專利名稱：重組潤滑素分子及其用途的制作方法
專利說明重組潤滑素分子及其用途 本發(fā)明涉及新的重組潤滑素分子及其作為潤滑劑、抗粘連劑和/或關(guān)節(jié)內(nèi)補(bǔ)充物應(yīng)用于例如，滑膜關(guān)節(jié)、半月板、腱、腹膜、心包和胸膜的用途。
背景技術(shù)：
滑膜關(guān)節(jié)的最佳功能性依賴于關(guān)節(jié)組織間極低的摩擦系數(shù)。通常，關(guān)節(jié)軟骨上保持了一個鄰接且潤滑良好的表面。但在骨關(guān)節(jié)炎(OA)期間，潤滑程度的降低促使了軟骨基質(zhì)降解和原纖維形成；這隨后促成了關(guān)節(jié)功能異常和疼痛。潤滑程度的降低也可以導(dǎo)致包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)在內(nèi)的關(guān)節(jié)功能障礙和其它關(guān)節(jié)炎形式的疼痛。潤滑表面也有助于其它組織(例如腱)實現(xiàn)最佳功能性。正常腱功能除必需潤滑表面外，還必需防止腱表面的細(xì)胞粘連。例如，在屈肌腱的損傷和修復(fù)中，腱粘連的形成是最常見的并發(fā)癥。天然潤滑素蛋白與巨核細(xì)胞刺激因子(MSF)前體蛋白相關(guān)。PRG4(蛋白聚糖4)是對MSF的命名，已被UCL/HGNC/HUGO人基因命名數(shù)據(jù)庫采用。US6433142和US20020137894(本文所引用的全部專利和專利申請均被完整引入作為參考)描述了PRG4蛋白(即MSF前體蛋白)。由PRG4基因的外顯子6編碼的多肽被強(qiáng)糖基化后，似乎對PRG4-相關(guān)蛋白在例如，關(guān)節(jié)軟骨表面之間充當(dāng)潤滑劑而言必不可少。有研究指出覆蓋腱鞘的內(nèi)膜滑膜細(xì)胞也可合成PRG4糖蛋白；該糖蛋白也很可能來源于腱細(xì)胞(Rees et al.，2002)。該糖蛋白主要存在于腱的纖維軟骨區(qū)。作為對其滑液功能的補(bǔ)充，該糖蛋白可能通過阻止細(xì)胞粘連腱表面，以及通過在腱行使正常功能期間提供潤滑，從而對腱起重要的細(xì)胞保護(hù)作用。PRG4(也被稱為“潤滑素”)基因的外顯子6編碼大約76-78個重復(fù)的KEPAPTT樣序列和6個重復(fù)的XXTTTX樣序列。改變本發(fā)明所述重組潤滑素蛋白中可比重復(fù)序列的數(shù)目有助于研發(fā)在提高關(guān)節(jié)內(nèi)潤滑程度和抵消組織間不良粘連方面有所修飾的生物療法。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及新的重組潤滑素(lubricin)分子及其作為潤滑劑、抗粘連劑和/或關(guān)節(jié)內(nèi)補(bǔ)充物的用途。為了最優(yōu)化表達(dá)參數(shù)和研究全部大約76-78個KEPAPTT樣序列的功能必要性，設(shè)計了能夠使得能夠合成具有不同O-連接的寡糖取代程度的重組潤滑素蛋白的潤滑素表達(dá)構(gòu)建體。該設(shè)計是通過將可變數(shù)目的KEPAPTT樣序列整合進(jìn)包括外顯子1-5、外顯子6的5′-和3′-側(cè)翼區(qū)以及外顯子7-12在內(nèi)的“核心”cDNA構(gòu)建體中而得以實現(xiàn)。重復(fù)插入編碼多個KEPAPTT樣序列的“合成cDNA盒”有助于生成不同大小的重組潤滑素構(gòu)建體。這些研究最初集中在構(gòu)建體PRG4-Lub1(含合成“cDNA盒-1”的DNA(SEQ ID NO1)，編碼4個KEPAPTT序列)。本發(fā)明重組潤滑素蛋白與若干種天然人潤滑素同工型共有一級結(jié)構(gòu)(參見US6743774、US20040072741和WO0064930)。在已表征的同工型中，編碼同工型一級結(jié)構(gòu)的PRG4基因外顯子的組成各不相同。例如，PRG4基因的外顯子1-12編碼V0同工型，即全長同工型，外顯子1-4和6-12則編碼V1同工型，該同工型僅缺少由外顯子5編碼的片段。外顯子1-3和6-12編碼V2同工型，該同工型缺少由外顯子4和5編碼的片段。最后，外顯子1、3和6-12則編碼V3同工型，該同工型缺少由外顯子2、4和5編碼的片段。也可能存在其它同工型，已有報道公開了若干種相關(guān)的突變蛋白(參見US20020086824)。具體而言，本發(fā)明提供了具有重復(fù)的KEPAPTT樣序列的重組潤滑素蛋白。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了包括SEQ IDNOS9、13、17、21或25所示序列的分離蛋白。在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供了包括SEQ ID NOS7、11、15、19或23所示序列的分離蛋白。在進(jìn)一步的相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供了含有重組潤滑素蛋白的編碼核酸序列的分離的多核苷酸。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了含有上述蛋白的編碼核酸序列的分離的多核苷酸。在進(jìn)一步的相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供了與SEQ ID NOS6、1O、14、18或22所示序列在序列的全長上具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的分離的多核苷酸。本發(fā)明的相關(guān)方面還提供了包含與SEQ ID NO27的(N-2)個重復(fù)連接的SEQ ID NO26的分離的蛋白，其中N為3-200的整數(shù)。在進(jìn)一步的相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供了分離的蛋白，包含SEQ IDNO26加SEQ ID NO2加[SEQ ID NO27的(N-2)個重復(fù)]加SEQ IDNO29，其中N為3-200的整數(shù)。在該節(jié)所指出的本發(fā)明相關(guān)方面的實施方案中，N更優(yōu)選地為5-50的整數(shù)，還要更優(yōu)選的是N為10-30的整數(shù)。表1.對具有序列標(biāo)志符的序列的鑒定 本發(fā)明的相關(guān)實施方案還提供了含有藥學(xué)可接受載體中的治療有效量的重組潤滑素蛋白組合物。在某些實施方案中，該組合物還含有乙酰透明質(zhì)酸或hylan。本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療被試者的方法，包括獲得重組潤滑素蛋白組合物；并將該組合物施用于被試者的組織。在本發(fā)明該方法的相關(guān)實施方案中，所述組織選自軟骨、滑膜、半月板、腱、腹膜、心包和胸膜。在本發(fā)明該方法的進(jìn)一步相關(guān)實施方案中，該方法還包括選自下列的步驟向被試者提供麻醉劑；向被試者提供抗炎癥藥物；向被試者提供抗生素；從被試者抽吸液體；清洗被試者的組織；并對被試者的組織成像。在其它相關(guān)實施方案中，所述被試者選自小鼠、大鼠、貓、狗、馬和人。在其它實施方案中，本發(fā)明還提供了含有編碼重組潤滑素蛋白的多核苷酸的表達(dá)載體，其中該多核苷酸與表達(dá)控制序列可操作連接。在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供了制備重組潤滑素蛋白的方法，包括在液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)由所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；和從該培養(yǎng)基中收集重組潤滑素蛋白。蛋白收集步驟可進(jìn)一步包括通過膜過濾培養(yǎng)基使所述蛋白濃縮；收集被截留在膜上的蛋白；和將收集到的蛋白溶解在含有濃度范圍為0.1-2.0M的L-精氨酸鹽酸鹽的緩沖鹽溶液中。在另一種相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供了對重組潤滑素蛋白具有特異性的分離抗體。下述優(yōu)選實施方案和權(quán)利要求的內(nèi)容有助于理解本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢。
發(fā)明詳述
被用于生成重組潤滑素蛋白的堿基DNA構(gòu)建體可能在PRG4基因外顯子6的5′和3′具有可變排列的序列。例如，該堿基DNA構(gòu)建體可能包括編碼生長調(diào)節(jié)素B樣結(jié)構(gòu)域(外顯子2-4)或血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域(外顯子7-9)的序列的可變排列。在外顯子6的3’具有不同外顯子排列的堿基DNA構(gòu)建體的實施方案可能包括分別僅具有外顯子7、8、9、10、11或12，或外顯子對(7和8)、(7和9)、(7和10)、(7和11)、(7和12)、(8和9)、(8和10)、(8和11)、(8和12)、(9和10)、(9和11)、(9和12)、(10和11)、(10和12)或(11和12)，或外顯子三聯(lián)體(7、8和9)、(7、8和10)、(7、8和11)、(7、8和12)、(7、9和10)、(7、9和11)、(7、9和12)、(7、10和11)、(7、10和12)、(7、11和12)、(8、9和10)、(8、9和11)、(8、9和12)、(8、10和11)、(8、10和12)、(8、11和12)、(9、10和11)、(9、10和12)、(9、11和12)或(10、11和12)，或外顯子四聯(lián)體(7、8、9和10)、(7、8、9和11)、(7、8、9和12)、(7、8、10和11)、(7、8、10和12)、(7、8、11和12)、(7、9、10和11)、(7、9、10和12)、(7、9、11和12)、(7、10、11和12)、(8、9、10和11)、(8、9、10和12)、(8、9、11和12)、(8、10、11和12)或(9、10、11和12)，或外顯子五聯(lián)體(7、8、9、10和11)、(7、8、9、10和12)、(7、8、9、11和12)、(7、8、10、11和12)、(7、9、10、11和12)或(8、9、10、11和12)或外顯子六聯(lián)體(7、8、9、10、11和12)的堿基DNA構(gòu)建體。此外，在外顯子6的5’具有不同外顯子排列的堿基DNA構(gòu)建體的實施方案可能包括分別僅具有外顯子1、2、3、4或5，或外顯子對(1和2)、(1和3)、(1和4)、(1和5)、(2和3)、(2和4)、(2和5)、(3和4)、(3和5)或(4和5)，或外顯子三聯(lián)體(1、2和3)、(1、2和4)、(1、2和5)、(1、3和4)、(1、3和5)、(1、4和5)、(2、3和4)、(2、3和5)、(2、4和5)或(3、4和5)，或外顯子四聯(lián)體(1、2、3和4)、(1、2、3和5)、(1、2、4和5)、(1、3、4和5)或(2、3、4和5)，或外顯子五聯(lián)體(1、2、3、4和5)的堿基DNA構(gòu)建體。本發(fā)明還包括由堿基DNA構(gòu)建體編碼的蛋白質(zhì)，即其中缺失了外顯子6序列-編碼多肽的部分或全部，并且未加入由合成cDNA盒來源的插入片段所編碼的任何氨基酸。本發(fā)明還包括與本文所述的特定實施方案具有同源性的多核苷酸，例如，與所述特定DNA序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。本發(fā)明進(jìn)一步包括具有特定核酸序列的多核苷酸，該核酸序列能夠在高嚴(yán)格性條件下以其功能結(jié)構(gòu)域長度與上述特定DNA序列的互補(bǔ)序列雜交。本發(fā)明還包括由上述同源或雜交多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。為了更清楚地描述本發(fā)明實施方案，下文提供了若干相關(guān)定義。定義.短語“重復(fù)的KEPAPTT樣序列”指與(a)“APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTTKEPAPTTPKEPAPTTTK”(SEQ ID NO26；45個氨基酸)并具有至少一個O-連接的取代的序列；(b)“KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP”(SEQ ID NO27；31個氨基酸)并具有至少一個O-連接的取代的序列；或(c)“EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP”(SEQ ID NO28；22個氨基酸)并具有至少一個O-連接的取代的序列，具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。重復(fù)的KEPAPTT樣序列可能優(yōu)選具有2、3、4個或更多O-連接的取代。有很多方法可測定兩個多核苷酸或多肽序列之間的同一性，術(shù)語“同一性”是技術(shù)人員熟知的，并具有與特定方法對應(yīng)的確定意義。本文所述的序列同一性是利用可通過NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih，gov/blast/；也可參考Tatusova和Madden(1999)的報道)獲得的BLAST 2 SEQUENCES工具測定的。對氨基酸序列而言所用的參數(shù)為預(yù)期值＝1000；字長＝2；過濾器＝關(guān)；其它參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值。這三個參數(shù)也被應(yīng)用于核酸序列同一性的測定，但字長＝8。被用于比較氨基酸序列的默認(rèn)值為矩陣＝BLOSUM62；開放空位＝11；延伸空位＝罰1分；和gap×dropoff＝50。被用于比較核酸序列的默認(rèn)值為匹配獎分＝1；錯配罰分＝-2；鏈選擇＝兩條鏈；開放空位＝5；延伸空位＝罰2分；和gap×dropoff＝50。重組潤滑素的O-連接的取代可以是用潤滑寡糖β-(1-3)-Gal-GalNac或其它部分，包括人工或天然存在的糖部分(諸如硫酸角質(zhì)素或硫酸軟骨素)進(jìn)行的取代。在某些實施方案中，O-連接的取代可以是對重組潤滑素充當(dāng)表面活性磷脂(SAPL)或表面活性劑的載體的能力起作用的部分(Hills，2002)。糖基化或取代百分比根據(jù)重量(干重)確定。在與DNADNA雜交有關(guān)的內(nèi)容中應(yīng)用的高嚴(yán)格性條件包括與下述條件等同的條件，即當(dāng)所用探針長度約為500個核苷酸長時，于42℃在由5X SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4·H2O和1.85g/lEDTA、用NaOH將pH調(diào)整為7.4)、0.5％SDS、5X Denhardt試劑和100μg/ml變性鮭精DNA組成的溶液中進(jìn)行結(jié)合或雜交后，于42℃在含有0.1X SSPE，1.0％SDS的溶液中進(jìn)行洗滌。本文所述多肽或其它化合物在制劑中所占重量(干重)百分比至少為50％時被描述為是“分離的”。本文所述多肽或其它化合物在制劑中所占重量(干重)百分比至少為80％時被描述為是“基本上純的”。本文所述多肽或其它化合物在制劑中所占重量(干重)百分比至少為95％和優(yōu)選99％時被描述為是“均質(zhì)的”。純度通過下述步驟測定，即進(jìn)行還原聚丙烯酰胺凝膠電泳和增強(qiáng)考馬斯藍(lán)染色后，對條帶進(jìn)行光密度描跡(即通過光密度測定法測定蛋白純度)。“無致熱原”指不含可導(dǎo)致發(fā)熱的污染物，包括內(nèi)毒素。對污染物的測定可通過美國食品藥物管理局制訂的適用標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法進(jìn)行。本文所用術(shù)語“治療有效量”指相關(guān)藥物組合物或方法中的各活性成分足以對患者產(chǎn)生具有意義的益處，即治療、治愈、預(yù)防或改善所述相關(guān)醫(yī)學(xué)狀況或加快了治療、治愈、預(yù)防或改善所述狀況的速度的量。當(dāng)該術(shù)語被應(yīng)用在單獨施用單個有效成分的情況中時，則僅與該有效成分有關(guān)。當(dāng)被應(yīng)用在組合施用情況中時，該術(shù)語指可導(dǎo)致獲得療效的有效成分的組合量，而不考慮該組合中各有效成分的施用順序是序貫還是同時。本發(fā)明的實施方案可被用作關(guān)節(jié)內(nèi)補(bǔ)充物。用并非來源于潤滑素的化合物進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)補(bǔ)充已被作為關(guān)節(jié)療法獲得了實踐。例如，利用聚合乙酰透明質(zhì)酸(HA)和更高分子量的hylans(諸如SYNVISC彈粘性液″Hylan G-F 20″--由WYETHPharmaceuticals分銷)進(jìn)行的“粘度補(bǔ)充療法”在臨床上被用于治療與OA有關(guān)的膝關(guān)節(jié)疼痛。該粘度補(bǔ)充療法尤其是在緩解患者負(fù)重疼痛方面已顯示具有重要的治療價值(Wobig et al.，1998)。Hylan G-F 20是通過將從公雞或小雞雞冠獲得的若干種HA分子交聯(lián)而得以生成。與利用較低分子量HA進(jìn)行的粘度補(bǔ)充療法相比，利用Hylan G-F 20進(jìn)行的粘度補(bǔ)充療法可更顯著地有效緩解疼痛(Wobig et al.，1999)。此外，在緩解疼痛方面，不耐受NSAIDs的患者尤其優(yōu)選利用Hylan G-F 20進(jìn)行的粘度補(bǔ)充療法，而不施用NSAIDs(例如，在具有胃腸并發(fā)癥高風(fēng)險的患者中；Espallargues and Pons，2003)。盡管Hylan G-F 20粘度補(bǔ)充療法是安全和易耐受的療法，可短期(即治療后維持3-6個月)減輕疼痛癥狀的同時還可改善關(guān)節(jié)功能，但該療法并不能顯著地使OA患者避免最終更換膝關(guān)節(jié)的需要(Espallargues and Pons，2003)。
實施例1重組潤滑素的克隆
構(gòu)建體.在某些實施方案中，被用于生成重組潤滑素 分子的堿基DNA構(gòu)建體包括SEQ ID NO6中從蛋氨酸密碼子(ATG)到BssHII限制位點(G^CGCGC)的序列(即堿基1-1123)和從SEQ IDNO6的BspEI限制位點(T^CCGGA)到終止密碼子(TAA)的序列(即堿基1269-2946)。這些序列，即SEQ ID NO6中的堿基1-1123和1269-2946編碼天然全長潤滑素(即PRG4)中的氨基酸M1-S373(由外顯子1-5和位于外顯子6中5′-密碼子側(cè)翼的大約174個堿基編碼)和E848-P1404(由位于外顯子6中3′-密碼子側(cè)翼的大約293個堿基和外顯子7-14編碼)。外顯子6在該堿基DNA構(gòu)建體中被缺失的部分與編碼天然PRG4中的氨基酸A374-P847的DNA序列對應(yīng)(由外顯子6編碼的大約940個氨基酸中缺失了474個氨基酸)。該缺失氨基酸序列富含KEPAPTT樣序列。將合成cDNA盒-1的DNA序列(SEQ ID NO1)加至所述堿基構(gòu)建體的BssHII/BspEI(位點)，可獲得重組PRG4-Lub1 cDNA構(gòu)建體(SEQ ID NO6)。SEQ ID NO6包括位于兩個特定DNA序列之間的Lub1 DNA插入片段(SEQ ID NO8；其編碼具有4個KEPAPTT序列的SEQ ID NO9的51個氨基酸)，其中一個DNA序列編碼天然PRG4中的氨基酸M1-S373，另一個DNA序列則編碼天然PRG4中的E848-P1404。換言之，重組潤滑素PRG4-LUB1包括了可形成4個完全KEPAPTT序列和大約3個不完全KEPAPTT序列的51個氨基酸，取代了天然PRG4中從A374到P847(474個氨基酸)的序列。將合成cDNA盒-2的DNA序列(SEQ ID NO3)加至PRG4-Lub1構(gòu)建體的Bsu36I/BspEI(位點)，可獲得PRG4-Lub2 cDNA構(gòu)建體(SEQ ID NO10)。該PRG4-Lub1 cDNA構(gòu)建體具有一個Bsu36I限制位點(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO6中的堿基1225-1231)。當(dāng)把合成cDNA盒-2加入PRG4-Lub1 cDNA構(gòu)建體中時，該Bsu36I位點被破壞了，但合成盒-2含有另一個內(nèi)部Bsu36I限制位點(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO3中的堿基92-98)。因此，可通過將合成cDNA盒-2 Bsu36I/BspEI加至上述PRG4-LubN構(gòu)建體中由合成cDNA盒-2提供的內(nèi)部Bsu36I限制位點，以制備PRG4-LubN+1構(gòu)建體。所述cDNA盒被合成為單鏈寡核苷酸形式，并可雜交在一起，生成具有粘性末端的雙鏈DNA片段。這是末端BssHII、Bsu36I和BspEI位點不完整的原因。在合成cDNA盒-1(SEQ ID NO1)中，與位于BssHII(G^CGCGC)和BspEI(T^CCGGA)限制位點兩側(cè)的殘留部分結(jié)合的序列包括內(nèi)部Bsu36I限制位點(CC^TNAGG，即CC^TAAGG)；該限制位點如下劃線部分所示CGCGCCCACAACTCCAAAAGAGCCCGCACCTACCACGACAAAGTCAGCTCCTACTACGCCCAAAGAGCCAGCGCCGACGACTACTAAAGAACCGGCACCCACCACGCCTAAGGAGCCAGCTCCTACTACAACGAAACCGGCACCAACCACTCCGG
SEQ ID NO2是SEQ ID NO1的翻譯序列，包括4個完全匹配的KEPAPTT序列(如突出部分所示)
合成cDNA盒-2(SEQ ID NO3)同樣具有殘留的5′-末端Bsu36I限制位點(即CC^TNAGG，僅由TAA序列證實)、3′-末端殘留BspEI限制位點(T^CCGGA)和內(nèi)部Bsu36I限制位點(CC^TNAGG)；這些限制位點如下劃線部分所示TAAAGAACCAGCCCCTACTACGACAAAGGAGCCTGCACCCACAACCACGAAGAGCGCACCCACAACACCAAAGGAGCCGGCCCCTACGACTCCTAAGGAACCCAAACCGGCACCAACCACTCCGG
SEQ ID NO4是SEQ ID NO3的翻譯序列，包括3個完全匹配的KEPAPTT序列(如突出部分所示) 在pTmed2載體(構(gòu)建體外加載體等同于SEQ ID NO5)中，重組PRG4-Lub1 cDNA構(gòu)建體(SEQ ID NO6)的側(cè)翼為SalI(G^TCGAC；SEQ ID NO5中的堿基1027-1032)和NotI(GC^GGCCGC；SEQ ID NO5中的堿基3984-3991)限制位點。SalI位點將修飾的Kozak翻譯起始序列(CCCACC；SEQ ID NO5中的堿基1032-1037)整合在翻譯起始密碼子ATG(SEQ ID NO5中的堿基1038-1040)之前。BssHII(G^CGCGC；SEQ ID NO5中的堿基2155-2160)和BspEI(T^CCGGA；SEQ ID NO5中的堿基2306-2311)限制位點之間具有上述內(nèi)部Bsu36I克隆位點(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO5中的堿基2262-2268)。PRG4-Lub1 cDNA構(gòu)建體(SEQ ID NO6)被翻譯進(jìn)PRG4-LUB1蛋白(SEQ ID NO7)中。介于完整PRG4-LUB1蛋白(SEQ ID NO7)中S373-E425(即天然PRG4的E848)之間的插入片段是如SEQ ID NO9所示的51個氨基酸。這些氨基酸從Lub1 DNA插入片段(SEQ ID NO8)翻譯，包括4個完全的KEPAPTT序列。BssHII限制位點(G^CGCGC；SEQ ID NO6中的堿基1118-1123)和BspEI限制位點(T^CCGGA；SEQ ID NO6的堿基1269-1274)之間具有內(nèi)部Bsu36I克隆位點(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO6中的堿基1225-1231)。與重組PRG4-Lub1構(gòu)建體被包含在pTmed2載體中的情況一樣，在pTmed2載體中，重組PRG4-Lub2 cDNA構(gòu)建體(SEQ ID NO10)的側(cè)翼為SalI(G^TCGAC)和NotI(GC^GGCCGC)限制位點；SalI位點將修飾的Kozak翻譯起始序列(CCCACC)整合在翻譯起始密碼子ATG(SEQ ID NO10中的堿基1-3)之前。同樣，在pTmed2載體中，重組PRG4-Lub3 cDNA構(gòu)建體(SEQ ID NO14)、重組PRG4-Lub4 cDNA構(gòu)建體(SEQ ID NO18)和重組PRG4-Lub5 cDNA構(gòu)建體(SEQ ID NO22)的側(cè)翼均為SalI(G^TCGAC)和NotI(GC^GGCCGC)限制位點；SalI位點將修飾的Kozak翻譯起始序列(CCCACC)整合在翻譯起始密碼子ATG(分別為SEQ ID NO14、18和22中的堿基1-3)之前。PRG4-Lub2 cDNA構(gòu)建體中的內(nèi)部Bsu36I克隆位點(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO10中的堿基1318-1324)位于BssHlI(G^CGCGC；堿基1118-1123)和BspEI(T^CCGGA；堿基1347-1352)限制位點之間。PRG4-Lub2構(gòu)建體(SEQ ID NO10)被翻譯進(jìn)PRG4-LUB2蛋白(SEQ ID NO11)中。介于完整PRG4-LUB2蛋白(SEQ ID NO11)中S373-E451(即天然PRG4的E848)之間的插入片段是如SEQ ID NO13所示的77個氨基酸。這些氨基酸從Lub2 DNA插入片段(SEQ ID NO12)翻譯。重組潤滑素PRG4-LUB2中取代了天然PRG4內(nèi)A374-P847(474個氨基酸)的77個氨基酸形成了6個完全的KEPAPTT序列和大約4個不完全的KEPAPTT序列。PRG4-Lub3 cDNA構(gòu)建體中的內(nèi)部Bsu36I克隆位點(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO14中的堿基1411-1417)位于BssHII(G^CGCGC；堿基1118-1123)和BspEI(T^CCGGA；堿基1440-1445)限制位點之間。PRG4-Lub3構(gòu)建體(SEQ ID NO14)被翻譯進(jìn)PRG4-LUB3蛋白(SEQ ID NO15)中。介于完整PRG4-LUB3蛋白(SEQ ID NO15)中S373-E482(即天然PRG4的E848)之間的插入片段是如SEQ ID NO17所示的108個氨基酸。這些氨基酸從Lub3 DNA插入片段(SEQ ID NO16)翻譯。重組潤滑素PRG4-LUB3中取代了天然PRG4內(nèi)A374-P847(474個氨基酸)的108個氨基酸形成了9個完全KEPAPTT序列和大約5個不完全的KEPAPTT序列。PRG4-Lub4 cDNA構(gòu)建體中的內(nèi)部Bs36I克隆位點(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO18中的堿基1504-1510)位于BssHII(G^CGCGC；堿基1118-1123)和BspEI(T^CCGGA；堿基1533-1538)限制位點之間。PRG4-Lub4構(gòu)建體(SEQ ID NO18)被翻譯進(jìn)PRG4-LUB4蛋白(SEQ ID NO19)中。完整PRG4-LUB4蛋白(SEQ ID NO19)中介于S373-E513(即天然PRG4的E848)之間的插入片段是如SEQ ID NO21所示的139個氨基酸。這些氨基酸從Lub4 DNA插入片段(SEQ ID NO20)翻譯。重組潤滑素PRG4-LUB4中取代了天然PRG4內(nèi)A374-P847(474個氨基酸)的139個氨基酸形成了12個完全KEPAPTT序列和大約6個不完全KEPAPTT序列。PRG4-Lub5 cDNA構(gòu)建體中的內(nèi)部Bsu36I克隆位點(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO22中的堿基1597-1603)位于BssHII(G^CGCGC；堿基1118-1123)和BspEI(T^CCGGA；堿基1626-1631)限制位點之間。PRG4-Lub5構(gòu)建體(SEQ ID NO22)被翻譯進(jìn)PRG4-LUB5蛋白(SEQ ID NO23)中。介于完整PRG4-LUB5蛋白(SEQ ID NO23)中S373-E544(即天然PRG4的E848)之間的插入片段是如SEQ ID NO25所示的170個氨基酸。這些氨基酸從Lub5 DNA插入片段(SEQ ID NO24)翻譯。重組潤滑素PRG4-LUB5中取代了天然PRG4內(nèi)A374-P847(474個氨基酸)的170個氨基酸形成了15個完全KEPAPTT序列和大約6個不完全KEPAPTT序列。重要的是，插入合成cDNA盒-2的過程可以無限重復(fù)。每次重復(fù)可加入3個完全KEPAPTT序列。與通過該方式利用插入序列而得以構(gòu)建的重組潤滑素PRG4-LUB2到PRG4-LUB5一樣，也可構(gòu)建重組潤滑素PRG4-LUB6-PRG4-LUBN。表2為BssHII/BspEl插入序列的概括。本發(fā)明提供的優(yōu)選實施方案是編碼重組潤滑素并被克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pTmed2的SalI(G^TCGAC；SEQ ID NO5中的堿基1027-1032)和NotI(GC^GGCCGC；SEQ ID NO5中的堿基3984-3991)限制位點中的cDNA構(gòu)建體(例如，pTmed2表達(dá)載體中的重組PRG4-Lub1 cDNA構(gòu)建體位于SEQ ID NO5中的堿基1038-3983之間)。SalI位點將修飾的Kozak翻譯起始序列的第一個堿基(CCCACC；SEQ ID NO5的堿基1032)整合在蛋氨酸起始密碼子(ATG；SEQ ID NO5中的堿基1038-1040)之前。本發(fā)明的另一些實施方案包括其它限制位點組合和其它表達(dá)載體。在一種優(yōu)選實施方案中，所述重復(fù)方法利用了位于表達(dá)載體pTmed2中，且側(cè)翼為用于BssHII(G^CGCGC)和BspEI(T^CCGGA)的限制位點的合成cDNA盒-1(SEQ ID NO1)，以及包括內(nèi)部Bsu36I限制位點(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO1中的堿基107-113)的合成cDNA盒-1。對在該優(yōu)選實施方案中重復(fù)生成的含有KEPAPTT樣序列的重組潤滑素構(gòu)建體而言，合成cDNA盒-2(SEQ IDNO3)被插入在該重組構(gòu)建體的Bsu36I和BspEI位點之間。合成cDNA盒-2(SEQ ID NO3)的側(cè)翼為經(jīng)過修飾的殘留Bsu36I位點(TAAAG)和殘留BspEI(ACTCCGG)位點。還包括內(nèi)部Bsu36I位點(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO3中的堿基92-98)。在將合成cDNA盒-2克隆進(jìn)重組潤滑素構(gòu)建體的Bsu36I和BspEI位點中的基礎(chǔ)上，原始構(gòu)建體的Bsu36I克隆位點被破壞了，在新構(gòu)建體中僅殘留了一個Bsu36I克隆位點。在該優(yōu)選實施方案中，氨基酸序列“APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTTKEPAPTTPKEPAPTTTK”(SEQ ID NO26；45個氨基酸)保留了各PRG4-LUBN蛋白(其中N＝1或更大的整數(shù))中的一個部分。此外，氨基酸序列“KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP”(SEQ ID NO27；31個氨基酸)由特定DNA插入片段編碼，該插入片段通過將合成cDNA盒-2Bsu36I/BsuEI加入PRG4-LubN cDNA構(gòu)建體而得以成為各PRG4-LubN+1 cDNA構(gòu)建體的一部分。在優(yōu)選實施方案中，對N為大于或等于3的整數(shù)的PRG4-LUBN蛋白而言，氨基酸序列“EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP”(SEQ ID NO28；22個氨基酸)將SEQ ID NO26與SEQ ID NO27的(N-2)個重復(fù)連接起來。此外，在N為大于或等于2的整數(shù)的PRG4-LUBN蛋白優(yōu)選實施方案中，氨基酸序列“KEPKPAPTTP”(SEQ ID NO29；10個氨基酸)直接位于最后一個SEQ ID NO27的插入重復(fù)之后。由于SEQ ID NO26、SEQ ID NO27和SEQ ID NO28形成了至少2個KEPAPTT序列，本文將它們均稱為“重復(fù)的KEPAPTT樣序列”(SEQ ID 28的N-末端與K殘基相連，因此SEQ ID NO28在PRG4-LUBN蛋白中形成了2個KEPAPTT序列)。因此，對重組潤滑素蛋白PRG4-LUBN(其中N為等于1或大于1的整數(shù))而言，優(yōu)選實施方案中的PRG4-LUBN蛋白包括SEQID NO26。此外，對重組潤滑素蛋白PRG4-LUBN(其中N為等于2或大于2的整數(shù))而言，優(yōu)選實施方案中的PRG4-LUBN蛋白還包括SEQ ID NO27。SEQ ID NO27在這些優(yōu)選實施方案的各PRG4-LUBN蛋白內(nèi)重復(fù)了(N-1)次。在PRG4-LUB2中，SEQ ID NO26和SEQ IDNO27重疊(即它們共有一個KEPAPTT序列)
在N為大于或等于3的整數(shù)的另一些優(yōu)選實施方案(例如，N等于3-200的整數(shù)，或更優(yōu)選的實施方案中，即在N等于5-50的整數(shù)，或在還要更優(yōu)選的實施方案中，即N等于10-30的整數(shù))中，重組潤滑素蛋白包括SEQ ID NO28所示的22個氨基酸，這些氨基酸將SEQ ID NO26的N-末端方向的45個氨基酸與SEQ ID NO27所示31個氨基酸的(N-2)個重復(fù)連接在一起，其中SEQ ID NO29所示10個氨基酸位于SEQ ID NO27的最后一個31個氨基酸的重復(fù)的C-末端。表3.優(yōu)選PRG4-LUB蛋白中的序列頻率 在N等于重復(fù)KEPAPTT樣序列數(shù)目的優(yōu)選實施方案中，PRG4-LUBN蛋白通常具有(3×N)個重復(fù)的KEPAPTT序列。重組潤滑素PRG4-LUB5(在優(yōu)選實施方案中具有3×N＝3×5＝15個拷貝的KEPAPTT序列)是最大的重組潤滑素PRG4-LUBN，其序列由本文具體公開。不過，對本發(fā)明的重組潤滑素而言，N值可能大于5，諸如7、10、12、15、20、25、30、40、50、100、150、200或更大值。具體而言，本文具體描述的蛋白質(zhì)PRG4-LUB1、PRG4-LUB2、PRG4-LUB3、PRG4-LUB4和PRG4-LUB5分別具有4、6、9、12和15個完全的KEPAPTT序列。但通過連續(xù)進(jìn)行本文所述的重復(fù)LubN插入方法使添加的KEPAPTT序列數(shù)不斷增加是可能的。我們具體描述了與天然PRG4/潤滑素蛋白相比，所具有的KEPAPTT或KEPAPTT樣序列數(shù)相對較少的PRG4-LUBN重組潤滑素，因為較小的蛋白質(zhì)易于合成和操縱。使KEPAPTT樣序列的數(shù)目超過天然PRG4蛋白所含該序列數(shù)也可能是理想的。這可通過下述兩種方法實現(xiàn)，即連續(xù)進(jìn)行本文所述的重復(fù)LubN插入方法，使重組潤滑素PRG4-LUBN蛋白中含有78個以上的KEPAPTT樣序列，或者首先利用完整PRG4 cDNA，而不是外顯子6-缺失或外顯子6-不完整形式的PRG4 cDNA。因此，加入的任意KEPAPTT樣序列的數(shù)目均應(yīng)超過其存在于天然PRG4蛋白中的數(shù)目。本發(fā)明包括了從完整PRG4 cDNA生成較大重組潤滑素蛋白的插入方法，以及利用外顯子6-缺失或外顯子6-不完整形式的PRG4cDNA的插入方法。
實施例2′LUB′蛋白的表達(dá)和純化
如下所述，在經(jīng)過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和預(yù)適應(yīng)的CHO DUKX細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)PRG4-Lub1 cDNA構(gòu)建體(SEQ ID NO6；含有合成cDNA盒-1序列)，并從條件培養(yǎng)基中將其純化后，溶解在含有500mM L-精氨酸鹽酸鹽的PBS中。在經(jīng)過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO DUKX細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)PRG4-Lub1cDNA構(gòu)建體，并收集條件培養(yǎng)基。利用安裝了10kDa標(biāo)稱分子量截留極限(NMWL)、30kDa NMWL或100kDa NMWL PALLFILTRONOMEGATM圓盤膜的AMICONM2000TM過濾設(shè)備在壓縮氮氣(40psi)條件下過濾濃縮2升體積的該條件培養(yǎng)基。從圓盤膜上抽吸獲得濃縮體積約為100ml的培養(yǎng)基。接著將該圓盤膜從AMICONM2000TM過濾設(shè)備上移除。利用細(xì)胞刮棒收集圓盤膜表面積聚的“粘液”存留物，轉(zhuǎn)移進(jìn)微量離心管中。以12,000xg離心微量離心管中的樣品10分鐘，除去水性上清液。將存留的“潤滑素-富集的”沉淀溶解在含有500mM L-精氨酸鹽酸鹽的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中。L-精氨酸鹽酸鹽的濃度范圍可以是100mM-2.0M。利用上述方法，直接從圓盤膜上獲得了從PRG4-LUB2到PRG4-LUB5糖蛋白(和PRG4-LUBN蛋白，其中N＝6或大于6的非負(fù)整數(shù)，以及含有KEPAPTT樣序列的其它糖蛋白)，即未純化圓盤膜上截留的濃縮液。也就是說，直接從10kDa NMWL、30kDa NMWL或100kDa NMWL PALL FILTRONOMEGATM過濾設(shè)備的圓盤膜上分離出了這些重組潤滑素糖蛋白。在某些情況中，也可通過層析技術(shù)或電泳技術(shù)或二者的組合從圓盤膜上截留的濃縮液中純化出這些糖蛋白。也可利用層析法和本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)純化重組潤滑素蛋白和糖蛋白(正如例如，US6433142有關(guān)MSF蛋白的描述；也可參考Deutscher，1990和Scopes，1994)。
實施例3免疫組織化學(xué)
進(jìn)一步利用免疫組織化學(xué)技術(shù)研究正常和骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中潤滑素的細(xì)胞來源。此外，根據(jù)下述方法還檢查了包括胸膜、心包、腹膜和腦膜在內(nèi)的其它組織表面是否存在潤滑素。在接受膝關(guān)節(jié)更換手術(shù)的患者同意的情況下獲得了骨關(guān)節(jié)炎軟骨和滑膜。接受檢查的其它組織為正常人滑膜和正常非人靈長類動物(NHP)滑膜、軟骨、胸膜、心包、腹膜、腦膜、腦、腱和韌帶，以及犬科動物的正常和骨關(guān)節(jié)炎半月板、軟骨、滑膜、韌帶和腱。在采集后或在不含和含有補(bǔ)充莫能菌素(5μM)的培養(yǎng)基中溫育24小時后，立即將這些組織固定在4％多聚甲醛中。為進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究，將這些組織固定在4％多聚甲醛中24小時后制備6-8微米厚的石蠟切片。將少部分組織冷凍在光學(xué)相干性X射線斷層術(shù)(OCT)冷凍化合物中，并以5-10微米的間距切片后進(jìn)行丙酮固定。免疫組織化學(xué)和免疫熒光分析利用的是通過用截短形式的重組潤滑素免疫生成并利用蛋白A柱純化后獲得的純化多克隆兔抗人潤滑素抗體(Ab 06A10)。CD16抗體(NEOMARKERS，F(xiàn)remont CA)被用于鑒定巨噬細(xì)胞(Fcy受體III)。CD106/VCAM-1抗體(NEOMARKERS)被用于標(biāo)記恒冷箱切片內(nèi)的成纖維細(xì)胞。對照切片則連續(xù)利用了等濃度的RIgG(VECTOR LABSTM，CA)、MIgG1(DAKO)和MIgG2a(DAKO)。采用Dextran Technology System(ENVISION+TM；DAKO)使抗體結(jié)合顯影，并用Mayer的明礬蘇木精對切片進(jìn)行復(fù)染。利用上述初級抗體進(jìn)行免疫熒光檢驗，并用第二抗體(Alexa Dyes-MOLECULAR PROBESTM，Oregon)山羊抗兔Alexa染料于546nm和山羊抗小鼠Alexa染料于488nm波長處探測?？贵w的熒光結(jié)合用NIKON熒光顯微鏡檢測。沿人正常和骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的表面檢測潤滑素。原纖維化的骨關(guān)節(jié)炎表面被厚潤滑素層完全包被。CD106免疫熒光檢驗結(jié)果顯示滑膜的內(nèi)膜成纖維細(xì)胞的細(xì)胞膜染色深；滑膜細(xì)胞內(nèi)染色也顯示存在潤滑素蛋白。對CD106+潤滑素雙重免疫染色的結(jié)果清晰顯示二者共同定位于滑膜的內(nèi)膜成纖維細(xì)胞內(nèi)。對滑膜巨噬細(xì)胞的CD16染色結(jié)果證實這些細(xì)胞存在于整個滑膜層中，但未與潤滑素共同定位。用潤滑素抗體對NHP和犬科動物關(guān)節(jié)組織(正常和OA)的染色結(jié)果顯示潤滑素包被了滑膜、軟骨、半月板和腱的表面。在未加入莫能菌素以提高所述糖蛋白的細(xì)胞內(nèi)含量的情況下，NHP軟骨的淺區(qū)細(xì)胞和移行區(qū)細(xì)胞中都顯示具有強(qiáng)免疫反應(yīng)性。沿腹膜、心包和胸膜分布的細(xì)胞也顯示存在潤滑素表達(dá)，但在腦膜或腦內(nèi)未觀測到免疫反應(yīng)性。概括而言，正常和骨關(guān)節(jié)炎滑膜、腱、半月板和軟骨均包被了充實的潤滑素層。該糖蛋白明顯地存在于OA關(guān)節(jié)內(nèi)的組織上。對人OA滑膜雙重免疫熒光染色的結(jié)果證實內(nèi)膜成纖維細(xì)胞滑膜細(xì)胞負(fù)責(zé)了潤滑素的合成。尚無與潤滑素蛋白在關(guān)節(jié)組織外部的定位有關(guān)的報道。在肺胸膜、心包和腹膜上明確證實存在潤滑素表層。一般認(rèn)為潤滑素在滑膜關(guān)節(jié)內(nèi)具有潤滑功能，但在其它組織內(nèi)還可能具有多重作用，包括但不限于潤滑和抗粘連功能。用潤滑素補(bǔ)充這些其它組織是本發(fā)明包括的生物療法。
實施例4作為機(jī)械潤滑劑的重組潤滑素
重組潤滑素可作為潤滑劑，通常與例如密封墊或軸承等一起應(yīng)用。例如，標(biāo)題為“Self-lubricating seal”的US3973781、標(biāo)題為“Grooved mechanical face seal”的US4491331、標(biāo)題為“Multi lip seal”的US4560174，以及標(biāo)題為“Differential surface roughness dynamic sealsand bearings”的US4973068均描述了不同設(shè)計形式的密封墊。重組潤滑素可作為潤滑劑與這些密封墊一起應(yīng)用。具體而言，重組潤滑素可被用作醫(yī)療設(shè)備、假體和植入物的潤滑劑尤其是在必需生物相容性潤滑劑的情況下。此外，其應(yīng)用不僅限于醫(yī)療，還包括在對環(huán)境要求敏感的情況中的應(yīng)用，即應(yīng)用生物相容性潤滑劑可能是理想的情況。
實施例5重組潤滑素組合物
本發(fā)明所述重組潤滑素可與藥學(xué)可接受載體組合應(yīng)用在藥物組合物中。這種組合物(除含有上述蛋白質(zhì)和載體外)還可含有稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑及本領(lǐng)域熟知的其它物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)可接受的”指不干擾有效成分的生物學(xué)活性作用效果的無毒物質(zhì)。所述載體的特征取決于給藥途徑。本發(fā)明所述藥物組合物還可含有細(xì)胞因子、淋巴因子或其它造血因子，諸如M-CSF、GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、TNF1、TNF2、G-CSF、Meg-CSF、血小板生成素、干細(xì)胞生長因子和促紅細(xì)胞生成素。該藥物組合物可進(jìn)一步含有可增強(qiáng)所述蛋白活性或?qū)ζ湓谥委熤械幕钚曰蛴猛酒鹧a(bǔ)充作用的其它物質(zhì)。這些其它的因子和/或物質(zhì)可被包括在該藥物組合物中，從而與本發(fā)明所述蛋白產(chǎn)生協(xié)同作用，或?qū)⒏弊饔脺p至最少。反過來，本發(fā)明所述蛋白也可被包括在上述特定細(xì)胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶栓劑或抗凝因子，或抗炎癥劑的制劑中，從而將副作用減至最少。將重組潤滑素蛋白與上述聚合乙酰透明質(zhì)酸(HA)和較高分子量的hylans組合應(yīng)用于關(guān)節(jié)內(nèi)補(bǔ)充是尤其優(yōu)選的?？蓱?yīng)用于關(guān)節(jié)內(nèi)補(bǔ)充的另一些優(yōu)選組合包括重組潤滑素蛋白與麻醉劑(例如利多卡因)、類固醇(例如丙酮縮去炎松己酸酯)或放射性同位素(例如釔)的組合應(yīng)用。可應(yīng)用于關(guān)節(jié)內(nèi)補(bǔ)充的另一些優(yōu)選組合可包括自體或異源細(xì)胞制劑(例如培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞或干細(xì)胞的細(xì)胞制劑，而無論其來源為自身或異源)。本發(fā)明所述重組潤滑素可以多聚體(例如異二聚體或同二聚體)或與其本身或其它蛋白復(fù)合的形式發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明所述藥物組合物可能包括這種多聚或復(fù)合形式的本發(fā)明蛋白。本發(fā)明所述藥物組合物可能為復(fù)合形式，即由本發(fā)明所述重組潤滑素蛋白和蛋白或肽抗原復(fù)合而成。該蛋白和/或肽抗原可將刺激信號送遞至B和T淋巴細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞通過其表面免疫球蛋白受體應(yīng)答抗原。T淋巴細(xì)胞則在MHC蛋白呈遞抗原后通過其T細(xì)胞受體(TCR)應(yīng)答該抗原。包括那些由宿主細(xì)胞上的I和II類MHC基因編碼的MHC和結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白在內(nèi)的MHC和結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白可將所述肽抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞?？乖M分也可被作為純化MHC-肽復(fù)合物單獨提供，或與可直接向T細(xì)胞傳遞信號的共同刺激分子一起被組合提供。能夠結(jié)合B細(xì)胞上的表面免疫球蛋白和其它分子的可選抗體和能夠結(jié)合T細(xì)胞上的TCR和其它分子的抗體均可與本發(fā)明所述藥物組合物組合。本發(fā)明所述藥物組合物可為脂質(zhì)體形式，其中除其它藥學(xué)可接受載體外，還組合含有本發(fā)明所述蛋白和兩親劑，諸如可以膠束、不溶性單層、液晶或薄層的聚集形式存在于水性溶液的脂質(zhì)。適用于脂質(zhì)體制劑的合適脂質(zhì)包括，但不限于甘油單酯、甘油二酯、硫苷酯、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、膽酸等。這種脂質(zhì)體制劑的制備方法是本領(lǐng)域熟知的，被公開在例如US4235871、US4501728、US4837028和US4737323中。在實施本發(fā)明所述治療或應(yīng)用方法的過程中，是將治療有效量的本發(fā)明蛋白施用于存在待治療狀況的被試者(例如哺乳動物)。根據(jù)本發(fā)明方法，可單獨施用本發(fā)明所述蛋白，或與其它療法組合施用，諸如應(yīng)用細(xì)胞因子、淋巴因子、其它造血因子或以細(xì)胞為基礎(chǔ)的補(bǔ)充物所進(jìn)行的治療。當(dāng)與一種或多種細(xì)胞因子、淋巴因子、其它造血因子或以細(xì)胞為基礎(chǔ)的補(bǔ)充物共同施用時，施用本發(fā)明蛋白和這些細(xì)胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶栓劑或抗凝因子，或以細(xì)胞為基礎(chǔ)的補(bǔ)充物的順序可為同時或序貫。如為序貫施用，則由主治醫(yī)師決定組合施用本發(fā)明蛋白和細(xì)胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶栓劑或抗凝因子，或以細(xì)胞為基礎(chǔ)的補(bǔ)充物的順序。被應(yīng)用在本發(fā)明所述藥物組合物中或被用于實施本發(fā)明所述方法的本發(fā)明蛋白的施用可通過多種常規(guī)方法實現(xiàn)，諸如皮膚、皮下、腹膜內(nèi)、腸胃外或靜脈注射，或在某些情況中采用口服、吸入、體表應(yīng)用的施用方法。通常優(yōu)選通過注射進(jìn)入關(guān)節(jié)組織內(nèi)而實現(xiàn)對患者給藥的方法(Schumacher，2003)。當(dāng)通過口服方式施用治療有效量的本發(fā)明蛋白時，其形式可為片劑、膠囊、粉劑、溶液或酏劑。當(dāng)以片劑形式被施用時，本發(fā)明藥物組合物可另外含有諸如明膠的固體載體或佐劑。該片劑、膠囊和粉劑含有大約5-95％的本發(fā)明蛋白，優(yōu)選地含有大約25-90％的本發(fā)明蛋白。當(dāng)以液體形式被施用時，可加入液體載體，諸如水、石油、動物或植物來源的油，諸如花生油、礦物油、大豆油或芝麻油，或合成的油。液體形式的藥物組合物可進(jìn)一步含有生理鹽水、葡萄糖或其它糖溶液，或諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇的二元醇。當(dāng)以液體形式被施用時，按重量計算，該藥物組合物含有大約0.5-90％的本發(fā)明蛋白，優(yōu)選含有大約1-50％的本發(fā)明蛋白。當(dāng)通過靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射施用治療有效量的本發(fā)明蛋白時，本發(fā)明蛋白應(yīng)為無致熱原、腸胃外可接受的水性溶液形式。這種腸胃外可接受蛋白溶液的制備方法在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)，應(yīng)考慮pH、等滲性、穩(wěn)定性等因素。適用于靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射的優(yōu)選藥物組合物除含有本發(fā)明蛋白外，還應(yīng)含有等滲載體，諸如氯化鈉注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、乳酸化林格氏注射液或本領(lǐng)域已知的其它載體。本發(fā)明藥物組合物還可含有穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖劑、抗氧化劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它添加劑。例如，與利多卡因或其它局部麻醉劑、類固醇或腎上腺類固醇、HA和/或hylans，或放射性同位素聯(lián)合或組合在一起的注射方法均被包括在本發(fā)明中。本發(fā)明蛋白在本發(fā)明藥物組合物中的量取決于待治療狀況的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，以及患者之前已接受的治療的性質(zhì)。最終由主治醫(yī)師決定治療個體患者所需本發(fā)明蛋白的量。最初，主治醫(yī)師應(yīng)施用低劑量的本發(fā)明蛋白，并觀察患者的反應(yīng)。直到對該患者在不進(jìn)一步提高劑量的情況下已獲得理想治療效果時才可施用較大劑量的本發(fā)明蛋白。根據(jù)施用方法和實施的準(zhǔn)確療程，預(yù)期被用于實施本發(fā)明方法的多種藥物組合物的施用劑量應(yīng)為每公斤體重施用大約0.01μg-大約100mg(優(yōu)選大約0.1μg-大約10mg，更優(yōu)選大約0.1μg-大約1mg)的本發(fā)明蛋白。如果通過靜脈內(nèi)途徑施用，利用含有本發(fā)明重組潤滑素的藥物組合物進(jìn)行靜脈內(nèi)治療的持續(xù)時間應(yīng)根據(jù)待治療疾病的嚴(yán)重程度和個體患者的狀況和潛在特異體質(zhì)反應(yīng)的不同進(jìn)行調(diào)整。預(yù)期每次連續(xù)靜脈內(nèi)施用本發(fā)明蛋白的持續(xù)時間應(yīng)為12-24個小時。最終由主治醫(yī)師決定利用本發(fā)明藥物組合物進(jìn)行靜脈內(nèi)治療的合適持續(xù)時間。對有助于治療骨、軟骨、腱或韌帶的本發(fā)明組合物而言，治療方法包括將該組合物局部、系統(tǒng)地施用或作為植入物或裝置局部施用。應(yīng)用于本發(fā)明的治療組合物被施用時應(yīng)為生理學(xué)可接受形式，且必須不含致熱原。此外，該組合物可能需要被膠囊化或以粘質(zhì)形式注射，以送遞至骨、軟骨或組織損傷部位。體表施用可能適用于某些傷口愈合和組織修復(fù)狀況。在本發(fā)明方法中，可選或另外地，可將還可任選地被包括在上述組合物中并有助于治療的物質(zhì)與含本發(fā)明重組潤滑素蛋白的組合物同時或序貫施用。該組合物優(yōu)選地應(yīng)包括能夠?qū)⒑兴龅鞍椎慕M合物送遞至骨和/或軟骨損傷部位、可能能夠使發(fā)育中的骨和軟骨具有結(jié)構(gòu)，以及任選地能夠被吸收進(jìn)體內(nèi)的基質(zhì)。這種基質(zhì)可由目前應(yīng)用于其它移植醫(yī)學(xué)應(yīng)用的材料制成。如應(yīng)用上述基質(zhì)，應(yīng)基于生物相容性、生物降解力、機(jī)械特性、外觀和界面特性選擇基質(zhì)材料。本發(fā)明所述組合物的這一特殊應(yīng)用相應(yīng)限定了合適的制劑?？赡苓m用于該組合物的基質(zhì)可能是生物可降解和已被化學(xué)定義的硫酸鈣、磷酸三鈣、羥磷灰石、聚乳酸、聚乙醇酸和聚酐。另一些可能適用的材料是生物可降解和已被生物學(xué)具體定義的材料，諸如骨或皮膚膠原。所述基質(zhì)進(jìn)一步包括純蛋白或胞外基質(zhì)組分。另一些可能適用的基質(zhì)是非生物可降解和已被化學(xué)定義的基質(zhì)，諸如燒結(jié)羥磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽或其它陶瓷。所述基質(zhì)可包括上述任意類型材料的組合，諸如聚乳酸和羥磷灰石或膠原和磷酸三鈣。生物陶瓷的組分可以變化，諸如鈣-鋁酸鹽-磷酸鹽的各組分比例可以變化，并可經(jīng)過加工，從而改變孔的大小、顆粒大小、顆粒形狀和生物降解力。在進(jìn)一步的組合物中，本發(fā)明蛋白可與有助于治療骨和/或軟骨缺陷、傷口或存在問題的組織的其它物質(zhì)組合在一起。這些物質(zhì)包括多種生長因子，諸如表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-α和TGF-β)，以及胰島素樣生長因子(IGF)。目前，該治療組合物也具有獸醫(yī)應(yīng)用價值。除人以外，尤其是諸如貓和狗的家畜、諸如小鼠和大鼠的實驗室動物，以及馬均是尤其適合接受利用本發(fā)明重組潤滑素蛋白進(jìn)行的這種治療的被試者或患者。含有所述蛋白的藥物組合物被應(yīng)用于組織再生方面時的給藥方案應(yīng)由主治醫(yī)師根據(jù)下述多種可改變所述蛋白作用效果的要素確定，例如希望形成的組織的重量、受損部位、受損組織的狀況、傷口大小、受損組織類型(例如軟骨或腱)、患者的年齡、性別、飲食、所有感染的嚴(yán)重程度、給藥時間及其它臨床要素。劑量可隨著重構(gòu)所應(yīng)用基質(zhì)的類型和所述藥物組合物中包含的其它蛋白的改變而調(diào)整。例如，在最終組合物中加入其它已知的生長因子，諸如IGF I(胰島素樣生長因子I)也可能影響該劑量。通過例如，X-射線、組織形態(tài)測定和四環(huán)素標(biāo)記法定期評估組織/骨生長和/或修復(fù)狀況，以監(jiān)測再生過程。本發(fā)明多核苷酸還可被用于基因治療。該多核苷酸可通過體內(nèi)或離體方法被導(dǎo)入被試者(例如哺乳動物)的細(xì)胞內(nèi)，并在其中表達(dá)。本發(fā)明多核苷酸還可通過其它已知適用于將核酸導(dǎo)入細(xì)胞或生物內(nèi)的方法被施用(包括但不限于，以病毒載體或裸DNA的形式)。也可在存在本發(fā)明核酸或蛋白的條件下體外培養(yǎng)細(xì)胞，使該細(xì)胞增殖或?qū)ζ洚a(chǎn)生預(yù)期作用或使其具有預(yù)期活性。接著可將經(jīng)過處理的細(xì)胞導(dǎo)入體內(nèi)用于治療。
實施例6抗-潤滑素抗體
本發(fā)明所述重組潤滑素蛋白還可被用于免疫動物，以獲得可與其或在某些實施方案中與其天然對應(yīng)物特異性反應(yīng)的多克隆和單克隆抗體。以完整重組潤滑素蛋白或其片段作為免疫原便可獲得這種抗體。所述肽免疫原的羧基末端還可含有半胱氨酸殘基，并可與諸如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)的半抗原結(jié)合。本領(lǐng)域已知這種肽的合成方法(例如Merrifield，1963和Krstenansky et al.，1987所述方法)?？膳c本發(fā)明重組潤滑素蛋白結(jié)合的單克隆抗體可能是有助于免疫檢測相關(guān)蛋白的診斷劑。中和可與這些相關(guān)蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可能是有助于治療與潤滑素相關(guān)病癥或在某些情況中是有助于治療可能涉及潤滑素異常表達(dá)的某些癌癥形式(例如滑膜瘤)的療法。除了可導(dǎo)向重組潤滑素蛋白多肽核心的抗體外，可導(dǎo)向重組潤滑素蛋白的糖部分或糖蛋白復(fù)合體的抗體也是理想的抗體。為生成可與糖基化重組潤滑素結(jié)合(而不結(jié)合其去糖基化形式)的抗體，免疫原優(yōu)選氨基酸序列跨重組潤滑素的高度糖基化部分，例如重復(fù)KEPAPTT樣序列的糖肽。也可以將在該高度糖基化區(qū)域范圍內(nèi)的較短糖肽，例如8-15個氨基酸長度的糖肽作為免疫原。生成高度糖基化生物分子的抗體的方法是本領(lǐng)域已知的(例如Schneerson et al.，1980所述方法)。
實施例7重組潤滑素送遞
送遞重組潤滑素采用了標(biāo)準(zhǔn)方法。對關(guān)節(jié)內(nèi)施用而言，是將濃度范圍為20-500μg/ml的重組潤滑素送遞進(jìn)滑膜腔，且單次注射體積為大約0.1-2ml。例如，利用細(xì)(例如14-30號，優(yōu)選18-26號)針將濃度為200-300μg/ml的1ml重組潤滑素注射進(jìn)膝關(guān)節(jié)。本發(fā)明組合物還適用于腸胃外施用，諸如靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)施用，在優(yōu)選實施方案中則是被施用于腹膜、心包或胸膜的表面。正確的施針位置對關(guān)節(jié)治療中通過注射送遞重組潤滑素蛋白的效能而言具有關(guān)鍵作用(Schumacher，2003)?？赏ㄟ^利用超聲技術(shù)幫助正確施針定位。在成功抽吸液體后，更易實現(xiàn)成功的注射。業(yè)已提出一種進(jìn)入髕上囊的外上側(cè)方法，可提供進(jìn)入膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)間隙的最可靠通路。關(guān)節(jié)內(nèi)注射除了可以施用重組潤滑素外，還可將編碼重組潤滑素的核酸(例如在基因治療應(yīng)用中)送遞至滑膜腔。為避免手術(shù)粘連，本文所述重組潤滑素被施用時的形式為凝膠、泡沫、纖維或織物。以該方式配制的重組潤滑素被置于受損或暴露的組織界面上方和之間，以避免相對表面之間的粘連形成。為了能夠生效，所述凝膠或薄膜必須持續(xù)足夠長的時間保持固定并阻止組織接觸，從而在其最終消散時使所述組織得以接觸并不再有粘連傾向。在大鼠盲腸磨損模型(Goldberg et al.，1993)中評估了被配制用于抑制或預(yù)防粘連形成的重組潤滑素(例如，以膜、織物、泡沫或凝膠的形式)在預(yù)防手術(shù)后粘連方面的效果。所述組合物被置于通過外科方法磨損的大鼠盲腸周圍，并與未經(jīng)治療的對照動物進(jìn)行對比(其盲腸已磨損但未接受任何治療的動物)。與缺乏重組潤滑素制劑條件下大鼠模型內(nèi)的粘連形成量相比，該制劑存在條件下粘連形成量的減少表明該制劑在臨床上可有效減少組織粘連的形成。但在需要組織粘連的狀況中(例如需使軟骨裂縫愈合的狀況)則最好避免采用重組潤滑素。使軟骨表面潤滑將有損于軟骨間的整合(Schaefer et al.，2004)。重組潤滑素也可被用于包被將被移植進(jìn)哺乳動物體內(nèi)的假肢和人工關(guān)節(jié)。例如，可將這種裝置浸入或浸沒在重組潤滑素溶液中，例如，遵照US5709020或US5702456所述方法。但在體內(nèi)應(yīng)用重組潤滑素以在假體周圍提供潤滑效果時應(yīng)多加注意。據(jù)報道，PRG4基因表達(dá)(即MSF基因表達(dá))出現(xiàn)的顯著上調(diào)與假體松動有關(guān)；潤滑素可破壞骨與假體之間緊密的相互作用，從而使假體松動(Morawietz etal.，2003)。
實施例8OA模型
為評估關(guān)節(jié)內(nèi)施用潤滑素制劑的效能，制備了骨關(guān)節(jié)炎/軟骨侵蝕的小鼠模型。為外科誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎，通過腹膜內(nèi)施用250mg/kg三溴乙醇(SIGMAChemical)麻醉小鼠，并對其膝關(guān)節(jié)進(jìn)行無菌外科手術(shù)。從髕骨韌帶的中間將其縱向切開，打開關(guān)節(jié)囊，并確定半月板脛骨韌帶(將內(nèi)側(cè)半月板固定在脛骨坪上)的位置。對一部分動物不進(jìn)行其它操作，并認(rèn)為該組接受了假手術(shù)。對試驗組動物則橫切其內(nèi)側(cè)半月板脛骨韌帶，使其內(nèi)側(cè)半月板失去穩(wěn)定狀態(tài)(DMM)。分別將接受假手術(shù)和DMM的動物的關(guān)節(jié)囊和皮下層縫合緊密，并通過應(yīng)用NEXABANDS/C組織粘合劑(Abbott，North Chicago，IL)將該部分的皮膚關(guān)閉。在手術(shù)前和手術(shù)后施用Buprenorphine(BUPRENEX；Reckitt & Coleman，Kingston-upon-Hull，UK)。通過利用30號針關(guān)節(jié)內(nèi)注射施用重組潤滑素制劑。手術(shù)后一周對每個膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)注射施用5-10毫升。以每周一次為基礎(chǔ)任選地進(jìn)行其它注射。在手術(shù)后第4周和第8周用二氧化碳處死動物。為評估骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展和嚴(yán)重程度，將完整膝關(guān)節(jié)置入4％的多聚甲醛中24小時后，在EDTA/聚乙烯吡咯烷酮中脫鈣5天。石蠟包埋關(guān)節(jié)并從完整關(guān)節(jié)中獲得6-μm額向切片。用Safranin O-fastgreen染色載玻片，并利用修飾的的半定量評分系統(tǒng)(Chambers et al.，2001)以70-μm間距對整個關(guān)節(jié)評級，其中“0”＝正常軟骨；“0.5”＝喪失Safranin O且無結(jié)構(gòu)變化；“1”＝關(guān)節(jié)表面粗糙并有小的原纖維形成；“2”＝原纖維形成下至表層下的緊鄰層中，并喪失部分表層；“3”＝輕度(＜20％)；“5”＝中度(20-80％)；和“6”＝重度(＞80％)喪失未鈣化軟骨。評分“4”(侵蝕至骨)不是該模型的特征。分別對關(guān)節(jié)的所有四分體(內(nèi)側(cè)脛骨坪、內(nèi)側(cè)股骨髁、外側(cè)脛骨坪和外側(cè)股骨髁)進(jìn)行評分。由不知道該試驗內(nèi)容的觀測者對各膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)進(jìn)行評分，最少分為12個級別。評分以在各關(guān)節(jié)內(nèi)觀測到的最大組織評分或總組織評分表示?？傇u分表示對整個關(guān)節(jié)各組織切片上的各關(guān)節(jié)四分體的累計評分。該分析方法可對損傷的嚴(yán)重程度以及被OA樣病變所影響的軟骨表面積進(jìn)行評估(Glasson et al.，2004)。參考文獻(xiàn)(1)Chambers et al.，2001，Arthritis Rheum.441455-65；(2)Deutscher，1990，Methods in Enzymology，Vol.182Guide to Protein Purification，AcademicPress；(3)Espallargues and Pons，2003，Iht′l J.Tech.Assess.Health Care 1941-56；(4)Flannery et al.，1999，Biochem.Biophys.Res.Comm.254535-41；(5)Glasson et al.，2004，Arthritis Rheum.502547-58；(6)Goldberg et al.，1993，InGynecologic Surgery andAdhesion Prevention，Willey-Liss，pp.191-204；(7)Hills，2002，J.Rheumatology 29200-01；(8)Ikegawa et al.，2000，Cytogenet.Cell Genet.90291-297；(9)Jay et al.，2001，J.Orthopaedic Research 19677-87；(10)Jay et al.，2002，Glycoconjugate Journal 18807-15；(11)Krstenansky et al.，1987，F(xiàn)EBS Lett.21110-16；(12)Marcelino et al.，1999，Nature Genetics 23319-322；(13)Merberg et al.，1993，Biology of Vitronectins and theirReceptors，Pressner et al.(編輯)Elsevier Science Publishers，pp.45-53；(14)Merrifield，1963，J.Amer.Chem.Soc.852149-54；(15)Morawietz et al.，2003，Virchows Arch.44357-66；(16)Rees et al.，2002，Matrix Biology 21593-602；(17)Schneerson et al.，1980，J.Exp.Med 152361-76；(18)Scopes，1994，Protein PurificationPrinciples and Practice(第3版)，Springer Verlag；(19)Schaefer et al.，2004，Biorheology 41503-508；(20)Schumacher，2003，Arthritis & Rheumatism 49413-20；(21)Tatusova and Madden，1999，F(xiàn)EMS Microbiol Lett.174247-50；(22)Wobig et al.，1998，Clin.Ther.20410-23；和(23)Wobig et al.，1999，Clin.Ther.211549-62.
序列表<110>WyethFlannery，Carl RCorcoran，Christopher JFreeman，Bethany ARacie，Lisa A<120>重組潤滑素分子及其用途<130>50657-01404WOPT<160>29<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>155<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成cDNA盒-1的核苷酸序列。
<400>1cgcgcccaca actccaaaag agcccgcacc taccacgaca aagtcagctc ctactacgcc 60caaagagcca gcgccgacga ctactaaaga accggcaccc accacgccta aggagccagc120tcctactaca acgaaaccgg caccaaccac tccgg 155<210>2<211>51<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO1的翻譯序列。
<400>2Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala1 5 10 15Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala20 25 30
Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Pro Ala Pro35 40 45Thr Thr Pro50<210>3<211>125<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成cDNA盒-2的核苷酸序列。
<400>3taaagaacca gcccctacta cgacaaagga gcctgcaccc acaaccacga agagcgcacc 60cacaacacca aaggagccgg cccctacgac tcctaaggaa cccaaaccgg caccaaccac120tccgg125<210>4<211>41<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO3的翻譯序列。
<400>4Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr1 5 10 15Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys20 25 30Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro35 40<210>5<211>8049<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>含有重組PRG4-Lub1 cDNA構(gòu)建體的pTmed2載體。
<400>5catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgtact 60gagtcattag ggactttcca atgggttttg cccagtacat aaggtcaata ggggtgaatc120aacaggaaag tcccattgga gccaagtaca ctgagtcaat agggactttc cattgggttt180tgcccagtac aaaaggtcaa tagggggtga gtcaatgggt ttttcccatt attggcacgt240acataaggtc aataggggtg agtcattggg tttttccagc caatttaatt aaaacgccat300gtactttccc accattgacg tcaatgggct attgaaacta atgcaacgtg acctttaaac360ggtactttcc catagctgat taatgggaaa gtaccgttct cgagccaata cacgtcaatg420ggaagtgaaa gggcagccaa aacgtaacac cgccccggtt ttcccctgga aattccatat480tggcacgcat tctattggct gagctgcgtt ctacgtgggt ataagaggcg cgaccagcgt540cggtaccgtc gcagtcttcg gtctgaccac cgtagaacgc agagctcctc gctgcagccc600aagctctgtt gggctcgcgg ttgaggacaa actcttcgcg gtctttccag tactcttgga660tcggaaaccc gtcggcctcc gaacggtact ccgccaccga gggacctgag cgagtccgca720tcgaccggat cggaaaacct ctcgactgtt ggggtgagta ctccctctca aaagcgggca780tgacttctgc gctaagattg tcagtttcca aaaacgagga ggatttgata ttcacctggc840ccgcggtgat gcctttgagg gtggccgcgt ccatctggtc agaaaagaca atctttttgt900tgtcaagctt gaggtgtggc aggcttgaga tctggccata cacttgagtg acaatgacat960ccactttgcc tttctctcca caggtgtcca ctcccaggtc caactgcaga cttcgaattc 1020tactgagtcg acccaccatg gcatggaaaa cacttcccat ttacctgttg ttgctgctgt 1080ctgttttcgt gattcagcaa gtttcatctc aagatttatc aagctgtgca gggagatgtg 1140gggaagggta ttctagagat gccacctgca actgtgatta taactgtcaa cactacatgg 1200agtgctgccc tgatttcaag agagtctgca ctgcggagct ttcctgtaaa ggccgctgct 1260ttgagtcctt cgagagaggg agggagtgtg actgcgacgc ccaatgtaag aagtatgaca 1320
agtgctgtcc cgattatgag agtttctgtg cagaagtgca taatcccaca tcaccaccat1380cttcaaagaa agcacctcca ccttcaggag catctcaaac catcaaatca acaaccaaac1440gttcacccaa accaccaaac aagaagaaga ctaagaaagt tatagaatca gaggaaataa1500cagaagaaca ttctgtttct gaaaatcaag agtcctcctc cagtagcagt tcaagtagtt1560cgtcgtcgac aatttggaaa atcaagtctt ccaaaaattc agctgctaat agagaattac1620agaagaaact caaagtaaaa gataacaaga agaacagaac taaaaagaaa cctaccccca1680aaccaccagt tgtagatgaa gctggaagtg gattggacaa tggtgacttc aaggtcacaa1740ctcctgacac gtctaccacc caacacaata aagtcagcac atctcccaag atcacaacag1800caaaaccaat aaatcccaga cccagtcttc cacctaattc tgatacatct aaagagacgt1860ctttgacagt gaataaagag acaacagttg aaactaaaga aactactaca acaaataaac1920agacttcaac tgatggaaaa gagaagacta cttccgctaa agagacacaa agtatagaga1980aaacatctgc taaagattta gcacccacat ctaaagtgct ggctaaacct acacccaaag2040ctgaaactac aaccaaaggc cctgctctca ccactcccaa ggagcccacg cccaccactc2100ccaaggagcc tgcatctacc acacccaaag agcccacacc taccaccatc aagagcgcgc2160ccacaactcc aaaagagccc gcacctacca cgacaaagtc agctcctact acgcccaaag2220agccagcgcc gacgactact aaagaaccgg cacccaccac gcctaaggag ccagctccta2280ctacaacgaa accggcacca accactccgg aaacacctcc tccaaccact tcagaggtct2340ctactccaac taccaccaag gagcctacca ctatccacaa aagccctgat gaatcaactc2400ctgagctttc tgcagaaccc acaccaaaag ctcttgaaaa cagtcccaag gaacctggtg2460tacctacaac taagacgccg gcggcgacta aacctgaaat gactacaaca gctaaagaca2520agacaacaga aagagactta cgtactacac ctgaaactac aactgctgca cctaagatga2580caaaagagac agcaactaca acagaaaaaa ctaccgaatc caaaataaca gctacaacca2640cacaagtaac atctaccaca actcaagata ccacaccatt caaaattact actcttaaaa2700caactactct tgcacccaaa gtaactacaa caaaaaagac aattactacc actgagatta2760
tgaacaaacc tgaagaaaca gctaaaccaa aagacagagc tactaattct aaagcgacaa2820ctcctaaacc tcaaaagcca accaaagcac ccaaaaaacc cacttctacc aaaaagccaa2880aaacaatgcc tagagtgaga aaaccaaaga cgacaccaac tccccgcaag atgacatcaa2940caatgccaga attgaaccct acctcaagaa tagcagaagc catgctccaa accaccacca3000gacctaacca aactccaaac tccaaactag ttgaagtaaa tccaaagagt gaagatgcag3060gtggtgctga aggagaaaca cctcatatgc ttctcaggcc ccatgtgttc atgcctgaag3120ttactcccga catggattac ttaccgagag tacccaatca aggcattatc atcaatccca3180tgctttccga tgagaccaat atatgcaatg gtaagccagt agatggactg actactttgc3240gcaatgggac attagttgca ttccgaggtc attatttctg gatgctaagt ccattcagtc3300caccatctcc agctcgcaga attactgaag tttggggtat tccttccccc attgatactg3360tttttactag gtgcaactgt gaaggaaaaa ctttcttctt taaggattct cagtactggc3420gttttaccaa tgatataaaa gatgcagggt accccaaacc aattttcaaa ggatttggag3480gactaactgg acaaatagtg gcagcgcttt caacagctaa atataagaac tggcctgaat3540ctgtgtattt tttcaagaga ggtggcagca ttcagcagta tatttataaa caggaacctg3600tacagaagtg ccctggaaga aggcctgctc taaattatcc agtgtatgga gaaatgacac3660aggttaggag acgtcgcttt gaacgtgcta taggaccttc tcaaacacac accatcagaa3720ttcaatattc acctgccaga ctggcttatc aagacaaagg tgtccttcat aatgaagtta3780aagtgagtat actgtggaga ggacttccaa atgtggttac ctcagctata tcactgccca3840acatcagaaa acctgacggc tatgattact atgccttttc taaagatcaa tactataaca3900ttgatgtgcc tagtagaaca gcaagagcaa ttactactcg ttctgggcag accttatcca3960aagtctggta caactgtcct taagcggccg ccgcaaattc taacgttact ggccgaagcc4020gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt4080ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc4140tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc4200
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc4260cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg4320cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct4380cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat4440ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaacgtct4500aggccccccg aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgattgc tcgagccatc4560atggttcgac cattgaactg catcgtcgcc gtgtcccaaa atatggggat tggcaagaac4620ggagacctac cctggcctcc gctcaggaac gagttcaagt acttccaaag aatgaccaca4680acctcttcag tggaaggtaa acagaatctg gtgattatgg gtaggaaaac ctggttctcc4740attcctgaga agaatcgacc tttaaaggac agaattaata tagttctcag tagagaactc4800aaagaaccac cacgaggagc tcattttctt gccaaaagtt tggatgatgc cttaagactt4860attgaacaac cggaattggc aagtaaagta gacatggttt ggatagtcgg aggcagttct4920gtttaccagg aagccatgaa tcaaccaggc cacctcagac tctttgtgac aaggatcatg4980caggaatttg aaagtgacac gtttttccca gaaattgatt tggggaaata taaacttctc5040ccagaatacc caggcgtcct ctctgaggtc caggaggaaa aaggcatcaa gtataagttt5100gaagtctacg agaagaaaga ctaacaggaa gatgctttca agttctctgc tcccctccta5160aagctatgca ttttttataa gaccatggga cttttgctgg ctttagatca taatcagcca5220taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct5280gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta5340caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag5400ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatccccg gccaacggtc5460tggtgacccg gctgcgagag ctcggtgtac ctgagacgcg agtaagccct tgagtcaaag5520acgtagtcgt tgcaagtccg caccaggtac tgatcatcga tgctagaccg tgcaaaagga5580gagcctgtaa gcgggcactc ttccgtggtc tggtggataa attcgcaagg gtatcatggc5640
ggacgaccgg ggttcgaacc ccggatccgg ccgtccgccg tgatccatcc ggttaccgcc5700cgcgtgtcga acccaggtgt gcgacgtcag acaacggggg agcgctcctt ttggcttcct5760tccaggcgcg gcggctgctg cgctagcttt tttggcgagc tcgaattaat tctgcattaa5820tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg5880ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag5940gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa6000ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc6060cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca6120ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg6180accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct6240caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt6300gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag6360tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc6420agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac6480actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga6540gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc6600aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg6660gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca6720aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt6780atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca6840gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg6900atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca6960ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt7020cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt7080
agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca7140cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca7200tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga7260agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact7320gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga7380gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg7440ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc7500tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga7560tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat7620gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt7680caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt7740atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac7800gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc7860tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag7920acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca7980gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg8040agagtgcac8049<210>6<211>2946<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組PRG4-Lub1 cDNA構(gòu)建體。
<400>6atggcatgga aaacacttcc catttacctg ttgttgctgc tgtctgtttt cgtgattcag 60caagtttcat ctcaagattt atcaagctgt gcagggagat gtggggaagg gtattctaga120
gatgccacct gcaactgtga ttataactgt caacactaca tggagtgctg ccctgatttc180aagagagtct gcactgcgga gctttcctgt aaaggccgct gctttgagtc cttcgagaga240gggagggagt gtgactgcga cgcccaatgt aagaagtatg acaagtgctg tcccgattat300gagagtttct gtgcagaagt gcataatccc acatcaccac catcttcaaa gaaagcacct360ccaccttcag gagcatctca aaccatcaaa tcaacaacca aacgttcacc caaaccacca420aacaagaaga agactaagaa agttatagaa tcagaggaaa taacagaaga acattctgtt480tctgaaaatc aagagtcctc ctccagtagc agttcaagta gttcgtcgtc gacaatttgg540aaaatcaagt cttccaaaaa ttcagctgct aatagagaat tacagaagaa actcaaagta600aaagataaca agaagaacag aactaaaaag aaacctaccc ccaaaccacc agttgtagat660gaagctggaa gtggattgga caatggtgac ttcaaggtca caactcctga cacgtctacc720acccaacaca ataaagtcag cacatctccc aagatcacaa cagcaaaacc aataaatccc780agacccagtc ttccacctaa ttctgataca tctaaagaga cgtctttgac agtgaataaa840gagacaacag ttgaaactaa agaaactact acaacaaata aacagacttc aactgatgga900aaagagaaga ctacttccgc taaagagaca caaagtatag agaaaacatc tgctaaagat960ttagcaccca catctaaagt gctggctaaa cctacaccca aagctgaaac tacaaccaaa 1020ggccctgctc tcaccactcc caaggagccc acgcccacca ctcccaagga gcctgcatct 1080accacaccca aagagcccac acctaccacc atcaagagcg cgcccacaac tccaaaagag 1140cccgcaccta ccacgacaaa gtcagctcct actacgccca aagagccagc gccgacgact 1200actaaagaac cggcacccac cacgcctaag gagccagctc ctactacaac gaaaccggca 1260ccaaccactc cggaaacacc tcctccaacc acttcagagg tctctactcc aactaccacc 1320aaggagccta ccactatcca caaaagccct gatgaatcaa ctcctgagct ttctgcagaa 1380cccacaccaa aagctcttga aaacagtccc aaggaacctg gtgtacctac aactaagacg 1440ccggcggcga ctaaacctga aatgactaca acagctaaag acaagacaac agaaagagac 1500ttacgtacta cacctgaaac tacaactgct gcacctaaga tgacaaaaga gacagcaact 1560
acaacagaaa aaactaccga atccaaaata acagctacaa ccacacaagt aacatctacc1620acaactcaag ataccacacc attcaaaatt actactctta aaacaactac tcttgcaccc1680aaagtaacta caacaaaaaa gacaattact accactgaga ttatgaacaa acctgaagaa1740acagctaaac caaaagacag agctactaat tctaaagcga caactcctaa acctcaaaag1800ccaaccaaag cacccaaaaa acccacttct accaaaaagc caaaaacaat gcctagagtg1860agaaaaccaa agacgacacc aactccccgc aagatgacat caacaatgcc agaattgaac1920cctacctcaa gaatagcaga agccatgctc caaaccacca ccagacctaa ccaaactcca1980aactccaaac tagttgaagt aaatccaaag agtgaagatg caggtggtgc tgaaggagaa2040acacctcata tgcttctcag gccccatgtg ttcatgcctg aagttactcc cgacatggat2100tacttaccga gagtacccaa tcaaggcatt atcatcaatc ccatgctttc cgatgagacc2160aatatatgca atggtaagcc agtagatgga ctgactactt tgcgcaatgg gacattagtt2220gcattccgag gtcattattt ctggatgcta agtccattca gtccaccatc tccagctcgc2280agaattactg aagtttgggg tattccttcc cccattgata ctgtttttac taggtgcaac2340tgtgaaggaa aaactttctt ctttaaggat tctcagtact ggcgttttac caatgatata2400aaagatgcag ggtaccccaa accaattttc aaaggatttg gaggactaac tggacaaata2460gtggcagcgc tttcaacagc taaatataag aactggcctg aatctgtgta ttttttcaag2520agaggtggca gcattcagca gtatatttat aaacaggaac ctgtacagaa gtgccctgga2580agaaggcctg ctctaaatta tccagtgtat ggagaaatga cacaggttag gagacgtcgc2640tttgaacgtg ctataggacc ttctcaaaca cacaccatca gaattcaata ttcacctgcc2700agactggctt atcaagacaa aggtgtcctt cataatgaag ttaaagtgag tatactgtgg2760agaggacttc caaatgtggt tacctcagct atatcactgc ccaacatcag aaaacctgac2820ggctatgatt actatgcctt ttctaaagat caatactata acattgatgt gcctagtaga2880acagcaagag caattactac tcgttctggg cagaccttat ccaaagtctg gtacaactgt2940ccttaa 2946
<210>7<211>981<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>完整PRG4-LUB1蛋白的氨基酸序列。
<400>7Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Set Val1 5 10 15Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly20 25 30Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr35 40 45Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys50 55 60Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg65 70 75 80Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys85 90 95Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser100 105 110Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Set Gly Ala Ser Gln Thr115 120 125Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys130 135 140Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val145 150 155 160Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Set Ser Ser Ser Set Ser Ser Set Ser165 170 175Ser Thr Ile Trp Lys Ile Lys Set Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg180 185 190Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr
195 200 205Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser210 215 220Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr225 230 235 240Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys245 250 255Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys260 265 270Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu275 280 285Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr290 295 300Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp305 310 315 320Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu325 330 335Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro340 345 350Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro355 360 365Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr370 375 380Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr385 390 395 400Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr405 410 415Thr Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Glu Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser420 425 430Glu Val Ser Thr Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Thr Thr Ile His Lys435 440 445Ser Pro Asp Glu Ser Thr Pro Glu Leu Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys
450 455 460Ala Leu Glu Asn Ser Pro Lys Glu Pro Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr465 470 475 480Pro Ala Ala Thr Lys Pro Glu Met Thr Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr485 490 495Thr Glu Arg Asp Leu Arg Thr Thr Pro Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro500 505 510Lys Met Thr Lys Glu Thr Ala Thr Thr Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser515 520 525Lys Ile Thr Ala Thr Thr Thr Gln Val Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp530 535 540Thr Thr Pro Phc Lys Ile Thr Thr Leu Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro545 550 555 560Lys Val Thr Thr Thr Lys Lys Thr Ile Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn565 570 575Lys Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Lys Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys580 585 590Ala Thr Thr Pro Lys Pro Gln Lys Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro595 600 605Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys Thr Met Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys610 615 620Thr Thr Pro Thr Pro Arg Lys Met Thr Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn625 630 635 640Pro Thr Ser Arg Ile Ala Glu Ala Met Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro645 650 655Asn Gln Thr Pro Asn Ser Lys Leu Val Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu660 665 670Asp Ala Gly Gly Ala Glu Gly Glu Thr Pro His Met Leu Leu Arg Pro675 680 685His Val Phe Met Pro Glu Val Thr Pro Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg690 695 700Val Pro Asn Gln Gly Ile Ile Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr
705 710 715 720Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn725 730 735Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg Gly His Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro740 745 750Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala Arg Arg Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile755 760 765Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys770 775 780Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser Gln Tyr Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile785 790 795 800Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Phe Lys Gly Phe Gly Gly Leu805 810 815Thr Gly Gln Ile Val Ala Ala Leu Ser Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp820 825 830Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys Arg Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr835 840 845Ile Tyr Lys Gln Glu Pro Val Gln Lys Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala850 855 860Leu Asn Tyr Pro Val Tyr Gly Glu Met Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg865 870 875 880Phe Glu Arg Ala Ile Gly Pro Ser Gln Thr His Thr Ile Arg Ile Gln885 890 895Tyr Ser Pro Ala Arg Leu Ala Tyr Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn900 905 910Glu Val Lys Val Ser Ile Leu Trp Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr915 920 925Ser Ala Ile Ser Leu Pro Asn Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr930 935 940Tyr Ala Phe Ser Lys Asp Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg945 950 955 960Thr Ala Arg Ala Ile Thr Thr Arg Ser Gly Gln Thr Leu Ser Lys Val
965 970 975Trp Tyr Asn Cys Pro980<210>8<211>157<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>來源于合成cDNA盒-1的Lub1 DNA插入片段。
<400>8gcgcgcccac aactccaaaa gagcccgcac ctaccacgac aaagtcagct cctactacgc 60ccaaagagcc agcgccgacg actactaaag aaccggcacc caccacgcct aaggagccag120ctcctactac aacgaaaccg gcaccaacca ctccgga 157<210>9<211>51<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由Lub1 DNA插入片段編碼的51個氨基酸(在SEQ ID NO7中位于S373-E425之間有4個KEPAPTT序列)。
<400>9Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala1 5 10 15Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala20 25 30Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Pro Ala Pro35 40 45Thr Thr Pro50<210>10<211>3024
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組PRG4-Lub2 cDNA構(gòu)建體。
<400>10atggcatgga aaacacttcc catttacctg ttgttgctgc tgtctgtttt cgtgattcag 60caagtttcat ctcaagattt atcaagctgt gcagggagat gtggggaagg gtattctaga120gatgccacct gcaactgtga ttataactgt caacactaca tggagtgctg ccctgatttc180aagagagtct gcactgcgga gctttcctgt aaaggccgct gctttgagtc cttcgagaga240gggagggagt gtgactgcga cgcccaatgt aagaagtatg acaagtgctg tcccgattat300gagagtttct gtgcagaagt gcataatccc acatcaccac catcttcaaa gaaagcacct360ccaccttcag gagcatctca aaccatcaaa tcaacaacca aacgttcacc caaaccacca420aacaagaaga agactaagaa agttatagaa tcagaggaaa taacagaaga acattctgtt480tctgaaaatc aagagtcctc ctccagtagc agttcaagta gttcgtcgtc gacaatttgg540aaaatcaagt cttccaaaaa ttcagctgct aatagagaat tacagaagaa actcaaagta600aaagataaca agaagaacag aactaaaaag aaacctaccc ccaaaccacc agttgtagat660gaagctggaa gtggattgga caatggtgac ttcaaggtca caactcctga cacgtctacc720acccaacaca ataaagtcag cacatctccc aagatcacaa cagcaaaacc aataaatccc780agacccagtc ttccacctaa ttctgataca tctaaagaga cgtctttgac agtgaataaa840gagacaacag ttgaaactaa agaaactact acaacaaata aacagacttc aactgatgga900aaagagaaga ctacttccgc taaagagaca caaagtatag agaaaacatc tgctaaagat960ttagcaccca catctaaagt gctggctaaa cctacaccca aagctgaaac tacaaccaaa 1020ggccctgctc tcaccactcc caaggagccc acgcccacca ctcccaagga gcctgcatct 1080accacaccca aagagcccac acctaccacc atcaagagcg cgcccacaac tccaaaagag 1140cccgcaccta ccacgacaaa gtcagctcct actacgccca aagagccagc gccgacgact 1200actaaagaac cggcacccac cacgcctaaa gaaccagccc ctactacgac aaaggagcct 1260
gcacccacaa ccacgaagag cgcacccaca acaccaaagg agccggcccc tacgactcct1320aaggaaccca aaccggcacc aaccactccg gaaacacctc ctccaaccac ttcagaggtc1380tctactccaa ctaccaccaa ggagcctacc actatccaca aaagccctga tgaatcaact1440cctgagcttt ctgcagaacc cacaccaaaa gctcttgaaa acagtcccaa ggaacctggt1500gtacctacaa ctaagacgcc ggcggcgact aaacctgaaa tgactacaac agctaaagac1560aagacaacag aaagagactt acgtactaca cctgaaacta caactgctgc acctaagatg1620acaaaagaga cagcaactac aacagaaaaa actaccgaat ccaaaataac agctacaacc1680acacaagtaa catctaccac aactcaagat accacaccat tcaaaattac tactcttaaa1740acaactactc ttgcacccaa agtaactaca acaaaaaaga caattactac cactgagatt1800atgaacaaac ctgaagaaac agctaaacca aaagacagag ctactaattc taaagcgaca1860actcctaaac ctcaaaagcc aaccaaagca cccaaaaaac ccacttctac caaaaagcca1920aaaacaatgc ctagagtgag aaaaccaaag acgacaccaa ctccccgcaa gatgacatca1980acaatgccag aattgaaccc tacctcaaga atagcagaag ccatgctcca aaccaccacc2040agacctaacc aaactccaaa ctccaaacta gttgaagtaa atccaaagag tgaagatgca2100ggtggtgctg aaggagaaac acctcatatg cttctcaggc cccatgtgtt catgcctgaa2160gttactcccg acatggatta cttaccgaga gtacccaatc aaggcattat catcaatccc2220atgctttccg atgagaccaa tatatgcaat ggtaagccag tagatggact gactactttg2280cgcaatggga cattagttgc attccgaggt cattatttct ggatgctaag tccattcagt2340ccaccatctc cagctcgcag aattactgaa gtttggggta ttccttcccc cattgatact2400gtttttacta ggtgcaactg tgaaggaaaa actttcttct ttaaggattc tcagtactgg2460cgttttacca atgatataaa agatgcaggg taccccaaac caattttcaa aggatttgga2520ggactaactg gacaaatagt ggcagcgctt tcaacagcta aatataagaa ctggcctgaa2580tctgtgtatt ttttcaagag aggtggcagc attcagcagt atatttataa acaggaacct2640gtacagaagt gccctggaag aaggcctgct ctaaattatc cagtgtatgg agaaatgaca2700
caggttagga gacgtcgctt tgaacgtgct ataggacctt ctcaaacaca caccatcaga 2760attcaatatt cacctgccag actggcttat caagacaaag gtgtccttca taatgaagtt 2820aaagtgagta tactgtggag aggacttcca aatgtggtta cctcagctat atcactgccc 2880aacatcagaa aacctgacgg ctatgattac tatgcctttt ctaaagatca atactataac 2940attgatgtgc ctagtagaac agcaagagca attactactc gttctgggca gaccttatcc 3000aaagtctggt acaactgtcc ttaa 3024<210>11<211>1007<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>完整PRG4-LUB2蛋白的氨基酸序列。
<400>11Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val1 5 10 15Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly20 25 30Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr35 40 45Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys50 55 60Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg65 70 75 80Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys85 90 95Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser100 105 110Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr115 120 125
Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys130 135 140Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val145 150 155 160Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser165 170 175Ser Thr Ile Trp Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg180 185 190Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr195 200 205Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser210 215 220Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr225 230 235 240Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys245 250 255Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys260 265 270Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu275 280 285Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr290 295 300Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp305 310 315 320Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu325 330 335Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro340 345 350Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro355 360 365Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr370 375 380
Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr385 390 395 400Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr405 410 415Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro420 425 430Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr435 440 445Thr Pro Glu Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser Glu Val Ser Thr Pro Thr450 455 460Thr Thr Lys Glu Pro Thr Thr Ile His Lys Ser Pro Asp Glu Ser Thr465 470 475 480Pro Glu Leu Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys Ala Leu Glu Asn Ser Pro485 490 495Lys Glu Pro Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr Pro Ala Ala Thr Lys Pro500 505 510Glu Met Thr Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg515 520 525Thr Thr Pro Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro Lys Met Thr Lys Glu Thr530 535 540Ala Thr Thr Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser Lys Ile Thr Ala Thr Thr545 550 555 560Thr Gln Val Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp Thr Thr Pro Phe Lys Ile565 570 575Thr Thr Leu Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Thr Thr Thr Lys580 585 590Lys Thr Ile Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Ala595 600 605Lys Pro Lys Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys Ala Thr Thr Pro Lys Pro610 615 620Gln Lys Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro625 630 635 640
Lys Thr Met Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg645 650 655Lys Met Thr Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile Ala660 665 670Glu Ala Met Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro Asn Ser675 680 685Lys Leu Val Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly Gly Ala Glu690 695 700Gly Glu Thr Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val Phe Met Pro Glu705 710 715 720Val Thr Pro Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val Pro Asn Gln Gly Ile725 730 735Ile Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr Asn Ile Cys Asn Gly Lys740 745 750Pro Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe755 760 765Arg Gly His Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro770 775 780Ala Arg Arg Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr785 790 795 800Val Phe Thr Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp805 810 815Ser Gln Tyr Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile Lys Asp Ala Gly Tyr Pro820 825 830Lys Pro Ile Phe Lys Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gly Gln Ile Val Ala835 840 845Ala Leu Ser Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Ser Val Tyr Phe850 855 860Phe Lys Arg Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr Ile Tyr Lys Gln Glu Pro865 870 875 880Val Gln Lys Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Val Tyr885 890 895
Gly Glu Met Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile Gly900 905 910Pro Ser Gln Thr His Thr Ile Arg Ile Gln Tyr Ser Pro Ala Arg Leu915 920 925Ala Tyr Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn Glu Val Lys Val Ser Ile930 935 940Leu Trp Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr Ser Ala Ile Ser Leu Pro945 950 955 960Asn Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Lys Asp965 970 975Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg Thr Ala Arg Ala Ile Thr980 985 990Thr Arg Ser Gly Gln Thr Leu Ser Lys Val Trp Tyr Asn Cys Pro995 1000 1005<210>12<211>235<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>來源于合成cDNA盒-1的Lub2 DNA插入片段和一個合成cDNA盒-2序列。
<400>12gcgcgcccac aactccaaaa gagcccgcac ctaccacgac aaagtcagct cctactacgc 60ccaaagagcc agcgccgacg actactaaag aaccggcacc caccacgcct aaagaaccag120cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc acaacaccaa180aggagccggc ccctacgact cctaaggaac ccaaaccggc accaaccact ccgga 235<210>13<211>77<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由Lub2 DNA插入片段編碼的77個氨基酸(在SEQ ID NO11中位于S373-E451之間有6個KEPAPTT序列)。
<400>13Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala1 5 10 15Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala20 25 30Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala35 40 45Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro50 55 60Thr Thr Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro65 70 75<210>14<211>3117<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組PRG4-Lub3 cDNA構(gòu)建體。
<400>14atggcatgga aaacacttcc catttacctg ttgttgctgc tgtctgtttt cgtgattcag 60caagtttcat ctcaagattt atcaagctgt gcagggagat gtggggaagg gtattctaga120gatgccacct gcaactgtga ttataactgt caacactaca tggagtgctg ccctgatttc180aagagagtct gcactgcgga gctttcctgt aaaggccgct gctttgagtc cttcgagaga240gggagggagt gtgactgcga cgcccaatgt aagaagtatg acaagtgctg tcccgattat300gagagtttct gtgcagaagt gcataatccc acatcaccac catcttcaaa gaaagcacct360ccaccttcag gagcatctca aaccatcaaa tcaacaacca aacgttcacc caaaccacca420aacaagaaga agactaagaa agttatagaa tcagaggaaa taacagaaga acattctgtt480tctgaaaatc aagagtcctc ctccagtagc agttcaagta gttcgtcgtc gacaatttgg540aaaatcaagt cttccaaaaa ttcagctgct aatagagaat tacagaagaa actcaaagta600
aaagataaca agaagaacag aactaaaaag aaacctaccc ccaaaccacc agttgtagat 660gaagctggaa gtggattgga caatggtgac ttcaaggtca caactcctga cacgtctacc 720acccaacaca ataaagtcag cacatctccc aagatcacaa cagcaaaacc aataaatccc 780agacccagtc ttccacctaa ttctgataca tctaaagaga cgtctttgac agtgaataaa 840gagacaacag ttgaaactaa agaaactact acaacaaata aacagacttc aactgatgga 900aaagagaaga ctacttccgc taaagagaca caaagtatag agaaaacatc tgctaaagat 960ttagcaccca catctaaagt gctggctaaa cctacaccca aagctgaaac tacaaccaaa1020ggccctgctc tcaccactcc caaggagccc acgcccacca ctcccaagga gcctgcatct1080accacaccca aagagcccac acctaccacc atcaagagcg cgcccacaac tccaaaagag1140cccgcaccta ccacgacaaa gtcagctcct actacgccca aagagccagc gccgacgact1200actaaagaac cggcacccac cacgcctaaa gaaccagccc ctactacgac aaaggagcct1260gcacccacaa ccacgaagag cgcacccaca acaccaaagg agccggcccc tacgactcct1320aaagaaccag cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc1380acaacaccaa aggagccggc ccctacgact cctaaggaac ccaaaccggc accaaccact1440ccggaaacac ctcctccaac cacttcagag gtctctactc caactaccac caaggagcct1500accactatcc acaaaagccc tgatgaatca actcctgagc tttctgcaga acccacacca1560aaagctcttg aaaacagtcc caaggaacct ggtgtaccta caactaagac gccggcggcg1620actaaacctg aaatgactac aacagctaaa gacaagacaa cagaaagaga cttacgtact1680acacctgaaa ctacaactgc tgcacctaag atgacaaaag agacagcaac tacaacagaa1740aaaactaccg aatccaaaat aacagctaca accacacaag taacatctac cacaactcaa1800gataccacac cattcaaaat tactactctt aaaacaacta ctcttgcacc caaagtaact1860acaacaaaaa agacaattac taccactgag attatgaaca aacctgaaga aacagctaaa1920ccaaaagaca gagctactaa ttctaaagcg acaactccta aacctcaaaa gccaaccaaa1980gcacccaaaa aacccacttc taccaaaaag ccaaaaacaa tgcctagagt gagaaaacca2040
aagacgacac caactccccg caagatgaca tcaacaatgc cagaattgaa ccctacctca2100agaatagcag aagccatgct ccaaaccacc accagaccta accaaactcc aaactccaaa2160ctagttgaag taaatccaaa gagtgaagat gcaggtggtg ctgaaggaga aacacctcat2220atgcttctca ggccccatgt gttcatgcct gaagttactc ccgacatgga ttacttaccg2280agagtaccca atcaaggcat tatcatcaat cccatgcttt ccgatgagac caatatatgc2340aatggtaagc cagtagatgg actgactact ttgcgcaatg ggacattagt tgcattccga2400ggtcattatt tctggatgct aagtccattc agtccaccat ctccagctcg cagaattact2460gaagtttggg gtattccttc ccccattgat actgttttta ctaggtgcaa ctgtgaagga2520aaaactttct tctttaagga ttctcagtac tggcgtttta ccaatgatat aaaagatgca2580gggtacccca aaccaatttt caaaggattt ggaggactaa ctggacaaat agtggcagcg2640ctttcaacag ctaaatataa gaactggcct gaatctgtgt attttttcaa gagaggtggc2700agcattcagc agtatattta taaacaggaa cctgtacaga agtgccctgg aagaaggcct2760gctctaaatt atccagtgta tggagaaatg acacaggtta ggagacgtcg ctttgaacgt2820gctataggac cttctcaaac acacaccatc agaattcaat attcacctgc cagactggct2880tatcaagaca aaggtgtcct tcataatgaa gttaaagtga gtatactgtg gagaggactt2940ccaaatgtgg ttacctcagc tatatcactg cccaacatca gaaaacctga cggctatgat3000tactatgcct tttctaaaga tcaatactat aacattgatg tgcctagtag aacagcaaga3060gcaattacta ctcgttctgg gcagacctta tccaaagtct ggtacaactg tccttaa 3117<210>15<211>1038<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>完整PRG4-LUB3蛋白的氨基酸序列。
<400>15Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val
1 5 10 15Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly20 25 30Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr35 40 45Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys50 55 60Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg65 70 75 80Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys85 90 95Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser100 105 110Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr115 120 125Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys130 135 140Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val145 150 155 160Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser165 170 175Ser Thr Ile Trp Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg180 185 190Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr195 200 205Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser210 215 220Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr225 230 235 240Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys245 250 255Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys
260 265 270Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu275 280 285Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr290 295 300Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp305 310 315 320Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu325 330 335Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro340 345 350Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro355 360 365Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr370 375 380Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr385 390 395 400Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr405 410 415Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro420 425 430Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr435 440 445Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys450 455 460Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr465 470 475 480Pro Glu Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser Glu Val Ser Thr Pro Thr Thr485 490 495Thr Lys Glu Pro Thr Thr Ile His Lys Ser Pro Asp Glu Ser Thr Pro500 505 510Glu Leu Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys Ala Leu Glu Asn Ser Pro Lys
515 520 525Glu Pro Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr Pro Ala Ala Thr Lys Pro Glu530 535 540Met Thr Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg Thr545 550 555 560Thr Pro Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro Lys Met Thr Lys Glu Thr Ala565 570 575Thr Thr Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser Lys Ile Thr Ala Thr Thr Thr580 585 590Gln Val Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp Thr Thr Pro Phe Lys Ile Thr595 600 605Thr Leu Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Thr Thr Thr Lys Lys610 615 620Thr Ile Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Ala Lys625 630 635 640Pro Lys Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys Ala Thr Thr Pro Lys Pro Gln645 650 655Lys Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys660 665 670Thr Met Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg Lys675 680 685Met Thr Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile Ala Glu690 695 700Ala Met Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro Asn Ser Lys705 710 715 720Leu Val Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly Gly Ala Glu Gly725 730 735Glu Thr Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val Phe Met Pro Glu Val740 745 750Thr Pro Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val Pro Asn Gln Gly Ile Ile755 760 765Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro
770 775 780Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg785 790 795 800Gly His Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala805 810 815Arg Arg Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val820 825 830Phe Thr Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser835 840 845Gln Tyr Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys850 855 860Pro Ile Phe Lys Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ala865 870 875 880Leu Ser Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe885 890 895Lys Arg Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr Ile Tyr Lys Gln Glu Pro Val900 905 910Gln Lys Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Val Tyr Gly915 920 925Glu Met Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile Gly Pro930 935 940Ser Gln Thr His Thr Ile Arg Ile Gln Tyr Ser Pro Ala Arg Leu Ala945 950 955 960Tyr Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn Glu Val Lys Val Ser Ile Leu965 970 975Trp Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr Ser Ala Ile Ser Leu Pro Asn980 985 990Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Lys Asp Gln995 1000 1005Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg Thr Ala Arg Ala Ile Thr1010 1015 1020Thr Arg Ser Gly Gln Thr Leu Ser Lys Val Trp Tyr Asn Cys Pro
1025 1030 1035<210>16<211>328<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>來源于合成cDNA盒-1的Lub3 DNA插入片段和2個合成cDNA盒-2序列。
<400>16gcgcgcccac aactccaaaa gagcccgcac ctaccacgac aaagtcagct cctactacgc 60ccaaagagcc agcgccgacg actactaaag aaccggcacc caccacgcct aaagaaccag120cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc acaacaccaa180aggagccggc ccctacgact cctaaagaac cagcccctac tacgacaaag gagcctgcac240ccacaaccac gaagagcgca cccacaacac caaaggagcc ggcccctacg actcctaagg300aacccaaacc ggcaccaacc actccgga 328<210>17<211>108<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由Lub3 DNA插入片段編碼的108個氨基酸(在SEQ ID NO15中位于S373-E482之間有9個KEPAPTT序列)。
<400>17Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala1 5 10 15Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala20 25 30Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala35 40 45Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro50 55 60
Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro65 70 75 80Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr85 90 95Thr Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro100 105<210>18<211>3210<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組PRG4-Lub4 cDNA構(gòu)建體。
<400>18atggcatgga aaacacttcc catttacctg ttgttgctgc tgtctgtttt cgtgattcag 60caagtttcat ctcaagattt atcaagctgt gcagggagat gtggggaagg gtattctaga120gatgccacct gcaactgtga ttataactgt caacactaca tggagtgctg ccctgatttc180aagagagtct gcactgcgga gctttcctgt aaaggccgct gctttgagtc cttcgagaga240gggagggagt gtgactgcga cgcccaatgt aagaagtatg acaagtgctg tcccgattat300gagagtttct gtgcagaagt gcataatccc acatcaccac catcttcaaa gaaagcacct360ccaccttcag gagcatctca aaccatcaaa tcaacaacca aacgttcacc caaaccacca420aacaagaaga agactaagaa agttatagaa tcagaggaaa taacagaaga acattctgtt480tctgaaaatc aagagtcctc ctccagtagc agttcaagta gttcgtcgtc gacaatttgg540aaaatcaagt cttccaaaaa ttcagctgct aatagagaat tacagaagaa actcaaagta600aaagataaca agaagaacag aactaaaaag aaacctaccc ccaaaccacc agttgtagat660gaagctggaa gtggattgga caatggtgac ttcaaggtca caactcctga cacgtctacc720acccaacaca ataaagtcag cacatctccc aagatcacaa cagcaaaacc aataaatccc780agacccagtc ttccacctaa ttctgataca tctaaagaga cgtctttgac agtgaataaa840gagacaacag ttgaaactaa agaaactact acaacaaata aacagacttc aactgatgga900
aaagagaaga ctacttccgc taaagagaca caaagtatag agaaaacatc tgctaaagat 960ttagcaccca catctaaagt gctggctaaa cctacaccca aagctgaaac tacaaccaaa1020ggccctgctc tcaccactcc caaggagccc acgcccacca ctcccaagga gcctgcatct1080accacaccca aagagcccac acctaccacc atcaagagcg cgcccacaac tccaaaagag1140cccgcaccta ccacgacaaa gtcagctcct actacgccca aagagccagc gccgacgact1200actaaagaac cggcacccac cacgcctaaa gaaccagccc ctactacgac aaaggagcct1260gcacccacaa ccacgaagag cgcacccaca acaccaaagg agccggcccc tacgactcct1320aaagaaccag cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc1380acaacaccaa aggagccggc ccctacgact cctaaagaac cagcccctac tacgacaaag1440gagcctgcac ccacaaccac gaagagcgca cccacaacac caaaggagcc ggcccctacg1500actcctaagg aacccaaacc ggcaccaacc actccggaaa cacctcctcc aaccacttca1560gaggtctcta ctccaactac caccaaggag cctaccacta tccacaaaag ccctgatgaa1620tcaactcctg agctttctgc agaacccaca ccaaaagctc ttgaaaacag tcccaaggaa1680cctggtgtac ctacaactaa gacgccggcg gcgactaaac ctgaaatgac tacaacagct1740aaagacaaga caacagaaag agacttacgt actacacctg aaactacaac tgctgcacct1800aagatgacaa aagagacagc aactacaaca gaaaaaacta ccgaatccaa aataacagct1860acaaccacac aagtaacatc taccacaact caagatacca caccattcaa aattactact1920cttaaaacaa ctactcttgc acccaaagta actacaacaa aaaagacaat tactaccact1980gagattatga acaaacctga agaaacagct aaaccaaaag acagagctac taattctaaa2040gcgacaactc ctaaacctca aaagccaacc aaagcaccca aaaaacccac ttctaccaaa2100aagccaaaaa caatgcctag agtgagaaaa ccaaagacga caccaactcc ccgcaagatg2160acatcaacaa tgccagaatt gaaccctacc tcaagaatag cagaagccat gctccaaacc2220accaccagac ctaaccaaac tccaaactcc aaactagttg aagtaaatcc aaagagtgaa2280gatgcaggtg gtgctgaagg agaaacacct catatgcttc tcaggcccca tgtgttcatg2340
cctgaagtta ctcccgacat ggattactta ccgagagtac ccaatcaagg cattatcatc2400aatcccatgc tttccgatga gaccaatata tgcaatggta agccagtaga tggactgact2460actttgcgca atgggacatt agttgcattc cgaggtcatt atttctggat gctaagtcca2520ttcagtccac catctccagc tcgcagaatt actgaagttt ggggtattcc ttcccccatt2580gatactgttt ttactaggtg caactgtgaa ggaaaaactt tcttctttaa ggattctcag2640tactggcgtt ttaccaatga tataaaagat gcagggtacc ccaaaccaat tttcaaagga2700tttggaggac taactggaca aatagtggca gcgctttcaa cagctaaata taagaactgg2760cctgaatctg tgtatttttt caagagaggt ggcagcattc agcagtatat ttataaacag2820gaacctgtac agaagtgccc tggaagaagg cctgctctaa attatccagt gtatggagaa2880atgacacagg ttaggagacg tcgctttgaa cgtgctatag gaccttctca aacacacacc2940atcagaattc aatattcacc tgccagactg gcttatcaag acaaaggtgt ccttcataat3000gaagttaaag tgagtatact gtggagagga cttccaaatg tggttacctc agctatatca3060ctgcccaaca tcagaaaacc tgacggctat gattactatg ccttttctaa agatcaatac3120tataacattg atgtgcctag tagaacagca agagcaatta ctactcgttc tgggcagacc3180ttatccaaag tctggtacaa ctgtccttaa 3210<210>19<211>1069<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>完整PRG4-LUB4蛋白的氨基酸序列。
<400>19Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val1 5 10 15Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly20 25 30
Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr35 40 45Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys50 55 60Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg65 70 75 80Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys85 90 95Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser100 105 110Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr115 120 125Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys130 135 140Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val145 150 155 160Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser165 170 175Ser Thr Ile Trp Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg180 185 190Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr195 200 205Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser210 215 220Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr225 230 235 240Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys245 250 255Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys260 265 270Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu275 280 285
Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr290 295 300Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp305 310 315 320Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu325 330 335Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro340 345 350Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro355 360 365Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr370 375 380Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr385 390 395 400Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr405 410 415Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro420 425 430Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr435 440 445Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys450 455 460Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys465 470 475 480Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu485 490 495Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro500 505 510Glu Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser Glu Val Ser Thr Pro Thr Thr Thr515 520 525Lys Glu Pro Thr Thr Ile His Lys Ser Pro Asp Glu Ser Thr Pro Glu530 535 540
Leu Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys Ala Leu Glu Asn Ser Pro Lys Glu545 550 555 560Pro Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr Pro Ala Ala Thr Lys Pro Glu Met565 570 575Thr Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg Thr Thr580 585 590Pro Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro Lys Met Thr Lys Glu Thr Ala Thr595 600 605Thr Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser Lys Ile Thr Ala Thr Thr Thr Gln610 615 620Val Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp Thr Thr Pro Phe Lys Ile Thr Thr625 630 635 640Leu Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Thr Thr Thr Lys Lys Thr645 650 655Ile Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro660 665 670Lys Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys Ala Thr Thr Pro Lys Pro Gln Lys675 680 685Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys Thr690 695 700Met Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg Lys Met705 710 715 720Thr Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile Ala Glu Ala725 730 735Met Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro Asn Ser Lys Leu740 745 750Val Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly Gly Ala Glu Gly Glu755 760 765Thr Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val Phe Met Pro Glu Val Thr770 775 780Pro Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val Pro Asn Gln Gly Ile Ile Ile785 790 795 800
Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro Val805 810 815Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg Gly820 825 830His Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala Arg835 840 845Arg Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe850 855 860Thr Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser Gln865 870 875 880Tyr Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Pro885 890 895Ile Phe Lys Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ala Leu900 905 910Ser Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys9l5 920 925Arg Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr Ile Tyr Lys Gln Glu Pro Val Gln930 935 940Lys Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Val Tyr Gly Glu945 950 955 960Met Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile Gly Pro Ser965 970 975Gln Thr His Thr Ile Arg Ile Gln Tyr Ser Pro Ala Arg Leu Ala Tyr980 985 990Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn Glu Val Lys Val Ser Ile Leu Trp995 1000 1005Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr Ser Ala Ile Ser Leu Pro Asn1010 1015 1020Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Lys Asp1025 1030 1035Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg Thr Ala Arg Ala Ile1040 1045 1050
Thr Thr Arg Ser Gly Gln Thr Leu Ser Lys Val Trp Tyr Asn Cys1055 1060 1065Pro<210>20<211>421<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>來源于cDNA盒-1的Lub4 DNA插入片段和3個合成cDNA盒-2序列。
<400>20gcgcgcccac aactccaaaa gagcccgcac ctaccacgac aaagtcagct cctactacgc 60ccaaagagcc agcgccgacg actactaaag aaccggcacc caccacgcct aaagaaccag120cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc acaacaccaa180aggagccggc ccctacgact cctaaagaac cagcccctac tacgacaaag gagcctgcac240ccacaaccac gaagagcgca cccacaacac caaaggagcc ggcccctacg actcctaaag300aaccagcccc tactacgaca aaggagcctg cacccacaac cacgaagagc gcacccacaa360caccaaagga gccggcccct acgactccta aggaacccaa accggcacca accactccgg420a421<210>21<211>139<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由Lub4 DNA插入片段編碼的139個氨基酸(在SEQ ID NO19中位于S373-E513之間有12個KEPAPTT序列)。
<400>21Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala1 5 10 15Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala
20 25 30Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala35 40 45Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro50 55 60Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro65 70 75 80Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr85 90 95Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr100 105 110Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr115 120 125Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro130 135<210>22<211>3303<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組PRG4-Lub5 cDNA構(gòu)建體。
<400>22atggcatgga aaacacttcc catttacctg ttgttgctgc tgtctgtttt cgtgattcag 60caagtttcat ctcaagattt atcaagctgt gcagggagat gtggggaagg gtattctaga120gatgccacct gcaactgtga ttataactgt caacactaca tggagtgctg ccctgatttc180aagagagtct gcactgcgga gctttcctgt aaaggccgct gctttgagtc cttcgagaga240gggagggagt gtgactgcga cgcccaatgt aagaagtatg acaagtgctg tcccgattat300gagagtttct gtgcagaagt gcataatccc acatcaccac catcttcaaa gaaagcacct360ccaccttcag gagcatctca aaccatcaaa tcaacaacca aacgttcacc caaaccacca420aacaagaaga agactaagaa agttatagaa tcagaggaaa taacagaaga acattctgtt480
tctgaaaatc aagagtcctc ctccagtagc agttcaagta gttcgtcgtc gacaatttgg 540aaaatcaagt cttccaaaaa ttcagctgct aatagagaat tacagaagaa actcaaagta 600aaagataaca agaagaacag aactaaaaag aaacctaccc ccaaaccacc agttgtagat 660gaagctggaa gtggattgga caatggtgac ttcaaggtca caactcctga cacgtctacc 720acccaacaca ataaagtcag cacatctccc aagatcacaa cagcaaaacc aataaatccc 780agacccagtc ttccacctaa ttctgataca tctaaagaga cgtctttgac agtgaataaa 840gagacaacag ttgaaactaa agaaactact acaacaaata aacagacttc aactgatgga 900aaagagaaga ctacttccgc taaagagaca caaagtatag agaaaacatc tgctaaagat 960ttagcaccca catctaaagt gctggctaaa cctacaccca aagctgaaac tacaaccaaa1020ggccctgctc tcaccactcc caaggagccc acgcccacca ctcccaagga gcctgcatct1080accacaccca aagagcccac acctaccacc atcaagagcg cgcccacaac tccaaaagag1140cccgcaccta ccacgacaaa gtcagctcct actacgccca aagagccagc gccgacgact1200actaaagaac cggcacccac cacgcctaaa gaaccagccc ctactacgac aaaggagcct1260gcacccacaa ccacgaagag cgcacccaca acaccaaagg agccggcccc tacgactcct1320aaagaaccag cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc1380acaacaccaa aggagccggc ccctacgact cctaaagaac cagcccctac tacgacaaag1440gagcctgcac ccacaaccac gaagagcgca cccacaacac caaaggagcc ggcccctacg1500actcctaaag aaccagcccc tactacgaca aaggagcctg cacccacaac cacgaagagc1560gcacccacaa caccaaagga gccggcccct acgactccta aggaacccaa accggcacca1620accactccgg aaacacctcc tccaaccact tcagaggtct ctactccaac taccaccaag1680gagcctacca ctatccacaa aagccctgat gaatcaactc ctgagctttc tgcagaaccc1740acaccaaaag ctcttgaaaa cagtcccaag gaacctggtg tacctacaac taagacgccg1800gcggcgacta aacctgaaat gactacaaca gctaaagaca agacaacaga aagagactta1860cgtactacac ctgaaactac aactgctgca cctaagatga caaaagagac agcaactaca1920
acagaaaaaa ctaccgaatc caaaataaca gctacaacca cacaagtaac atctaccaca1980actcaagata ccacaccatt caaaattact actcttaaaa caactactct tgcacccaaa2040gtaactacaa caaaaaagac aattactacc actgagatta tgaacaaacc tgaagaaaca2100gctaaaccaa aagacagagc tactaattct aaagcgacaa ctcctaaacc tcaaaagcca2160accaaagcac ccaaaaaacc cacttctacc aaaaagccaa aaacaatgcc tagagtgaga2220aaaccaaaga cgacaccaac tccccgcaag atgacatcaa caatgccaga attgaaccct2280acctcaagaa tagcagaagc catgctccaa accaccacca gacctaacca aactccaaac2340tccaaactag ttgaagtaaa tccaaagagt gaagatgcag gtggtgctga aggagaaaca2400cctcatatgc ttctcaggcc ccatgtgttc atgcctgaag ttactcccga catggattac2460ttaccgagag tacccaatca aggcattatc atcaatccca tgctttccga tgagaccaat2520atatgcaatg gtaagccagt agatggactg actactttgc gcaatgggac attagttgca2580ttccgaggtc attatttctg gatgctaagt ccattcagtc caccatctcc agctcgcaga2640attactgaag tttggggtat tccttccccc attgatactg tttttactag gtgcaactgt2700gaaggaaaaa ctttcttctt taaggattct cagtactggc gttttaccaa tgatataaaa2760gatgcagggt accccaaacc aattttcaaa ggatttggag gactaactgg acaaatagtg2820gcagcgcttt caacagctaa atataagaac tggcctgaat ctgtgtattt tttcaagaga2880ggtggcagca ttcagcagta tatttataaa caggaacctg tacagaagtg ccctggaaga2940aggcctgctc taaattatcc agtgtatgga gaaatgacac aggttaggag acgtcgcttt3000gaacgtgcta taggaccttc tcaaacacac accatcagaa ttcaatattc acctgccaga3060ctggcttatc aagacaaagg tgtccttcat aatgaagtta aagtgagtat actgtggaga3120ggacttccaa atgtggttac ctcagctata tcactgccca acatcagaaa acctgacggc3180tatgattact atgccttttc taaagatcaa tactataaca ttgatgtgcc tagtagaaca3240gcaagagcaa ttactactcg ttctgggcag accttatcca aagtctggta caactgtcct3300taa 3303
<210>23<211>1100<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>完整PRG4-LUB5蛋白的氨基酸序列。
<400>23Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val1 5 10 15Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly20 25 30Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr35 40 45Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys50 55 60Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg65 70 75 80Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys85 90 95Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser100 105 110Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr115 120 125Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys130 135 140Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val145 150 155 160Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser165 170 175Ser Thr Ile Trp Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg180 185 190
Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr195 200 205Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser210 215 220Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr225 230 235 240Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys245 250 255Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys260 265 270Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu275 280 285Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr290 295 300Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp305 310 315 320Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu325 330 335Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro340 345 350Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro355 360 365Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr370 375 380Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr385 390 395 400Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr405 410 415Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro420 425 430Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr435 440 445
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys450 455 460Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys465 470 475 480Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu485 490 495Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu500 505 510Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro515 520 525Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Glu530 535 540Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser Glu Val Ser Thr Pro Thr Thr Thr Lys545 550 555 560Glu Pro Thr Thr Ile His Lys Ser Pro Asp Glu Ser Thr Pro Glu Leu565 570 575Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys Ala Leu Glu Asn Ser Pro Lys Glu Pro580 585 590Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr Pro Ala Ala Thr Lys Pro Glu Met Thr595 600 605Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg Thr Thr Pro610 615 620Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro Lys Met Thr Lys Glu Thr Ala Thr Thr625 630 635 640Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser Lys Ile Thr Ala Thr Thr Thr Gln Val645 650 655Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp Thr Thr Pro Phe Lys Ile Thr Thr Leu660 665 670Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Thr Thr Thr Lys Lys Thr Ile675 680 685Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Lys690 695 700
Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys Ala Thr Thr Pro Lys Pro Gln Lys Pro705 710 715 720Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys Thr Met725 730 735Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg Lys Met Thr740 745 750Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile Ala Glu Ala Met755 760 765Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro Asn Ser Lys Leu Val770 775 780Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly Gly Ala Glu Gly Glu Thr785 790 795 800Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val Phe Met Pro Glu Val Thr Pro805 810 815Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val Pro Asn Gln Gly Ile Ile Ile Asn820 825 830Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro Val Asp835 840 845Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg Gly His850 855 860Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala Arg Arg865 870 875 880Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr885 890 895Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser Gln Tyr900 905 910Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Pro Ile915 920 925Phe Lys Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ala Leu Ser930 935 940Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys Arg945 950 955 960
Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr Ile Tyr Lys Gln Glu Pro Val Gln Lys965 970 975Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Val Tyr Gly Glu Met980 985 990Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile Gly Pro Ser Gln995 1000 1005Thr His Thr Ile Arg Ile Gln Tyr Ser Pro Ala Arg Leu Ala Tyr1010 1015 1020Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn Glu Val Lys Val Ser Ile Leu1025 1030 1035Trp Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr Ser Ala Ile Ser Leu Pro1040 1045 1050Asn Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Lys1055 1060 1065Asp Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg Thr Ala Arg Ala1070 1075 1080Ile Thr Thr Arg Ser Gly Gln Thr Leu Ser Lys Val Trp Tyr Asn1085 1090 1095Cys Pro1100<210>24<211>514<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>來源于cDNA盒-1的Lub5 DNA插入片段和4個合成cDNA盒-2序列。
<400>24gcgcgcccac aactccaaaa gagcccgcac ctaccacgac aaagtcagct cctactacgc 60ccaaagagcc agcgccgacg actactaaag aaccggcacc caccacgcct aaagaaccag120cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc acaacaccaa180aggagccggc ccctacgact cctaaagaac cagcccctac tacgacaaag gagcctgcac240
ccacaaccac gaagagcgca cccacaacac caaaggagcc ggcccctacg actcctaaag300aaccagcccc tactacgaca aaggagcctg cacccacaac cacgaagagc gcacccacaa360caccaaagga gccggcccct acgactccta aagaaccagc ccctactacg acaaaggagc420ctgcacccac aaccacgaag agcgcaccca caacaccaaa ggagccggcc cctacgactc480ctaaggaacc caaaccggca ccaaccactc cgga514<210>25<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由Lub5 DNA插入片段編碼的170個氨基酸(在SEQ ID NO23中位于S373-E544之間有15個KEPAPTT序列)。
<400>25Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala1 5 10 15Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala20 25 30Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala35 40 45Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro50 55 60Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro65 70 75 80Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr85 90 95Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr100 105 110Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr115 120 125Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr130 135 140
Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro145 150 155 160Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro165 170<210>26<211>45<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選PRG4-LUBN蛋白中的氨基酸序列″APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTTKEPAPTTPKEPAPTTTK″(45個氨基酸)<400>26Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala1 5 10 15Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala20 25 30Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys35 40 45<210>27<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在優(yōu)選PRG4-LUBN蛋白中重復(fù)N-1次的氨基酸序列″KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP″(31個氨基酸)<400>27Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr1 5 10 15Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro20 25 30<210>28
<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在優(yōu)選PRG4-LUBN蛋白中使SEQ ID NO26與SEQ ID NO27的(N-2)個重復(fù)連接的氨基酸序列″EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP″(22個氨基酸)，其中N＝3或更高數(shù)值。
<400>28Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu1 5 10 15Pro Ala Pro Thr Thr Pro20<210>29<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選PRG4-LUBN蛋白中的氨基酸序列″KEPKPAPTTP″(10個氨基酸)，其中N＝2或更高數(shù)值。
<400>29Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro1 5 10
權(quán)利要求
1.分離的蛋白，包括SEQ ID NOS9、13、17、21或25。
2.分離的蛋白，包括與SEQ ID NO27的N-2個重復(fù)連接的SEQID NO26，其中N為3-200的整數(shù)。
3.權(quán)利要求2所述的蛋白，其中N為5-50的整數(shù)。
4.權(quán)利要求2所述的蛋白，其中N為10-30的整數(shù)。
5.分離的蛋白，包括SEQ ID NO26加SEQ ID NO28加[SEQ IDNO27的N-2個重復(fù)]加SEQ ID NO29，其中N為10-30的整數(shù)。
6.分離的多核苷酸，含有編碼權(quán)利要求1所述蛋白的核酸序列。
7.分離的多核苷酸，含有編碼權(quán)利要求2所述蛋白的核酸序列。
8.分離的多核苷酸，含有編碼權(quán)利要求3所述蛋白的核酸序列。
9.分離的多核苷酸，含有編碼權(quán)利要求4所述蛋白的核酸序列。
10.分離的多核苷酸，含有編碼權(quán)利要求5所述蛋白的核酸序列。
11.分離的蛋白，包括SEQ ID NOS7、11、15、19或23。
12.分離的多核苷酸，含有編碼權(quán)利要求11所述蛋白的核酸序列。
13.權(quán)利要求6所述的多核苷酸，其中該多核苷酸包括SEQ IDNOS8、12、16、20或24。
14.權(quán)利要求12所述的多核苷酸，其中該多核苷酸包括SEQ IDNOS6、10、14、18或22。
15.分離的多核苷酸，包括與SEQ ID NOS6、10、14、18或22在序列的全長上具有至少80％同一性的多核苷酸。
16.權(quán)利要求15所述的多核苷酸，包括具有至少90％同一性的多核苷酸。
17.權(quán)利要求15所述的多核苷酸，包括具有至少95％同一性的多核苷酸。
18.權(quán)利要求15所述的多核苷酸，包括具有至少99％同一性的多核苷酸。
19.權(quán)利要求1或2所述的蛋白，其中該蛋白與β-(1-3)-Gal-GalNac為O連接。
20.組合物，含有藥學(xué)可接受載體中的治療有效量的權(quán)利要求19所述的蛋白。
21.權(quán)利要求20所述的組合物，還包括乙酰透明質(zhì)酸或hylan。
22.治療被試者的方法，包括獲得權(quán)利要求20所述的組合物；和對被試者的組織施用該組合物。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述組織選自軟骨、滑膜、半月板、腱、腹膜、心包和胸膜。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述組織為軟骨。
25.權(quán)利要求22所述的方法，還包括選自下列的步驟向被試者提供麻醉劑；向被試者提供抗炎癥藥物；向被試者提供抗生素；從被試者抽吸液體；清洗被試者的組織；并對被試者的組織成像。
26.權(quán)利要求22所述的方法，其中被試者選自小鼠、大鼠、貓、狗、馬和人。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中被試者為人。
28.表達(dá)載體，含有與表達(dá)控制序列可操作連接的權(quán)利要求6或7所述的多核苷酸。
29.制備重組蛋白的方法，包括在液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)由權(quán)利要求28所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；并從該培養(yǎng)基中收集重組蛋白。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中蛋白收集步驟還包括通過膜過濾培養(yǎng)基使所述蛋白濃縮；從膜上收集被截留的蛋白；并將收集到的蛋白溶解在含有濃度范圍為0.1-2.0M的L-精氨酸鹽酸鹽的緩沖鹽溶液中。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中L-精氨酸鹽酸鹽的濃度為0.5M。
32.對權(quán)利要求1或2所述的蛋白具有特異性的分離抗體。
全文摘要
重組潤滑素分子及其用途。本發(fā)明提供了新的重組潤滑素分子及其作為潤滑劑、抗粘連劑和/或關(guān)節(jié)內(nèi)補(bǔ)充物應(yīng)用于例如滑膜關(guān)節(jié)、半月板、腱、腹膜、心包和胸膜的用途。
文檔編號A61K31/728GK1867350SQ200480029904
公開日2006年11月22日 申請日期2004年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月14日
發(fā)明者C·R·弗里納里, C·J·科爾科蘭, B·A·弗里曼, L·A·拉西 申請人:惠氏公司