)胞或抑制其增殖的組合量提供。這樣的方法可以包括將細(xì)胞與試劑和耗損CD4+T細(xì)胞的化合物同時接觸，或者在一個時間段內(nèi)接觸，其中將耗損CD4+T細(xì)胞的化合物與試劑分開施用給細(xì)胞、組織或生物產(chǎn)生了所需的治療效果。這也可以通過下述方式實現(xiàn)將細(xì)胞、組織或生物與同時含有耗損CD4+T細(xì)胞的化合物和一種或多種試劑的單一組合物或藥物制劑接觸，或者將細(xì)胞與兩種或多種不同的組合物或制劑接觸，其中一種組合物包含耗損CD4+T細(xì)胞的化合物，而另一種組合物包含一種或多種試劑。
當(dāng)用于細(xì)胞、組織或生物時，術(shù)語“接觸”和“暴露”在此處是指這樣一種過程，借助于該過程，耗損CD4+T細(xì)胞的化合物和/或其它試劑(例如化療試劑或放療試劑)的治療構(gòu)建物被遞送于靶細(xì)胞，或被直接并列置于所述靶細(xì)胞、組織或生物中。為了殺死細(xì)胞或使細(xì)胞靜息，耗損CD4+T細(xì)胞的化合物和/或額外試劑以有效殺死所述細(xì)胞或防止它們分裂的組合量遞送給一種或多種細(xì)胞。
耗損CD4+T細(xì)胞的化合物可以在其它試劑之前、與其同時和/或在其之后施用，其間的時間間隔為數(shù)分鐘至數(shù)星期。在一些實施方案中，耗損CD4+T細(xì)胞的化合物與其它試劑分開施用于細(xì)胞、組織或生物，在這樣的實施方案中，通常應(yīng)該保證每次遞送之間的時間間隔不應(yīng)太長，從而使得耗損CD4+T細(xì)胞的化合物和試劑仍能對所述細(xì)胞、組織或生物施加有利的組合效果。例如，在這樣的情況下，設(shè)想可以將兩個、三個、四個或更多特征(modality)和耗損CD4+T細(xì)胞的化合物幾乎同時(即少于大約1分鐘)與所述細(xì)胞、組織或生物接觸。在其它方面，一種或多種試劑可以和耗損CD4+T細(xì)胞的化合物幾乎同時施用，或在施用耗損CD4+T細(xì)胞的化合物之前和/或之后大約1分鐘、大約5分鐘、大約10分鐘、大約20分鐘、大約30分鐘、大約45分鐘、大約60分鐘、大約2小時、大約3小時、大約4小時、大約5小時、大約6小時、大約7小時、大約8小時、大約9小時、大約10小時、大約11小時、大約12小時、大約13小時、大約14小時、大約15小時、大約16小時、大約17小時、大約18小時、大約19小時、大約20小時、大約21小時、大約22小時、大約22小時、大約23小時、大約24小時、大約25小時、大約26小時、大約27小時、大約28小時、大約29小時、大約30小時、大約31小時、大約32小時、大約33小時、大約34小時、大約35小時、大約36小時、大約37小時、大約38小時、大約39小時、大約40小時、大約41小時、大約42小時、大約43小時、大約44小時、大約45小時、大約46小時、大約47小時、大約48小時、大約1天、大約2天、大約3天、大約4天、大約5天、大約6天、大約7天、大約8天、大約9天、大約10天、大約11天、大約12天、大約13天、大約14天、大約15天、大約16天、大約17天、大約18天、大約19天、大約20天、大約21天、大約1周、大約2周、大約3周、大約4周、大約5周、大約6周、大約7周o r大約8周或更多周之內(nèi)施用，或在由這些時間所導(dǎo)出的任何時間范圍內(nèi)施用。
可以使用耗損CD4+T細(xì)胞的化合物和一種或多種試劑的不同組合方案。此種組合的非限制性例子如下所示，其中含有耗損CD4+T細(xì)胞的化合物的組合物為“A”，試劑為“B”A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/BB/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/AB/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A含有耗損CD4+T細(xì)胞的化合物的組合物向細(xì)胞、組織或生物的施用可以遵循施用化療劑的一般方案進(jìn)行，同時考慮毒性(如果有毒性的話)。預(yù)期，如果必要的話，應(yīng)該重復(fù)治療周期。在特定的實施方案中，設(shè)想多種額外試劑可以以與本發(fā)明的任何組合應(yīng)用。LIGHT治療以及LIGHT治療與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑治療的聯(lián)合
LIGHT是一個新發(fā)現(xiàn)的作用于免疫調(diào)節(jié)的基因。我們所進(jìn)行的突變能夠提高其在細(xì)胞表面表達(dá)的穩(wěn)定性從而更好地刺激免疫反應(yīng)。對LIGHT的四個氨基酸的突變阻止了該蛋白質(zhì)的降解。我們關(guān)于采用LIGHT將腫瘤組織轉(zhuǎn)化為淋巴組織的發(fā)明包括了一個新的基因免疫治療的思想和一個新的突變基因。
我們已經(jīng)明確一種新的對腫瘤的免疫治療方法通過在腫瘤組織中誘發(fā)淋巴組織使淋巴細(xì)胞能夠直接接觸腫瘤細(xì)胞，在腫瘤內(nèi)部誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)從而根除腫瘤。LIGHT是作為基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的淋巴毒受體和T細(xì)胞表達(dá)的HVEM的配合體。通過將突變的LIGHT引入腫瘤組織之中，將誘發(fā)出高水平的化學(xué)因子和粘附分子，并且伴隨大量的未活化T淋巴細(xì)胞的津潤。LIGHT的突變體阻止了蛋白酶對其的降解，使得LIGH能夠在腫瘤細(xì)胞的表面完整表達(dá)。LIGHT對免疫反應(yīng)的協(xié)同激活活性將對腫瘤特異的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的選擇性激活有極大的幫助，從而有益于清除現(xiàn)存的高進(jìn)行性的原發(fā)腫瘤和其他衍生部位的腫瘤。表達(dá)LIGHT的腫瘤細(xì)胞可以作為臨床相關(guān)的治療性疫苗，可用于根除已存的原發(fā)腫瘤。表達(dá)LIGHT的腫瘤細(xì)胞作為臨床相關(guān)的治療性疫苗將在腫瘤內(nèi)部吸引并活化原始淋巴細(xì)胞，從而產(chǎn)生更多的抗腫瘤淋巴細(xì)胞用于清除腫瘤。我們的研究已經(jīng)證明腫瘤壞死因子超家族(TNFSF14)和LIGHT能夠在腫瘤內(nèi)部的基質(zhì)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表面形成受體信號并吸引腫瘤特異性的T細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)LIGHT轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞能夠通過協(xié)同其兩類受體的新的作用而增強對已存原發(fā)腫瘤的免疫清除反應(yīng)。我們的研究數(shù)據(jù)表明腫瘤組織表達(dá)的LIGHT具有更強的激發(fā)對原發(fā)進(jìn)行性腫瘤的清除作用，強于其他細(xì)胞因子和協(xié)同刺激分子的激發(fā)作用(Nature Immunology，Vol.5，No.2，2004年2月，p.141-149)。到目前為止，象LIGHT這樣，有如此雙重的征召和激活T細(xì)胞的效能的分子尚未見有任何其他的報道。這樣的特性使我們能夠開發(fā)出一種全新的對腫瘤的免疫治療方法。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述LIGHT是人類LIGHT。在另一個優(yōu)選實施方案中，LIGHT是突變LIGHT。特別優(yōu)選的是，所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是不含LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EQLI(對于人而言)的突變LIGHT。在另一個實施方案中，所述突變LIGHT具有細(xì)胞外域氨基酸序列和標(biāo)簽序列(例如便于純化的標(biāo)簽)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。LIGHT氨基酸序列以及氨基酸殘基編號參見Nature Immunology，Vol.5，No.2，2004年2月，p.141-149。
LIGHT或者突變體LIGHT的給藥優(yōu)選是通過各種病毒投送系統(tǒng)或表達(dá)LIGHT的腫瘤細(xì)胞來進(jìn)行的。具體地，包括向癌癥患者給予包含并表達(dá)編碼突變LIGHT的核酸的重組病毒(優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組病毒的藥用組合物；或者向癌癥患者給予包含并表達(dá)編碼突變LIGHT的核酸的腫瘤細(xì)胞或者腫瘤(優(yōu)選地，該腫瘤細(xì)胞或者腫瘤還包含并表達(dá)腫瘤抗原)或者包含這種腫瘤細(xì)胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。在一個優(yōu)選實施方案中，所述給予是向腫瘤內(nèi)給予。特別是，將上述重組病毒或者腫瘤細(xì)胞注射到腫瘤原發(fā)部位優(yōu)選的病毒投送系統(tǒng)包括，但不限于，重組的腺病毒和禽痘病毒(fowlpox virus)等其他病毒。在特別優(yōu)選的實施方案中，突變體LIGHT通過重組的腺病毒和禽痘病毒來給藥。如果原發(fā)腫瘤細(xì)胞在1-2月內(nèi)未能被清除，腫瘤將被手術(shù)切除或放射照射。我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)過LIGHT的治療處理，動物體建立了強烈的腫瘤免疫記憶，能夠清除末梢部位的腫瘤。因而我們預(yù)計應(yīng)該對擴散轉(zhuǎn)移部位的腫瘤有同樣的清除作用。
使用重組的腺病毒和禽痘病毒來給藥具有特別的優(yōu)點，例如，效率更高和更安全。由于易于生產(chǎn)而且產(chǎn)量高，重組腺病毒已經(jīng)廣泛用于人和動物實驗，但是大多數(shù)患者可能會有抗腺病毒抗體，它們可能會迅速中和注入的腺病毒。還不清楚腫瘤內(nèi)注射腺病毒是否會避免這種快速清除。很少有患者在血清中有抗禽痘病毒抗體。因此，這種重組病毒的持續(xù)是一個潛在優(yōu)點。但是，產(chǎn)生高滴度禽痘病毒是困難的。有可能能夠初始使用重組腺病毒、然后用禽痘病毒治療患者，以降低宿主對清除病毒的反應(yīng)。我們的初步結(jié)果顯示，使用帶有重組LIGHT的5×1010病毒顆粒在腫瘤內(nèi)注射到已建立的Ag104Ld腫瘤中，導(dǎo)致局部和遠(yuǎn)處腫瘤的排斥(5/5)，而對照病毒(沒有LIGHT)沒有明顯保護(hù)(5只小鼠中0只被排斥)。
CD4+CD25+T細(xì)胞是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，它們能夠抑制效應(yīng)T細(xì)胞殺滅腫瘤細(xì)胞的能力。耗損調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特別是CD4+CD25+細(xì)胞能夠增強抗腫瘤活性。將在腫瘤內(nèi)給予LIGHT和耗損調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相結(jié)合，是一種新的免疫治療的有效治療方法。
升高的CD4+調(diào)控性T細(xì)胞水平是診斷和預(yù)后的指示劑本發(fā)明可以用作癌癥的診斷和/或預(yù)后指示劑，以及癌癥預(yù)后的指示劑。例如，腫瘤中升高的CD4+T細(xì)胞可能表明某些癌癥患者的較差的預(yù)后。此外，本發(fā)明也可以用于確定潛在新治療劑對癌癥的功效，并且本發(fā)明也可以用于藥物開發(fā)。例如，導(dǎo)致癌變腫瘤中CD4+T細(xì)胞減少的化合物可能表明該化合物具有作為癌癥治療劑的顯著潛力。在其它情況下，使用細(xì)胞系的體外測試法可以用于確定化合物對CD4+T細(xì)胞的作用。在某些實施方案中，測試化合物對動物或人類腫瘤中CD4+T細(xì)胞的減少可能表明改善的功效。此外，本發(fā)明也提供了用于確定受試者是否應(yīng)該接受導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞減少的治療有效量的藥物的方法。例如，CD4+T細(xì)胞數(shù)量增加的患者尤其能從導(dǎo)致受試者腫瘤位點CD4+T減少的療法中得到益處。
一旦患者被診斷患有癌癥，我們將檢查腫瘤樣品的活體解剖中的調(diào)控性CD4+T細(xì)胞。如果CD4占據(jù)統(tǒng)治地位，患者將用抗-CD4抗體局部治療。如果非常難以局部注射腫瘤，則可以進(jìn)行全身性注射。如果滲透性淋巴細(xì)胞是有限的，則50ul至100ul ad-LIGHT(1-5×1010vp)將被注射入腫瘤組織，并在3天后使用抗-CD4抗體，以允許在其后的兩周中產(chǎn)生強免疫應(yīng)答(進(jìn)行或不進(jìn)行組合治療)?；蛘?，抗-CD4與抗-CD137或其它CD8刺激物聯(lián)合使用。
耗損CD4+T細(xì)胞和/或治療癌癥的化合物和組合的體外證實本領(lǐng)域普通技術(shù)人員得到和體外測試大量化合物或化合物組合，它們能耗損CD4+T細(xì)胞、刺激對抗癌癥的免疫應(yīng)答、和/或產(chǎn)生在本發(fā)明中有用的任何其它效果。此類測試可以用如以下實施例所述和/或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的那些方法來進(jìn)行。
簡言之，通過用人類CD4肽或蛋白質(zhì)免疫小鼠可以得到和測試候選化合物體外耗損CD4+T細(xì)胞和/或治療癌癥的能力?？蛇x擇地，我們從非盈利性機構(gòu)American Tissue Culture Center獲得了含有抗人類CD4抗體地小鼠雜交瘤。如早前所述，通過用人類免疫球蛋白基因來替換CD4基因可以得到人源化的CD4。另一種選擇是，人源化的抗-CD4抗體可以從一些私人公司獲得。
一旦確定了候選化合物或組合在體外顯示可用于本發(fā)明，則通常用下述的體內(nèi)方法來測試它們。
耗損CD4+T細(xì)胞的化合物的體內(nèi)證實可以獲得并體內(nèi)測試大量具有如下特征的化合物或化合物組合耗損CD4+T細(xì)胞；刺激對抗癌癥的免疫應(yīng)答；和/或?qū)е氯魏慰捎糜诒景l(fā)明的其它效果。通常，只有在用如上所述的體外方法顯示某一特定候選物或組合具有希望時，才進(jìn)行此類體內(nèi)測試?？梢杂妹枋鲇谙旅鎸嵤├械暮?或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的那些方法來進(jìn)行此類測試。
簡而言之，將獲得候選物質(zhì)，并測試其體內(nèi)耗損CD4+T細(xì)胞和/或治療癌癥的能力。
一旦候選化合物或組合在體內(nèi)顯示可用于本發(fā)明，其通常作為下述臨床試驗的主題。
因此，本發(fā)明還涉及用于篩選或者測試癌癥治療劑的方法，包括通過體內(nèi)或者體外實驗測試候選物質(zhì)是否能夠耗損調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
臨床試驗使用體外和體內(nèi)方法，例如那些此處所述的和/或本領(lǐng)域已知的方法，鑒定有前途的化合物或組合后，此類化合物和組合可以稱為下面所一般描述的臨床試驗的主題。
一旦患者被診斷患有癌癥和潛在的轉(zhuǎn)移，我們將檢查腫瘤樣品的活體解剖中的調(diào)控性CD4+T細(xì)胞。如果CD4占據(jù)統(tǒng)治地位，患者將用抗CD4抗體局部治療。如果非常難以局部注射腫瘤，甚至難以用放射干預(yù)(指導(dǎo))，則可以進(jìn)行全身性注射。如果滲透性淋巴細(xì)胞是有限的，則50ul至100ul ad-LIGHT(1-5×1010vp)將被注射入腫瘤組織，并在3天后使用抗CD4抗體，以允許在其后的兩周中產(chǎn)生強免疫應(yīng)答(進(jìn)行或不進(jìn)行組合治療)。或者，抗-CD4與抗-CD137或其它CD8刺激物聯(lián)合使用。
發(fā)明的有益效果在發(fā)明人的實驗中，用突變LIGHT治療導(dǎo)致對腫瘤的免疫力提高500倍。耗損調(diào)節(jié)性T細(xì)胞提供另外的增強效果，這種治療已經(jīng)顯示對已確立腫瘤非常有效(增加100-500倍)。將在腫瘤內(nèi)給予LIGHT和耗損調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相結(jié)合，提供了更好的效果。
實施例引入下面實施例來證明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將意識到，下面實施例所公開的技術(shù)代表本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的用于很好實施本發(fā)明的技術(shù)，因此可以認(rèn)為它們構(gòu)成了實施本發(fā)明的優(yōu)選方式。但是，在閱讀本發(fā)明公開內(nèi)容后，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也應(yīng)認(rèn)識到，可以對所公開的具體實施方案進(jìn)行許多改變而仍能得到相似的結(jié)果，但又不背離本發(fā)明的精神和范圍。
實施例1材料和方法小鼠和細(xì)胞系。5-8周大小的雌性C3H×B6F1(C3B6F1)和C3H小鼠購自US National Cancer Institute的Frederick CancerResearch Facility，并被飼養(yǎng)于芝加哥大學(xué)的不含病原體的特定設(shè)備中。根據(jù)學(xué)院和National Institutes of Health(NIH)的規(guī)定對動物進(jìn)行照料和研究，并經(jīng)芝加哥大學(xué)的動物使用委員會的批準(zhǔn)。已經(jīng)描述了表達(dá)鼠H-2Ld(AG104-Ld)的Ag104細(xì)胞系(Wang，2001)和Ag104纖維肉瘤(Wick等人，1997)。
組織學(xué)和免疫學(xué)。用于組織學(xué)檢查的人類腫瘤組織于10％緩沖的中性福爾馬林中固定，石蠟包埋，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法用蘇木精和曙紅(H&E)染色，或根據(jù)制造商的說明用特異于CD4(NovocastraLaboratories，UK)和CD8(DAKO，CA)的單克隆抗體染色。分別通過使用DAB(Sigma-Aldrich，MO)的過氧化物酶技術(shù)或使用Vector Blue(Vector，CA)的APAAP技術(shù)來揭示抗-CD4或抗-CD8抗體的結(jié)合。對于乳腺癌樣本，在一個隨機選取的40倍高被視野中對CD4+和CD8+細(xì)胞進(jìn)行手工計數(shù)。
測量脾和腫瘤中的細(xì)胞因子。根據(jù)描述(Janssen等人，2003)，本發(fā)明人制備了腫瘤和脾的勻漿。簡而言之，收集相當(dāng)數(shù)量的腫瘤或脾組織，稱重，并在含有蛋白酶抑制劑的PBS中進(jìn)行勻漿，通過離心收集上清液。根據(jù)制造商的說明，在配有細(xì)胞QuestPro和CBA軟件的FACSCaliber血細(xì)胞計數(shù)器(BD Pharmingen)中使用細(xì)胞計數(shù)珠陣列試劑盒(CBA)來定量上清液中的細(xì)胞因子數(shù)量。
流式細(xì)胞分析。使用異硫氰酸熒光素(FITC)綴合的、藻紅蛋白(PE)綴合的、Cy-鉻綴合的或生物綴合的針對小鼠CD45RB、CD4、CD8、CD25和I FN的抗體(均來自BD Pharmingen)進(jìn)行FACS分析。鏈霉親合素-Cy-鉻綴合物來自BD Pharmingen；針對2C TCR的生物素綴合的克隆型抗體(1B2)細(xì)胞染色按照所描述的進(jìn)行(Sun和Bevan，2003)。對于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，在Brefeldin A(Sigma-Aldrich)的存在下，用PMA(50ng/ml，Sigma-Aldrich)和離子霉素(500ng/ml，Sigma-Aldrich)對純化自腫瘤組織的T細(xì)胞再刺激4小時。對于CFSE-標(biāo)記的2C T細(xì)胞的分析，用生物素化的1B2抗體對分離的腫瘤或脾單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行染色，洗滌，并用PE偶聯(lián)的抗-CD8和CyC偶聯(lián)的鏈霉親合素的混合物染色。用FlowJo軟件(BD Pharmingen)分析FACS數(shù)據(jù)。
細(xì)胞分離和體外檢測。為了從腫瘤組織中分離CD4+T細(xì)胞，先使小鼠放血以減少血液對腫瘤組織的污染。收集腫瘤組織，再PBS中洗滌，切成片，并在37℃搖床中重懸于Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基25分鐘，所述培養(yǎng)基添加了2％胎牛血清和1.5mg/ml膠原酶D(膠原酶D溶液)。25分鐘后收集細(xì)胞懸浮液，在膠原酶D溶液中對細(xì)胞塊再消化25分鐘直到所有的腫瘤組織分解成單細(xì)胞懸浮液。使用AutoMACS系統(tǒng)(Miltenyi Biotech，CA)，用生物素綴合的Thy-1.2抗體接著用抗生物素磁珠從所述單細(xì)胞懸浮液中富集腫瘤浸潤型T細(xì)胞。用PE綴合的抗-CD4對富集的腫瘤浸潤型T細(xì)胞進(jìn)行染色，并在MoFlo上用FACS分選為CD4+群體。通過AutoMACS系統(tǒng)(Miltenyi Biotech)，使用CD4+T細(xì)胞或CD4+CD25+調(diào)控性T細(xì)胞分離磁珠系統(tǒng)(Miltenyi Biotech)分別從脾單細(xì)胞懸浮液中純化CD4+或CD4+CD25-以及CD4+CD25-細(xì)胞。對于所有的細(xì)胞分離，通常能得到超過90％純度的所需群體。對于T細(xì)胞共刺激檢測，發(fā)明人用50μl2μg/ml的抗-CD3抗體包被96孔板過夜。接著用PBS洗滌所述板，將6×104個純化的CD4+CD25-T細(xì)胞培養(yǎng)于每孔中，其中添加或不添加分離自帶有腫瘤的小鼠的脾或腫瘤組織的6×104個CD4+T細(xì)胞。在所有檢測中，于3天培養(yǎng)期的最后24小時向每孔加入1μCi的[3H]胸苷，從而估算T細(xì)胞增殖。在TopCount微量板閃爍計數(shù)器(Packard，MA)中測量[3H]胸苷的整合。
2C T細(xì)胞的適應(yīng)性轉(zhuǎn)移。本發(fā)明人首先通過將106MC57-SIY個腫瘤細(xì)胞皮下接種于B6/Rag-1-/-背景的2C小鼠(2C小鼠)的多個位點來激活2C T細(xì)胞(Sun和Bevan，2003)。發(fā)明人接著從這些被攻擊的2C小鼠中分離淋巴結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞，并在腫瘤接種后5天用CD8+T細(xì)胞富集試劑盒(Miltenyi Biotec)對CD8+T細(xì)胞進(jìn)行負(fù)選擇。當(dāng)分析時，大部分2C細(xì)胞表達(dá)CD44高CD62L低表型。按照所描述的(Sun和Bevan，2003)，接著用CFSE對這些2C T細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。發(fā)明人將3×106個CFSE-標(biāo)記的T細(xì)胞(體積0.2-ml)靜脈內(nèi)注射于帶有腫瘤的小鼠的眼窩后血管叢(retro-orbital plexus)。轉(zhuǎn)移后48小時從脾和腫瘤中分離細(xì)胞，并進(jìn)行FACS分析。
體內(nèi)細(xì)胞耗損和細(xì)胞因子阻斷。按照標(biāo)準(zhǔn)程序(Sun和Bevan，2003)，使用針對CD4+細(xì)胞的mAb GK1.5、針對CD8+細(xì)胞的mAb 2.34和針對CD25+細(xì)胞的PC61系統(tǒng)性耗損小鼠中的淋巴細(xì)胞亞類。用流式細(xì)胞術(shù)對脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞的檢查顯示耗損的CD4+或CD8+亞類占總淋巴細(xì)胞的不到0.5％，其它亞類的水平正常。用溶于50μl PBS的12.5-50μg GK1.5進(jìn)行了腫瘤內(nèi)CD4+細(xì)胞耗損。為了阻斷IL-10或TGF-β，在腫瘤攻擊前1天以及腫瘤攻擊后7天將100μg抗-IL-10受體或250μg抗-TGF-β抗體經(jīng)腹膜內(nèi)(i.p.)注射入小鼠。腫瘤攻擊后7天，將100μg脂多糖(LPS)或/和拮抗性抗-CD40抗體經(jīng)腹膜內(nèi)給予小鼠。
實時定量性RT-PCR檢測。按照描述(Shedlock和Shen，2003)，對foxp-3進(jìn)行實時定量性反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測。簡而言之，從腫瘤中分離總RNA，使用First Strand cDNA Synthesis Kit(Amersham Pharmacia，NJ)將5μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成互補。在CepheidSmartCycler實時熱循環(huán)儀(Cepheid，CA)上進(jìn)行實時定量性PCR分析。根據(jù)制造商的說明(PE Applied Biosystems，MA)，用含有AmpliTaqGold DNA Polymerase的TaqMan Universal PCR master混合物擴增每一cDNA樣品中的foxp-3和GAPDH。發(fā)明人利用比較型CT(擴增曲線和閾值的交點處的閾值循環(huán)數(shù)目)方法確定了目標(biāo)基因的濃度，并將數(shù)值對內(nèi)部GAPDH對照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。用于foxp-3的引物序列為5′-CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3′(正向引物)和5′-TTCTCACAACCAGGCCACTTG-3′(反向引物)，用于FOXP-3的探針為5′-ATCCTACCCACTGCTGGCAAATGGAGTC-3′。
實施例2
耗損CD4+T細(xì)胞導(dǎo)致癌腫瘤的破壞在人患者中CD4+T細(xì)胞浸潤侵襲性乳腺癌。人類癌癥常常具有抗原性，但令人費解的是大多數(shù)人類癌癥不能誘導(dǎo)排斥，甚至在淋巴細(xì)胞顯著浸潤腫瘤組織時也是如此(Rosenberg，1999；Beck-Engeser等，2001)。為了研究浸潤腫瘤的淋巴細(xì)胞的狀態(tài)和性質(zhì)，本發(fā)明人檢查了幾種人類癌癥組織，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和黑素瘤，并觀察到常常存在顯著的浸潤腫瘤的淋巴細(xì)胞。為了進(jìn)一步分析何種類型的T淋巴細(xì)胞浸潤腫瘤組織，本發(fā)明人用抗-CD4和抗-CD8抗體染色乳腺癌樣本并發(fā)現(xiàn)不同程度的CD8+和CD4+T細(xì)胞浸潤(圖1a-d)。令人感興趣的是，在本發(fā)明人檢查的乳腺癌樣本中，本發(fā)明人觀察到在腫瘤進(jìn)展的早期非常少的CD4+T細(xì)胞浸潤乳腺癌組織。然而，隨著腫瘤發(fā)展，腫瘤內(nèi)部的CD4+T細(xì)胞群體急劇增加。為了驗證這一觀察結(jié)果，本發(fā)明人計數(shù)了十個早期乳腺癌組織、原位乳腺癌相對于十個晚期侵襲性乳腺癌組織中存在的CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+T細(xì)胞比例急劇增加(圖1e).本發(fā)明人還觀察到CD4+T細(xì)胞常常與CD8+T細(xì)胞緊密接觸(圖1b和d)?？紤]到這些癌癥的漸進(jìn)性質(zhì)，本發(fā)明人推測缺少對癌癥的免疫排斥可能并非由弱免疫識別引起而是由異常免疫應(yīng)答引起。
強抗原不阻礙腫瘤生長。由于在研究腫瘤浸潤性CD4+T細(xì)胞體內(nèi)對于人類癌癥的基本作用方面存在的局限性，本發(fā)明人開發(fā)了一種小鼠腫瘤模型，該模型與具有一定CD4+及CD8+T細(xì)胞浸潤的人類癌癥極為相似。Ag104是一種在C3H小鼠中自發(fā)形成的低分化實體瘤，其具有高度的進(jìn)行性、差的免疫原性并對免疫治療具有抗性(Belkaid等，2002；Wang，2001；Dudley等，2002)。當(dāng)接種少至104個細(xì)胞時，Ag104在C3H和C3B6F1小鼠中均100％生長。導(dǎo)致在免疫活性同基因野生型小鼠體內(nèi)快速生長的該腫瘤的低免疫原性，可能由腫瘤抗原的弱表達(dá)或者不表達(dá)所致。為了排除這種解釋，本發(fā)明人用編碼Ld抗原(一種強抗原)的基因轉(zhuǎn)染Ag 104腫瘤細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞系體外表達(dá)高水平的Ld。出乎意料地，表達(dá)Ld的Ag104腫瘤(Ag104Ld)在104低劑量時與親本腫瘤以相似的動力學(xué)方式生長(圖2a)。據(jù)報道，可以選擇抗原丟失的變體來避免免疫識別(Pardoll，2003)。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，分離自帶有腫瘤的小鼠的Ag104Ld腫瘤細(xì)胞與注射前的細(xì)胞表達(dá)相當(dāng)水平的Ld(數(shù)據(jù)未顯示)。從該研究，本發(fā)明人得出這樣的結(jié)論抗原性腫瘤可以在不喪失其腫瘤抗原的情況下進(jìn)展。因此，由Ag104Ld腫瘤在免疫活性同基因野生型小鼠體內(nèi)的快速生長指示的該腫瘤的弱免疫原性，不可能由I型MHC的低表達(dá)或者抗原的丟失引起。
抗原Ld不阻礙腫瘤生長的一個原因可能是該抗原被免疫系統(tǒng)所忽視并且從未被免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)。為了檢測此可能性，本發(fā)明人在接種Ag104Ld腫瘤后20天通過手術(shù)除去該腫瘤，然后在手術(shù)后3周用更高劑量的腫瘤細(xì)胞再次攻擊小鼠。令人驚奇的是，所有這些小鼠均排斥第二次腫瘤攻擊，而幼稚小鼠卻死于腫瘤負(fù)載(表1)。該結(jié)果說明，T細(xì)胞被Ld抗原致敏，并且在手術(shù)除去腫瘤后，這些T細(xì)胞能夠發(fā)展成記憶細(xì)胞并賦予抗第二次腫瘤攻擊的保護(hù)作用。本發(fā)明人能夠證明，這些記憶T細(xì)胞主要是Ld特異性的，因為這些小鼠不能排斥親本腫瘤Ag104(表1)。這些結(jié)果提示我們，抗原特異性T細(xì)胞確實存在，但是其在帶有腫瘤的小鼠中不能適當(dāng)?shù)匕l(fā)揮功能。這提出了一種可能性Ag104Ld腫瘤的弱免疫原性可能不是由弱免疫識別引起而是由腫瘤存在時，尤其是腫瘤微環(huán)境中的異常免疫應(yīng)答引起的。
CD4+CD25+T細(xì)胞在腫瘤內(nèi)部聚積。為了研究甚至在免疫原性抗原存在的情況下腫瘤排斥仍然受損的原因，本發(fā)明人首先在動物模型中檢查了浸潤腫瘤的淋巴細(xì)胞(TIL)。免疫組織化學(xué)染色揭示，Ag104Ld腫瘤組織被CD4+和CD8+細(xì)胞浸潤，這些細(xì)胞以在人類腫瘤組織中看到的相似方式共同定位。觀察到非常少的浸潤腫瘤的DX5+NK或NK T細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。令人驚奇的是，聚積在腫瘤中的淋巴細(xì)胞主要由CD4+CD25+T細(xì)胞亞群組成(圖2b)。本發(fā)明人然后在腫瘤攻擊后第0、7或16天比較了脾、引流淋巴結(jié)(draining lymph node，DLN)和腫瘤中CD4+CD25+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，隨著時間推移，腫瘤內(nèi)部的CD4+CD25+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)急劇增加，而在脾和DLN中其保持恒定(圖2b)。這些數(shù)據(jù)表明，在效應(yīng)部位而不是在淋巴器官中存在增加百分?jǐn)?shù)的CD4+CD25+T細(xì)胞。這些CD4+CD25+T細(xì)胞是CD45RBlow表型的(FIG.2c)，這與對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的觀察結(jié)果一致(Golgher等，2002)。FOXP3是對小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化和功能關(guān)鍵的forkhead/winged螺旋轉(zhuǎn)錄因子基因(Wang等，2002；van Elsas等，2001；Dieckmann等，2001)。實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)證明，與從帶有腫瘤的小鼠的脾臟分離的CD4+T細(xì)胞或者從幼稚小鼠的脾臟分離的CD4+CD25-T細(xì)胞相比，從該腫瘤分離的CD4+T細(xì)胞中FOXP3 mRNA的表達(dá)強得多(FIG.2d)。這些觀察結(jié)果提出了這種可能性，即在腫瘤發(fā)展過程中，積累構(gòu)成效應(yīng)部位70％CD4+T細(xì)胞的CD4+CD25+細(xì)胞抑制局部免疫應(yīng)當(dāng)。本發(fā)明人推測，癌癥免疫原性差可能是由于在腫瘤環(huán)境中積累的CD4+CD25+T細(xì)胞產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)機制引起的。
CD4+CD25+T細(xì)胞抑制抗癌免疫。為了檢查腫瘤浸潤CD4+CD25+T細(xì)胞是否抑制體外T細(xì)胞應(yīng)答，本發(fā)明人從已經(jīng)在C3B6F1小鼠中建立20天的腫瘤組織分離CD4+T細(xì)胞，并在最佳劑量平板結(jié)合的刺激性抗CD3抗體(2μg/ml)存在的情況下將它們與從幼稚C3B6F1小鼠獲得的純化CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這些腫瘤浸潤CD4+T細(xì)胞的確顯著抑制通過3H摻入測量的CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖，而從帶有腫瘤的小鼠的脾臟分離的CD4+T細(xì)胞不產(chǎn)生這種抑制(FIG.2e)。因為CD4+和CD8+細(xì)胞能夠在T細(xì)胞活化的早期表達(dá)CD25，所以產(chǎn)生了在體內(nèi)耗損CD25+細(xì)胞是否會消除將被激活的CD8+T細(xì)胞的疑問。但是，發(fā)明人觀察到，在腫瘤攻擊后的2周，在脾臟和腫瘤中大部分CD8+T細(xì)胞是CD25-(FIG.2f)。耗損CD25+細(xì)胞沒有減小CD8+群體，因為僅僅很少的CD8+細(xì)胞表達(dá)CD25(FIG.2f)。在腫瘤環(huán)境內(nèi)部，優(yōu)先積累的CD4+CD25+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞都沒有表達(dá)CD25。為了直接研究CD4+T細(xì)胞在體內(nèi)腫瘤免疫中的根本作用，發(fā)明人耗損了CD4+細(xì)胞，然后觀察腫瘤生長。驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CD4+細(xì)胞被耗損時，高度血管化和低免疫原性的Ag104Ld腫瘤被迅速排斥(FIG.2g andTable 2)。CD4+細(xì)胞耗損產(chǎn)生的腫瘤排斥是CD8+細(xì)胞依賴性的，因為腫瘤在沒有CD4+細(xì)胞、也沒有CD8+細(xì)胞時不受控制地生長(Table2)。NK1.1+NK and NKT細(xì)胞的耗損不引起腫瘤排斥(Table 2)。為了證實表達(dá)CD25的CD4+T細(xì)胞亞群導(dǎo)致了體內(nèi)抗腫瘤免疫的抑制，發(fā)明人用抗CD25抗體處理帶腫瘤的小鼠兩周。在腫瘤攻擊后14天用該抗體耗損CD25+細(xì)胞顯著地抑制腫瘤的生長(FIG.2h)。這些數(shù)據(jù)表明，在抗腫瘤免疫應(yīng)答的后期，主要是CD25+T細(xì)胞起抑制作用。
即使在不存在抗原Ld的情況下，耗損CD4+細(xì)胞也允許50％小鼠完全排斥親本Ag104腫瘤(表1)，而且剩下的50％小鼠延遲了腫瘤生長動力學(xué)(數(shù)據(jù)未顯示)。這些觀察結(jié)果提示，一旦解除CD4介導(dǎo)的抑制，其它腫瘤抗原也可能誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。為了測試排斥是否導(dǎo)致針對其它腫瘤抗原的保護(hù)性免疫，首先接種Ag104Ldtumor細(xì)胞，14天后耗損CD4+細(xì)胞。耗損CD4+細(xì)胞引起的腫瘤排斥不僅針對Ag104Ldtumor細(xì)胞的后來攻擊產(chǎn)生保護(hù)作用，而且針對Ag104tumor細(xì)胞的后來攻擊產(chǎn)生保護(hù)作用(表1)。這些數(shù)據(jù)表明，抑制性CD4+細(xì)胞的去除使得擴大的CD8+細(xì)胞群體參與保護(hù)性免疫。
調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在效應(yīng)期抑制CD8+T 細(xì)胞。為了測試CD4+細(xì)胞是否在致敏期或效應(yīng)期抑制CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，本發(fā)明人在腫瘤攻擊前3天或腫瘤攻擊后20天耗損CD4+細(xì)胞。對外周血的FACS分析證實，每一處理均在頭20天或腫瘤攻擊后20-40天消除CD4+細(xì)胞。將CD4耗損限制在頭20天，或者換言之，在腫瘤生長的致敏期，導(dǎo)致延遲的但進(jìn)行性的腫瘤發(fā)育(表2)。在效應(yīng)期，即腫瘤攻擊后20天——建立的腫瘤達(dá)到500mm3以上平均大小時進(jìn)行CD4耗損，導(dǎo)致完全的腫瘤排斥(表2)。在腫瘤進(jìn)展的整個持續(xù)期耗損CD4+細(xì)胞時，也觀察到排斥(表2)。在腫瘤攻擊前3天和腫瘤攻擊后10天注射抗-CD4抗體。本發(fā)明人必需看到可能導(dǎo)致此類大體積、充分血管化的高度進(jìn)行性腫瘤完全被破壞的任何其它處理。這些數(shù)據(jù)提示，在免疫應(yīng)答晚期而不是在早期缺少CD4+細(xì)胞對于增強CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫更為關(guān)鍵。
如上述，CD4耗損介導(dǎo)的腫瘤排斥依賴于CD8+T細(xì)胞，這提示在腫瘤內(nèi)部CD4+細(xì)胞可能抑制CD8+細(xì)胞。本發(fā)明仍接著檢查了CD4+細(xì)胞如何抑制CD8+T細(xì)胞的功能。首先，發(fā)明人在CD4+耗損后檢測到腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞急劇增加(圖3a)并且檢測到CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生增加的IFN-γ(圖3b)。這提示，CD4+細(xì)胞可以抑制應(yīng)答腫瘤的CD8+細(xì)胞的擴增。為了檢測這一假說，本發(fā)明人將CFSE標(biāo)記的2C T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移至帶有Ag104Ld的C3B6F1小鼠中，其中所述2C T細(xì)胞在2C/Rag-1-/-小鼠中通過MC57-SIY腫瘤細(xì)胞(Sun和Bevasn，2003)激活。2C T細(xì)胞來源于T細(xì)胞受體(TCR)轉(zhuǎn)基因2C小鼠，其可以直接識別Ag104Ld上的Ld抗原。這些轉(zhuǎn)移的效應(yīng)2C T細(xì)胞表達(dá)高水平的CD44并下調(diào)CD62L的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。在CD4+T細(xì)胞耗損前，僅有少數(shù)的CFSE標(biāo)記的效應(yīng)2C細(xì)胞存在于腫瘤中，但在耗損后，觀察到該效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量和百分比急劇增加(圖3c)。更重要的是，這些2C T細(xì)胞主要在CD4+T細(xì)胞耗損后于效應(yīng)部位發(fā)生增殖，這提示抑制作用主要存在于局部腫瘤部位(圖3c)。因此，這些CD4+細(xì)胞在腫瘤部位抑制了CD8+T細(xì)胞增殖、成熟和擴張。
IL-10和TGF-β參與體內(nèi)的抑制機制。為了研究CD4+細(xì)胞抑制抗腫瘤免疫的機制，本發(fā)明人比較了CD4+細(xì)胞耗損前后脾和腫瘤中的細(xì)胞因子水平。在脾中，在存在CD4+細(xì)胞時或不存在CD4+細(xì)胞時進(jìn)行檢測，細(xì)胞因子水平?jīng)]有顯著差異(圖4a)。Th2細(xì)胞因子，IL-4和IL-5，在存在或缺少CD4+T細(xì)胞時于腫瘤部位沒有表現(xiàn)出顯著差異(圖4b)。然后，缺少CD4+T細(xì)胞時，腫瘤組織中的炎性細(xì)胞因子(包括IFN-γ，TNF，IL-6和MCP-1)相較于存在CD4+細(xì)胞時的水平急劇增加。在耗損CD4+細(xì)胞后，抗炎性細(xì)胞因子IL-10的水平也低的多(圖4b)。這些結(jié)果提示，CD4+細(xì)胞維持了抑制抗腫瘤免疫的抗炎性環(huán)境。
本發(fā)明人推測如果阻斷抗炎性細(xì)胞因子的作用可能促進(jìn)抗腫瘤免疫。事實上，在本發(fā)明人用抗-IL-10受體(IL-10R)抗體處理小鼠后，腫瘤生長被急劇抑制(圖4c)。用抗IL-10R抗體聯(lián)合炎性信號(如LPS)或抗-CD40抗體激動劑處理小鼠時，腫瘤生長進(jìn)一步收到抑制(圖4c)。TGF-β是可以抑制炎性反應(yīng)的另一種細(xì)胞因子。為了在模型中研究TGF-β在介導(dǎo)抗腫瘤免疫方面的作用，本發(fā)明人在用Ag104Ld腫瘤細(xì)胞進(jìn)行攻擊時阻斷了TGF-β。TGF-β阻斷后腫瘤被完全排斥(圖4d)。這些結(jié)果說明，腫瘤內(nèi)的抗炎性環(huán)境在防止腫瘤排斥方面是關(guān)鍵的。CD4+細(xì)胞表現(xiàn)出可以活躍地維持此抗炎性環(huán)境以抑制抗腫瘤免疫，由此促進(jìn)抗原性腫瘤生長。
在效應(yīng)部位耗損CD4+CD25+T細(xì)胞可以根除已經(jīng)建立的腫瘤。由于CD4+CD25+T細(xì)胞是腫瘤發(fā)展期間腫瘤內(nèi)的主要CD4+T細(xì)胞群體，故本發(fā)明人提出在腫瘤部位耗損CD4+細(xì)胞將足以實現(xiàn)腫瘤排斥。在帶有腫瘤的宿主中在腫瘤部分使用少量的抗CD4抗體選擇性地耗損CD4+細(xì)胞，可以有效地逆轉(zhuǎn)CD8+細(xì)胞對腫瘤的免疫耐受，并同時保持淋巴組織中有正常數(shù)量的CD4+細(xì)胞。為了確保在腫瘤建立后于效應(yīng)部位耗損CD4+抑制性細(xì)胞可以促進(jìn)抗腫瘤免疫，本發(fā)明人使用了低劑量的抗CD4抗體(10-15μg)進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射以保證在腫瘤內(nèi)而不是系統(tǒng)性地耗損CD4+T細(xì)胞(圖5a)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，接種腫瘤后14天于腫瘤內(nèi)耗損CD4+細(xì)胞快速地導(dǎo)致對充分建立的腫瘤的完全排斥作用(圖5b)。此結(jié)果證實，腫瘤內(nèi)CD4+抑制性細(xì)胞的耗損足以導(dǎo)致對已經(jīng)建立的腫瘤的排斥作用，并提示抗腫瘤CD8+T細(xì)胞的有效抑制作用主要發(fā)生在效應(yīng)部位并且是可以逆轉(zhuǎn)的。重要的是，局部處理可以成為可負(fù)擔(dān)的有效腫瘤免疫治療處理方法。
對弱腫瘤抗原的不良免疫應(yīng)答常常被認(rèn)為是免疫活性宿主中腫瘤進(jìn)行性生長的基礎(chǔ)，并被推測為成功免疫治療的主要障礙。在本研究中，本發(fā)明人將強Ld同種抗原引入小鼠Ag104纖維肉瘤細(xì)胞系中，該細(xì)胞系是一種可以在數(shù)周內(nèi)殺死宿主的、高度進(jìn)行性、侵襲性和血管化的腫瘤。然而，存在強抗原未能引起抗腫瘤免疫應(yīng)答以阻止或延遲腫瘤生長。在人和動物癌癥中一般可以觀察到淋巴細(xì)胞浸潤(Gilboa，1999；Clark等，1989；Clemente等，1996)，但是很少觀察到對癌癥的免疫排斥。在具有明顯T細(xì)胞浸潤的情況下，宿主不能根除腫瘤是一個一直未得以充分理解的令人困惑的現(xiàn)象。在動物模型中對TIL的更近觀察揭示，CD4+亞群CD4+CD25+T細(xì)胞選擇性地聚積在腫瘤內(nèi)并包括了所有TIL的大多數(shù)。本發(fā)明人還證實，在腫瘤進(jìn)展過程中，CD4+CD25+T細(xì)胞主要在腫瘤內(nèi)介導(dǎo)抑制性環(huán)境并廢除CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)功能。局部腫瘤內(nèi)耗損這些調(diào)節(jié)性T細(xì)胞使得腫瘤的免疫原性被暴露出來并逆轉(zhuǎn)CTL耐受性，導(dǎo)致對已經(jīng)充分建立的腫瘤的快速排斥作用。更重要的是，在本研究中，本發(fā)明人闡明了，T調(diào)節(jié)性細(xì)胞可以是一種重要的局部因子，其可以抑制針對強腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致癌癥在免疫活性宿主中進(jìn)行性生長。
對CD4+T細(xì)胞在腫瘤免疫中的作用已經(jīng)進(jìn)行廣泛研究(Liyanage等，2002)。研究表明CD4+T細(xì)胞在促進(jìn)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答(Woo等，2001；Woo等，2002；Wang等，2004)和發(fā)展CD8T細(xì)胞記憶(Yu等，2004；Ward等，1989；Shedlock and Shen，2003)中具有重要作用。在抗腫瘤免疫中，CD4+T細(xì)胞被證明對于維持過繼轉(zhuǎn)移CD8+T細(xì)胞的功能是重要的(Sun and Bevan，2003；Dudley等，2002；Wang等，2002)。在小鼠中耗損CD4+細(xì)胞顯著削弱粒細(xì)胞/巨嗜細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)疫苗/抗-CTLA4處理保護(hù)動物不被后續(xù)腫瘤攻擊的能力(vanElsas等，2001)。另一方面。最近的研究強烈支持這樣的觀點，即，CD4+細(xì)胞中的群體，CD4+CD25+T細(xì)胞，顯著限制疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答，并且在腫瘤攻擊之前抑制或者消除它們能夠顯著增強腫瘤免疫治療(Machiels等，2001；Sutmuller等，2001；Steitz等，2001；Yu等，2003；Houghton等，2001)。例如，在一項研究中，當(dāng)動物在腫瘤攻擊之前用anti-CD25抗體處理時，GM-CSF轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤疫苗與anti-CTLA4的結(jié)合更有效地消除已經(jīng)建立的腫瘤。(Yu等，2003)。盡管這些研究表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠抑制CD8+T細(xì)胞的初始致敏，但仍然普遍關(guān)注的是，在帶有腫瘤的宿主中耗損CD4+CD25+T細(xì)胞可能會無意中消除了CD4+T細(xì)胞的輔助功能，CD4+T細(xì)胞在被腫瘤或者免疫接種活化之后也能表達(dá)CD25+標(biāo)志。本發(fā)明人提出，CD4+細(xì)胞在初始階段主要起到增強性輔助細(xì)胞作用，但是一旦腫瘤變?yōu)殚L期持久和確立的腫瘤，CD4+T調(diào)節(jié)細(xì)胞積累增加，抑制CD8+細(xì)胞的功能并遮蔽腫瘤的免疫原性。的確，該研究已經(jīng)證明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可更大程度地參與效應(yīng)期(effector phase)，主要在局部腫瘤位點，通過直接抑制腫瘤浸潤性CD8+效應(yīng)細(xì)胞(effector細(xì)胞)來實現(xiàn)。在腫瘤部位耗損這些調(diào)節(jié)性T細(xì)胞高效地逆轉(zhuǎn)了CTL耐受化(tolerization)，導(dǎo)致已確立腫瘤的快速排斥。因此，該研究證明，CD4+CD25+T細(xì)胞對于抗腫瘤免疫(主要是CD8+T細(xì)胞應(yīng)答)的抑制主要在腫瘤部位在效應(yīng)期發(fā)生，在腫瘤發(fā)展后期耗損T調(diào)節(jié)性細(xì)胞不會減弱可能的T輔助細(xì)胞功能。事實上，耗損T調(diào)節(jié)性細(xì)胞揭露了腫瘤細(xì)胞的免疫原性，并且，對于甚至缺乏強抗原Ld的親本腫瘤細(xì)胞的再次攻擊提供長期保護(hù)。該結(jié)果提示，免疫的誘導(dǎo)不是僅僅針對Ld，相反，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的耗損揭露了對以前沒有免疫原性的腫瘤抗原的免疫，擴充了具有腫瘤反應(yīng)性的CD8+T細(xì)胞集合(repertoire)。親本Ag104(無Ld)腫瘤系(高度進(jìn)行性的，沒有免疫原性抗原)不能對傳統(tǒng)免疫治療產(chǎn)生反應(yīng)，卻在耗損調(diào)節(jié)性T細(xì)胞后顯示了增強的免疫原性，導(dǎo)致腫瘤排斥或者延遲的腫瘤發(fā)展?？梢韵氲?，通過耗損CD4+細(xì)胞局部誘導(dǎo)的這種強抗腫瘤免疫可能會導(dǎo)致遠(yuǎn)處腫瘤的排斥。
腫瘤微環(huán)境可能允許在腫瘤發(fā)展以后激活或者擴增調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。本發(fā)明人推測，在腫瘤組織內(nèi)部的慢性發(fā)炎可能與慢性自身免疫發(fā)炎或者持久感染過程中對正常組織的保護(hù)性免疫的一些方面類似，后者允許積累CD4+CD25+T細(xì)胞亞群以下調(diào)免疫應(yīng)答，限制局部炎癥和減輕局部組織破壞(Sakaguchi，2004；Shevach，2002；Maloy andPowrie，2001；Casares等，2003；Golgher等，2002)。此外，腫瘤介導(dǎo)的抑制性因子相對于效應(yīng)T細(xì)胞而言可能有利于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生存。結(jié)果，設(shè)計用來在正常組織中防止失控的炎性應(yīng)答的同樣的調(diào)節(jié)機制有可能抑制抗腫瘤免疫。在各種腫瘤組織中找到含有CD4+CD25+群體的腫瘤浸潤T細(xì)胞是不罕見的(Dieckmann等，2001；Liyanage等，2002；Woo等，2001；Woo等，2002；Wang等，2004)。通過表面標(biāo)志和細(xì)胞因子譜來更好地表征從腫瘤組織分離的CD4+T細(xì)胞的性質(zhì)將是有益的。
對于確定腫瘤內(nèi)部免疫應(yīng)答的結(jié)果，理解T效應(yīng)細(xì)胞與T調(diào)節(jié)性細(xì)胞的平衡可能更重要。最近的研究證明，在腫瘤內(nèi)部迅速募集幼稚淋巴細(xì)胞和擴充CD8+T細(xì)胞可能是一種建立主要是促炎性環(huán)境、導(dǎo)致排斥當(dāng)?shù)睾瓦h(yuǎn)處腫瘤的方法(Janssen等，2003)?，F(xiàn)在，本發(fā)明人進(jìn)一步在本研究中證明，耗損調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是另一種將腫瘤內(nèi)部抗炎環(huán)境轉(zhuǎn)化為促炎環(huán)境的有效方法。局部治療以消除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與全身性治療相比具有三個優(yōu)點第一，它需要非常低劑量的抗體，因此，該治療在臨床上的費用是可負(fù)擔(dān)的，即使對于發(fā)展中國家；第二，它避免了全身耗損所有CD4+T細(xì)胞所誘導(dǎo)的副作用，而全身耗損所有CD4+T細(xì)胞可能會消除T輔助細(xì)胞介導(dǎo)的針對病原體的保護(hù)性免疫；第三，它不會妨礙在淋巴組織中輔助CD4+T細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞的有效致敏，因為所述耗損是局部的。因此，腫瘤環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一種引人注目的靶標(biāo)，它們的耗損可能會導(dǎo)致當(dāng)前免疫治療方法的改進(jìn)?？焖贁U充腫瘤部位的效應(yīng)細(xì)胞、同時局部耗損調(diào)節(jié)性細(xì)胞的聯(lián)合治療可能提供一種增強抗腫瘤免疫和對癌癥患者產(chǎn)生臨床上有利的結(jié)果的有效策略。
* * *基于本文公開的內(nèi)容，本文公開和要求保護(hù)的所有組合物和方法都能夠不需要過度實驗而制備和實施。盡管本發(fā)明的組合物和方法已經(jīng)通過優(yōu)選的實施方案進(jìn)行了說明，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明組合物和方法以及該方法的步驟和步驟順序可以進(jìn)行改動，而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體的是，很明顯，可以用化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的某些試劑替代本文公開的試劑，同時實現(xiàn)相同或者類似的結(jié)果。所有這些本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的替代和修改都被認(rèn)為包括在權(quán)利要求書限定的本發(fā)明精神、范圍和概念之內(nèi)。
表1 CD4耗損誘導(dǎo)針對Ld以外的抗原的免疫應(yīng)答。

a所示腫瘤細(xì)胞數(shù)被皮下注射到C3B6F1小鼠中。在手術(shù)去除或者經(jīng)抗CD4抗體處理排斥第一次腫瘤后30天，進(jìn)行再次攻擊。
b在第一次腫瘤攻擊后21天手術(shù)去除腫瘤。
c在第一次腫瘤攻擊后第14天用抗CD4抗體耗損CD4+細(xì)胞。耗損通過用FACS檢查外周血來證實。
表2 通過清除CD4+細(xì)胞增加腫瘤排斥

a所示腫瘤細(xì)胞數(shù)被皮下注射到C3B6F1小鼠中。
b從一個獨立實驗獲得的或者從兩個獨立實驗綜合的結(jié)果。
c在腫瘤攻擊之前3天和之后7天用抗CD4抗體耗損CD4+細(xì)胞。
d在腫瘤攻擊之前3天和之后7天用抗CD4抗體耗損CD4+細(xì)胞。在腫瘤攻擊后14天用抗CD8抗體耗損CD8+細(xì)胞。
e在腫瘤攻擊前3天用anti-asialo GM-1抗體耗損NK細(xì)胞。
f在腫瘤攻擊之前3天或之后7天用抗NK1.1抗體耗損NK和NKT細(xì)胞。
各種細(xì)胞群的耗損通過用FACS檢查外周血來證實。
表3 CD4+細(xì)胞引起的抑制是在效應(yīng)期(effector phase)而不是在致敏期(priming phase)

a所示腫瘤細(xì)胞數(shù)被皮下注射到C3B6F1小鼠中。
b假定腫瘤攻擊是在第0天。
CD4+細(xì)胞用抗CD4抗體耗損。CD4+細(xì)胞不存在的天通過用FACS檢查外周血來證實。
c結(jié)果從多個獨立實驗總結(jié)而來。
d平均腫瘤大小達(dá)到500mm3以上。
參考文獻(xiàn)以下參考文獻(xiàn)并入本文作為參考，它們補充、解釋或者教導(dǎo)了這里使用的方法、技術(shù)和/或組合物，或者提供了為這些方法、技術(shù)和/或組合物提供了背景。
Bach and Bach，Nat.Rev.Immunol.，3189-198，2003.
Beck-Engeser等，J.Exp.Med.，194285-300，2001.
Belkaid等，Nature，420502-507，2002.
Boon and van der Bruggen，J.Exp.Med.，183725-729，1996.
Casares等，J.Immunol.，1715931-5939，2003.
Clark等，J.Natl.Cancer Inst.，811893-1904，1989.
Clemente等，Cancer，771303-1310，1996.
Coulie等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927976-7980，1995.
De Plaen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852274-2278，1988.
Dieckmann等，J.Exp.Med.，1931303-1310，2001.
Dudley等，Science，298850-854，2002.
Dunn等，Annu.Rev.Immunol.，22329-360，2004.
Fontenot等，Nat.Immunol.，4330-336，2003.
Gilboa，Immunity，11263-270，1999.
Golgher等，Eur.J.Immunol.，323267-3275，2002.
Gorelik，Adv.Cancer Res.，3971-120，1983.
Hinoda Y等，Cancer Sci.95621-5，2004.
Hori等，Science，2991057-1061，2003.
Hought on等，Curr.Opin.Immunol.，13134-140，2001.
Houghton，J.Exp.Med.，1801-4，1994.
Janssen等，Nature，421852-856，2003.
Kang等，Nat.Immunol.，3576-582，2002.
Khattri等，Nat.Immunol.，4337-342，2003.
Liyanage等，J.Immunol.，1692756-2761，2002.
Lurquin等，Cell，58293-303，1989.
Machiels等，Cancer Res.，613689-3697，2001.
Maloy and Powrie，Nat.Immunol.，2816-822，2001.
Mandruzzato等，j.Exp.Med.，186785-793，1997.
Melero等，Nat.Med.，3682-685，1997.
Monach等，Immunity，245-59，1995.
Ossendorp等，Immunol.Lett.，7475-79，2000.
Palmer，Nat.Rev.Immunol.，3383-391，2003.
Pardoll，Annu.Rev.Immunol.，21807-839，2003.
Perdrizet等，J.Exp.Med.，1711205-1220，1990.
Robbins等，J.Exp.Med.，1831185-1192，1996.
Rosenberg，Immunity，10281-287，1999.
Sakaguchi，Annu.Rev.Immunol.，22531-562，2004.
Shedlock and Shen，Science，300337-339，2003.
Shevach，Nat.Rev.Immunol.，2389-400，2002.
Singh等，J.Exp.Med.，175139-146，1992.
Smith等，J Clin Pathol.；57912-7，2004.
Starr等，Annu.Rev.Immunol.，21139-176，2003.
Steitz等，Cancer Res.，618643-8646，2001.
Sun and Bevan，Science，300339-342，2003.
Sutmuller等，J.Exp.Med.，194823-832，2001.
Toes等J.Exp.Med.，189753-756，1999.
Van den Eynde等，J.Exp.Med.，1731373-1384，1991.
van Elsas等，J.Exp.Med.，194481-489，2001.
Viguier等，J.Immunol.，1731444-1453，2004.
Wang等，Immunity，20107-118，2004.
Wang等，J.Exp.Med.，1951397-1406，2002.
Wang，Trends Immunol.，22269-276，2001.
Ward等，J.Exp.Med.，170217-232，1989.
Wick等，J.Exp.Med.，186229-238，1997.
Wolfel等，Science，2691281-1284，1995.
Woo等，Cancer Res.，614766-4772，2001.
Woo等，J.Immunol.，1684272-4276，2002.
Yu等，J.Exp.Med.，197985-995，2003Yu等，Nat.Immunol.，5141-149，2004.
Zhang等，N.Engl.J.Med.，348203-213，2003.
權(quán)利要求
1.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑在制備藥物中的用途，其中所述藥物通過耗損患者(包括動物，哺乳動物，特別是人類)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而治療或者預(yù)防腫瘤(特別是癌癥，例如實體癌)。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞，特別是CD4+CD25+T細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1-2之一的用途，其中所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腫瘤部位處，和/或在腫瘤內(nèi)，和/或在腫瘤外。
4.權(quán)利要求1-3之一的用途，其中所述耗損是腫瘤局部的，和/或是全身性的。
5.權(quán)利要求1-4之一的用途，其中所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抗體，特別是抗CD4+抗體，如抗CD4+CD25+抗體；或者，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑是IL2-毒素。
6.權(quán)利要求5的用途，其中所述抗體是抗人CD4抗體。
7.權(quán)利要求5的用途，其中所述抗體是單克隆抗體或者多克隆抗體。
8.權(quán)利要求5的用途，其中所述抗體是人源化抗體。
9.權(quán)利要求1-8之一的用途，其中所述患者的CD8+T細(xì)胞不被耗損。
10.權(quán)利要求1-9之一的用途，其中CD8+T細(xì)胞參與對腫瘤的免疫應(yīng)答。
11.權(quán)利要求1-10之一的用途，其中所述藥物還包括其它活性成分，并且所述藥物被配制成適于所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑和所述其它活性成分同時給藥或者分開給藥的形式。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述其它活性成分是CD8+T細(xì)胞的激活劑。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述激活劑是抗體，尤其是單克隆抗體，人源化抗體等。
14.權(quán)利要求12的用途，其中所述激活劑是編碼激活CD8+T細(xì)胞的多肽的核酸。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述激活劑是編碼LIGHT的核酸。
16.權(quán)利要求14的用途，其中所述激活劑是編碼突變LIGHT的核酸。
17.權(quán)利要求11的用途，其中所述其它活性成分是包含并表達(dá)編碼突變LIGHT的核酸的腫瘤細(xì)胞或者腫瘤(優(yōu)選地，該腫瘤細(xì)胞或者腫瘤還包含并表達(dá)腫瘤抗原)或者包含腫瘤細(xì)胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。
18.權(quán)利要求11的用途，其中所述其它活性成分是包含并表達(dá)編碼突變LIGHT的核酸的重組病毒(優(yōu)選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組病毒的藥用組合物。
19.權(quán)利要求16-18任一項的用途，其中所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是不含LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EKLI的突變LIGHT。
20.權(quán)利要求16-18任一項的用途，其中所述突變LIGHT具有細(xì)胞外域氨基酸序列和標(biāo)簽序列(例如便于純化的標(biāo)簽)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。
21.權(quán)利要求11的用途，其中所述其它活性成分是化學(xué)治療藥物，尤其是對CD8+T細(xì)胞沒有實質(zhì)性毒性的化療藥物，或者對CD8+T細(xì)胞的毒性比對CD4+T細(xì)胞的毒性小的化療藥物。
22.權(quán)利要求11的用途，其中所述其它活性成分是放療藥物。
23.權(quán)利要求11的用途，其中所述其它活性成分是抗癌疫苗，例如基因疫苗或者肽疫苗。
24.權(quán)利要求11的用途，其中所述其它活性成分是治療性多肽。
25.權(quán)利要求11的用途，其中所述其它活性成分是編碼治療性多肽的核酸。
26.權(quán)利要求11的用途，其中所述腫瘤是實體癌，例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、頭頸癌、前列腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌、胃癌、腦癌、黑素瘤、食道癌、皮膚癌或者腎癌，特別是乳腺癌，轉(zhuǎn)移性乳腺癌；或者所述腫瘤是血液癌，例如淋巴瘤或者白血病。
27.藥物組合物，包含調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑作為活性成分，所述藥物組合物通過耗損患者(包括動物，哺乳動物，特別是人類)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而治療或者預(yù)防腫瘤(特別是癌癥，例如實體癌)。
28.權(quán)利要求27的藥物組合物，其特征在于權(quán)利要求2-26之任何一項的限定部分所限定的特征。
29.可用于分析患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(特別是CD4+T細(xì)胞，特別是CD4+CD25+T細(xì)胞)群體的試劑在制備用于癌癥診斷或者預(yù)后的藥劑或者藥劑盒中的用途。
30.權(quán)利要求29的用途，其中所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在患者腫瘤內(nèi)。
31.權(quán)利要求30的用途，其中腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平升高表明患者預(yù)后不佳。
32.權(quán)利要求29的用途，其中所述藥劑或者藥劑盒還包含用于分析癌癥患者體內(nèi)CD8+T細(xì)胞群體的試劑。
33.權(quán)利要求32的用途，其中相對于CD8+T細(xì)胞的正常水平，所述患者體內(nèi)CD8+T細(xì)胞水平升高或者正常水平是癌癥的正預(yù)后指標(biāo)和/或診斷。
34.包含并表達(dá)編碼突變LIGHT的核酸cDNA的重組病毒，優(yōu)選地，該重組病毒是重組腺病毒或者禽痘病毒。
35.權(quán)利要求34的重組病毒，其中所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是不含LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EKLI的突變LIGHT。
36.權(quán)利要求34的重組病毒，其中所述突變LIGHT具有細(xì)胞外域氨基酸序列和標(biāo)簽序列(例如便于純化的標(biāo)簽)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。
37.包含權(quán)利要求34-36之一的重組病毒的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預(yù)防性疫苗。
38.權(quán)利要求34-36之一的病毒或者權(quán)利要求37的組合物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
39.用于篩選或者測試癌癥治療劑的方法，包括獲得候選物質(zhì)，和在(非人動物優(yōu)選實驗動物，特別是患有癌癥的那些)體內(nèi)或者體外實驗中測試候選物質(zhì)是否能夠耗損調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑在制備藥物中的用途，其中所述藥物通過耗損患者(包括動物，哺乳動物，特別是人類)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而治療或者預(yù)防腫瘤(特別是癌癥，例如實體癌)。所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗損劑的例子是抗CD文檔編號A61K39/235GK1833724SQ200510055009
公開日2006年9月20日 申請日期2005年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月14日
發(fā)明者傅陽心 申請人:傅陽心