專利名稱：一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療用干細(xì)胞制劑及其制備方法，更具體地說(shuō)，涉及一種用于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)移植治療的干細(xì)胞制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
Alzheimer病是一種會(huì)不斷發(fā)展的破壞腦細(xì)胞的退化性疾病，目前全球該病患者已達(dá)1700-2000萬(wàn)，其中80歲以上的人平均每5人就有1人患此病。由于對(duì)該病尚無(wú)有效的治療方法，成為困擾當(dāng)今社會(huì)及醫(yī)學(xué)界的一大難題。隨著世界人口老齡化，Alzheimer病已成了21世紀(jì)的災(zāi)難。
Qu等報(bào)道(QuT，Brannen CL，Kim HM，Sugaya K.Human neural stem cellsimprove cognitive function of aged brain.Neuroreport.2001 May8；12(6)1127-32.)，將人的神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)移植入老年大鼠腦內(nèi)，能夠改善大鼠的認(rèn)知功能；而Ende N等報(bào)道(Ende N，Chen R，Ende-Harris D.Human umbilical cordblood cells ameliorate Alzheimer’s disease in transgenic mice.J Med.2001；32(3-4)241-7.)，經(jīng)靜脈移植人的臍血單個(gè)核細(xì)胞可以延長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠的壽命。經(jīng)靜脈移植臍血細(xì)胞到肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的小鼠后(Garbuzova-Davis S，Willing AE，Zigova T，Saporta S，Justen EB，Lane JC，Hudson JE，Chen N，DavisCD，Sanberg PR.Intravenous administration of human umbilical cord blood cellsin a mouse model of amyotrophic lateral sclerosisdistribution，migration，anddifferentiation.J Hematother Stem Cell Res.2003 Jun；12(3)255-70.)，發(fā)現(xiàn)臍血細(xì)胞可將疾病的發(fā)生延緩2～3周，并延長(zhǎng)了患病小鼠的壽命。在腦和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷區(qū)域內(nèi)，移植細(xì)胞可存活10～12周，部分細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)標(biāo)志物神經(jīng)烯醇化酶、III型微管蛋白和神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白。這些初步的研究結(jié)果顯示，干細(xì)胞對(duì)癡呆有治療作用。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的自身修復(fù)能力是相當(dāng)有限的，因此細(xì)胞移植替代治療成為近年來(lái)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)之一。目前研究較廣泛的中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植物主要是胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞。但因來(lái)源有限、倫理障礙及免疫排斥等問(wèn)題，這些細(xì)胞的實(shí)用性受到極大限制。近來(lái)研究表明，骨髓MSC具有分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力。但是，骨髓源細(xì)胞有較高的病毒感染危險(xiǎn)，且隨著年齡增長(zhǎng)其細(xì)胞數(shù)量和增殖、分化能力也顯著性下降，較難滿足臨床需求。因此，尋找新的細(xì)胞來(lái)源成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的熱點(diǎn)。
對(duì)臍帶血中CD133陽(yáng)性細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，60±8％臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Nestin(Ha Y，Lee JE，Kim KN，Cho YE，Yoon DH.Intermediate filament nestinexpressions in human cord blood monocytes(HCMNCs).Acta Neurochir(Wien).2003Jun；145(6)483-7.)。由此推測(cè)，臍帶血造血干細(xì)胞可能和神經(jīng)干細(xì)胞具有很大的同源性。Buzanska等(Buzanska L，Machaj EK，Zablocka B，Pojda Z，Domanska-Janik K.Human cord blood-derived cells attain neuronal and glial features in vitro.JCell Sci.2002 May 15；115(Pt10)2131-8.)對(duì)磁珠分選去除CD34陽(yáng)性細(xì)胞的臍帶血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，低密度(10細(xì)胞/cm2)接種后，細(xì)胞形成表達(dá)Nestin的集落。
我們的研究首次發(fā)現(xiàn)，臍血單個(gè)核細(xì)胞能產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF和NT4、NT5(FanC.G.，Zhang Q.J.，Tang F.W.，Han Z.B.，Wang G.S.，Han Z.C.Human umbilical cord bloodcells express neurotrophic factors.Neurosci Lett，2005.Vol.338.322-325)。
臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞較其它干細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中擁有更廣泛的應(yīng)用前景。但目前尚無(wú)臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞治療Alzheimer病的相關(guān)報(bào)道。
臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞向造血和內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能已經(jīng)被充分的認(rèn)識(shí)，并在血液血管疾病的治療中有良好的應(yīng)用前景。但臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞向神經(jīng)分化的潛能和在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的作用未被充分認(rèn)識(shí)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種來(lái)源豐富、易于獲得、免疫源性較弱，異體移植后免疫排斥反應(yīng)發(fā)生率低的治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑，它含有1×104/μL～9×104/μL的臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞，溶劑為可保持細(xì)胞活性的常規(guī)性溶劑。
所述臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞的濃度優(yōu)選為4×104/μL～6×104/μL。
所述臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞的濃度最好為5×104/μL。
所述一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑的溶劑為1％人血白蛋白磷酸緩沖液。
一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑的制備方法，其特征是由下述步驟組成(1)將臍帶血采集于無(wú)菌抗凝袋中；(2)用淋巴細(xì)胞分離液離心分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞；(3)凍存單個(gè)核細(xì)胞；(4)免疫磁珠分選CD133陽(yáng)性細(xì)胞，使其濃度為1×104/μL～9×104/μL，溶劑為可保持細(xì)胞活性的常規(guī)性溶劑。
本發(fā)明的一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑具有的選點(diǎn)是1.來(lái)源豐富，易于獲得；2.采集方便，對(duì)供者無(wú)痛苦；3.臍帶血細(xì)胞免疫源性較弱，異體移植后免疫排斥反應(yīng)發(fā)生率低、程度較輕；4.可以進(jìn)行HLA配型；5.臍帶血易于冷凍保存；6.可通過(guò)靜脈輸注方式移植；7.易于分選。我們將本發(fā)明的一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑應(yīng)用于治療Alzheimer病，可以為該病的治療提供新的臨床策略。


圖1為本發(fā)明一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑直接種植在腦營(yíng)養(yǎng)支持細(xì)胞表面，培養(yǎng)后，表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和III型微管蛋白，形成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元樣細(xì)胞。
圖2為用放射臂水迷宮(RAWM)測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，與移植臍帶血CD133陰性細(xì)胞及磷酸緩沖液的小鼠的認(rèn)知功能相比，移植本發(fā)明一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑，小鼠認(rèn)知功能在移植后30天后即有明顯改善，在移植后6個(gè)月時(shí)仍持續(xù)存在(P＜0.05)。
圖3為與接受磷酸緩沖液處理的小鼠的存活曲線相比，移植臍帶血CD133陰性細(xì)胞后，二者無(wú)明顯差別，但移植本發(fā)明一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑(人臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞)后的存活曲線明顯不同(P＜0.05)。
圖4.Dil標(biāo)記的本發(fā)明的一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑(人臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞)在移植后30天時(shí)，表達(dá)III型微管蛋白的神經(jīng)元樣細(xì)胞(C由A和B合成)和神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白陽(yáng)性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(F由D和E合成)，移植細(xì)胞主要位于雙側(cè)頂葉皮質(zhì)(II，IV和V層；G)和海馬(H)；神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞也在海馬中出現(xiàn)(I)。
圖5為在移植本發(fā)明一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑(人臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞)后的180天，預(yù)先用一種熒光燃料(Dil)標(biāo)記的移植細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)烯醇化酶(A)和神經(jīng)微絲(B)，而在接受CD133陰性細(xì)胞移植的小鼠腦內(nèi)，臍帶血細(xì)胞主要分布在側(cè)腦室周邊，稀有移植細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)抗原(C)。
圖6.表達(dá)III型微管蛋白的臍帶血細(xì)胞的比例，在移植后30天明顯高于移植后180天，而表達(dá)神經(jīng)烯醇化酶的移植細(xì)胞比例，在180天明顯高于30天。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑作進(jìn)一步說(shuō)明，并將用本發(fā)明細(xì)胞移植治療Alzheimer病作進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑，它含有1×104/μL的臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞，溶劑為可保持細(xì)胞活性的常規(guī)性溶劑。
實(shí)施例2一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑，它含有9×104/μL的臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞，溶劑為可保持細(xì)胞活性的常規(guī)性溶劑。
實(shí)施例3一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑，它含有4×104/μL的臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞，溶劑為1％人血白蛋白磷酸緩沖液。
實(shí)施例4一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑，它含有6×104/μL的臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞，溶劑為1％人血白蛋白磷酸緩沖液。
實(shí)施例5一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑，它含有5×104/μL的臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞，溶劑為1％人血白蛋白磷酸緩沖液。
實(shí)施例6一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑的制備方法，由下述步驟組成(1)將臍帶血采集于無(wú)菌抗凝袋中 臍血標(biāo)本采自健康足月妊娠，經(jīng)產(chǎn)道分娩的胎盤(pán)組織，胎盤(pán)娩出后立即結(jié)扎臍帶，嚴(yán)格消毒后用16號(hào)針頭穿刺臍靜脈，通過(guò)重力將盡可能多的臍血收集于含有28ml CPD-A抗凝劑的450ml采血袋內(nèi)；(2)用淋巴細(xì)胞分離液離心分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞；標(biāo)本采集后在4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分離。首先按5∶1(羥乙基淀粉體積臍血體積)比例加入6.0％的羥乙基淀粉，于10℃，50g離心10分鐘，沉淀紅細(xì)胞，收集富含有核細(xì)胞(NC)的血漿，緩緩加至約1∶1體積的淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Hypaque)的液面上，1800轉(zhuǎn)離心20分鐘。吸取中間的細(xì)胞層，MACS緩沖液洗滌兩遍，1500轉(zhuǎn)，10分鐘，制備單個(gè)核細(xì)胞(MNC)懸液。如果紅細(xì)胞仍然很多，可用5ml MACS緩沖液重懸細(xì)胞，再用10倍體積的低滲氯化銨溶液裂解殘留紅細(xì)胞；(3)凍存單個(gè)核細(xì)胞；(4)免疫磁珠分選CD133陽(yáng)性細(xì)胞，采用Mini MACS免疫磁性吸附柱分離裝置，應(yīng)用CD133陽(yáng)性細(xì)胞單選試劑盒按其說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞的分離與純化，于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用MACS緩沖液調(diào)細(xì)胞濃度為1.0×108MNC/300ul(少于1.0×108按1.0×108計(jì))，加入IgG FcR阻斷劑(阻斷非特異結(jié)合)和CD133微磁珠單克隆抗體各100ul/108細(xì)胞，充分混勻后4-8℃孵育30分鐘。用5-10倍體積MACS緩沖液洗滌一遍，調(diào)細(xì)胞濃度為108/500ul。隨后將細(xì)胞加入固定于高強(qiáng)度磁場(chǎng)的MiniMACS吸附柱中進(jìn)行分離，未與磁珠結(jié)合的CD133陰性細(xì)胞隨緩沖液流出，而結(jié)合磁珠的CD133陽(yáng)性細(xì)胞則保留于吸附柱中，用MACS緩沖液沖洗三遍后，將MiniMACS吸附柱撤離磁場(chǎng)，并洗脫CD133陽(yáng)性細(xì)胞。為提高細(xì)胞的分選純度，將富集的陽(yáng)性細(xì)胞二次過(guò)柱，使其濃度為1×104/μL～9×104/μL，溶劑為可保持細(xì)胞活性的常規(guī)性溶劑如1％人血白蛋白磷酸緩沖液。
由于臍帶血細(xì)胞的低抗原性，將凍存的臍帶血細(xì)胞按照相同的ABO血型進(jìn)行混合，然后大型磁柱進(jìn)行分選，制備臨床用制劑。
將一種含有5×104/μL的臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞，溶劑為1％人血白蛋白磷酸緩沖液的治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑，移植至轉(zhuǎn)基因Alzheimer病癡呆鼠的體內(nèi)(該制劑可通過(guò)直接腦室注射移植，也可同其它營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的藥物或促進(jìn)干細(xì)胞增殖及向神經(jīng)細(xì)胞分化的藥物一起共同移植。)實(shí)施例7體外共培養(yǎng)體系中CD133陽(yáng)性細(xì)胞的神經(jīng)分化共培養(yǎng)體系是兩種細(xì)胞直接接觸的培養(yǎng)體系，在這種培養(yǎng)體系中，臍帶血細(xì)胞直接種植在預(yù)先培養(yǎng)的腦營(yíng)養(yǎng)支持細(xì)胞表面。為了在共培養(yǎng)4周后能夠區(qū)別兩種細(xì)胞，臍帶血細(xì)胞在加入共培養(yǎng)體系之前，用5溴脫氧尿核苷(BrdU)進(jìn)行標(biāo)記。與Mckay R的方法相同，首先將分選的CD133陽(yáng)性臍血細(xì)胞重懸在DMEM，胎牛血清(10％)，谷胺酰氨glutamine(1％)，并加入BrdU，使終濃度為20μmol/L，同時(shí)，加入白細(xì)胞介素3(50ng/mL)，白細(xì)胞介素6(100ng/mL)以及干細(xì)胞因子(100ng/mL)(購(gòu)自PeproTech)，培養(yǎng)72小時(shí)，以便對(duì)BrdU的標(biāo)記起易化作用。標(biāo)記好的細(xì)胞用磷酸緩沖液清洗三次，然后直接種植在預(yù)先培養(yǎng)在24孔板中的腦營(yíng)養(yǎng)支持細(xì)胞的表面。兩種細(xì)胞在DMEM/F12僅添加10％胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周，每三天半量換液一次。4周后，所有細(xì)胞樣品固定后用雙標(biāo)免疫組化檢測(cè)細(xì)胞表型。在這個(gè)培養(yǎng)體系中，共對(duì)6份臍血中的2.4×106個(gè)CD133陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。
實(shí)施例8經(jīng)腦室移植細(xì)胞48只APP695轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為3組。第一組小鼠共8只，作為對(duì)照組，經(jīng)腦室注射10μL磷酸緩沖液。第二組和第三組均分別為20只，分別經(jīng)腦室接受10μL CD133陽(yáng)性和CD133陰性5×105臍血細(xì)胞移植，移植前臍血細(xì)胞用Molecular Probe公司的Dil熒光染料標(biāo)記。動(dòng)物用戊巴比妥鈉50mg/Kg腹腔注射麻醉后，固定于Stoelting立體定向架，以人字縫作為參照點(diǎn)，X2cm；Y2.5cm；Z-4cm，顱骨鉆孔后，用Hamilton微量注射器穿刺腦室，回抽無(wú)阻力并確定無(wú)誤后，在側(cè)腦室內(nèi)以1μL/分的速度注射磷酸緩沖液及臍血細(xì)胞懸液。注射完后，留注射針約5分鐘。拔出微量注射器后，用纖維蛋白膠封閉注射針孔，以防止注射細(xì)胞液回流。移植細(xì)胞后沒(méi)有使用任何免疫抑制劑。根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和照料條例對(duì)本實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)物進(jìn)行護(hù)理對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠移植前后的存活天數(shù)進(jìn)行詳細(xì)記錄。
實(shí)施例9認(rèn)知功能的檢測(cè)用RAWM按照Arendash等的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)價(jià)(ArendashG.W.，King D.L.，Gordon M.N.，Morgan D.，Hatcher J.M.，Hope C.E.，Diamond D.M.，Progressive.age-related behavioral impairments in transgenic mice carrying both mutantamyloid precursor protein and presenilin-1 transgenes.Brain Res.2001；89142-53.)。在RAWM的測(cè)試中，在直徑1米的水池中，等距離放置六個(gè)三角鋁壁(邊長(zhǎng)30.5cm×高21cm)，這種排列形成一個(gè)直接40cm的圓形泳區(qū)和放射狀排列的6個(gè)長(zhǎng)30.5cm寬19cm的臂(泳道)，并使臂高出水面約5cm。RAWM測(cè)試包括每天4個(gè)記錄測(cè)試和1個(gè)記憶保留測(cè)試，并進(jìn)行連續(xù)9天的測(cè)試。在每天的測(cè)試中，水下逃脫平臺(tái)放置在當(dāng)天設(shè)定的目標(biāo)臂的遠(yuǎn)端，而目標(biāo)臂的選定在每天都是隨機(jī)變換的。以半隨機(jī)的方法在除目標(biāo)臂外的其余5個(gè)臂中選定當(dāng)天記錄測(cè)試的起始臂，先進(jìn)行4次測(cè)試(T1-4)，并以第4次測(cè)試(T4)的錯(cuò)誤次數(shù)作為當(dāng)天的指數(shù)。對(duì)于每次的學(xué)習(xí)測(cè)試，動(dòng)物放置在起始臂中，面向公共圓形水域，在1分鐘的連續(xù)測(cè)試中，允許動(dòng)物游向臂中，如果游向非目標(biāo)臂，記錄一次錯(cuò)誤并從讓動(dòng)物經(jīng)過(guò)圓形水域而回到起始臂重新開(kāi)始測(cè)試。如果動(dòng)物進(jìn)入目標(biāo)臂，但沒(méi)有確定目標(biāo)臂中的水下逃脫平臺(tái)，仍記一次錯(cuò)誤并重新開(kāi)始測(cè)試。
在每次的獲取測(cè)試中，與錯(cuò)過(guò)逃脫平臺(tái)相比，優(yōu)先對(duì)選錯(cuò)臂進(jìn)行記錄。動(dòng)物一旦發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，允許在平臺(tái)上停留30秒種。如果動(dòng)物在60秒的測(cè)試中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，可選擇引導(dǎo)到逃脫平臺(tái)。在完成四次測(cè)試后，動(dòng)物用加熱燈烤干放回籠內(nèi)，延遲30分鐘后進(jìn)行記憶保留測(cè)試(T5)，并與第四次測(cè)試(T4)相同的起始臂進(jìn)行測(cè)試。在這1分鐘的測(cè)試中，記錄沒(méi)有找到目標(biāo)臂的錯(cuò)誤次數(shù)。測(cè)試在移植臍血CD133陽(yáng)性細(xì)胞前和移植后的30，90，180天后進(jìn)行，由不同的研究人員以雙盲實(shí)驗(yàn)方法對(duì)動(dòng)物進(jìn)行經(jīng)腦室移植和認(rèn)知功能評(píng)分。見(jiàn)表1使用RAWM測(cè)試后，不同組別間小鼠認(rèn)知功能的比較表1數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示

*P＜0.05，在同一時(shí)間點(diǎn)時(shí)，與其它兩組比較。
**P＜0.01，在同一時(shí)間點(diǎn)時(shí)，與其它兩組比較。
將本發(fā)明的一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑移植到有認(rèn)知障礙的轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)放射臂水迷宮測(cè)試，從移植后30天至180天，認(rèn)知功能均有改善，90天時(shí)改善最明顯。上述結(jié)果表明，臍帶血來(lái)源的CD133陽(yáng)性細(xì)胞具有向神經(jīng)分化的潛能，而且經(jīng)腦室移植改細(xì)胞制劑后能明顯改善癡呆小鼠認(rèn)知功能并延長(zhǎng)存活時(shí)間。
實(shí)施例10免疫組織化學(xué)評(píng)估1.切片的準(zhǔn)備對(duì)照組中兩只小鼠在腦室注射磷酸緩沖液30天后處死，另兩組中有四只小鼠在移植后的30天和180天分別被處死，其它動(dòng)物在移植后自然存活。在準(zhǔn)備腦切片時(shí)，動(dòng)物先用戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉后，以0.9％鹽水100ml和4％多聚甲醛經(jīng)心臟各灌注30分鐘。取出腦后，分塊用石蠟包埋。以冠狀位對(duì)石蠟塊進(jìn)行厚10μm的連續(xù)切片。
2.免疫組化染色切片脫臘后用0.1％Triton X-100處理5分鐘，0.01M磷酸緩沖液沖洗2次，每次3分，3％H2O2孵育5分，0.01M磷酸緩沖液沖洗2次，每次3分，普通馬血清封閉，傾去封閉血清后，用以下一抗體室溫3-4小時(shí)III型微管蛋白(1∶100)，神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(1∶1000)和神經(jīng)烯醇化酶(1∶1000)，0.01M磷酸緩沖液沖洗2次，每次3分。滴加免疫組化試劑盒中的二抗，室溫孵育40分，0.01M磷酸緩沖液沖洗2次，每次3分，然后加入標(biāo)記的三抗，溫孵育40分，0.01M磷酸緩沖液沖洗2次，每次3分，加入DAB顯色，脫水透明后封片。切片上Dil的熒光在543nm的汞燈激發(fā)下呈現(xiàn)紅色熒光。同一視野下的用激光和明場(chǎng)同時(shí)拍照，并用SPOT軟件進(jìn)行合成。對(duì)不同腦區(qū)的切片均進(jìn)行觀察，對(duì)不同切片的同一區(qū)域內(nèi)近20個(gè)視野下的雙染細(xì)胞進(jìn)行量化計(jì)數(shù)。
實(shí)施例11統(tǒng)計(jì)分析認(rèn)知功能評(píng)分用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)各組中分化的細(xì)胞比率進(jìn)行t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示.以Kaplan-Meier存活統(tǒng)計(jì)分析對(duì)動(dòng)物存活功能進(jìn)行分析。P＜0.05為顯著性差異。
權(quán)利要求
1.一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑，其特征是它含有1×104/μL～9×104/μL的臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞，溶劑為可保持細(xì)胞活性的常規(guī)性溶劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑，其特征是所述臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞的濃度為4×104/μL～6×104/μL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑，其特征是所述臍帶血CD133陽(yáng)性細(xì)胞的濃度為5×104/μL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑，其特征是所述溶劑為1％人血白蛋白磷酸緩沖液。
5.一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑的制備方法，其特征是由下述步驟組成(1)將臍帶血采集于無(wú)菌抗凝袋中；(2)用淋巴細(xì)胞分離液離心分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞；(3)凍存單個(gè)核細(xì)胞；(4)免疫磁珠分選CD133陽(yáng)性細(xì)胞，使其濃度為1×104/μL～9×104/μL，溶劑為可保持細(xì)胞活性的常規(guī)性溶劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種治療阿爾茨海默病的干細(xì)胞制劑及其制備方法，本發(fā)明制劑含有1×10
文檔編號(hào)A61P25/00GK1720993SQ20051001375
公開(kāi)日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2005年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月10日
發(fā)明者韓忠朝, 湯鋒武 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所泰達(dá)生命科學(xué)技術(shù)研究中心, 天津昂賽細(xì)胞基因工程有限公司