專利名稱：特異人抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及結合特定表位的抗體，所述表位存在于細胞，如癌細胞、轉移細胞、白血病細胞、白細胞和血小板上并且對于諸如細胞滾動(cell rolling)、轉移、炎癥和自身免疫病的多種生理現(xiàn)象是重要的。更具體地，所述抗體具有抗癌活性、抗轉移活性、抗白血病活性、抗病毒活性、抗感染活性，和/或針對其他疾病的活性，所述其他疾病例如炎性疾病、自身免疫病、病毒感染、心血管病，如心肌梗死、視網(wǎng)膜病，和由依賴硫酸化酪氨酸的蛋白質-蛋白質相互作用導致的疾病。此外，本發(fā)明的抗體可以用作靶向劑以將治療劑導向身體內的特定細胞或者部位。
背景技術：
白血病、淋巴瘤和骨髓瘤是來源于骨髓和淋巴組織并且參與細胞的不受控制的生長的癌。急性成淋巴細胞性白血病(ALL)是由特定臨床和免疫學特征定義的異質性疾病。與ALL的其他形式類似，B細胞ALL(B-ALL)的大多數(shù)病例的確定原因還是未知的；盡管在許多病例中，該疾病由單個細胞DNA中的獲得性遺傳改變引起，所述遺傳改變導致異常和連續(xù)增殖。在兒童和成年人中，患有B-ALL的患者的預后比其他白血病患者的更嚴重。慢性淋巴細胞性白血病(CLL)是B細胞CLL(B-CLL)的一個實例，是白血病的緩慢發(fā)展形式，其特征是淋巴細胞數(shù)目增加。急性髓細胞性白血病(AML)是贅生物的異質組，其中祖細胞在正常條件下產(chǎn)生髓細胞系的終末分化的細胞(紅細胞、粒細胞、單核細胞和血小板)。與其他形式的瘤形成一樣，AML與獲得性遺傳改變有關，所述遺傳改變導致正常分化的髓樣細胞被相對不分化的母細胞代替，從而顯示出一種或多種類型的早期骨髓分化。AML通常在骨髓中發(fā)展，且較低程度地在次級造血器官中發(fā)展。AML主要侵襲成年人，在15-40歲的發(fā)病率達到峰值，但是還已知AML侵襲兒童和老人。幾乎所有AML患者都需要診斷后立即治療以實現(xiàn)臨床減輕，其中沒有證據(jù)表明循環(huán)的未分化的母細胞的異常水平。
分離的scFv抗體分子的配體血小板、血纖蛋白原、GPIb、選擇蛋白和PSGL-1(P-選擇蛋白糖蛋白配體-1)的每一種都在以下幾種致病條件或者疾病狀態(tài)中起重要作用，如異常炎癥或者致病性炎癥、異常免疫反應或者致病性免疫反應、自身免疫反應、轉移、異常粘連或者致病性粘連、血栓形成和/或再狹窄，和異常聚集或者致病性聚集。從而，與血小板和與這些分子結合或交叉反應的抗體可以用于診斷和治療與這些和其他致病條件有關的疾病和病癥。
血小板血小板是血液系統(tǒng)的良好表征的成分并且在止血、血栓形成和/或再狹窄中起若干重要的作用。對血管的損傷啟動稱作止血的過程，其特征是一系列的順序事件。對損傷血管的最初反應是血小板粘附到血管內表面上受影響的區(qū)域。下一步是許多層血小板在前面粘附的血小板上聚集，形成止血栓子并封閉血管壁。通過沉積血纖蛋白聚合物進一步加強止血栓子。僅當損傷被修復時血塊或者栓子得到降解。
循環(huán)的血小板是從巨核細胞的外周釋放的細胞質顆粒。血小板在止血起重要作用。在血管損傷后，血小板粘附到受損的組織表面并相互附著(粘合)。該事件序列快速發(fā)生，從而在血管損傷部位形成無結構的塊(通常稱作血小板栓子或者血栓)。該粘合現(xiàn)象(也稱作聚集)可以由多種物質、或者激動劑，如膠原、腺苷二磷酸(ADP)、腎上腺素、5-羥色胺和利托菌素體外引起。聚集是所進行的多種體外試驗之一，用作血小板功能的量度。
轉移中血小板的重要性腫瘤轉移可能是限制癌癥患者存活的最重要的因素。所積累的數(shù)據(jù)表明腫瘤細胞與宿主血小板相互作用的能力代表轉移中不可缺少的決定因素之一(Oleksowicz，Thrombosis Res.79261-74(1995))。當轉移性癌細胞進入血流時，形成包被腫瘤細胞的多細胞復合體，它們由血小板和白細胞組成。這些復合體也可以稱作微栓塞，它們幫助腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)。血小板對腫瘤細胞的包被需要血小板表達P-選擇蛋白。
已經(jīng)證明腫瘤細胞聚集血小板的能力與腫瘤細胞的轉移潛力相關，并且已經(jīng)顯示抑制腫瘤誘導的血小板聚集與嚙齒動物模型中轉移的抑制相關。已經(jīng)證明腫瘤細胞與血小板的相互作用涉及膜粘著分子和激動劑分泌。已經(jīng)在腫瘤細胞系上鑒定了免疫相關的血小板糖蛋白的表達。還證明在乳腺腫瘤細胞系的表面上表達血小板免疫相關的糖蛋白、GPIb、GPIIb/IIIa、GPIb/IX和整聯(lián)蛋白αv亞基(Oleksowicz，(1995)，同上；Kamiyama等人，J.Lab.Clin.Med.117(3)209-17(1991))。
Gasic等人(PNAS 6146-52(1968))顯示抗體誘導的血小板減少顯著降低CT26結腸腺癌、Lewis肺癌和B16黑素瘤產(chǎn)生的轉移的數(shù)目和體積(Karpatkin等人，J.Clin.Invest.81(4)1012-19(1988)；Clezardin等人，Cancer Res.53(19)4695-700(1993))。此外，發(fā)現(xiàn)在HEL細胞的表面膜上表達單多肽鏈(60kd)，其與GPIb密切相關并且對應于不完全或者異常O-糖基化的GPIbα亞基(Kieffer等人，J.Biol.Chem.261(34)15854-62(1986))。
GPIb復合體止血過程中的每一步都需要血小板表面上存在受體。對止血重要的一種受體是糖蛋白Ib-IX復合體(也稱作CD42)。該受體介導血小板通過結合內皮下膜中的von Willebrand因子(vWF)在受傷部位粘著血管壁(最初的附著)。它在止血中重要的兩種其他血小板功能中也具有重要作用(a)在動脈狹窄區(qū)通過高剪切力誘導血小板的聚集和(b)通過低濃度凝血酶誘導血小板激活。
GPIb-IX復合體是血小板質膜的外表面的主要成分之一。所述復合體包含三種跨膜多肽-GPIb的二硫鍵連接的130kDaα鏈和25kDaβ鏈和非共價結合的GPIX(22kDa)。為了CD42復合體的有效細胞表面表達和功能，所有亞基都以等摩爾量存在于血小板膜上，表明三種亞基正確裝配成復合體是在質膜上的完全表達所需要的。GPIb的α鏈由三種不同結構域組成，它們是(1)含有富含亮氨酸的重復序列和Cys-結合的側翼序列的球狀N-末端肽結構域；(2)高度糖基化的粘蛋白樣大糖肽結構域；和(3)膜結合的C-末端區(qū)，其含有連接GPIbα和跨膜和細胞質序列的二硫鍵。
一些證據(jù)表明vWF和GPIb-IX復合體的結合凝血酶的結構域存在于球狀區(qū)，其包括GPIbα的氨基末端的約300個氨基酸。人血小板GPIb-IX復合體是關鍵的膜受體，其介導血小板功能和反應性。GPIb對內皮下結合的vWF的識別允許血小板粘附到受損的血管。此外，vWF對GPIbα的結合還誘導血小板激活，其可以包括GPIb-IX的細胞質結構域與細胞骨架或者磷脂酶A2的相互作用。此外，GPIbα含有α-凝血酶的高親和力結合位點，其通過當前還沒有較好定義的機制促進血小板激活。
GPIbα的N-末端球狀含有帶負電荷的氨基酸簇。一些證據(jù)表明在表達GPIb-IX復合體的經(jīng)轉染的CHO細胞和在血小板GPIbα中，該結構域含有的三個酪氨酸殘基(Tyr-276、Tyr-278和Tyr-279)經(jīng)歷硫酸化。
蛋白質硫酸化蛋白質硫酸化是廣泛的翻譯后修飾，其包括硫酸鹽酶促共價附著到糖側鏈或者多肽主鏈。該修飾在高爾基體外側室中發(fā)生。硫酸化蛋白質包括分泌性蛋白質、導向顆粒的蛋白質，和質膜蛋白質的細胞外區(qū)域。酪氨酸是當前已知經(jīng)歷硫酸化的氨基酸殘基。Kehoe等人，Chem.Biol.7R57-61(2000)。其他氨基酸，例如，蘇氨酸，可以也經(jīng)歷硫酸化，尤其在患病細胞中經(jīng)歷硫酸化。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多蛋白質是酪氨酸硫酸化的，但是如在GPIb中發(fā)現(xiàn)的，在單一多肽中存在三個或更多個硫酸化酪氨酸是不常見的。GPIbα(CD42)由血小板和巨核細胞表達并且通過結合vWF介導血小板附著到內皮下膜和在內皮下膜上滾動，其在其N-末端結構域也含有許多負電荷。認為這種高度酸性和親水環(huán)境是硫酸化的前提條件，因為酪氨酰蛋白質磺基轉移酶特異識別并硫酸化與酸性氨基酸殘基相鄰的酪氨酸(Bundgaard等人，J.Biol.Chem.27221700-05(1997))。GPIbα的酸性區(qū)域的完全硫酸化產(chǎn)生具有顯著負電荷密度的區(qū)域——在19個氨基酸序列內13個帶負電荷，從而使得該區(qū)域是與其他蛋白質靜電相互作用的候選位點。
還認為硫酸化的N-末端酪氨酸影響CC-趨化因子受體如CCR5的作用，所述受體作為人和猿猴免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2和SIV)進入靶細胞的相關的七跨膜片段(7TMS)受體的共同受體。例如，認為硫酸化的N-末端酪氨酸有助于CCR5結合MIP-1α、MIP-1β和HIV-1 gp120/CD4復合體并且有助于HIV-1進入表達CCR5和CD4的細胞的能力。CXCR4是另一種重要的HIV-1共同受體，其也被硫酸化(Farzan等人，Cell 96(5)667-76(1999))。酪氨酸硫酸化在依賴CXCR4的HIV-1進入中的作用沒有依賴CCR5的進入中的作用重要；從而證明了酪氨酸硫酸化在CXC-趨化因子家族中的可能作用并且強調了CCR5和CXCR4的HIV-利用中一般性差別(Farzan等人，J.Biol.Chem.，277(33)29，484-89(2002))。
選擇蛋白和PSGL-1P-、E-和L-選擇蛋白是粘著分子家族成員，其除其他功能外，介導血管內皮上白細胞的滾動。P-選擇蛋白以顆粒儲存在血小板中并在由凝血酶、組胺、佛波酯或者其他刺激分子激活后轉運到表面。P-選擇蛋白也在激活的內皮細胞上表達。E-選擇蛋白在內皮細胞上表達，且L-選擇蛋白在嗜中性粒細胞、單核細胞、T細胞和B細胞上表達。
PSGL-1(也稱作CD162)是P-選擇蛋白、E-選擇蛋白和L-選擇蛋白的粘蛋白糖蛋白配體，其與GPIb具有結構相似性(Afshar-Kharghan等人(2001)，前述)。PSGL-1是二硫鍵連接的同型二聚體，其具有PACE(配對的堿性氨基酸轉化酶)切割位點。PSGL-1的細胞外部分含有三個N-連接的糖基化位點并具有許多唾液酸化、巖藻糖基化O-連接的寡糖分枝(Moore等人，J.Biol.Chem.118445-56(1992))。大多數(shù)N-聚糖位點和許多O-聚糖位點都被占據(jù)。已經(jīng)測定了來自人HL-60細胞的PSGL-1的O-聚糖的結構。這些O-聚糖的亞型是結合選擇蛋白所需的核心-2、唾液酸化和巖藻糖基化結構。PSGL-1的氨基末端區(qū)的酪氨酸硫酸化也是結合P-選擇蛋白和L-選擇蛋白所需的。此外，存在有N-末端前肽，其可能在翻譯后被切割。
PSGL-1在HL60細胞中具有361個殘基，其中267個殘基為細胞外區(qū)、25個殘基為跨膜區(qū)和69個殘基為細胞內區(qū)，且在細胞表面上形成二硫鍵結合的同型二聚體或者異二聚體(Afshar-Kharghan等人，Blood 973306-12(2001))。編碼PSGL-1的序列是單個外顯子，因此可變剪接是不可能的。然而，HL60細胞和大多數(shù)細胞系中的PSGL-1具有存在于細胞外區(qū)的10個殘基共有序列的15個連續(xù)重復序列，盡管在多形核白細胞、單核細胞和幾種其他細胞系(包括大多數(shù)天然白細胞)中存在該序列的14和16個重復。
PSGL-1在嗜中性粒細胞中以二聚體表達，具有250kDa和160kDa的表觀分子量，而在HL60上，二聚體形式為約220kDa。當在還原條件下分析時，每個亞基減小一半。分子量的不同可能是由于存在不同數(shù)目的十聚體重復導致的分子多態(tài)性(Leukocyte Typing VI.T.Kishimoto等人編著(1997))。
大多數(shù)血液白細胞，如嗜中性粒細胞、單核細胞、白細胞、B細胞亞群和所有T細胞都表達PSGL-1(Kishimoto等人(1997)，前述)。PSGL-1介導白細胞在激活的內皮、激活的血小板和其他白細胞和炎性部位上的滾動，并介導嗜中性粒細胞在P-選擇蛋白上的滾動。PSGL-1也可以通過結合L-選擇蛋白介導嗜中性粒細胞-嗜中性粒細胞相互作用，從而介導炎癥(Snapp等人，Blood 91(1)154-64(1998))。
白細胞滾動在炎癥中是重要的，且P-選擇蛋白(由激活的內皮并且在血小板上表達，其可以在損傷部位固定化)和PSGL-1之間的相互作用對于血管壁上白細胞的粘連和滾動是有幫助的(Ramachandran等人，PNAS 98(18)10166-71(2001)；Afshar-Kharghan等人(2001)，前述)。細胞滾動對于轉移也是重要的，且認為內皮細胞上P-和E-選擇蛋白結合轉移細胞，從而促進從血流外滲到周圍組織中。
從而，已經(jīng)在所有白細胞嗜中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、激活的外周T細胞、粒細胞、嗜酸性粒細胞、血小板和在一些CD34陽性干細胞和B細胞的某些亞群上發(fā)現(xiàn)了PSGL-1。P-選擇蛋白在激活的血小板和內皮細胞上選擇性表達。P-選擇蛋白和PSGL-1之間的相互作用促進血管壁上白細胞的滾動，且白細胞在血管部位的異常積累導致多種病理炎癥。PSGL-1上個體硫酸酪氨酸的立體特異貢獻對于P-選擇蛋白對PSGL-1的結合是重要的。電荷對于結合也是重要的減少NaCl(從150到50mM)增強了結合(Kd約75nM)。PSGL-1上的酪氨酸硫酸化增強P-選擇蛋白上的PSGL-1粘著，但不是所述粘著最終需要的。PSGL-1酪氨酸硫酸化支持在所有剪切率的較慢滾動粘附并且支持在更高剪切率的滾動粘附(Rodgers等人，Biophys.J.812001-09(2001))。此外，已經(jīng)提出血小板上PSGL-1表達為白細胞中的1/100-1/25(Frenette等人，J.Exp.Med.191(8)1413-22(2000))。
已經(jīng)產(chǎn)生了針對人PSGL-1的通過商業(yè)途徑可獲得的單克隆抗體KPL1，并且顯示其抑制PSGL-1與P-選擇蛋白之間和PSGL-1與L-選擇蛋白之間的相互作用。將KPL1表位作圖到PSGL-1的酪氨酸硫酸化區(qū)域(YEYLDYD)(SEQ ID NO1)(Snapp等人，Blood 91(1)154-64(1998))。
用O-唾液酸糖蛋白酶對腫瘤細胞的預處理也抑制腫瘤細胞-血小板復合體形成，所述預處理除去了唾液酸化、巖藻糖基化的粘蛋白配體。體內實驗表明這些處理的任一種導致單核細胞與循環(huán)的腫瘤細胞的更大的結合，表明減小血小板結合增加了免疫細胞對循環(huán)腫瘤細胞的接近(Varki和Varki，Braz.J.Biol.Res.34(6)711-17(2001))。
血纖蛋白原有兩種形式的正常人血纖蛋白原-正常的(γ)和γ’，每一種都在正常個體中發(fā)現(xiàn)。正常血纖蛋白原是更豐富的形式(身體中發(fā)現(xiàn)的總血纖蛋白原的約90％)，由兩條相同的55kDaα鏈、兩條相同的95kDaβ鏈和兩條相同的49.5kDaγ鏈組成。正常的變體血纖蛋白原是較不豐富的形式(身體中發(fā)現(xiàn)的血纖蛋白原的約10％)，由兩條相同的55kDaα鏈、兩條相同的95kDaβ鏈、一條49.5kDaγ鏈和一條變體50.5kDaγ’鏈組成。γ和γ’鏈由相同基因編碼，在3’末端發(fā)生可變剪接。正常的γ鏈由氨基酸1-411組成，且正常的變體γ’鏈由427個氨基酸組成，其中氨基酸1-407與正常γ鏈中的氨基酸相同，而氨基酸408-427為VRPEHPAETEYDSLYPEDDL(SEQ ID NO2)。該區(qū)域通常由凝血酶分子占據(jù)。
在離子化鈣的存在下通過凝血酶的作用將血纖蛋白原轉化成血纖蛋白而產(chǎn)生血液的凝固。血纖蛋白也是血栓和急性炎性滲出物的成分。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供結合硫酸化PSGL-1的多種抗體或者多肽和其使用方法。
具體地，本發(fā)明的一個目的是提供通過施用本發(fā)明的抗體激活ADCC或者刺激自然殺傷細胞(NK)或者T細胞的方法。
本發(fā)明的另一具體目的是提供誘導細胞死亡的方法。
本發(fā)明的再一個具體目的是提供防止病毒如HIV感染的方法，其包括對需要其的患者施用本文所述的抗體。
本發(fā)明的另一具體目的是提供將試劑導入表達硫酸化PGSL-1的細胞的方法，其具有下面的步驟將所述試劑偶聯(lián)或者復合本文描述的抗體和將所述抗體-試劑偶聯(lián)物或者復合體施用于細胞。
最后，本發(fā)明的一個具體目的是提供使用本發(fā)明抗體進行診斷、預后和分期的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了結合包含基序D-X-Y-D(SEQ ID NO3)的PSGL-1的表位的抗體或者多肽，其中X代表D和Y之間的任意氨基酸或者共價鍵，且Y經(jīng)硫酸化，所述抗體可以與試劑的多個拷貝偶聯(lián)或者復合，所述試劑選自抗癌劑、抗白血病劑、抗轉移劑、抗腫瘤劑、抗疾病劑、抗粘附劑、抗血栓形成劑、抗再狹窄劑、抗自身免疫劑、抗聚集劑、抗細菌劑、抗病毒劑和消炎藥。
本發(fā)明的抗體可以用于誘導依賴抗體的細胞毒性和/或刺激自然殺傷(NK)細胞或者T細胞。此外，通過對需要其的患者施用這些抗體，提供了誘導細胞死亡的方法。還提供了通過對需要其的患者施用本發(fā)明的抗體預防病毒(例如，HIV)感染的方法。本發(fā)明還提供了通過將試劑偶聯(lián)或者復合本發(fā)明的抗體并向細胞施用所述抗體-試劑偶聯(lián)物或者復合體來將試劑導入表達硫酸化PSGL-1的細胞中的方法。本發(fā)明還提供了鑒定、分離和純化腫瘤細胞標記的方法。最后，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明抗體進行診斷、預后和分期的方法。
附圖簡述本文參考下面的附圖作為實例并且不作為限制，更詳細地描述本發(fā)明，在所述附圖中

圖1顯示了部分純化的AML-R1細胞裂解物穿過Y1-IgG親和柱之前和之后的蛋白質印跡。
圖2表明在所純化的蛋白質的硫酸化酪氨酸基序中的三個酪氨酸中，酪氨酸2和3經(jīng)硫酸化。
圖3顯示了原代B-CLL樣品中Y1-IgG(20μg/ml)介導的ADCC(細胞毒性百分數(shù))。
圖4顯示了PBMC的Y1-IgG介導的針對AML細胞的ADCC(細胞毒性百分數(shù))。
圖5顯示了ML-2細胞中增加的ADCC(細胞毒性百分數(shù))，其作為Y1-IgG濃度的函數(shù)。
圖6顯示了PBMC的針對ML-2的ADCC(細胞毒性百分數(shù))。其作為Y1-IgG和KPL-1之間競爭的函數(shù)。
圖7A顯示了來自正常供者和B-CLL患者的自然殺傷細胞的針對ML-2細胞的Y1-IgG介導的ADCC(細胞毒性百分數(shù))。圖7B表明CD14+細胞(單核細胞)參與針對M12靶的ADCC。
圖8顯示了Y1介導的NK細胞上CD69(早期激活標記)的表達。
圖9顯示了通過FACS分析測定的Y1-IgG對來自B-CLL患者的單核細胞(CD19+，CD5+)的細胞凋亡作用。
圖10顯示了Y1-IgG和利妥?，斀閷У尼槍碜匀薆-CLL患者的單核細胞，即原代人B-CLL細胞(KBC115和KBC116細胞)的ADCC活性(細胞毒性百分數(shù))的分析。
圖11顯示了在患者血漿存在和不存在時，Y1-IgG、利妥?，敽虲ampath介導的針對來自人B-CLL患者的單核細胞(KBC156、KBC159、KBC160、KBC166和RAJI細胞)的CDC活性(溶解百分數(shù))。
圖12顯示了連接嗎啉代-阿霉素的抗體制備的反應方案。
圖13顯示了臍帶血和AML細胞中抗體-試劑復合體，即Y1-嗎啉代柔紅霉素(Y1-M-DNR)和Y1-嗎啉代阿霉素(Y1-M-Dox)復合體的細胞毒性。
圖14顯示了抗體-試劑復合體Y1-M-DNR針對兩種患者AML樣品(M4和M5期)和針對CD34+細胞的細胞毒性。
圖15顯示了多種Y1復合體的作為B-ALL細胞中對照的百分數(shù)的細胞毒性。
圖16A顯示了Y1 scFv與KU812細胞的結合，圖16B顯示了硫酸鹽饑餓的KU812細胞上GPIb的表面表達。
圖17A顯示了硫酸化肽DLYDYYPE對Y1-scFv與血小板結合的抑制作用。圖17B顯示了Y1-scFv血小板結合測定中替代突變肽的效果。
圖18A顯示了突變肽在抑制Y1-scFv與純化的glycocalicin結合中的作用。圖18B顯示了通過ELISA分析Y1-scFv與共價偶聯(lián)CovaLinkTMPlates的肽的結合。
圖19顯示了Y1與從PSGL-1衍生的固定化、硫酸化肽的結合。
圖20顯示了Y1結合非硫酸化PSGL-1和結合在第1、2和3位硫酸化的PSGL-1的活性百分數(shù)。
圖21顯示了高度酸性并且具有硫酸化酪氨酸的一些潛在的Y1結合基序。
圖22顯示了Y1對小細胞肺癌(SCLC)裂解物的識別。
圖23顯示了Y1內吞進入原代AML細胞的。
圖24顯示Y1內吞進入原代AML細胞的。
圖25顯示了Y1結合健康CD34+干細胞的分析。
圖26顯示了Y1結合健康CD34+干細胞的分析。
圖27顯示了37℃下Y1向原代AML細胞的內化。
圖28顯示了通過酸處理剝離膜結合的蛋白質后原代AML細胞中Y1染色的顯色。
圖29顯示了通過鏈霉蛋白酶處理剝離膜結合的蛋白質后原代AML細胞中Y1染色的顯色。
圖30顯示了4℃(圖30A)和37℃(圖30B)酸處理或者蔗糖預溫育后原代AML細胞中Y1染色的顯色。
圖31表明Y1-scFv有效抑制激活的人血小板與ML2細胞的結合。
圖32顯示了Y1-scFv(10μg/ml)對低密度(0.2μg/ml)固定化rh-P-選擇蛋白上ML2細胞滾動的影響。
圖33顯示了Y1-scFv(10μg/ml)對高密度(1.0μg/ml)固定化rh-P-選擇蛋白上ML2細胞滾動的影響。
圖34顯示在多種剪切應力下Y1-IgG(1μg/ml)對固定化rh-P-選擇蛋白(1.0μg/ml)上ML2細胞滾動的影響。
圖35顯示了增加濃度的Y1-scFv對高密度(1.0μg/ml)固定化rh-P-選擇蛋白上人嗜中性粒細胞滾動的影響。
圖36顯示了Y1-IgG對高密度(1.0μg/ml)固定化rh-P-選擇蛋白上人嗜中性粒細胞滾動的影響。
發(fā)明詳述抗體(Abs)或者免疫球蛋白(Igs)是結合抗原的蛋白質分子。天然發(fā)生的抗體的每種功能結合單位由通過二硫鍵連接在一起的四條多肽鏈(2條重鏈和2條輕鏈)的單位組成。每條鏈具有恒定區(qū)和可變區(qū)。可以將天然發(fā)生的抗體基于它們的重鏈成分分成幾類，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。IgG類包括幾種亞類，包括但不限于，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。B-淋巴細胞在體內產(chǎn)生免疫球蛋白，且每種此類分子識別特定外來抗原決定簇并且促進該抗原的清除。
可以以多種形式(包括抗體復合體)產(chǎn)生和使用抗體。文中所用術語“抗體復合體”或“多種抗體復合體”用于指一個或多個抗體與另一種抗體或者與一個或多個抗體片段的復合體，或者兩個或更多個抗體片段的復合體?？贵w片段的實例包括Fv、Fab、F(ab’)2、Fc和Fd片段。因此，根據(jù)本發(fā)明的抗體包括抗體或者其片段的復合體。
如本說明書和權利要求中所用的，將Fv定義為由人抗體的重鏈可變區(qū)和人抗體的輕鏈可變區(qū)組成的分子，其可以相同或不同，并且其中重鏈可變區(qū)連接、連結、融合或者共價附著或者結合輕鏈的可變區(qū)。Fv可以是單鏈Fv(scFv)或者二硫鍵穩(wěn)定的Fv(dsFv)。scFv由抗體的每條重鏈和輕鏈的可變結構域組成，所述可變結構域通過柔性氨基酸多肽間隔臂或者接頭連接。接頭可以是分枝或不分枝的。優(yōu)選地，接頭為0-15個氨基酸殘基，最優(yōu)選接頭為(Gly4Ser)3。
Fv分子自身由第一條鏈和第二條鏈組成，每條鏈具有第一、第二和第三高變區(qū)。輕鏈和重鏈的可變結構域內的高變環(huán)稱作互補決定區(qū)(CDR)。每條重鏈和輕鏈內有CDR1、CDR2和CDR3區(qū)。認為這些區(qū)形成抗原結合部位并且可以被特異修飾以產(chǎn)生增強的結合活性。實際上這些區(qū)的最可變的是重鏈的CDR3區(qū)。將CDR3區(qū)理解為Ig分子的最暴露的區(qū)域，并且，如本文所示和提供的，是主要負責所觀察到的選擇性和/或特異結合特征的部位。
將Fv分子的片段定義為小于最初Fv但是仍然保持最初Fv的選擇性和/或特異結合特征的任一分子。此類片段的實例包括但不限于(1)微型抗體(minibody)，其包含僅Fv的重鏈的片段，(2)微體，其包含抗體重鏈可變區(qū)的小部分單位(國際申請?zhí)朠CT/IL99/00581)，(3)具有輕鏈的片段的類似體，和(4)具有輕鏈可變區(qū)的功能單位的類似體。應該明白Fv分子的片段應該基本上是環(huán)狀或成環(huán)的多肽。
文中所用術語“Fab片段”是免疫球蛋白的單價抗原結合片段。Fab片段由輕鏈和部分重鏈組成。
F(ab’)2片段是通過胃蛋白酶消化得到的免疫球蛋白的二價抗原結合片段。它含有兩條輕鏈和兩條重鏈的部分。
Fc片段是免疫球蛋白的非抗原結合部分。它含有重鏈的羧基末端部分和Fc受體的結合部位。
Fd片段是免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)和第一個恒定區(qū)。
多克隆抗體是免疫應答的產(chǎn)物并且由許多不同的B-淋巴細胞形成。單克隆抗體來自一個克隆B細胞。
應用于多肽的并且如本發(fā)明定義的，盒指連續(xù)氨基酸的給定序列，其作為構架并且被認為是一個單位并且被同樣地進行操作。可以替代、插入、除去或者在一端或兩端附著氨基酸。同樣，可以替代、插入、除去或者在一端或兩端附著氨基酸序列。
文中所用的術語“表位”指抗原決定簇或識別位點或者抗原位點，其與抗體、抗體片段、抗體復合體或者具有其結合片段的復合體或者T細胞受體相互作用。術語表位在本文與術語配體、結構域和結合區(qū)可以互換使用。
選擇性在文中定義為導向分子選擇并結合實體或者實體狀態(tài)混合物中的一個實體或者細胞狀態(tài)的能力，所有實體或者實體狀態(tài)可以都對導向分子特異。
文中所用術語“親和力”是結合分子(例如，抗體上的一個結合部位)和配體(例如，抗原決定簇)之間的結合強度(結合常數(shù))的量度?？贵w上單個抗原結合部位和單個表位之間非共價相互作用總和的強度是該抗體對所述表位的親和力。低親和力抗體結合抗原弱并且傾向于容易地解離，而高親和力抗體更緊密結合抗原并且更長時間保持結合。術語“親合力”與親和力不同，因為親合力反映了抗原-抗體相互作用的效價。
抗體-抗原相互作用的特異性盡管抗原-抗體反應是特異的，但是在一些情況中，一種抗原引起的抗體可以與另一種不相關抗原交叉反應。如果兩種不同的抗原共有同源或者類似的結構、表位或者其錨定區(qū)，或者如果對一個表位特異的抗體結合具有相似的結構構象或者化學性質的不相關表位，那么發(fā)生此類交叉反應。
血小板是巨核細胞的盤狀胞質片段，其在骨髓竇中流出并隨后在外周血流中循環(huán)。血小板具有幾種生理功能，包括凝血中的主要作用。血小板含有位于中心的顆粒和外周透明原生質，但是沒有確定的核。
文中所用凝集指導致懸浮的細菌、細胞、盤或者具有類似大小的其他顆?？梢哉掣交蛘咝纬蓤F的過程。該過程類似于沉淀但是顆粒更大并且處于懸浮液而不是在溶液中。
術語聚集指體外誘導的血小板聚集，以及作為順序機制的一部分的凝血酶和膠原的聚集，導致形成血栓或者止血栓子。
將保守氨基酸替代定義為通過改變肽、多肽或者蛋白質或者其片段的一個或兩個氨基酸改變氨基酸組成。替代是被通常相似性質的氨基酸(例如，酸性、堿性、芳族、大小、帶正電荷或負電荷、極性、非極性)所替代的，從而該替代不相當大地改變肽、多肽或者蛋白質特征(例如，電荷、等電點、親和力、親合力、構象、溶解性)或活性?？梢詫Υ祟惐Ｊ匕被崽娲M行的一般替代可以在如下氨基酸組中甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)和異亮氨酸(I)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)組氨酸(H)、賴氨酸(K)和精氨酸(R)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)
可以在例如，主要負責分子的選擇性和/或特異結合特征的高變區(qū)側翼區(qū)域，以及分子的其他部分，例如，可變重鏈盒中進行保守氨基酸替代。額外或備選地，可以通過重建分子形成完全大小的抗體、雙鏈抗體(diabody)(二聚體)、三鏈抗體(triabody)(三聚體)和/或四鏈抗體(tetrabody)(四聚體)或者形成微型抗體或者微體來實現(xiàn)修飾。
噬菌粒定義為攜帶質粒DNA的噬菌體顆粒。噬菌粒是經(jīng)設計成含有來自絲狀噬菌體的復制起點的質粒載體，所述絲狀噬菌體如fd的m13。因為它攜帶質粒DNA，所以噬菌粒顆粒不具有足夠空間來含有噬菌體基因組的完整互補序列。從噬菌體基因組丟失的成分是包裝噬菌體顆粒必需的信息。因此，為了增殖噬菌體，必須將所希望的噬菌體顆粒與互補丟失的包裝信息的輔助噬菌體株系一起培養(yǎng)。
啟動子是DNA上的一個區(qū)域，RNA聚合酶在該區(qū)域結合并啟動轉錄。
噬菌體展示文庫(也稱作噬菌體肽/抗體文庫、噬菌體文庫或者肽/抗體文庫)包含噬菌體的大群體(108或更大)，每個噬菌體顆粒展示一個不同的肽或多肽序列?？梢詷嫿ㄟ@些肽或者多肽片段以使其具有可變長度。所展示的肽或者多肽可以來自，但不限于，人抗體重鏈或輕鏈。
藥物組合物指制劑，其包含本發(fā)明的抗體或肽或多肽和其藥學上可接受的載體、賦形劑或者稀釋劑，或者抗體-藥物試劑(抗體-試劑)復合體和其藥學上可接受的載體、賦形劑或者稀釋劑。
在本發(fā)明上下文中，試劑可用于哺乳動物的活動性疾病治療、預防性治療或者診斷，所述哺乳動物包括但不限于，人、牛、馬、豬、鼠、犬、貓或者任意其他溫血動物。試劑選自放射性同位素、毒素、寡核苷酸、重組蛋白質、抗體片段、抗癌劑、抗白血病劑、抗轉移劑、抗腫瘤劑、抗疾病劑、抗粘附劑、抗血栓形成劑、抗再狹窄劑、抗自身免疫劑、抗聚集劑、抗細菌劑、抗病毒劑和消炎藥。此類試劑的其他實例包括，但不限于抗病毒劑，包括無環(huán)鳥苷、更昔洛韋和齊多夫定；抗血栓形成/再狹窄劑，包括西洛他唑、達肝素鈉、瑞維肝素鈉和阿司匹林；消炎藥包括扎托洛芬、普拉洛芬、哚昔康、乙?；畻钏?7、雙氯芬酸鈉、布洛芬、右布洛芬、舒林酸、萘普生、氨托美丁、塞來昔布、吲哚美辛、羅非克西和尼美舒利；抗自身免疫劑包括來氟洛米、昂他克(denileukin diftifox)、subreum、WinRho SDF、去纖苷和環(huán)磷酰胺；抗粘附/抗聚集劑包括利馬羅斯特、clorcromene和透明質酸。
抗白血病劑是具有抗白血病活性的試劑。例如，抗白血病劑包括抑制或者終止白血病或者未成熟的前白血病細胞生長的試劑、殺死白血病或者前白血病細胞的試劑、增加白血病或前白血病細胞對其他抗白血病劑的易感性的試劑，和抑制白血病細胞轉移的試劑。在本發(fā)明中，抗白血病劑還可以是具有防止、抑制、延遲或者終止腫瘤血管化的抗血管生成活性的試劑。
通過分析在多種條件、特定時間、多種組織等中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的量可研究基因的表達模式。當基因產(chǎn)物的量高于在正常對照，例如未患病對照中發(fā)現(xiàn)的量時，認為基因“超表達”。
給定細胞可以在其表面表達具有給定抗體的結合部位(或者表位)的蛋白質，但是該結合部位可以以隱藏形式(例如，空間位阻的或者封閉的，或者缺少抗體結合所需的特征)在細胞中以一種狀態(tài)存在，所述狀態(tài)可以稱作第一階段(階段I)。階段I可以是例如，正常、健康的未患病狀態(tài)。當表位以隱藏形式存在時，它不被給定抗體識別，即，不存在抗體對該表位或者對階段I的給定細胞的結合。然而，表位可以通過例如經(jīng)歷自身修飾得以暴露，或者因為附近或者結合的分子受到修飾或者因為一個區(qū)域經(jīng)歷構象改變而被去封閉從而得以暴露。修飾的實例包括折疊的改變、翻譯后修飾的改變、磷脂化改變、硫酸化改變、糖基化改變等等。當細胞進入不同狀態(tài)時可以發(fā)生此類修飾，所述狀態(tài)可以稱作第二階段(階段II)。第二狀態(tài)或者階段的實例包括激活、增殖、轉化，或者處于惡性狀態(tài)。在被修飾后，表位可以暴露，從而抗體可以結合該表位。
肽模擬物(peptido-mimetics)(肽模擬物)是氨基酸之間不再含有任何肽鍵，即酰胺鍵的分子；然而，在本發(fā)明上下文中，術語肽模擬物意在包括本質上不再完全是肽的分子，如假肽、半肽和類肽。不管是完全還是部分非肽，根據(jù)本發(fā)明的肽模擬物提供了反應性化學部分的空間排列，其與肽模擬物所基于的肽中活性基團的三維排列非常類似。這些分子包括小分子、脂類、多糖或者其綴合物。
噬菌粒是經(jīng)設計成含有來自絲狀噬菌體的復制起點的質粒載體，所述絲狀噬菌體如m13或fd。
存在多種疾病，它們涉及患病的、改變的或者另外修飾的細胞，所述細胞在它們的表面表達細胞特異的和/或疾病特異的配體。這些配體可以用于通過識別、選擇、診斷和治療每個單獨的細胞來實現(xiàn)識別、選擇、診斷和治療特定疾病。本發(fā)明提供了肽或者多肽，它們包含F(xiàn)v分子、其構建體、其片段、片段的構建體或者構建體的片段，它們全部都具有增加的結合特征。這些結合特征允許肽或者多肽分子相對于其他細胞選擇性和/或特異結合靶細胞，所述結合特異性和/或選擇性主要由第一個高變區(qū)決定。Fv可以為scFv或dsFv。
上述Fv分子可以用于導向患病細胞。所述患病細胞可以為例如，癌細胞。服從通過特異導向進行診斷和/或治療的癌癥類型的實例包括，但不限于，癌、肉瘤、白血病、腺瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、胚細胞瘤、精原細胞瘤和黑素瘤。白血病、淋巴瘤和骨髓瘤是來自骨髓和淋巴組織的癌并且涉及細胞的不受控制的生長。
使用噬菌體展示文庫鑒定了結合PSGL-1和/或GPIb的抗體，并在美國申請?zhí)?0/032,423、10/032,037、10/029,988、10/029,926、09/751,181、10,189,032和60/258,948和國際申請?zhí)朠CT/US01/49442和PCT/US01/49440中公開。這些申請中公開的抗體的特定實例包括Y1、Y17和L32抗體。從種系(DP32)分離了這些抗體并且發(fā)現(xiàn)它們特異結合在造血細胞的蛋白質上發(fā)現(xiàn)的表位，該表位在N-末端酪氨酸經(jīng)硫酸化并且認為其參與細胞遷移，例如，腫瘤轉移。
結合Y1/Y17/L32的硫酸化表位的特征是存在硫酸化部分，如硫酸化酪氨酸殘基或者硫酸化糖或脂類部分，所述部分優(yōu)選在配體和受體中發(fā)現(xiàn)的兩個或更多個酸性氨基酸的簇內，其中所述配體和受體在諸如炎癥、免疫反應、感染、自身免疫反應、轉移、粘附、血栓形成和/或再狹窄、細胞滾動和聚集的多種過程中起重要作用。在患病細胞，如T-ALL細胞、B-白血病細胞、B-CLL細胞、AML細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞和轉移細胞上也發(fā)現(xiàn)了此類表位。這些表位是這些過程(以及導向劑)的治療性藥療法和診斷方法的有用靶。
此外，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明抗體的結合取決于細胞的發(fā)育階段(基于法國-美國-英國系統(tǒng)對AML亞型分類，其中使用在常規(guī)處理和細胞化學染色下觀察到的形態(tài)學)抗體可以結合M3或者以上亞型的AML細胞，但是不結合M0或M1亞型細胞。此外，所述抗體可以結合或不結合M2亞型細胞。因此，本發(fā)明的抗體不結合正常的健康骨髓(例如，CD34+細胞)。認為此類差異是基于PSGL-1表達和/或硫酸化的改變，以及暴露稍微不同的表位的PSGL-1的可能的構象改變的。
具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KU812細胞(表達低水平GPIb的人慢性髓細胞樣白血病細胞系)結合Y1抗體。在KU812細胞在氯酸鈉中生長后(其抑制硫酸化但是不抑制GPIb蛋白質的表達)，Y1對細胞的結合減小了50％。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基于GPIb的氨基酸273到285的酪氨酸硫酸化肽競爭抑制Y1抗體與血小板的結合，而非硫酸化肽不抑制Y1抗體與血小板的結合。
本發(fā)明包含或者使用識別并結合包含硫酸化酪氨酸基序的表位的的抗體或者其片段。此類基序包含富含酸性殘基(天冬氨酸和谷氨酸)并且含有至少一個酪氨酸的肽序列。識別和結合至少部分取決于所硫酸化的至少一個酪氨酸。一種此類抗體是Y1或者其片段。盡管Y1是在本文描述的實施方案中所指的抗體，但是這不應該理解成將本發(fā)明限制于使用Y1的實施方案。本發(fā)明包括使用結合包含硫酸化酪氨酸基序的表位的其他抗體的實施方案，所述抗體包括但不限于，與Y1和其保留結合特異性的片段相關的抗體。
根據(jù)本發(fā)明，提供了結合包含硫酸化酪氨酸基序的表位的抗體或者其片段，其中所述結合取決于基序的受到硫酸化的至少一個酪氨酸。在一個實施方案中，所述抗體介導依賴抗體的細胞毒性。在優(yōu)選實施方案中，抗體是Y1或者相關抗體，或者其片段。
本發(fā)明還提供了與此類抗體或者其片段復合(例如，結合、組合、融合或者連接)的試劑。1到16個試劑分子或者更多分子可以結合每個抗體?？贵w在鉸鏈區(qū)具有四個二硫鍵，它們可以選擇性還原成8個硫醇基。通過使用共價結合硫醇官能團并且攜帶一個試劑分子的接頭，可以將最多達8個試劑分子附著到抗體。通過使用與硫醇官能團類似反應但是攜帶n個試劑分子的接頭，可以將最多達8n個試劑分子附著到抗體。在一個實施方案中，僅重鏈與試劑復合或者僅輕鏈與試劑復合，而在更優(yōu)選實施方案中，每條重鏈與試劑的約2個拷貝復合并且每條輕鏈與試劑的約2個拷貝復合。
對于本領域技術人員，已知通過使用中間藥物載體可以將甚至更大數(shù)目的試劑分子連接到抗體，所述載體為諸如天然的(例如，葡聚糖)和合成的(例如，HPMA)聚合物以及脂質體(例如，抗體-接頭-載體-試劑)。還可以將試劑直接或間接連接到抗體的游離氨基。例如，可以通過接頭將試劑連接到游離ε-或α-氨基。通常，試劑直接連接到接頭，或者首先連接到載體，然后載體再連接到接頭。接頭-試劑或者接頭-載體-試劑復合體然后連接抗體?？贵w-試劑復合體可以被腫瘤細胞內化，其中試劑引起細胞死亡。在一個實施方案中，可以在細胞內通過例如，酸切割或者酶切割破壞抗體-試劑連接。在優(yōu)選實施方案中，所示抗體為Y1抗體或者相關抗體或者其片段。
本發(fā)明還提供了用于治療疾病的組合物，其包含Y1或者Y1-試劑復合體。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過使用本發(fā)明抗體誘導或者激活ADCC的方法。因此，這些抗體可以激活ADCC和/或刺激自然殺傷(NK)細胞(例如，CD56+)、γδT-細胞和/或單核細胞，這可以導致細胞溶解。通常，施用包含抗體的Fc區(qū)或者部分的抗體后，抗體結合效應細胞，例如NK細胞上的Fc受體(FcR)，從而引發(fā)釋放穿孔素和粒酶B和/或誘導FasB表達，其然后導致細胞凋亡。效應細胞上表達的FasL與靶細胞表面上Fas受體的結合可以通過Fas受體信號轉導途徑的激活誘導靶細胞的細胞凋亡。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體誘導效應細胞上FasL表達。多種因素可以影響ADCC，包括有關的效應細胞的類型、細胞因子(例如，IL-2和G-CSF)、溫育時間、細胞表面上存在的受體數(shù)和抗體親和力。
在再一個實施方案中，提供了通過對需要其的患者施用偶聯(lián)或復合試劑的本發(fā)明的抗體來誘導細胞死亡的方法，其中抗體-試劑偶聯(lián)物或者復合體通過內化進入細胞，并且抗體-試劑綴合物或者復合體受到切割，從而釋放試劑。可通過任意適宜的方法，例如，通過內吞或者通過吞噬作用發(fā)生內化。本發(fā)明從而提供了治療患者中疾病的方法(例如，治療可以包括減輕疾病的影響、預防疾病或者抑制疾病進展)。
特別地，用抗體向細胞引入試劑。所述抗體結合優(yōu)先在患病細胞表面上表達的蛋白質，如具有硫酸化酪氨酸殘基的蛋白質。在優(yōu)選實施方案中，試劑為毒素，如阿霉素、嗎啉代-阿霉素或者嗎啉代-柔紅霉素。在更優(yōu)選的實施方案中，毒素通過己二酸接頭或者[N-ε-馬來酰亞胺己酸]酰肼接頭連接到抗體。己二酸接頭已經(jīng)用于結合α氨基，而N-[馬來酰亞胺己酸]酰肼接頭已經(jīng)用于結合α氨基和結合還原二硫鍵的SH基(通過馬來酰亞胺基形成C-S鍵)。此外，在藥物和N-[馬來酰亞胺己酸]酰肼接頭之間形成腙鍵。
抗體-試劑復合體結合細胞表面蛋白質后，細胞內化該復合體。然后細胞內的酶切割抗體-毒素鍵，并且毒素作用于細胞以引起其死亡。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療疾病的包含此類抗體-毒素綴合物的組合物。
另一實施方案提供了用于向細胞導入非毒性試劑的類似方法。非毒性試劑可以用于改變細胞的行為或者活性，例如，通過直接或間接激活或抑制特定基因的活性實現(xiàn)所述改變。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了預防病毒感染的方法，其包括對需要其的患者施用本文所述的抗體。從而，通過施用阻斷感染的抗體實現(xiàn)治療疾病的方法。細胞在其表面表達含有含硫酸化酪氨酸基序的表位的蛋白質，所述表位被所述抗體識別并且是傳染物感染所需的?？贵w結合該蛋白質，從而阻斷感染。已知優(yōu)選抗體通過含有硫酸化酪氨酸基序的表位結合的蛋白質包括血纖蛋白原γ鏈、GP1b-α鏈、補體C4和PSGL-1。認為優(yōu)選抗體通過含有硫酸化酪氨酸基序的表位結合的蛋白質包括包括CCR5和CXCR4。CCR5和CXCR4任一個可以作為HIV感染必需的共同受體。在優(yōu)選實施方案中，所述抗體可以用于阻斷HIV株的感染。優(yōu)選抗體為Y1。
最后，提供了將試劑導入表達硫酸化PSGL-1的細胞的方法，其具有下面的步驟將試劑偶聯(lián)或者復合到本文描述的抗體并向細胞施用所述抗體-試劑偶聯(lián)物或者復合體。
本發(fā)明的抗體結合硫酸化PSGL-1。參與炎癥的白細胞，如單核細胞、嗜中性粒細胞和淋巴細胞主要由疾病(如動脈粥樣硬化)炎癥過程中的四種粘著分子PSGL-1、P-選擇蛋白、VLA-4和VCAM-1募集(Huo和Ley，Acta Physiol.Scand.，17335-43(2001)；Libby，Sci.Am.May48-55(2002)；Wang等人，J.Am.Coll.Cardiol.38577-582(2001))?？贵w對這些中心分子任一種的干擾暗示抗體在消除相關疾病中的潛在作用。特別地，P-選擇蛋白控制細胞附著和滾動。此外，P-選擇蛋白-PSGL-1相互作用激活細胞上的許多其他分子，它們整體與腫瘤發(fā)生(當涉及惡性細胞時)和炎癥反應(當涉及白細胞時)相關(Shebuski和Kilgore，J.Pharmacol.Exp.Ther.300729-735(2002))。基于對P-選擇蛋白調節(jié)細胞過程的能力的理解，顯然，抗體對硫酸化PSGL-1的增強的scFv選擇性使得它們成為治療多種惡性和炎性疾病的極好的分子。此外，惡性疾病的模型已經(jīng)表明P-選擇蛋白與惡性細胞的結合需要PSGL-1的硫酸化(Ma和Geng，J.Immunol.1681690-1696(2002))。該需要類似于抗體結合的要求。從而，人們可以預期抗體可以消除P-選擇蛋白對進行性惡性疾病的促進。
優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體結合參與炎癥或者腫瘤發(fā)生的至少一種細胞類型上存在的表位，所述細胞類型包括T-ALL細胞、AML細胞、前-B-ALL細胞、B-白血病細胞、B-CLL細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞和轉移細胞。此外，優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體可以結合脂類、糖、肽、糖脂、糖蛋白、脂蛋白和/或脂多糖分子上的表位。此類表位優(yōu)選具有至少一個硫酸化部分。備選地，但也是優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體與兩個或更多個表位交叉反應，每個表位都具有一個或多個硫酸化酪氨酸殘基，和至少一簇兩個或更多個酸性氨基酸，它的一個實例是PSGL-1。
本發(fā)明的這些抗體、其抗原結合片段或者復合體可以在結合細胞表面上的PSGL-1后內化到細胞。此類內化可以通過內吞以主動過程發(fā)生，所述主動過程是依賴于方式、時間和溫度的。例如，Y1通過PSGL-1特異性內化到來自AML患者的細胞。
本發(fā)明的抗體結合具有硫酸化酪氨酸位點的蛋白質。此類蛋白質包括PSGL-1、GP1b、α-2-抗纖溶酶；氨肽酶B；CC趨化因子受體，如CCR2、CCR5、CCR3、CXCR3、CXCR4、CCR8、CCR2b和CXCI；七跨膜片段(7TMS)受體；凝血因子，如因子V、VIII和IX；血纖蛋白原γ鏈；肝素輔因子II；分泌粒蛋白，如分泌粒蛋白I和II；玻連蛋白、淀粉狀蛋白前體、α-2-抗纖溶酶；縮膽囊素；α-絨毛膜促性腺激素；補體C4；硫酸皮膚素蛋白聚糖；纖連蛋白；和castrin。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體結合硫酸化CC趨化因子受體，如CCR5、CXCR4、CXCI和CCR2b。如前文所提到的，硫酸化酪氨酸可以有助于CCR5與MIP-1α、MIPβ和HIV-1 gp120/CD4的結合和有助于HIV-1進入表達CCR5和CD4的細胞的能力。
可以在原核或者真核表達系統(tǒng)中產(chǎn)生抗體、肽、多肽、蛋白質和其片段和構建體。在原核或者真核表達系統(tǒng)中產(chǎn)生抗體和片段的方法是本領域公知的。
如本發(fā)明中定義或如所討論的真核細胞系統(tǒng)指用于通過遺傳工程方法產(chǎn)生肽或多肽的表達系統(tǒng)，其中宿主細胞是真核細胞。真核表達系統(tǒng)可以是哺乳動物系統(tǒng)，并且哺乳動物表達系統(tǒng)中產(chǎn)生的肽或多肽經(jīng)純化后優(yōu)選基本上無哺乳動物污染物。有用的真核表達系統(tǒng)的其他實例包括酵母表達系統(tǒng)。
用于產(chǎn)生本發(fā)明的肽或多肽的優(yōu)選的原核系統(tǒng)使用大腸桿菌(E.coli)作為表達載體的宿主。大腸桿菌系統(tǒng)中產(chǎn)生的肽或多肽經(jīng)純化后基本上無大腸桿菌污染性蛋白質。原核表達系統(tǒng)的使用可以導致在提供用于本發(fā)明的一些或所有序列的N-末端加入甲硫氨酸殘基?？梢匀绫绢I域已知的進行肽或多肽產(chǎn)生后N-末端甲硫氨酸殘基的除去，以允許肽或多肽的完全表達，一個實例是在適宜的條件下使用氣單胞菌屬(Aeromonas)氨肽酶(美國專利號5,763,215)。
本發(fā)明的抗體和多肽可以復合，例如結合、組合、融合或者連接多種藥物試劑，如藥物、毒素、藥物和放射性同位素與任選地，藥學上有效的載體，以形成包含抗體/多肽和具有抗病和/或抗癌活性的藥物試劑的肽-藥物組合物。此類組合物還可以用于診斷目的。
例如，將蒽環(huán)類抗生素綴合或者復合到抗體是本領域公知的(Dubowchik & Walker，Pharmacol.& Thera.8367-123(1999)；Trail等人，Cancer Immunol Immunother.52328-337(2003))。此類綴合可以通過直接綴合或者通過接頭，如酸可切割的接頭或者酶可切割的接頭來實現(xiàn)，并且可以包括使用中間載體，如葡聚糖和合成的聚合物。蒽環(huán)類抗生素已經(jīng)通過(1)α氨基(約pH8)復合到本發(fā)明的抗體以產(chǎn)生4∶1的藥物∶抗體比(在該情況中兩個藥物分子附著到重鏈，且兩個藥物分子附著到輕鏈)；和通過(2)二硫鍵復合到本發(fā)明的抗體以產(chǎn)生4∶1至8∶1的藥物抗體比(取決于所用的方法)。如本領域已知的，藥物抗體比例如，可以通過使用2、3、4等分枝接頭二倍化、三倍化或者四倍化等。本領域技術人員可以對抗體、接頭、載體和/或藥物進行化學修飾以便使得反應對于制備綴合物的目的而言更方便。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將Fc區(qū)中的兩個二硫鍵用巰基乙胺還原并與約pH7的藥物接頭反應，其導致4∶1的藥物抗體比(在該情況中，所有四個藥物都附著到重鏈)。在另一實施方案中，將鉸鏈區(qū)中四個二硫鍵用DTT(約pH7)還原然后與藥物接頭反應，其導致約7∶1到8∶1的藥物抗體比(在該情況中，5或6個藥物分子附著到重鏈，且1或2個藥物分子附著到輕鏈)。
可以用于本發(fā)明的載體的實例包括葡聚糖、HPMA(親水聚合物)、或者任意其他聚合物，如親水聚合物，以及其衍生物、組合和修飾。備選地，可以使用經(jīng)裝飾的脂質體，其也成為免疫脂質體，如用scFvY1分子裝飾的脂質體，如Doxil，其是含有大量阿霉素的通過商業(yè)途徑可得到的脂質體?？梢灾苽浯祟愔|體以含有一種或多種所希望的試劑，和與本發(fā)明的抗體混合以提供高的藥物與抗體比。
備選地，抗體或多肽和試劑之間的連接可以是直接連接。兩個或更多個相鄰分子之間的直接連接可以通過分子中元素或者元素的基團之間的化學鍵產(chǎn)生?；瘜W鍵可以是例如，離子鍵、共價鍵、疏水鍵、親水鍵、靜電鍵或者氫鍵。鍵可以是例如，酰胺、二硫化碳、肽和/或二硫鍵。為了將抗體附著到試劑或接頭，如本領域中已知的，可以使用胺、羧基、羥基、硫醇和酯官能團來形成共價鍵。
可以通過接頭化合物產(chǎn)生肽和試劑之間或者肽和載體之間或者載體和試劑之間的連接。本文所用接頭化合物定義為連接兩個或更多個部分的化合物。接頭可以是直鏈或分枝的。分枝的接頭化合物可以由雙分枝、三分枝或者四分枝或更多分枝的化合物組成?？捎糜诒景l(fā)明的接頭化合物包括選自二羧酸、馬來酰亞胺酰肼、PDPH、羧酸酰肼和小肽的那些化合物。
根據(jù)本發(fā)明，接頭化合物的更特定的實例包括(a)二羧酸，如琥珀酸、戊二酸和己二酸；(b)馬來酰亞胺酰肼，如N-[馬來酰亞胺己酸]酰肼、4-[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧基酰肼和N-[馬來酰亞胺十一烷酸]酰肼；(c)(3-[2-吡啶基二硫代]丙?；ｋ?衍生物、組合、修飾和類似物；和(d)選自2-5個碳原子的羧酸酰肼。
使用小肽接頭通過直接偶聯(lián)進行連接也是有用的。例如，使用小肽可以實現(xiàn)例如抗癌藥物阿霉素的游離糖和scFv之間的直接偶聯(lián)。小肽的實例包括AU1、AU5、BTag、c-myc、FLAG、Glu-Glu、HA、His6、HSV、HTTPHH、IRS、KT3、C蛋白、S-TAG、T7、V5、VSV-G和KAK。
本發(fā)明的抗體和多肽可以結合、綴合、復合或者另外結合顯像劑(也稱作指示性標記)，如放射性同位素，并且這些綴合物可以用于診斷和顯像目的。提供了具有此類放射性同位素-抗體(或片段)復合體的試劑盒。
可以用于診斷的放射性同位素的實例包括111銦、113銦、99m錸、105錸、101錸、99m锝、121m碲、122m碲、125m碲、165銩、167銩、168銩、123碘、126碘、131碘、133碘、81m氪、33氙、90釔、213鉍、77溴、18氟、95釕、97釕、103釕、105釕、107汞、203汞、67鎵和68鎵。優(yōu)選的放射性同位素對X射線或者任意適宜的順磁離子不透。
指示性標記分子還可以是熒光標記分子。熒光標記分子的實例包括熒光素、藻紅蛋白或者羅丹明，或者其修飾或綴合物。
綴合指示性標記的抗體和多肽可以用于診斷、預后或監(jiān)控疾病狀態(tài)。通常，這種方法包括提供來自患者的至少一個細胞的樣品，并確定本發(fā)明的抗體或者其片段是否結合患者的所述細胞，從而指出該患者處于所述疾病的危險中或者患有該疾病。可以在體內、體外或者離體(ex vivo)實施此類監(jiān)控。當在體內或離體實施監(jiān)控或診斷時，顯像劑優(yōu)選為生理上可接受的，因為它不對患者造成不可接受的水平的傷害。臨床醫(yī)生使用諸如疾病的嚴重性的標準和其他選擇的可用性可以確定傷害的可接受水平。
對于癌癥，分期患者中的疾病通常包括基于腫瘤的大小、類型、位置和侵襲力確定疾病的分類。通過腫瘤特征分類癌癥的一種分類系統(tǒng)是“TNM Classification of Malignant Tumours”(第六版)(L.H.Sobin，編著)，將其引用作為本文參考，并且所述分類系統(tǒng)將癌癥階段分類成T、N和M類，其中T根據(jù)其大小和位置描述原發(fā)腫瘤，N描述局部淋巴結，且M描述遠的轉移。此外，數(shù)字I、II、III和IV用于指出階段，并且每個數(shù)字指TNM因子的可能的組合。例如，I期乳腺癌由TMN組定義T1、N0、M0，其指T1-腫瘤直徑為2cm或更小，N0-無局部淋巴結轉移，M0-無遠的轉移。另一種系統(tǒng)用于分期AML，基于法國-美國-英國系統(tǒng)使用在常規(guī)處理和細胞化學染色下觀察到的形態(tài)學對亞型分類。
此外，造血和淋巴樣組織的腫瘤疾病的最近提出的世界衛(wèi)生組織(WHO)分期或分類包括(特別對于AML)疾病的常規(guī)FAB型分類以及額外的疾病類型，其與特定細胞遺傳學發(fā)現(xiàn)和與脊髓發(fā)育不良有關的AML相關。其他人也已經(jīng)提出病理分類。例如，AML特異的一種提議包括疾病類型，其與特異細胞遺傳學易位相關并且可以通過形態(tài)評估和免疫分型可靠地識別，并且并入相關的脊髓發(fā)育不良改變的重要性。該系統(tǒng)將得到細胞遺傳學或分子遺傳學研究支持并且隨著描述新的可識別的臨床病理實體而擴大(Arber，Am.J.Clin.Pathol.115(4)552-60(2001))。
從而，本發(fā)明提供了診斷試劑盒，其用于在治療之前、期間或之后體外分析治療功效，所述試劑盒具有顯像劑，其具有連接到指示性標記分子或者顯像劑的本發(fā)明的肽。本發(fā)明還提供了使用顯像劑用于癌癥，更具體地腫瘤的診斷定位和顯像的方法，所述方法具有如下步驟(a)將細胞與組合物接觸；(b)測量結合所述細胞的放射性；和因此(c)顯示腫瘤。
適宜的顯像劑的實例包括熒光染料，如FITC、PE等等，和熒光蛋白質，如綠色熒光蛋白。其他實例包括放射性分子和酶，所述酶與底物反應產(chǎn)生可識別的改變，如顏色改變。
在一個實例中，試劑盒的顯像劑為熒光染料，如FITC，并且試劑盒提供了對癌，更具體地，血液相關癌，例如，白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的治療功效的分析。例如，在診斷后、治療期間、緩和期間和復發(fā)期間，用FACS分析測定通過顯像劑染色的細胞百分數(shù)和疾病的每個階段染色的強度。
本發(fā)明的抗體和多肽可以結合、綴合或者另外結合抗癌劑、抗腫瘤劑、抗病毒劑、抗轉移劑、消炎藥、抗血栓形成劑、抗再狹窄劑、抗聚集劑、抗自身免疫劑、抗粘附劑、抗心血管疾病劑、藥物試劑或者其他抗疾病劑。試劑指可用于預防性治療或者診斷哺乳動物的試劑，所述哺乳動物包括但不限于，人、牛、馬、豬、鼠、犬、貓或者任意其他的溫血動物。
此類試劑的實例包括，但不限于，抗病毒劑，包括包括無環(huán)鳥苷、更昔洛韋和齊多夫定；抗血栓形成/再狹窄劑，包括西洛他唑、達肝素鈉、瑞維肝素鈉和阿司匹林；消炎藥包括扎托洛芬、普拉洛芬、哚昔康、乙?；畻钏?7、雙氯芬酸鈉、布洛芬、右布洛芬、舒林酸、萘普生、氨托美丁、塞來昔布、吲哚美辛、羅非克西和尼美舒利；抗自身免疫劑包括來氟洛米、昂他克、subreum、WinRho SDF、去纖苷和環(huán)磷酰胺；且抗粘附/抗聚集劑包括利馬羅斯特、clorcromene和透明質酸。
示例性藥物試劑包括蒽環(huán)類抗生素，如阿霉素(阿霉素)、柔紅霉素、伊達比星、二乙氧醋酰阿霉素、去甲柔紅霉素、表柔比星、去羥阿霉素、嗎啉代阿霉素、嗎啉代柔紅霉素、甲氧基嗎啉基阿霉素、甲氧基嗎啉代柔紅霉素和甲氧基嗎啉基阿霉素和它們的取代的衍生物、組合和修飾。其他示例性藥物試劑包括順鉑、紫杉醇、加利車霉素、長春新堿、阿糖胞苷(Ara-C)、環(huán)磷酰胺、潑尼松、氟達拉濱、伊達比星、苯丁酸氮芥、干擾素α、羥基脲、替莫唑胺、沙利度胺和博來霉素，和它們的衍生物、組合和修飾。
抗癌劑是具有抗癌活性的試劑。例如，抗癌劑包括抑制或者終止癌性或者未成熟前癌細胞生長的試劑、殺死癌性或者前癌細胞的試劑、增加癌性或前癌細胞對其他抗癌劑易感性的試劑，和抑制癌細胞轉移的試劑。在本發(fā)明中，抗癌劑還可以是具有防止、抑制、延遲或者終止腫瘤血管化的抗血管生成活性的試劑。
癌細胞生長的抑制包括例如，(i)防止癌性或者轉移生長，(ii)減慢癌性或者轉移生長，(iii)總體防止癌細胞生長過程或者轉移過程，而保持讓細胞完整和存活，(iv)干擾癌細胞與微環(huán)境的接觸，或者(v)殺死癌細胞。例如，抗體通過如下方式殺死癌細胞，即結合癌細胞從而通過依賴抗體的細胞毒性刺激T細胞或者自然殺傷細胞以殺死結合的細胞。
抗白血病劑是具有抗白血病活性的試劑。例如，抗白血病劑包括抑制或者終止白血病或者未成熟的前白血病細胞生長的試劑、殺死白血病或者前白血病細胞的試劑、增加白血病或前白血病細胞對其他抗白血病劑的易感性的試劑，和抑制白血病細胞轉移的試劑。在本發(fā)明中，抗白血病劑還可以是具有防止、抑制、延遲或者終止腫瘤血管化的抗血管生成活性的試劑。
白血病細胞生長的抑制包括，例如，(i)防止白血病或轉移生長，(ii)減慢白血病或者轉移生長，(iii)總體防止白血病細胞生長過程或者轉移過程，而保持讓細胞完整和存活，(iv)干擾癌細胞與微環(huán)境的接觸，或者(v)殺死白血病細胞。
本發(fā)明的抗體和其片段可以有用地連接的抗疾病、抗癌和抗白血病劑的實例包括毒素、放射性同位素和藥物。
毒素的實例包括白樹毒素、假單胞菌(Pseudomonas)外毒素(PE)、PE40、PE38、白喉毒素、蓖麻毒蛋白或者其衍生物、組合和修飾。
放射性同位素的實例包括可以用于定位和/或治療的γ-發(fā)射體、正電子發(fā)射體和X射線發(fā)射體，和可以用于治療的β-發(fā)射體和α-發(fā)射體。前面描述的用于診斷的放射性同位素也可以用于治療。
抗癌或者抗白血病劑的非限制性實例包括蒽環(huán)類抗生素，如阿霉素(阿霉素)、柔紅霉素、伊達比星、二乙氧醋酰阿霉素、去甲柔紅霉素、表柔比星、去羥阿霉素、嗎啉代阿霉素、嗎啉代柔紅霉素、甲氧基嗎啉基阿霉素、甲氧基嗎啉代柔紅霉素和甲氧基嗎啉基阿霉素和它們的取代的衍生物、組合和修飾。示例性藥物試劑包括順鉑、紫杉醇、加利車霉素、長春新堿、阿糖胞苷(Ara-C)、環(huán)磷酰胺、潑尼松、柔紅霉素、伊達比星、氟達拉濱、苯丁酸氮芥、干擾素α、羥基脲、替莫唑胺、沙利度胺和博來霉素，和它們的衍生物、組合和修飾。
在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物具有本發(fā)明的抗體或多肽和藥學上可接受的載體。所述抗體或多肽存在的量可以有效抑制腫瘤細胞或者白血病細胞的細胞滾動、炎癥、自身免疫病、轉移、生長和/或復制，或者抑制腫瘤患者中腫瘤細胞數(shù)目或者白血病患者中白血病細胞數(shù)目的增加。備選地，所述抗體或者多肽可以以有效增加腫瘤細胞或者白血病細胞的死亡率的量存在。還備選地，所述抗體或多肽可以以有效改變患病細胞對抗疾病劑傷害的易感性、腫瘤細胞對抗癌劑傷害的易感性或者白血病細胞對抗白血病劑傷害的易感性的量存在。進一步備選地，所述抗體或多肽可以以有效減少腫瘤患者中腫瘤細胞數(shù)或者白血病患者中白血病細胞數(shù)的量存在。還備選地，所述抗體或多肽可以以有效抑制再狹窄的量存在。所述抗體或多肽還可以以有效抑制HIV進入的量存在。備選地，所述抗體或多肽可以用作導向劑將治療劑導向特定細胞或部位。
可以將本發(fā)明的抗體和多肽通過任意適宜的方法施用于需要其的患者。示例性方法包括靜脈內、肌內、皮下、局部、氣管內、鞘內、腹膜內、淋巴管內、鼻、舌下、經(jīng)口、直腸、陰道、呼吸道、口的、皮內、經(jīng)皮或者胸膜內施用。
對于靜脈內施用，將優(yōu)選制備制劑從而施用于患者的量將是所希望的組合物的從約0.1mg到約1000mg的有效量。更優(yōu)選地，所施用的量將是所希望的組合物的從約1mg到約500mg的范圍內。本發(fā)明的組合物在寬劑量范圍內有效并且取決于多種因素，諸如所治療的疾病的詳情、基于肽或者多肽的藥物組合物在患者身體內的半衰期、與抗體或者其片段復合的任何試劑和藥物組合物的物理和化學特征、藥物組合物的施用方式、待治療或診斷的患者的詳情，以及治療醫(yī)生認為重要的其他參數(shù)。
用于經(jīng)口施用的藥物組合物可以是任意適宜的形式。實例包括片劑、液體、乳劑、懸浮液、糖漿、丸劑、囊片(caplet)和膠囊。制備藥物組合物的方法是本領域公知的(見，例如，Remington，TheScience and Practice of Pharmacy，Alfonso R.Gennaro(編著)Lippincott，Williams & Wilkins(pub))。
還可以配制藥物組合物以便方便定時、持續(xù)、脈沖或連續(xù)釋放。還可以以裝置，如定時、持續(xù)、脈沖或持續(xù)釋放裝置施用藥物組合物。
用于局部施用的藥物組合物可以是任意適宜的形式，如乳膏、軟膏、洗劑、貼劑、溶液、懸浮液、凍干物和凝膠。
具有本發(fā)明的抗體、構建體、綴合物和片段的組合物可以包含常規(guī)的藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑、載體等等。片劑、丸劑、囊片和膠囊可以包括常規(guī)賦形劑，如乳糖、淀粉和硬脂酸鎂。栓劑可以包括賦形劑，如蠟和甘油。注射液包括無菌無致熱原介質，如鹽水，并且可以包括緩沖劑、穩(wěn)定劑或者防腐劑。還可以使用常規(guī)腸溶衣。
本發(fā)明的抗體和多肽和其藥物組合物可以用于在需要其的患者中減輕疾病的影響、防止疾病或者抑制疾病進展的方法中。此類方法包括抑制腫瘤細胞或者白血病細胞的細胞滾動、炎癥、自身免疫病、轉移、生長和/或復制，或者抑制腫瘤患者中腫瘤細胞數(shù)或者白血病患者中白血病細胞數(shù)的增加。此外，此類方法包括增加腫瘤細胞或者白血病細胞的死亡率，改變患病細胞對抗疾病劑傷害的易感性、腫瘤細胞對抗癌劑傷害的易感性或者白血病細胞對抗癌劑傷害的易感性。此類方法還包括減少腫瘤患者中腫瘤細胞數(shù)或者白血病患者中白血病細胞數(shù)。此類方法還包括抑制或減少細胞中HIV進入。此類方法還包括預防或抑制心血管疾病，如再狹窄。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)用于治療多種疾病狀態(tài)的藥物的方法，所述疾病狀態(tài)為例如，AML、T-ALL、B-白血病、B-CLL、前-B-ALL、多發(fā)性骨髓瘤、轉移、HIV感染、心血管疾病，或者其他疾病，在所述其他疾病中諸如細胞滾動、炎癥、免疫反應、感染、自身免疫反應、轉移的細胞功能或者活動起重要作用。此類藥物包含本發(fā)明的抗體和多肽。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過測定Y1特異結合組織樣品的能力和比較Y1結合與對照抗體如KPL-1的結合來診斷人中癌癥的方法。在一個實施方案中，所述方法包括從血液分離細胞樣品或者從人分離實體組織，將細胞與識別含有硫酸化酪氨酸基序的表位的抗體或者其片段(“實驗抗體”)溫育，洗除非特異結合的抗體，并比較所得結果與用參照標準如具有已知結合活性的對照抗體進行相應染色步驟所得到的結果。對照抗體是識別含有酪氨酸基序的非硫酸化形式的表位或者含有所述表位的抗原的抗體。當實驗抗體結合顯著大于對照的結合(如通過染色強度測定的)時，表明存在腫瘤細胞。可以通過標準方法進行染色步驟。例如，可以使用第二抗體對第一抗體顯色，所述第二抗體識別第一抗體并且綴合酶底物，當所述底物與酶反應時產(chǎn)生顏色反應。備選地，當實驗抗體和對照抗體都結合細胞，但是細胞內化Y1并且不內化對照抗體時表明存在腫瘤細胞。在一個實施方案中，癌癥是實體瘤。在另一實施方案中，癌癥是血液相關的腫瘤。在優(yōu)選實施方案中，實驗抗體是Y1或者其片段，或者相關抗體或者其片段。在另一優(yōu)選實施方案中，對照抗體是KPL1。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了診斷癌癥的方法，其包括篩選來自血液或者實體組織的細胞樣品中腫瘤細胞的存在。用Y1或者其片段或者相關抗體或者其片段對細胞樣品裂解物實施蛋白質印跡。通過用可檢測標記來標記Y1自身或者通過使用利用可檢測的抗人抗體的標準方法可以觀察到Y1結合。當Y1結合顯著大于對照的結合時，表明存在腫瘤細胞，其中對照如上文定義。當Y1結合顯著大于對照的結合時，表明存在腫瘤細胞。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了通過制備細胞裂解物和通過使其經(jīng)過親和柱純化裂解物來鑒定血液相關的或者實體腫瘤的蛋白質標記的方法。親和柱摻入Y1或者其片段，或者相關抗體或其片段。在一個實施方案中，細胞裂解物來自從人收集的原代組織樣品。在另一實施方案中，細胞裂解物來自腫瘤細胞系。在另一實施方案中，腫瘤細胞系可以是無限增殖化細胞系。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了監(jiān)控血液相關的癌癥的階段的方法，其包括從患有血液相關的癌癥的患者收集白細胞，將所述細胞與Y1溫育，確定相對于參照標準而言Y1結合的程度。
作為治療性導向蛋白質如GPIb和PSGL-1上存在的硫酸化酪氨酸表位的備選方法，通過篩選適宜的組合文庫可以鑒定小無機化學實體。此類化學實體相對于基于scFv或者IgG的治療劑而言具有許多優(yōu)點。例如，無機化學實體可以經(jīng)口施用并且具有增強的生物安全性譜，包括減小的免疫交叉反應性。它可以提供針對靶的增強的選擇性，尤其按照合理的藥物設計以最優(yōu)化最初選擇的先導化合物。其他優(yōu)點包括更低的生產(chǎn)成本、更長的貯存期間和較不復雜的管理機構批準過程。
因為已經(jīng)鑒定了例如GPIb和PSGL-1上本發(fā)明表位的許多實施方案，所以可以采用配體驅動的方法鑒定無機化學實體，其具有非常窄的特異性，或者備選地，對于諸如再灌注損傷的疾病狀態(tài)導向一種以上的硫酸化酪氨酸表位，所述再灌注損傷涉及一種以上的不同靶，每種靶都具有此類表位。配體驅動的方法顯著縮短了鑒定用于治療性介入的靶的篩選過程，并且使得可以用引導物最優(yōu)化同時進行靶確認，可以用一系列聚焦的(focused)文庫實施靶確認。
首先通過分析抗體如Y1及其已知靶如GPIb的殘基硫酸化Tyr-276和Asp-277之間的三維相互作用可以設計和開發(fā)專門用于導向硫酸化酪氨酸表位的無機化學實體的文庫。通過計算機輔助組合文庫設計可以開發(fā)由模擬Y1結合位點并且提供對靶的增加的親和力的實體組成的化學文庫。
在該申請全文中，已經(jīng)參考了多種出版物、專利和專利申請。這些出版物、專利和專利申請的教導和公開內容在此全文引用作為本申請的參考，以更完整地描述本發(fā)明所屬的技術水平。
實施例給出下面的實施例以幫助理解和進一步闡明本發(fā)明，但是不意在并且不理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。盡管描述了具體試劑和反應條件，但是可以做出修改，它們包括在本發(fā)明的范圍內。因此，提供下面的實施例用于進一步闡明本發(fā)明。
實施例1從原代AML細胞(R1198-3)鑒定Y1配體1.1從患者收集原代AML細胞(M4期)并裂解。將裂解物純化，其包括在Y1-IgG柱上的親和層析(見圖1)。用內切蛋白酶Asp-N消化所分離的蛋白質，并用質譜法測定所得肽序列。所述序列與公布的人PSGL-1N-末端氨基酸序列相同。這些結果表明4期原代AML細胞表達Y1-IgG可結合的PSGL-1。還確定純化的蛋白質在Y1識別基序的酪氨酸2和3上硫酸化(見圖2)。用內部對照驗證Y1的免疫調節(jié)效果的特異性，例如，沒有檢測到小鼠白細胞介素-6分泌的誘導。
實施例2依賴抗體的細胞毒性2.1 Y1-IgG的效果確定Y1-IgG是否能夠介導依賴抗體的細胞毒性(ADCC)的研究已表明該抗體介導多種靶細胞的效應細胞的細胞毒性，所述靶細胞包括來自患者臨床樣品的ML2(AML來源的細胞系，作為我們的模型系統(tǒng)中的靶)和B-CLL細胞。Y1-IgG通過CD162(PSGL-1)結合該細胞類型，CD162是在健康B細胞和早期AML中基本上不存在的一種分子。
已經(jīng)定義了參與Y1-IgG ADCC的效應細胞群體。為了Y1-IgG介導ADCC，需要自然殺傷(NK)細胞(CD56+)、γδT細胞和單核細胞(CD14+)，但是不需要T輔助細胞(CD4+)和細胞毒性T細胞(CD8+)。用來自健康受試者和B-CLL患者的供體細胞證實了該結論。
此外，如通過早期激活標記(CD69+)的出現(xiàn)、細胞因子如TNFα和IFNγ的分泌和FasL的誘導所測量的，甚至在靶細胞不存在的情況下，Y1-IgG也能介導不同類型效應細胞的激活。Y1-IgG與第二抗人Fc抗體的超交聯(lián)(XL)表明細胞凋亡機制也促進細胞死亡。
將在體外針對原代B-CLL細胞的Y1-IgG活性與當前廣泛用于治療多種淋巴樣惡性腫瘤的兩種通過商業(yè)途徑可得到的人源化抗體利妥?，?結合CD20)和Campath(結合CD52)的活性進行比較。盡管利妥希瑪對B-CLL的作用機制不清楚，但是它針對CD20陽性惡性B細胞的細胞毒性效果可能涉及依賴補體的細胞毒性(CDC)、ADCC和細胞凋亡的誘導之一或多種。Campath針對CD52陽性惡性B細胞，以及正常B和T細胞的細胞毒性效果涉及CDC、ADCC和細胞凋亡的誘導。Campath施用與所有成熟的正常B和T細胞的完全除去有關，導致嚴重血液學毒性。
對于ADCC實驗，在FICOLL上分離單核效應細胞和靶細胞。然后用PKH26標記靶細胞，PKH26在細胞膜的脂類區(qū)穩(wěn)定摻入熒光染料。然后洗滌細胞并以多種效應物∶靶(E∶T)比，在不同濃度的Y1-IgG或者對照抗體的不存在或存在下溫育24小時。死亡細胞經(jīng)TOPRO(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)染色并通過FACS在門控靶細胞上進行分析。
對于CDC實驗，在FICOLL上分離來自B-CLL患者的單核細胞。在患者血漿存在或不存在下，將細胞與或不與Y1-IgG或者對照抗體溫育24小時。然后用膜聯(lián)蛋白-PI對細胞凋亡的細胞染色并通過FACS進行分析。
為了評估效應細胞激活，在FICOLL上分離來自健康供體的單核細胞。將細胞與或不與Y1-IgG或者對照抗體溫育24小時。對不同類型的效應細胞，用CD69(早期激活標記)抗體進行FACS分析。通過ELISA測量細胞因子如TNFα和IFNγ的分泌。
對于細胞凋亡實驗，在FICOLL上分離來自B-CLL患者的單核細胞。將細胞與或不與Y1-IgG或者對照抗體在37℃溫育10分鐘。然后加入抗人Fc抗體并在37℃溫育4-24小時。然后使患病細胞(CD19+、CD5+)經(jīng)細胞凋亡標記膜聯(lián)蛋白-TOPRO染色并通過FACS進行分析。
用Y1-IgG和利妥希瑪?shù)谋容^研究表明在介導ADCC和誘導針對B-CLL細胞的細胞凋亡方面，Y1-IgG優(yōu)于利妥?，?。與Campath相反，發(fā)現(xiàn)Y1-IgG不能介導針對原代B-CLL細胞的CDC。這些體外結果表明Y1-IgG可用作治療劑基于其ADCC活性治療B-CLL。
2.1.1原代B-慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)中的ADCC為確定Y1-IgG是否介導原代B-CLL中的ADCC，將來自不同患者的B-CLL細胞與PBMC效應細胞以不同效應物/靶比共同溫育24小時。對13種不同B-CLL臨床樣品的分析表明Y1-IgG介導所有病例中效應細胞的細胞毒性(圖3)，其中細胞溶解的平均程度為約21.4％。13個樣品中的4個(30％)顯示出30％以上的溶解，而13個樣品中僅兩個(15％)顯示出小于10％的溶解。在一些情況中，甚至在低E∶T比也看到高程度的溶解，例如，KBC171顯示出約62％的溶解，而在其他情況中，甚至在高E∶T比下也看到低程度溶解，例如，KBC104顯示出僅約7％溶解。差異可能歸因于從不同健康供體得到的效應細胞樣品，以及B-CLL樣品中的不同。
2.1.2 PBMC的Y1-IgG介導的針對急性髓細胞樣白血病細胞的ADCCPBMC也實現(xiàn)針對來自患者的原代AML細胞的ADCC，其中使用不同比的PBMC∶AML(10或20μg/ml Y1-IgG存在下10，20或40)。例如，在10∶1的細胞比時，不存在抗體時7.9％的AML細胞死亡，存在人IgG時，6％細胞死亡。存在10和20μg/ml Y1-IgG時，分別14.2％和17.6％的AML細胞死亡(圖4)。細胞毒性的程度隨著Y1-IgG濃度的增加(10或20μg/ml)而增加。人IgG不誘導ADCC。對于一個額外的原代AML樣品得到相似結果(數(shù)據(jù)未顯示)。
ML-2細胞提供了ADCC的良好模型，因為Y1-IgG結合而不經(jīng)歷可檢測的內化。
a.ML2 ADCC隨著Y1-IgG濃度而增加溫育24小時后，在四種不同的效應物(PBMC)與靶比(5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)時，存在Y1-IgG時細胞毒性高于不存在Y1-IgG的毒性(圖5)。當用小鼠抗-PSGL-1抗體KPL1代替Y1-IgG時，該效應減小或缺乏，并且當使用人IgG(其結合效應細胞上的Fc受體)而不是使用Y1-IgG時，所述效應進一步減小。當效應物∶靶比為40∶1時，低至5μg/ml濃度的Y1-IgG也可以誘導ADCC。
b.Y1-IgG和KPL-1之間的競爭在20∶1和40∶1的效應物∶靶比下，Y1-IgG(20和50μg/ml)誘導針對ML-2細胞的ADCC。僅小鼠抗-PSGL-1抗體KPL-1不誘導ADCC，并且因此其可以用作Y1-結合誘導的ADCC的競爭劑。KPL-1部分抑制Y1-IgG誘導的ADCC(圖6)，并且例如，盡管存在Y1-IgG時(20μg/ml；效應物/靶比20∶1)，溫育48小時后觀察到74.1％的細胞毒性，但KPL1(20μg/ml)的額外存在導致僅58.8％的細胞毒性。從而，ML2的Y1-IgG誘導的ADCC包括Y1-IgG對PSGL-1的結合。
c.自然殺傷細胞、γδT細胞和單核細胞涉及Y1-IgG介導的ADCC分析陽性選擇的效應細胞實現(xiàn)ML2或者B-CLL靶細胞的Y1-IgG介導的ADCC的能力。用通過商業(yè)途徑可得到的磁珠從正常供體和B-CLL患者分離自然殺傷(NK)細胞(CD56+)、γδT細胞和細胞毒性T細胞(CD8+)。如圖7A中所示，來自正常供體和來自B-CLL患者的NK細胞(圖7A中的KCS樣品)能夠實現(xiàn)ML2和B-CLL靶的ADCC(圖7A中的KCS樣品)，從而導致相對于對照而言13-68％的溶解。還證明γδT細胞也介導ML2細胞的ADCC。相反，細胞毒性T細胞似乎不參與Y1-IgG介導的細胞毒性。
從PBMC的特定細胞群體的陰性選擇表明，除了NK細胞(CD56+)和γδ+T細胞之外，CD14+細胞(單核細胞)也參與針對ML2靶細胞的ADCC(圖7B)。參與Y1-IgG介導的毒性的所有效應細胞都表達Fc受體CD16。
d.Y1對NK細胞的激活如通過CD69的表達所測量的，Y1介導自然殺傷細胞的ADCC。在Y1-IgG或者人IgG或者鼠抗-CD62抗體(KPL1、PL1或者PL2)存在下或者不存在任何抗體(對照)下將來自6名健康供體的效應細胞在37℃溫育24小時。然后進行FACS分析并確定自然殺傷(NK)細胞(CD56+)上早期激活標記CD69的表達。如圖8中所示，用所有6名供體的細胞介導Y1-IgG對NK細胞的激活。相反，通過人IgG或者抗-CD162小鼠抗體KPL1、PL1或者PL2不能檢測到效果。初步研究已經(jīng)表明與Y1-IgG溫育后誘導效應細胞上FasL的表達(數(shù)據(jù)未顯示)。
e.Y1-IgG誘導的細胞凋亡如通過FACS分析評估的，在Y1-IgG存在下溫育的來自B-CLL患者的單核細胞(CD19+、CD5+)在24小時內顯示出約5％細胞凋亡(圖9)。加入與Y1-IgG交聯(lián)的第二抗體在24小時內引起額外的50％細胞凋亡(圖9)。
這些結果表明針對PSGL-1上硫酸化表位的抗體的交聯(lián)引起原代B-CLL細胞的細胞凋亡。這暗示PSGL-1可以是在體內誘導B-CLL患者中細胞凋亡的靶，其中交聯(lián)效應可以受到具有Fc受體的細胞，例如，單核細胞、CD56+NK細胞和γδ+T細胞的介導。
使用抗-PSGL-1抗體KPL1可以抑制上述細胞凋亡和交聯(lián)效果(數(shù)據(jù)未顯示)。該抗體本身不誘導細胞凋亡。這證明細胞凋亡信號通過PSGL-1上的表位介導。
f.Y1-IgG相對于利妥?，攲-CLL的ADCC效果在兩個原發(fā)性人B-CLL患者樣品中Y1-IgG抗體誘導的細胞死亡百分數(shù)顯著高于由利妥?，?shù)玫降慕Y果。圖10表明Y1誘導相對于對照而言25％到35％的細胞毒性，相比而言，利妥?，斦T導僅10％到13％的細胞毒性。以10μg/ml Y1-IgG實現(xiàn)靶細胞上受體分子的飽和，而相同濃度的利妥希瑪卻不能實現(xiàn)。
一起考慮，結果表明Y1-IgG是作為B-CLL治療中治療劑的有希望的候選物，因為它的細胞毒性和細胞凋亡效應似乎由這些患病細胞上表達的PSGL-1硫酸化表位的特異識別介導。
g.分析Y1-IgG、利妥?，敽虲ampath對B-CLL的CDC效果將來自B-CLL患者的單核細胞與Y1-IgG、利妥?，敾蛘逤ampath在25％患者血漿存在和不存在下溫育。如圖11所示，僅Campath通過CDC介導原代B-CLL細胞的細胞毒性。利妥?，敽蚘1-IgG都不通過補體結合誘導細胞毒性。
這些體外結果表明Y1-IgG可以用作基于其ADCC活性治療B-CLL的治療劑。
實施例3Y1-IgG-M-柔紅霉素衍生物3.1制備Y1-IgG-M-柔紅霉素衍生物制備抗體-毒素綴合物，如嗎啉代-阿霉素-Y1-IgG(圖13)和抗體-M-柔紅霉素綴合物(見下文)。將柔紅霉素修飾，連接到兩種不同接頭之一，然后通過抗體的游離氨基或者通過抗體的還原二硫鍵連接到抗體。術語M-DNR-LINKER指嗎啉基柔紅霉素乙酸鹽的(6-馬來酰亞胺己?；?腙和M-DNR-AES。
a.制備3’-脫氨基-3’-(4-嗎啉基)柔紅霉素乙酸鹽(M-DNR-Ac)氬氣下將無水三乙胺加入鹽酸柔紅霉素溶于無水二甲基甲酰胺的溶液中，然后加入二(2-碘乙基)醚。使反應混合物避光并在室溫攪拌36小時。
用二氯甲烷萃取所得水性混合物。有機相用無水硫酸鈉干燥，通過硅藻土(celite)過濾并蒸發(fā)至干燥。通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物，合并相關級分并蒸發(fā)以得到M-DNR游離堿，其為紅色油，發(fā)現(xiàn)其純度為98％(通過HPLC)。得率為55％。
與乙酸反應后，所得游離堿以其固體乙酸鹽分離，然后凍干。M-DNR-Ac在氬氣-20℃下穩(wěn)定至少12個月。
b.制備嗎啉基柔紅霉素乙酸鹽的(6-馬來酰亞胺己?；?腙氬氣下將6-馬來酰亞胺己?；ｋ录尤隡-DNR-Ac溶于無水甲醇中的溶液，然后加入三氟乙酸。將澄清溶液避光并在室溫攪拌24小時。
25℃下將甲醇溶液減壓蒸發(fā)至干燥，得到紅色油狀殘余物，其溶于無水甲醇中。向該溶液加入無水醚并通過離心分離沉淀的紅色固體。用無水醚三次研磨后得到純的結晶產(chǎn)物，其純度為98％，得率為88％，在高真空干燥，并在-20℃氬氣下保存。嗎啉基柔紅霉素乙酸鹽的(6-馬來酰亞胺己?；?腙在-20℃氬氣下穩(wěn)定至少4個月。
c.制備嗎啉代柔紅霉素的己二酸單腙的N-羥基琥珀酰亞胺酯(M-DNR-AES)1.制備嗎啉代柔紅霉素的己二酸單腙將下面的成分合并并在Ar下避光下室溫攪拌1小時嗎啉代柔紅霉素乙酸鹽、無水MeOH、新鮮制備的甲醇溶液(酰肼己二酸鹽酸鹽和Et3N和TFA母液)。
減壓除去溶劑并將所得殘余物溶于NH4OAc:AN中并注射到半制備型HPLC柱。洗滌混合物并在等度條件下濃縮。約4.5分鐘后收集所希望的產(chǎn)物并通過C-18 Sep Pak柱體濃縮。洗脫產(chǎn)物，將其凍干并在-20℃氬氣下保存。所得產(chǎn)物為紅色固體，其得率為80％，純度為95％。
2.嗎啉代柔紅霉素的己二酸單腙的N-羥基琥珀酰亞胺酯的制備向溶于無水THF中的嗎啉代柔紅霉素的己二酸單腙加入溶于無水THF中的羥基琥珀酰亞胺和溶于無水THF中的DCC。室溫氬氣下攪拌澄清的紅色溶液24小時。通過分析型HPLC測定反應結束，并除去溶劑。然后將冰狀固體溶于緩沖液(N-甲基嗎啉乙酸鹽/AN)并通過棉花過濾。
通過RP-HPLC分離產(chǎn)物，用2體積N-甲基嗎啉乙酸鹽溶液稀釋并加樣到Sep-Pak(900mg)上。洗脫產(chǎn)物并凍干以得到粉末，其得率為73％，純度為97.4％。
d.制備M-DNR-Y1-IgG綴合物以M-DNR-LINKER/Y1-IgG為23的摩爾比將M-DNR-LINKER溶于無水DMF中的溶液加到MAb溶液。室溫氬氣下溫和攪拌混合物過夜，然后離心。通過SPIN-X管(Costar)過濾上清液并用Bio-Beads SM-2(Biorad)在室溫振蕩1小時。讓混合物靜置10分鐘。使上清液穿過已用PBS平衡的PD-10柱(Pharmacia)。用PBS洗脫綴合物并合并含有蛋白質的級分。通過SPIN-X過濾對純化的綴合物除菌。冷凍綴合物溶液并在-70℃保存。所得產(chǎn)物綴合物的得率為45-50％，并且具有下面的特征5％聚集物；2％-5％吸收的、非共價連接的M-DNR衍生物；藥物與抗體的平均分子比率為4。
e.制備M-DNR-Y1-IgG綴合物(通過Fc區(qū)內S-S鍵的還原)將溶于由NaCl、MES和EDTA組成的緩沖液中的Y1-IgG加到半胱胺鹽酸鹽(Merck)在相同緩沖液中的溶液中。氬氣下37℃溫育混合物1.5小時。將反應混合物裝入已經(jīng)用PBS/EDTA平衡的PD-10柱(Sephadex G-25，Pharmacia)。用PBS/EDTA洗脫還原蛋白質。合并具有最高蛋白質濃度的級分并在4℃保存。游離巰基與抗體的分子比率為至少3.5。在DMF中稀釋嗎啉基柔紅霉素乙酸鹽的(6-馬來酰亞胺己?；?腙并將其加到還原蛋白質溶液中，并在4℃溫育30分鐘。使反應混合物穿過用PBS預平衡的PD-10柱，然后用PBS洗脫。合并蛋白質級分，然后通過SPIN-X過濾(Costar)除菌。將純化的綴合物等分試樣并在-70℃保存。所得產(chǎn)物綴合物的得率為～50％并且具有下面的特征小于5％聚集物；1-2％游離M-DNR衍生物；藥物與抗體的平均分子比率為4。
f.制備IgG-Y1-M-DNR綴合物(通過S-S鍵的還原)通過將IgG-Y1穿過EDTA中的PD-10柱(Sephadex-25M，Pharmacia)并在PBS/EDTA中洗脫。合并含有蛋白質的級分。游離巰基與抗體的分子比率為至少6。在DMF中稀釋溶于無水二甲基甲酰胺中的嗎啉基柔紅霉素乙酸鹽的(6-馬來酰亞胺己?；?腙并將其加到還原蛋白質。溶液在4℃溫育30分鐘。蛋白質綴合物在PBS中的PD-10柱上純化并通過SPIN-X過濾(Corning Life Sciences)將蛋白質級分除菌。將綴合物冷凍并在-70℃保存。得率相對于最初抗體而言為約50％。最終產(chǎn)物含有小于5％聚集體；游離M-DNR為0-2％；藥物與抗體的平均分子比率為7。
3.2 Y1-IgG-M-DNR衍生物的細胞毒性(圖12-14)以半固體(METHOCULTTM；StemCell Technologies Inc.，Vancouver BC，加拿大)克隆發(fā)生測定評估Y1-藥物綴合物的特定細胞毒性影響。將細胞(來自臍帶血或者原代AML患者樣品的CD34+干細胞)與濃度最高達10-6M的游離或者綴合藥物在37℃溫育1小時。洗滌細胞，接種在METHOCULTTM中并生長10-12天，之后計數(shù)集落。將牛(b)-IgG-M-DNR用作非特異綴合物對照。
結果(圖13)顯示了綴合物Y1-IgG-M-DNR對臍帶血樣品的有限效果。即，在1μM Y1-IgG-M-DNR存在下溫育的非靶細胞(健康CD34+干細胞)至少與對照細胞和在1μM b-IgG-M-DNR或者0.1μM M-DNR(即非致死劑量的游離藥物)存在下的細胞生存地一樣好。從而，在所有臍帶血樣品中都沒有見到顯著影響。
相反，在AML樣品(M7巨核細胞型白血病)中，相對于相同濃度下的非特異b-IgG-M-DNR綴合物，Y1-IgG-M-DNR在抑制集落生長中抑制性為三倍高(圖13)。即，相對于對照(單獨溫育的靶細胞)，1μM Y1-IgG-M-DNR將原代AML細胞的生存力減小到40％，而0.1μM M-DNR和1μM b-IgG-M-DNR的每一種相對于對照而言將原代AML細胞的生存力減小到80％。
在類似實驗中進一步證明Y1-IgG-M-DNR綴合物的特異性，從而表明與1μM Y1-IgG-M-DNR溫育后，相對于對照，來自原代AML-M4和AML-M5細胞(從患者得到)的集落形成分別被抑制到60％和35％(圖14)。相反，與1μM h-IgG-M-DNR孵育后，所有AML-M4細胞和78％的AML-M5細胞都產(chǎn)生集落。與1μM M-DNR溫育的細胞不產(chǎn)生集落，從而證明該細胞對所述藥物敏感。
B-ALL細胞不表達Y1表位(通過不能結合Y1評估)，不對Y1-IgG-M-DNR敏感，從而與1μM Y1-IgG-M-DNR溫育后以與對照相同的速率形成集落(圖15)。
實施例4Y1識別基序和硫酸化為了評估酪氨酸硫酸化對Y1-scFv與GPIb的結合的潛在影響，在用于抑制硫酸化的100mM氯酸鈉存在下，在無硫酸鹽的培養(yǎng)基中生長表達GPIb的人慢性髓細胞樣白血病細胞系KU812。在所用的條件下，酪氨酸硫酸化被抑制最高達95％，而不影響蛋白質合成或者其他翻譯后修飾。如圖16A中所示，與生長在缺少氯酸鈉的完全培養(yǎng)基中的對照細胞相比，存在氯酸鈉時生長后Y1-scFv與KU812細胞的結合減小50％。如通過FACS分析使用小鼠抗GPIb-單克隆抗體AK2-FITC闡明的，在相同條件下，硫酸鹽饑餓細胞上GPIb的表面表達未改變(圖16B)。
為進一步評估硫酸酪氨酸修飾是否在Y1-scFv與GPIb的結合中起作用，對基于GPIb的殘基273-285的多種合成肽評估了抑制Y1-scFv與血小板結合的能力。
簡言之，通過固相方法，使用ABIMED AMS-422多重肽合成儀合成肽，并且如果需要，使用FMOC-Try鈉鹽摻入硫酸酪氨酸。用Lichrosorb RP-18柱純化合成肽。對于Y1-scFv血小板結合測定，溫育合成肽(2.5、25或者200μM)和Y1-scFv(10μg)的混合物并洗滌。洗滌后，將血小板與R-藻紅蛋白標記的抗scFv溫育，洗滌并通過FACS進行分析。
如圖17A中所示，肽DLYSDYSYSPE(SEQ ID NO4)(包含3個硫酸化酪氨酸)在25μM有效抑制Y1-scFv與血小板的結合，而相應的非硫酸化對照DLYDYYPE(SEQ ID NO5)甚至在200μM也沒有效果。此外，肽DLYSDYYPE(SEQ ID NO6)、DLYSDYSYPE(SEQ ID NO7)和DLYSDYYSPE(SEQ ID NO8)(分別在第一、第一和第二和第一和第三個酪氨酸硫酸化)在25μM有效抑制Y1-scFv結合。肽DLYDYSYSPE(SEQID NO9)和DLYDYYSPE(SEQ ID NO10)(分別在第二和第三，和第三個酪氨酸硫酸化)甚至在200μM對Y1-scFv結合也沒有影響(圖17A)。這些結果清楚地表明在GPIb中Tyr-276，即“第一個”酪氨酸位置的硫酸化對于顯著競爭并因此對于Y1-scFv與GPIb的結合是重要的。
為了評估GPIb的殘基273-285區(qū)內的額外的氨基酸是否有助于Y1-scFv結合，在Y1-scFv血小板結合測定中測試了基于肽DLYSDYYPE的替代突變肽(圖17B)。當用帶負電的Glu殘基替代硫酸化Tyr-276時，與DLYSDYYPE相比，突變肽DLEDYYPE(SEQ ID NO11)對Y1-scFv與血小板的結合沒有顯著抑制。類似地，分別用Glu、Asn和Ala替代Asp-277的突變肽DLYSEYYPE(SEQ ID NO12)、DLYSNYYPE(SEQID NO13)和DLYSAYYPE(SEQID NO14)基本上不能抑制Y1-scFv與血小板的結合。另一方面，Ala對Leu-275的替代(DAYSDYYPE)(SEQ IDNO15)和氨基酸278到280的多種替代[DLYSDFYPE(SEQ IDNO16)、DLYSDAYPE(SEQ ID NO17)、DLYSDYYAE(SEQ ID NO18)和DLYSDYYPA(SEQ ID NO19)]產(chǎn)生以基本上都與DLYSDYYPE相同的方式抑制Y1-scFv與血小板的結合的突變肽(圖17B)。
為了驗證血小板結合抑制測定，還測試了突變肽抑制Y1-scFv與純化的glycocalicin的結合(圖18A)。簡言之，將微量滴定板上固定的glycocalicin與Y1-scFv(5μg/ml)和肽(25μM)溫育。洗滌后，用多克隆抗-scFv(通過用scFv混合物免疫兔產(chǎn)生)并綴合辣根過氧化物酶的抗兔IgG抗體檢測結合的Y1-scFv，并用ELISA讀出器在450nm讀吸收。
glycocalicin結合抑制測定中所得結果(圖18A)表明GPIb的硫酸化Tyr-276和相鄰殘基Asp-277對于Y1-scFv的結合都是重要的，從而證實了在血小板結合抑制測定中所得的結果(圖17A和B)。通過ELISA評估Y1-scFv與共價偶聯(lián)CovaLink Plates的肽的直接結合得到額外的證據(jù)(圖18B)。該研究表明具有硫酸化Tyr-276或Asp-277的替代的GPIb-衍生突變肽基本上不能通過Y1-scFv直接結合，與在275、278、279或280位具有替代或者具有非硫酸化Tyr-278或Tyr-279的突變肽形成對照，后者都基本上能夠通過Y1-scFv直接結合。
使用基于PSGL-1的殘基42-58的合成肽的類似直接結合實驗證實PSGL-1酪氨酸硫酸化對于Y1-scFv結合是重要的(見圖19)。特別地，PSGL-1序列QATEYEYLDYDFLPETE(SEQ ID NO20)在第三個酪氨酸位的硫酸化導致相對于相應非硫酸化的對照肽而言約100％的Y1-scFv結合活性(見圖20)。相反，相同線性肽在第二個酪氨酸位的硫酸化賦予相對于對照的僅約40％結合，且在第一個酪氨酸位的硫酸化賦予基本上與對照不可區(qū)分的結合活性。
總起來看，使用基于PGIb和PSGL-1的合成肽所得的結果表明序列YSD對于Y1與其表位的結合是重要的，其中YSD是在基序DXYSD(SEQID NO21)中發(fā)現(xiàn)的，其中X代表任一氨基酸，且YS代表硫酸化酪氨酸。
已知一些蛋白質含有在基序DXYSD和/或高度酸性環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的序列YSD(圖21)。認為這種酸性環(huán)境對于體內酪氨酸硫酸化是重要的。如對于GPIb和PSGL-1所示的，預測Y1能夠在該硫酸化序列結合所述蛋白質。
4.2 Y1結合實體瘤抗原而KPL-1不結合進行小細胞肺癌(SCLC)細胞系裂解物的蛋白質印跡以比較Y1和通過商業(yè)途徑可得到的小鼠抗-PSGL-1抗體KPL1的結合(圖22)。在Y1印跡中觀察到一條寬帶，而在KPL1印跡中沒有觀察到帶。這表明PSGL-1可以作為使用Y1的SCLC患者中免疫治療的靶。
實施例5通過PSGL-1的Y1-IgG介導的內吞PSGL-1在AML患者的血細胞上高度表達。下面的結果表明Y1特異識別表達PSGL-1的腫瘤細胞并且被它內化。通過商業(yè)途徑可得到的KPL-1(抗-PSGL-1)結合腫瘤細胞但是不被內化。這表明PSGL-1可以作為使用Y1的AML患者中免疫治療的靶。
5.1共聚焦顯微鏡術研究在FICOLL梯度上分離患者的白細胞。在37℃，在熒光抗-PSGL-1抗體(Y1或者商業(yè)抗體KPL1和PL1)的存在下將細胞溫育不同的時間段。通過共聚焦顯微鏡術顯現(xiàn)細胞確定活細胞中熒光抗體的定位。
圖23和24顯示了在37℃下與Y1-PE(左)、KPL1-PE(中)和Y1-IgG-FITC(右)溫育2小時后通過共聚焦顯微鏡術顯現(xiàn)的活的AML患者細胞。以三維方式(X、Y和Z平面)掃描細胞并關于Z平面從球體中心采集所呈現(xiàn)的圖像。如所示的，溫育后，細胞的內部部分(但不是細胞核)中存在Y1-IgG，而KPL1存在于細胞膜上并且未被內化。
5.1熒光顯微鏡術研究在FICOLL梯度上分離患者的白細胞。在37℃，在Y1-IgG存在下溫育細胞不同的時間段。為了檢測Y1-IgG，將細胞固定、透化，然后用羅丹明標記的抗-人(Fc)抗體染色。通過熒光顯微鏡術顯示細胞。
圖25和26顯示了在37℃使細胞與Y1-IgG-FITC(左)和KPL1-PE(右)和與抗-CD34-PE或FITC溫育2小時后通過共聚焦顯微鏡術顯現(xiàn)的活CD34+細胞(分別來自健康骨髓和健康臍帶血)。如所示的，Y1-IgG不結合正常CD34+干細胞。相反，KPL-1-PE標記包括CD34+細胞的正常細胞，如通過在右下小圖中一些細胞的復染色所證明的。
5.3監(jiān)控內吞作用在抗體存在下，在4℃下使細胞與0.1％NaN3(其抑制內化的主動過程)溫育后檢測Y1-IgG的細胞表面結合。在37℃溫育10分鐘-2小時(無NaN3)導致加帽和膜片形成以及內在染色。用不同AML樣品，通過共聚焦顯微鏡術或者通過熒光顯微鏡術得到類似的圖。
圖27顯示了來自AML患者樣品的四種個體細胞，它們用未標記的Y1-IgG在37℃或者4℃下溫育不同的時間段。如所示的，在抗體存在下，在4℃下使細胞與0.1％NaN3溫育后檢測Y1-IgG的細胞表面結合。在37℃溫育Y1-IgG 10分鐘-2小時(無NaN3)導致加帽和膜片形成以及內在染色。內化隨時間推移而增加。保持在4℃的細胞中沒有觀察到內化。用羅丹明標記的抗-人(Fc)抗體檢測Y1-IgG。用熒光顯微鏡術進行細胞顯現(xiàn)。
5.4酸剝離用50mM甘氨酸(pH 2.5)處理細胞導致消除Y1-IgG的細胞表面結合并使得可以檢測內化的Y1-IgG。
圖28顯示了與未標記的Y1-IgG在37℃下溫育1小時的AML患者細胞。然后將下排中所示細胞與50mM甘氨酸(pH 2.5)在室溫下孵育5分鐘以除去表面結合的Y1-IgG。如所示的，上面小圖代表細胞表面加帽和膜片形成以及內化的Y1-IgG。在下面小圖中，僅檢測到內化的Y1-IgG。
5.5鏈霉蛋白酶通過蛋白水解酶鏈霉蛋白酶除去細胞表面蛋白質，還導致除去Y1-IgG的細胞表面結合，并使得可以檢測內化的Y1-IgG。
圖29顯示了與未標記的Y1-IgG在37℃下溫育1小時的AML患者細胞。然后將下排中所示細胞與1mg/ml鏈霉蛋白酶在室溫下溫育60分鐘以除去表面結合的Y1-IgG。如所示的，上面小圖代表細胞表面加帽和膜片形成以及內化的Y1-IgG。在下面小圖中，僅檢測到內化的Y1-IgG。注意到通過鏈霉蛋白酶除去了腹足，這意味著在細胞表面的外表面上通過CD162的Y1-IgG交聯(lián)形成腹足。
5.6有被小窩介導的內吞可以通過有被小窩發(fā)生受體介導的內吞。在與Y1-IgG溫育前通過將細胞與0.45M蔗糖在37℃溫育15分鐘可以阻斷有被小窩介導的內吞。該方法抑制Y1-IgG的內吞而不影響Y1-IgG對細胞表面的結合。
圖30顯示了在4℃(圖30A)或37℃(圖30B)下與未標記的Y1-IgG溫育1小時的AML患者的細胞。然后將中間排中所示細胞在室溫下與50mM甘氨酸(pH 2.5)溫育5分鐘以除去表面結合的Y1-IgG。如所示的(圖30A)，上面小圖代表Y1-IgG的細胞表面染色。通過酸洗滌除去表面結合的Y1-IgG(中間小圖)。在37℃(圖30B)，觀察到加帽和膜片形成以及Y1-IgG的內化(上面小圖)。酸洗滌除去細胞表面結合的Y1-IgG并且僅可以檢測到內化的抗體(中間小圖)。
在與Y1-IgG溫育前通過將細胞與0.45M蔗糖在37℃溫育15分鐘可以阻斷有被小窩介導的內吞(底排)。如下面小圖所示的，用0.45M蔗糖處理細胞不影響4℃下Y1-IgG與細胞的結合(圖30A)但是抑制37℃下的內化(圖30B)。
實施例6白細胞-血小板相互作用的Y1-IgG-抑制多種疾病中白細胞對血管表面的粘附導致器官損傷，所述疾病包括再灌注損傷、發(fā)作、腸系膜和外周血管??；器官移植和循環(huán)休克。再灌注損傷與白細胞對缺血區(qū)中血管內皮的粘附有關，這可能部分是由凝血酶和細胞因子對血小板和內皮的激活導致的，其使得它們的表面粘附白細胞。再灌注損傷的主要起始物是von Willbrand因子(vWF)和血小板GIPb受體之間的相互作用。用溶栓劑如組織纖溶酶原激活物和鏈激酶治療以減輕冠狀動脈阻塞的心臟病患者可能由于再灌注損傷而仍然遭受心肌壞死。從而，需要能夠減輕對血管表面的白細胞粘附并且可以與溶栓劑聯(lián)合施用以改善心血管疾病的結果的藥物。
因為Y1(scFv和完整IgG)結合血小板上的(即GPIb)和白細胞上的(即PSGL-1)不同的硫酸化分子，所以該抗體具有作為抑制多種細胞-細胞相互作用的治療劑的潛力。
圖31表明Y1-scFv有效抑制激活的人血小板與ML2細胞的結合(表達PSGL-1的人AML來源的細胞系)。當將抗體同時與血小板和ML2細胞溫育時得到最佳抑制，而當抗體最初與血小板或者ML2細胞溫育，然后除去非結合的抗體并隨后加入剩余的細胞類型時，得到部分抑制(圖31)。
圖31也表明鼠抗體KPL1(針對人PSGL-1 N-末端結構域，但不是酪氨酸硫酸化依賴的)也有效抑制活化的血小板與ML2的結合，但是抑制小于Y1-scFv發(fā)揮的抑制作用。這可能是由于如下實事，即KPL1不識別兩種細胞類型上存在的表位，而Y1-scFv卻可以識別所述表位。用鼠抗體PL2抗體沒有觀察到抑制，該抗體也針對人PSGL-1(未顯示)。
實施例7流動條件下固定化P-選擇蛋白上細胞滾動的Y1-IgG抑制為了制備配體包被的基質，將重組人(rh)-P-選擇蛋白(R & DSystems，Minneapolis，MN)用包被介質(補加20mM碳酸氫鹽的PBS，pH8.5)稀釋到0.2-1.0μg/ml，并立即吸附到聚苯乙烯板上，在4℃過夜，然后用含有2μg/ml人血清清蛋白(Calbiochem)的PBS在4℃洗滌1小時。
對于層流測定，將其中固定純化的配體的聚苯乙烯板裝配在如前描述的平行板層流室中(Lawrence & Springer，Gell 65，859-873(1991))。人嗜中性粒細胞(通過葡聚糖沉降和在FICOLL上的密度分離從抗凝血分離)或者ML-2細胞在H/H培養(yǎng)基(Hanks平衡鹽溶液，10mM HEPES)中洗滌，以2×106個細胞/ml重懸浮在細胞結合培養(yǎng)基(H/H培養(yǎng)基，其中補加2mM CaCl2)，并在室溫下通過流動室以產(chǎn)生所希望的流速的壁剪切應力的速率灌注，所述速率以自動化注射器泵(Harvard Apparatus，Natick，MA)產(chǎn)生。在達到測試粘著基質的上游邊后，升高流速以產(chǎn)生1dyn/cm2的剪切應力，并用倒置相差顯微鏡(Diaphot 300，Nikon Inc.，Tokyo，日本)的10X物鏡在兩個不同視野(每個視野面積為0.17mm2)顯現(xiàn)所有細胞相互作用。如以前描述的(Dwir等人J.Biol.Chem.275，18682-18691(2000))，用成像系統(tǒng)WSCAN-Array-3(Galai，Migdal-Ha′emek，以色列)分析白細胞的瞬時速度。
通過計算機化細胞運動追蹤確定測試視野上滾動白細胞的積累。滾動細胞的頻率定義為最初粘連后細胞通量中啟動粘性基質上持續(xù)至少3秒的持續(xù)滾動的細胞數(shù)。將細胞與不同濃度的抗體溫育并用含有相同濃度抗體的結合培養(yǎng)基灌注到流動室。試劑洗滌后(“洗滌的”)或者在所述試劑存在下分析細胞滾動。
對于圖像分析，開發(fā)了顯像系統(tǒng)以用于定量分析不同粘性基質上細胞滾動的瞬時速度。由768×574象素(象素大小1.15μm，使用10X物鏡)組成的視頻幀圖像用Matrox Pulsar幀抓取器(MatroxGraphics Inc.，Dorval，Quebec，加拿大)數(shù)字化，并通過運行在Atlas pentium MMX-200工作站上的WSCAN-Array-3成像軟件(Galai，Migdal-Ha′emek，以色列)掃描并處理圖像。從以0.02秒間隔跟蹤的圖像鑒定細胞運動。程序輸出提供了相隔0.02秒的連續(xù)隔行視野中每個細胞的中心點的坐標。
與David Malah教授的實驗室(Electric Engineering Faculty，Technion，Haifa，以色列)合作開發(fā)了用于細胞運動分析的計算機程序。該軟件在Matlab 5.2下運行，并且比較連續(xù)視頻圖像中個體細胞在最多5秒時間段內的瞬時位置。根據(jù)流動方向上瞬時細胞速度的改變確定個體細胞在配體包被的視野上持續(xù)滾動或者以急動穿過其的范圍。滾動暫停定義為在1-1.75dyn/cm2的剪切應力下瞬時速度下降到29μm/s以下。該閾值速度給出了通過計算機化系統(tǒng)和手工直接從視頻監(jiān)視器對代表性細胞進行的暫停分析之間的最佳相關性。將個體滾動細胞的連續(xù)暫停之間的步距平均(step distance)以得到給定滾動細胞的平均步距。
圖32顯示了Y1-scFv(10μg/ml)對ML2細胞在低密度(0.2μg/ml)固定化rh-P-選擇蛋白上滾動的影響。分析表明在1dyn/cm2的剪切應力下，在Y1-scFv存在下，每個視野的滾動細胞數(shù)被完全消除。當使用等量scFv-N06(陰性對照)時，沒有得到該效果。
圖33顯示了在多種剪切應力下，Y1-scFv(10μg/ml)對ML2細胞在高密度(1.0μg/ml)固定化rh-P-選擇蛋白上滾動的影響。分析表明在1、5和10dyn/cm2的剪切應力下，在Y1-scFv存在下，每個視野的滾動細胞數(shù)分別受到83％、98％和100％抑制。用陰性對照N06，或者當細胞與Y1-scFv溫育后洗滌然后測試(Y1洗滌)時沒有得到該效果。
圖34顯示了在多種剪切應力下，Y1-IgG(1μg/ml)對ML2細胞在固定化rh-P-選擇蛋白(1μg/ml)上滾動的影響。分析表明在1dyn/cm2的剪切應力下，細胞滾動被抑制89％，在5和10dyn/cm2的剪切應力下，細胞滾動被抑制100％。當細胞與Y1-IgG溫育后洗滌然后測試(Y1-IgG洗滌)時，在1、5和10dyn/cm2的剪切應力下時，細胞滾動分別被抑制46％、48％和54％。鼠抗-PSGL-1抗體KPL1也能夠在所有剪切應力下100％抑制細胞滾動。
圖35顯示了增加濃度的Y1-scFv對高密度(1.0μg/ml)固定化rh-P-選擇蛋白上人嗜中性粒細胞滾動的影響。分析表明在1dyn/cm2的剪切應力下，1、5和10μg/ml的Y1-scFv抑制滾動的嗜中性粒細胞數(shù)分別為20％、81％和100％。
圖36顯示了Y1-IgG對高密度(1.0μg/ml)固定化rh-P-選擇蛋白上人嗜中性粒細胞滾動的影響。分析表明在1dyn/cm2的剪切應力下，在Y1-IgG(1μg/ml)的存在下，每個視野滾動的嗜中性粒細胞數(shù)被完全消除(100％抑制)。用KPL-1得到類似結果。
實施例8無機化合物文庫的篩選用通過諸如己酸的短接頭偶聯(lián)到合成肽的生物素標記(生物素化的)可以制備來自特定受體(蛋白質)的合成的硫酸化肽(在肽的已知氨基酸序列內的給定特定酪氨酸殘基上硫酸化)。使用相同的合成肽可以制備沒有硫酸化和沒有生物素標記(“B”)的對照肽。此外，可以制備來自其他不相關蛋白質的合成的硫酸化肽作為額外對照，其沒有生物素標記(“C”)。
可以將上面的生物素化肽(“A”)偶聯(lián)到鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠并洗除過量未結合的生物素化肽?？梢栽诖罅窟^量非硫酸化對照肽(“B”)的存在下在生理條件(37℃，pH 7.0-7.4，鹽濃度，電導率等等)針對小分子化學實體文庫篩選生物素-鏈霉抗生物素蛋白肽綴合物(“D”)以選擇結合“A”的分子。然后用緩沖液洗滌偶聯(lián)的磁珠兩次，每次進行離心以除去過量未結合的分子。結合磁珠的分子(“E”)可以經(jīng)洗脫、化學鑒定并以更大量制備以用于進一步篩選。
通過其他篩選方法可以證實所選化合物(“E”)對生物素化硫酸化肽的結合。所述方法包括與生物素化的不相關硫酸化肽競爭(方法1)或者與特異結合生物素化肽“A”的抗體或者其片段(例如，scFv)競爭(方法2)。
8.1通過與不相關生物素化硫酸化肽競爭進行再次篩選(方法1)為了確?；衔锾禺惤Y合“A”，可以實施第二輪篩選?？梢杂盟x化合物“E”，在過量不相關生物素化硫酸化肽“C”的存在下再次篩選生物素-鏈霉抗生物素蛋白肽綴合物(“D”)。然后離心所述管，用緩沖液洗滌生物素-鏈霉抗生物素蛋白肽綴合物偶聯(lián)的磁珠兩次并每次進行離心以除去過量未結合的分子?？梢韵疵摻Y合磁珠的化合物用于化學鑒定?？梢灾苽涓罅炕衔镆杂糜谶M一步研究，如對“A”的選擇性結合的驗證，和體外和體內功效試驗。
8.2通過與特異的scFv抗-硫酸化抗體的競爭的再次篩選(方法2)在大量過量特異識別和結合“A”的特定scFv抗體的存在下，通過競爭生物素-鏈霉抗生物素蛋白肽綴合物(“D”)與每種所選化合物“E”的結合可以再次篩選與“A”具有優(yōu)選結合親和力的化合物。可以制備特異抑制scFv抗體與“A”的結合的化合物以用于進一步研究，如對“A”的選擇性結合的驗證，和體外和體內功效試驗。
已經(jīng)參考特定實施例、材料和數(shù)據(jù)描述了本發(fā)明。本領域技術人員將明白，可以得到使用或制備本發(fā)明的多種方面的備選方法。此類備選方法可以理解為包括在下面的權利要求所限定的本發(fā)明的目的和精神內。
序列表SEQ ID NO1YEYLDYDSEQ ID NO2VRPEHPAETEYDSLYPEDDLSEQ ID NO3DXYDSEQ ID NO4DLYSDYSYSPESEQ ID NO5DLYDYYPESEQ ID NO6DLYSDYYPESEQ ID NO7DLYSDYSYPESEQ ID NO8DLYSDYYSPESEQ ID NO9DLYDYSYSPESEQ ID NO10DLYDYYSPESEQ ID NO11DLEDYYPESEQ ID NO12DLYSEYYPESEQ ID NO13DLYSNYYPESEQ ID NO14DLYSAYYPESEQ ID NO15DAYSDYYPESEQ ID NO16DLYSDFYPE
SEQ ID NO17DLYSDAYPESEQ ID NO18DLYSDYYAESEQ ID NO19DLYSDYYPASEQ ID NO20QATEYEYLDYDFLPETESEQ ID NO21DXYSDSEQ ID NO22DEGDTDLYDYYPEEDTEGDSEQ ID NO23EHPAETEYDSLYPEDSEQ ID NO24MEANEDYEDYEYDELPAKSEQ ID NO25GYYDYDFPL
權利要求
1.結合包含基序D-X-Y-D的表位的抗體或者其片段，其中X代表D和Y之間的任意氨基酸或者共價鍵，且Y經(jīng)硫酸化。
2.權利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與選自抗癌劑、抗白血病劑、抗轉移劑、抗腫瘤劑、抗疾病劑、抗粘附劑、抗血栓形成劑、抗再狹窄劑、抗自身免疫劑、抗聚集劑、抗細菌劑、抗病毒劑和消炎藥的試劑復合。
3.權利要求2的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段通過游離氨基與所述試劑復合。
4.權利要求2的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與所述試劑的1到16個拷貝復合。
5.權利要求4的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段為IgG，所述抗體或其片段的每條重鏈與所述試劑的約3個拷貝復合，且每條輕鏈與所述試劑的約1個拷貝復合。
6.權利要求2的抗體或其片段，其中所述試劑為選自無環(huán)鳥苷、更昔洛韋和齊多夫定的抗病毒劑。
7.權利要求2的抗體或其片段，其中所述試劑為選自西洛他唑、達肝素鈉、瑞維肝素鈉和阿司匹林的抗血栓形成/再狹窄劑。
8.權利要求2的抗體或其片段，其中所述試劑為選自扎托洛芬、普拉洛芬、哚昔康、乙?；畻钏?7、雙氯芬酸鈉、布洛芬、右布洛芬、舒林酸、萘普生、氨托美丁、塞來昔布、吲哚美辛、羅非克西和尼美舒利的消炎藥。
9.權利要求2的抗體或其片段，其中所述試劑為選自來氟洛米、昂他克、subreum、WinRho SDF、去纖苷和環(huán)磷酰胺的抗自身免疫劑。
10.權利要求2的抗體或其片段，其中所述試劑為選自利馬羅斯特、clorcromene和透明質酸的抗粘附/抗聚集劑。
11.權利要求2的抗體或其片段，其中所述試劑選自毒素、放射性同位素、顯像劑和藥物試劑。
12.權利要求11的抗體或其片段，其中所述毒素選自白樹毒素、假單胞菌外毒素(PE)、PE40、PE38、蓖麻毒蛋白和其修飾和衍生物。
13.權利要求11的抗體或其片段，其中所述放射性同位素選自γ-發(fā)射體、正電子發(fā)射體、X射線發(fā)射體、β-發(fā)射體和α-發(fā)射體。
14.權利要求11的抗體或其片段，其中所述放射性同位素選自111銦、113銦、99m錸、105錸、101錸、99m锝、121m碲、122m碲、125m碲、165銩、167銩、168銩、123碘、126碘、131碘、133碘、81m氪、33氙、90釔、213鉍、77溴、18氟、95釕、97釕、103釕、105釕、107汞、203汞、67鎵和68鎵。
15.權利要求11的抗體或其片段，其中所述藥物試劑為蒽環(huán)類抗生素。
16.權利要求15的抗體或其片段，其中所述蒽環(huán)類抗生素選自阿霉素、柔紅霉素、伊達比星、二乙氧醋酰阿霉素、去甲柔紅霉素、表柔比星、去羥阿霉素、嗎啉代阿霉素、嗎啉代柔紅霉素和甲氧基嗎啉基阿霉素。
17.權利要求11的抗體或其片段，其中所述藥物試劑選自順鉑、紫杉醇、加利車霉素、長春新堿、阿糖胞苷(Ara-C)、環(huán)磷酰胺、潑尼松、氟達拉濱、苯丁酸氮芥、干擾素α、羥基脲、替莫唑胺、沙利度胺和博來霉素，和它們的衍生物和組合。
18.權利要求2的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與可以與一種以上試劑復合的運載體或載體復合。
19.權利要求18的抗體或其片段，其中所述運載體或載體選自葡聚糖、親水聚合物、HPMA和脂質體，和它們的衍生物和修飾。
20.藥物組合物，其包含權利要求1的抗體或其片段和藥學上可接受的載體。
21.診斷、預后或者分期試劑盒，其包含權利要求1的抗體或其片段和顯像劑。
22.權利要求21的診斷、預后或者分期試劑盒，其中所述顯像劑為放射性同位素。
23.誘導依賴抗體的細胞毒性(ADCC)的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求20的藥物組合物。
24.刺激自然殺傷(NK)細胞或者T細胞的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求20的藥物組合物。
25.誘導細胞死亡的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求2的抗體或其片段，其中與試劑復合的所述抗體或其片段進入細胞并且所述抗體或其片段從所述試劑切割，從而釋放該試劑。
26.治療HIV的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求20的藥物組合物。
27.權利要求26的方法，其中所述施用防止HIV進入。
28.向表達包含基序D-X-Y-D的表位的細胞導入試劑的方法，其中基序D-X-Y-D中X代表D和Y之間的任意氨基酸或者共價鍵，且Y經(jīng)硫酸化，其中所述方法包括下面的步驟將試劑復合到權利要求1的抗體或其片段和對細胞施用復合所述試劑的所述抗體或其片段。
29.權利要求28的方法，其中所述方法治療需要其的患者中的疾病。
30.權利要求28的方法，其中所述方法治療需要其的患者中的細胞滾動。
31.權利要求28的方法，其中所述方法治療需要其的患者中的炎癥。
32.權利要求28的方法，其中所述方法治療需要其的患者中的自身免疫病。
33.權利要求28的方法，其中所述方法治療需要其的患者中的轉移。
34.權利要求28的方法，其中所述方法治療需要其的患者中腫瘤細胞的生長和/或復制。
35.權利要求28的方法，其中所述方法增加需要其的患者中腫瘤細胞的死亡率。
36.權利要求28的方法，其中所述方法抑制需要其的患者中白血病細胞的生長和/或復制。
37.權利要求28的方法，其中所述方法增加需要其的患者中白血病細胞的死亡率。
38.權利要求28的方法，其中所述方法改變需要其的患者中患病細胞對抗疾病劑傷害的易感性。
39.權利要求28的方法，其中所述方法增加需要其的患者中腫瘤細胞對抗癌劑傷害的易感性。
40.權利要求28的方法，其中所述方法增加需要其的患者中白血病細胞對抗白血病劑傷害的易感性。
41.權利要求28的方法，其中所述方法抑制患有腫瘤的患者中腫瘤細胞數(shù)目的增加。
42.權利要求28的方法，其中所述方法減少患有腫瘤的患者中腫瘤細胞數(shù)目。
43.權利要求28的方法，其中所述方法抑制患有白血病的患者中白血病細胞數(shù)目的增加。
44.權利要求28的方法，其中所述方法減少患有白血病的患者中白血病細胞數(shù)目。
45.權利要求28的方法，其中所述方法抑制需要其的患者中的血小板聚集。
46.權利要求28的方法，其中所述方法抑制需要其的患者中的再狹窄。
47.監(jiān)控患者中腫瘤細胞的方法，其包括提供來自所述患者的腫瘤細胞和將所述腫瘤細胞與權利要求1的抗體或者其片段溫育，從而對腫瘤細胞分期。
48.權利要求47的方法，其中該方法還包括確定相對于參照標準，所述抗體或其片段的特異結合。
49.權利要求47的方法，其中所述抗體或其片段為Y1。
50.分離腫瘤特異抗原的方法，其包括得到細胞樣品，裂解細胞，鑒定權利要求1的抗體或者其片段的蛋白質配體并通過將細胞裂解物穿過包含所述抗體或其片段的親和柱純化所述蛋白質配體。
51.權利要求50的方法，其中所述方法還包括對所述蛋白質配體測序，從而鑒定腫瘤特異抗原。
52.權利要求50的方法，其中所述抗體或其片段為Y1。
53.權利要求50的方法，其中從人的腫瘤得到所述細胞。
54.權利要求53的方法，其中所述腫瘤是實體瘤。
55.權利要求54的方法，其中所述腫瘤是小細胞肺癌。
56.權利要求53的方法，其中所述腫瘤是血液相關的腫瘤。
57.權利要求56的方法，其中所述腫瘤是白血病。
58.診斷、預后或分期患者中疾病的方法，其包括提供包含來自所述患者的細胞的樣品并確定權利要求1的抗體或者其片段是否結合患者的細胞，從而指出所述患者有危險患有或者已經(jīng)患有該疾病。
59.權利要求58的方法，其中所述方法還包括確定所述抗體或其片段的特異結合并比較相對于參照標準，所述抗體或其片段與所述細胞的特異結合。
60.權利要求58的方法，其中用蛋白質印跡確定權利要求1的抗體或者其片段是否結合患者的細胞。
61.權利要求58的方法，其中所述疾病是癌癥。
62.權利要求61的方法，其中所述癌癥是實體瘤。
63.權利要求62的方法，其中所述癌癥是小細胞肺癌。
64.權利要求61的方法，其中所述癌癥是血液相關的腫瘤。
65.權利要求64的方法，其中所述癌癥是白血病。
66.權利要求58的方法，其中所述抗體或其片段為Y1。
67.從患者清除腫瘤細胞的方法，其包括提供含有來自患者的細胞的樣品和將來自患者的細胞與權利要求1的抗體或其片段溫育。
68.權利要求67的方法，其中所述清除離體發(fā)生。
69.形成蒽環(huán)類抗生素試劑復合體的方法，其包括提供蒽環(huán)類抗生素；將己二酸與所述蒽環(huán)類抗生素反應；產(chǎn)生己二酸-蒽環(huán)類抗生素的活性酯；和將所述己二酸-蒽環(huán)類抗生素與多肽反應形成蒽環(huán)類-試劑復合體。
70.權利要求69的方法，其中蒽環(huán)類抗生素為選自阿霉素、柔紅霉素、伊達比星、二乙氧醋酰阿霉素、去甲柔紅霉素、表柔比星、去羥阿霉素、嗎啉代阿霉素、嗎啉代柔紅霉素和甲氧基嗎啉基阿霉素的蒽環(huán)類抗生素。
71.權利要求69的方法，其中所述多肽為抗體或其片段。
72.根據(jù)權利要求69的方法產(chǎn)生的復合體。
73.權利要求72的方法，其中所述蒽環(huán)類抗生素為阿霉素、柔紅霉素、伊達比星、二乙氧醋酰阿霉素、去甲柔紅霉素、表柔比星、去羥阿霉素、嗎啉代阿霉素、嗎啉代柔紅霉素和甲氧基嗎啉基阿霉素。
74.權利要求72的方法，其中所述多肽為抗體或其片段。
75.結合包含序列YD的表位的抗體或其片段，其中YD位于基序DXYD內或者酸性環(huán)境內，并且其中X為D和Y之間的任意氨基酸或者共價鏈，并且其中Y經(jīng)硫酸化。
76.藥物組合物，其包含權利要求75的抗體或其片段和藥學上可接受的載體。
77.診斷、預后或分期試劑盒，其包含權利要求75的抗體或其片段和顯像劑。
78.權利要求77的診斷、預后或分期試劑盒，其中所述顯像劑是放射性同位素。
79.誘導依賴抗體的細胞毒性(ADCC)的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求76的藥物組合物。
80.刺激自然殺傷(NK)細胞或者T細胞的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求76的藥物組合物。
81.誘導細胞死亡的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求75的抗體或其片段，其中與試劑復合的所述抗體或其片段進入細胞并且所述抗體或其片段從所述試劑切割，從而釋放該試劑。
82.治療HIV的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求76的藥物組合物。
83.權利要求82的方法，其中所述施用防止HIV進入。
84.疾病治療方法，其包括對需要其的患者施用權利要求1或76的藥物組合物。
85.權利要求84的方法，其中所述方法治療需要其的患者中的細胞滾動。
全文摘要
本發(fā)明提供了結合PSGL－1的表位的抗體，所述表位包含基序D－X－Y－D，其中X代表D和Y之間的任意氨基酸或者共價鍵，且Y經(jīng)硫酸化，所述抗體可以與試劑的一個或多個拷貝復合。本發(fā)明的抗體可以用于誘導依賴抗體的細胞毒性和/或刺激自然殺傷(NK)細胞或T細胞的方法中。此外，通過對需要其的患者施用這些抗體，提供了誘導細胞死亡的方法。還提供了通過對需要其的患者施用本發(fā)明的抗體防止病毒(例如，HIV)感染的方法。本發(fā)明還提供了通過將試劑偶聯(lián)或復合到本發(fā)明的抗體并向細胞施用該復合體將試劑導入表達硫酸化PSGL－1的細胞的方法。最后，本發(fā)明提供了使用所述抗體進行診斷、預后和分期的方法。
文檔編號A61K47/48GK1897970SQ200480024911
公開日2007年1月17日 申請日期2004年6月30日 優(yōu)先權日2003年6月30日
發(fā)明者A·萊瓦農(nóng), T·福格爾, D·普拉克辛, T·佩雷茨, B·阿米特, L·庫珀曼, Y·哈蓋, E·桑頓, Y·坎菲, R·本-萊維, T·斯拉伯 申請人:生物技術通用(以色列)有限公司