專利名稱：免疫抑制劑化合物和組合物的制作方法
相關(guān)申請的交叉參考本申請要求美國臨時專利申請No.60/471,931(提交于2003年5月19日)和美國臨時專利申請No.60/562,182(提交于2004年4月14日)的優(yōu)先權(quán)。這些申請的全部公開內(nèi)容出于所有目的完整地引用在此作為參考。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供一類新穎的免疫抑制劑化合物，可用于治療或預(yù)防由淋巴細胞相互作用介導(dǎo)的疾病或障礙，特別是與EDG受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的疾病。
背景EDG受體屬于密切相關(guān)的、受脂質(zhì)活化的G-蛋白偶聯(lián)受體家族。EDG-1、EDG-3、EDG-5、EDG-6和EDG-8(也分別稱為S1P1、S1P3、S1P2、S1P4和S1P5)被鑒定為對鞘氨醇-1-磷酸(S1P)具有特異性的受體。EDG2、EDG4和EDG7(分別也稱為LPA1、LPA2和LPA3)是對溶血磷脂酸(LPA)具有特異性的受體。在S1P受體同種型中，EDG-1、EDG-3和EDG-5在多種組織中被廣泛表達，而EDG-6的表達很大程度上限于淋巴樣組織和血小板，EDG-8的表達限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。EDG受體負責信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，被認為在牽涉細胞發(fā)育、增殖、供養(yǎng)、遷移、分化、可塑性和細胞程序死亡的細胞過程中扮演重要角色。某些EDG受體與由淋巴細胞相互作用介導(dǎo)的疾病有關(guān)，例如在移植排斥、自體免疫疾病、炎性疾病、感染性疾病和癌癥中。EDG受體活性的改變對這些疾病的病理學和/或癥狀學起作用。因此，本身改變EDG受體活性的分子在這類疾病的治療中可用作治療劑。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及式I化合物及其N-氧化物衍生物、前體藥物衍生物、被保護的衍生物、個別的異構(gòu)體和異構(gòu)體的混合物，和這類化合物在藥學上可接受的鹽和溶劑合物(例如水合物)， 其中n是1、2或3；A選自-X1C(O)OR6、-X1OP(O)(OR6)2、-X1P(O)(OR6)2、-X1S(O)2OR6、-X1P(O)(R6)OR6和1H-四唑-5-基；其中X1選自鍵和C1-3亞烷基；每個R6獨立地選自氫和C1-6烷基；X是鍵或者選自C1-4亞烷基、-X1OX2-、-X1NR7X2-、-X1C(O)NR7X2-、-X1NR7C(O)X2-、-X1S(O)X2-、-X1S(O)2X2-、-X1SX2-和C2-9亞雜芳基；其中X1和X2獨立地選自鍵和C1-3亞烷基；R7選自氫和C1-6烷基；X的任意亞雜芳基可選地被選自鹵代和C1-6烷基的基團取代；Y選自C6-10芳基和C2-9雜芳基，其中Y的任意芳基或雜芳基可以可選地被1至3個基團取代，所述基團選自鹵代、羥基、氰基、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷基和鹵代C1-6烷氧基；R1選自C6-10芳基和C2-9雜芳基；其中R1的任意芳基或雜芳基可選地被選自以下的基團取代C6-10芳基C0-4烷基、C2-9雜芳基C0-4烷基、C3-8環(huán)烷基C0-4烷基、C3-8雜環(huán)烷基C0-4烷基或C1-6烷基；其中R1的任意芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基可以可選地被一至五個基團取代，所述基團選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷基和鹵代C1-6烷氧基；R1的任意烷基可以可選地具有被選自以下的原子或基團所代替的亞甲基-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR7-和-O-；其中R7選自氫或C1-6烷基；R2、R3、R4和R5獨立地選自氫、C1-6烷基、鹵代、羥基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷基和鹵代C1-6烷氧基。
本發(fā)明的第二方面是藥物組合物，它含有式I化合物或者其N-氧化物衍生物、個別的異構(gòu)體或異構(gòu)體的混合物或其藥學上可接受的鹽，混合有一種或多種適合的賦形劑。
本發(fā)明的第三方面是治療動物疾病的方法，其中EDG受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變能夠預(yù)防、抑制或改善該疾病的病理學和/或癥狀學，該方法包括對該動物施用治療有效量的式I化合物或者其N-氧化物衍生物、個別的異構(gòu)體或異構(gòu)體的混合物或其藥學上可接受的鹽。
本發(fā)明的第四方面是式I化合物在制備用于治療動物疾病的藥物中的用途，其中EDG受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變對該疾病的病理學和/或癥狀學起作用。
本發(fā)明的第五方面是制備式I化合物和其N-氧化物衍生物、前體藥物衍生物、被保護的衍生物、個別的異構(gòu)體和異構(gòu)體的混合物和其藥學上可接受的鹽的方法。
優(yōu)選實施方式的說明本發(fā)明提供可用于治療和/或預(yù)防由淋巴細胞相互作用介導(dǎo)的疾病或障礙的化合物。還提供治療這類疾病或障礙的方法。
定義本說明書中，除非另有定義“烷基”作為一個基團和其他基團例如鹵代烷基、烷氧基、?；⑼榱蚧?、烷基磺?；屯榛鶃喕酋；慕Y(jié)構(gòu)要素，可以是直鏈或支鏈的?！版溝┗弊鳛橐粋€基團和其他基團的結(jié)構(gòu)要素，含有一條或多條碳-碳雙鍵，并且可以是直鏈或支鏈的。任意雙鍵可以是順式-或反式-構(gòu)型?！叭不弊鳛橐粋€基團和其他基團與化合物的結(jié)構(gòu)要素，含有至少一條C≡C叁鍵，也可以含有一條或多條C＝C雙鍵，并且只要可能的話，可以是直鏈或支鏈的。任意環(huán)烷基單獨或者作為其他基團的結(jié)構(gòu)要素，可以含有3至8個碳原子，優(yōu)選3至6個碳原子?！皝喭榛焙汀皝喯┗笔欠謩e從“烷基”和“鏈烯基”衍生的二價基團。本申請中，R1的任意烷基可以可選地被選自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR20-和-O-(其中R20是氫或C1-6烷基)的基團所中斷。這些基團包括-CH2-O-CH2-、-CH2-S(O)2-CH2-、-(CH2)2-NR20-CH2-、-CH2-O-(CH2)2-等。
“芳基”表示單環(huán)或稠合二環(huán)芳族環(huán)組合，含有六至十個環(huán)碳原子。例如，C6-12芳基可以是苯基、聯(lián)苯基或萘基，優(yōu)選苯基。稠合二環(huán)可以是部分飽和的，例如1，2，3，4-四氫萘等。“亞芳基”表示從芳基衍生的二價基團。例如，用在本申請中的亞芳基可以是亞苯基、亞聯(lián)苯基、亞萘基等。
“鹵代”或“鹵素”表示F、Cl、Br或I，優(yōu)選F或Cl。鹵代烷基和化合物可以是部分鹵化或全鹵化的，其中在多鹵化的情況下，鹵素取代基可以相同或不同。優(yōu)選的全鹵化烷基例如有三氟甲基或三氟甲氧基。
“雜芳基”表示如本申請所定義的芳基，加有至少一個選自N、O或S的雜原子部分，每個環(huán)由5至6個環(huán)原子組成，另有規(guī)定除外。例如，C2雜芳基包括噁二唑、三唑等。C9雜芳基包括喹啉、1，2，3，4-四氫喹啉等。用在本申請中的C2-9雜芳基包括噻吩基、吡啶基、呋喃基、異噁唑基、苯并噁唑基或苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯基，優(yōu)選噻吩基、呋喃基或吡啶基?！皝嗠s芳基”表示如本申請所定義的雜芳基，其條件是環(huán)組合包含二價基團。稠合二環(huán)雜芳基環(huán)系可以是部分飽和的，例如2，3-二氫-1H-異吲哚、1，2，3，4-四氫喹啉等。
用在本發(fā)明中的EDG-1選擇性化合物(試劑或調(diào)控劑)具有這樣一種特異性，它相對EDG-3和一種或多種EDG-5、EDG-6和EDG-8而言對EDG-1具有選擇性。本文所用的對一種EDG受體(“選擇性受體”)相比對另一種EDG受體(“非選擇性受體”)而言的選擇性意味著該化合物在誘導(dǎo)由選擇性EDG受體(例如EDG-1)介導(dǎo)的活性方面的效力相比誘導(dǎo)非選擇性S1P-特異性EDG受體介導(dǎo)的活性的效力高得多。如果在GTP-γS結(jié)合測定法(如下實施例所述)中測量，EDG-1選擇性化合物對選擇性受體(EDG-1)的EC50(導(dǎo)致50％最大響應(yīng)的有效濃度)通常比其對非選擇性受體(例如一種或多種EDG-3、EDG-5、EDG-6和EDG-8)的EC50低至少5、10、25、50、100、500或1000倍。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供可用于治療或預(yù)防由淋巴細胞相互作用介導(dǎo)的疾病或障礙的化合物。在一種實施方式中，就式I化合物而言，R1是苯基、萘基、呋喃基或噻吩基，可選地被C6-10芳基C0-4烷基、C2-9雜芳基C0-4烷基、C3-8環(huán)烷基C0-4烷基、C3-8雜環(huán)烷基C0-4烷基或C1-6烷基取代；其中R1的任意芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基可以可選地被一至五個基團取代，所述基團選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷基和鹵代C1-6烷氧基；R1的任意烷基可以可選地具有被選自以下的原子或基團所代替的亞甲基-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR7-和-O-；其中R7是氫或C1-6烷基。
在另一種實施方式中，Y選自苯基和苯并噁唑基；X是鍵或者選自-X1OX2-和C4-6亞雜芳基；其中X1和X2獨立地選自鍵和C1-3亞烷基；其中X的任意亞雜芳基可選地被選自鹵代和C1-6烷基的基團取代。
在另一種實施方式中，R1選自 和 其中星號是R1與X的連接點；m選自1和2；R12選自氫、C6-10芳基C0-4烷基、C2-9雜芳基C0-4烷基、C3-8環(huán)烷基C0-4烷基、C3-8雜環(huán)烷基C0-4烷基或C1-6烷基；其中R12的任意芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基可以可選地被一至三個基團取代，所述基團選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷基和鹵代C1-6烷氧基；R12的任意烷基可以可選地具有被選自以下的原子或基團所代替的亞甲基-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR10-和-O-；其中R10是氫或C1-6烷基；R13選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷基和鹵代C1-6烷氧基。
在另一種實施方式中，A是-(CH2)2C(O)OH；R2、R3、R4和R5是氫。
在另一種實施方式中，n是1或2；Y選自苯基和苯并噁唑基；X是鍵或者選自[1，2，4]噁二唑、-CH2O-、-OCH2-、異噁唑和[1，3，4]噁二唑。
在另一種實施方式中，R1選自
和 其中R12選自氫、苯基和環(huán)己基；其中R12的任意苯基或環(huán)己基可選地被甲基取代；R13選自三氟甲基、甲基和乙基。
優(yōu)選的本發(fā)明化合物選自3-{6-[3-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，2，4]噁二唑-5-基]-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基}-丙酸、3-[6-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸、3-{5-[5-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-異噁唑-3-基]-1，3-二氫-異吲哚-2-基}-丙酸、3-{5-[5-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-1，3-二氫-異吲哚-2-基}-丙酸、3-{5-[5-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，3，4]噁二唑-2-基]-1，3-二氫-異吲哚-2-基}-丙酸、3-[2-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-5，7-二氫-噁唑并[4，5-f]異吲哚-6-基]-丙酸、3-{7-[5-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基}-丙酸、3-{6-[5-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基}-丙酸、3-{6-[5-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，3，4]噁二唑-2-基]-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基}-丙酸、3-[6-(3-三氟甲基-芐基氧基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸、3-[6-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐基氧基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸、3-[6-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基甲氧基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸、3-[7-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐基氧基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸、3-[6-(4-環(huán)己基-3-甲基-苯氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸、3-[6-(4-環(huán)己基-3-乙基-苯氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸、3-[6-(2-乙基-聯(lián)苯-4-基氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸和3-[6-(2-乙基-3′-甲基-聯(lián)苯-4-基氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸。
進一步優(yōu)選的化合物也如以下實施例和表1所示。
本發(fā)明提供具有以被保護形式存在的羥基或氨基的化合物形式；它們充當前體藥物。前體藥物是在施用后通過一種或多種化學或生物化學轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化為活性藥物形式的化合物。容易在生理條件下轉(zhuǎn)化為所要求保護化合物的本發(fā)明化合物形式是所要求保護化合物的前體藥物，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。前體藥物的實例包括其中羥基被?；上鄬Σ环€(wěn)定的酯、例如乙酸酯的形式，和其中氨基被甘氨酸或L-氨基酸、例如絲氨酸的羧酸基團?；?、生成對普通代謝酶的水解作用特別敏感的酰胺鍵的形式。
式I化合物可以以游離形式或鹽形式存在，例如與無機或有機酸的加成鹽。若存在羥基，這些基團也可以以鹽形式存在，例如銨鹽或者與金屬如鋰、鈉、鉀、鈣、鋅或鎂的鹽，或者其混合物。式I化合物和它們的鹽的水合物或溶劑合物形式也是本發(fā)明的一部分。
當式I化合物在分子中具有不對稱中心時，得到各種旋光異構(gòu)體。本發(fā)明也涵蓋對映體、外消旋物、非對映異構(gòu)體及其混合物。而且，當式I化合物包括幾何異構(gòu)體時，本發(fā)明涵蓋順式-化合物、反式化合物及其混合物。相似的考慮適用于具有如上所述不對稱碳原子或不飽和鍵的原料。
治療免疫調(diào)控病癥的方法和藥物組合物游離形式或藥學上可接受的鹽形式的式I化合物表現(xiàn)有價值的藥理性質(zhì)，例如淋巴細胞再循環(huán)調(diào)控性質(zhì)，因此適用于治療，例如實施例3的體外與體內(nèi)試驗所示。式I化合物優(yōu)選地顯示1×10-11至1×10-5M的EC50，優(yōu)選小于50nM。這些化合物表現(xiàn)對一種或多種EDG/S1P受體的選擇性，優(yōu)選EDG-1/S1P-1。本發(fā)明的EDG-1/S1P-1選擇性調(diào)控劑可以通過測定化合物與EDG-1/S1P-1和一種或多種其他EDG/S1P受體(例如EDG-3/S1P-3、EDG-5/S1P-2、EDG-6/S1P-4和EDG-8/S1P-5)的結(jié)合來鑒定。EDG-1/S1P-1選擇性調(diào)控劑通常對EDG-1/S1P-1受體的EC50為1×10-11至1×10-5M，優(yōu)選小于50nM，更優(yōu)選小于5nM。它對一種或多種其他EDG/S1P受體的EC50比其對EDG-1/S1P-1的EC50高至少5、10、25、50、100、500或1000倍。因而，一些EDG-1/S1P-1調(diào)控性化合物對EDG-1/S1P-1的EC50小于5nM，而它們對一種或多種其他EDG/S1P受體的EC50為至少100nM或更高。除了測定與EDG/S1P受體的結(jié)合活性外，EDG-1/S1P-1選擇性試劑也可以通過檢查供試試劑改變由EDG/S1P受體介導(dǎo)的細胞過程或活性的能力來鑒定。
式I化合物因此可用于治療和/或預(yù)防由淋巴細胞相互作用介導(dǎo)的疾病或障礙，例如在移植術(shù)中，例如細胞、組織或器官同種或異種移植物的急性或慢性排斥或者移植物功能延遲；移植物對宿主的疾病；自體免疫疾病，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、橋本甲狀腺炎、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、I或II型糖尿病和與之有關(guān)的障礙、脈管炎、惡性貧血、斯耶格倫氏綜合征、眼色素層炎、牛皮癬、Graves眼病、斑形脫發(fā)和其他；變應(yīng)性疾病，例如變應(yīng)性哮喘、特發(fā)性皮炎、變應(yīng)性鼻炎/結(jié)膜炎、變應(yīng)性接觸性皮炎；可選伴有異常反應(yīng)的炎性疾病，例如炎性腸病、克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎、內(nèi)源性哮喘、炎性肺損傷、炎性肝損傷、炎性腎小球損傷、動脈粥樣硬化、骨關(guān)節(jié)炎、刺激性接觸性皮炎與其他濕疹性皮炎、脂溢性皮炎、免疫介導(dǎo)障礙的皮膚表現(xiàn)、炎性眼疾病、角膜結(jié)膜炎、心肌炎或肝炎；缺血/再灌注損傷，例如心肌梗死、中風、腸道缺血、腎衰或出血性休克、創(chuàng)傷性休克、T細胞淋巴瘤或T細胞白血?。桓腥拘约膊?，例如中毒性休克(例如超抗原誘發(fā)的)、膿毒性休克、成人呼吸窘迫綜合征或者病毒感染，例如AIDS、病毒性肝炎、慢性細菌感染；或者老年性癡呆。細胞、組織或?qū)嶓w器官移植物的實例例如包括胰島、干細胞、骨髓、角膜組織、神經(jīng)元組織、心、肺、聯(lián)合心肺、腎、肝、腸、胰、氣管或食管。就上述用途而言，所需劑量當然將因施用方式、所治療的特定病癥和所需效果而異。
此外，式I化合物可用于癌癥化療，特別是實體腫瘤例如乳腺癌的癌癥化療，或者用作抗血管生成劑。
所需劑量當然將因施用方式、所治療的特定病癥和所需效果而異。一般而言，在約0.03至2.5mg/kg體重的每日劑量下，系統(tǒng)性獲得令人滿意的結(jié)果。在大型哺乳動物、例如人類中適用的每日劑量在約0.5mg至約100mg的范圍內(nèi)，例如方便地以每天多達四次的分劑量施用，或者以延遲方式施用。適合于口服給藥的單元劑型包含約1至50mg活性成分。
式I化合物可以借助任意常規(guī)途徑施用，特別是腸內(nèi)方式，例如口服，劑型例如片劑或膠囊劑；或腸胃外方式，劑型例如可注射溶液或懸液；局部方式，劑型例如洗劑、凝膠劑、軟膏劑或霜劑，或者鼻用或栓劑方式。通過與藥學上可接受的載體或稀釋劑混合，可以按照常規(guī)方式制備包含游離形式或藥學上可接受的鹽形式的式I化合物以及至少一種藥學上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。
式I化合物可以以游離形式或藥學上可接受的鹽形式施用，例如如上所示。這類鹽可以按照常規(guī)方式制備且表現(xiàn)與游離化合物同等級別的活性。
按照上述，本發(fā)明進一步提供1.1在需要該治療的對象中預(yù)防或治療由淋巴細胞介導(dǎo)的障礙或疾病(例如如上所示)的方法，該方法包括對所述對象施用有效量的式I化合物或其藥學上可接受的鹽；1.2在需要該治療的對象中預(yù)防或治療急性或慢性移植物排斥或者T-細胞介導(dǎo)的炎性或自體免疫疾病(例如如上所示)的方法，該方法包括對所述對象施用有效量的式I化合物或其藥學上可接受的鹽；1.3在有需要的對象中抑制或控制血管生成失調(diào)、例如鞘氨醇-1-磷酸(S1P)介導(dǎo)的血管生成的方法，包括對所述對象施用治療有效量的式I化合物或其藥學上可接受的鹽；1.4在有需要的對象中預(yù)防或治療由新血管生成過程介導(dǎo)或與血管生成失調(diào)有關(guān)的疾病的方法，包括對所述對象施用治療有效量的式I化合物或其藥學上可接受的鹽。
2.用作藥物的游離形式或藥學上可接受的鹽形式的式I化合物，例如在如上1.1至1.4下所示的任意方法中。
3.藥物組合物，例如用在如上1.1至1.4的任意方法中，包含游離形式或藥學上可接受的鹽形式的式I化合物以及藥學上可接受的稀釋劑或載體。
4.用于制備藥物組合物的式I化合物或其藥學上可接受的鹽，該組合物用在如上1.1至1.4的任意方法中。
式I化合物可以作為單獨的活性成分施用，或者例如作為佐藥與其他藥物聯(lián)合施用，所述其他藥物例如免疫抑制劑或免疫調(diào)控劑或者其他抗炎劑，例如用于治療或預(yù)防同種或異種抑制物急性或慢性排斥或者炎性或自體免疫障礙，或者化學治療劑，例如惡性細胞抗增殖劑。例如，式I化合物可以與下列藥物聯(lián)合使用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，例如環(huán)孢菌素A或FK506；mTOR抑制劑，例如雷帕霉素、40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578或AP23573；具有免疫抑制性質(zhì)的子囊霉素，例如ABT-281、ASM981等；皮質(zhì)類固醇；環(huán)磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；來氟洛米；咪唑立賓；霉酚酸；霉酚酸酯(麥考酚酸嗎啉乙酯)；15-脫氧精胍菌素(spergualine)或者其免疫抑制性同系物、類似物或衍生物；免疫抑制性單克隆抗體，例如白血病受體的單克隆抗體，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或它們的配體；其他免疫調(diào)控性化合物，例如具有至少一部分細胞外CTLA4結(jié)構(gòu)域或其突變體的重組結(jié)合性分子，例如與非CTLA4蛋白序列連接的至少細胞外CTLA4部分或其突變體，例如CTLA4Ig(例如命名為ATCC 68629)或其突變體，例如LEA29Y；粘著分子抑制劑，例如LFA-1拮抗劑、ICAM-1或-3拮抗劑、VCAM-4拮抗劑或VLA-4拮抗劑；或者一種化學治療劑。
術(shù)語“化學治療劑”表示任意的化學治療劑，它包括但不限于i.芳香酶抑制劑，ii.抗-雌激素藥、抗-雄激素藥(尤其在前列腺癌的情況下)或促性腺激素釋放因子激動劑，iii.拓撲異構(gòu)酶I抑制劑或拓撲異構(gòu)酶II抑制劑，iv.微管活性劑、烷基化劑、抗腫瘤性抗代謝產(chǎn)物或鉑化合物，v.靶向/降低蛋白或脂質(zhì)激酶活性或者蛋白或脂質(zhì)磷酸酶活性的化合物、進一步的抗血管生成化合物或誘導(dǎo)細胞分化過程的化合物，vi.緩激肽1受體或血管緊張素II拮抗劑，vii.環(huán)加氧酶抑制劑、雙膦酸類、組蛋白脫乙酰酶抑制劑、類肝素酶抑制劑(防止硫酸類肝素降解)，例如PI-88；生物應(yīng)答改性劑，優(yōu)選淋巴因子或干擾素，例如干擾素□；遍在蛋白化作用抑制劑，或阻滯抗細胞程序死亡路徑的抑制劑，
viii.Ras致癌基因同種型的抑制劑，例如H-Ras、K-Ras或N-Ras，或法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，例如L-744,832或DK8G557，ix.端粒酶抑制劑，例如telomestatin，x.蛋白酶抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、甲硫氨酸氨肽酶抑制劑(例如bengamide或其衍生物)或蛋白體抑制劑(例如PS-341)，和/或xi.mTOR抑制劑。
本文所用的術(shù)語“芳香酶抑制劑”涉及抑制雌激素產(chǎn)生的化合物，也就是抑制底物雄甾烯二酮和睪酮分別向雌酮和雌二醇的轉(zhuǎn)化的化合物。該術(shù)語包括但不限于類固醇，尤其是阿他美坦、依西美坦和福美司坦，特別是非類固醇，尤其是氨魯米特、roglethimide、吡魯米特、曲洛司坦、睪內(nèi)酯、酮康唑(ketokonazole)、伏羅唑、法曲唑、阿那曲唑和來曲唑。包含化學治療劑芳香酶抑制劑的本發(fā)明組合特別可用于治療激素受體陽性腫瘤，例如乳腺腫瘤。
本文所用的術(shù)語“抗雌激素藥”涉及在雌激素受體水平拮抗雌激素效應(yīng)的化合物。該術(shù)語包括但不限于他莫昔芬、fulvestrant、雷洛昔芬和鹽酸雷洛昔芬。包含化學治療劑抗雌激素藥的本發(fā)明組合特別可用于治療雌激素受體陽性腫瘤，例如乳腺腫瘤。
本文所用的術(shù)語“抗雄激素藥”涉及能夠抑制雄性激素生物效應(yīng)的任意物質(zhì)，包括但不限于比卡魯胺。
本文所用的術(shù)語“促性腺激素釋放因子激動劑”包括但不限于阿巴瑞克(abarelix)、性瑞林和醋酸性瑞林。
本文所用的術(shù)語“拓撲異構(gòu)酶I抑制劑”包括但不限于托泊替康、伊立替康、9-硝基喜樹堿和大分子喜樹堿綴合物PNU-166148(WO 99/17804中的化合物A1)。
本文所用的術(shù)語“拓撲異構(gòu)酶II抑制劑”包括但不限于蒽環(huán)素類，例如阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素、伊達比星和奈莫比星(nemorubicin)，蒽醌類的米托蒽醌和洛索蒽醌(losoxantrone)；和鬼臼毒素(podophillotoxine)依托泊苷和替尼泊苷。
術(shù)語“微管活性劑”涉及微管穩(wěn)定化與微管去穩(wěn)定化劑，包括但不限于紫杉烷類，例如紫杉醇和多西他賽；長春花屬生物堿，例如長春花堿尤其是硫酸長春花堿、長春新堿尤其是硫酸長春新堿，和長春烯堿；海綿內(nèi)酯(discodermolide)和埃坡霉素及其衍生物，例如埃坡霉素B或其衍生物。
本文所用的術(shù)語“烷基化劑”包括但不限于白消安、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖或亞硝基脲(BCNU或GliadelTM)。
術(shù)語“抗腫瘤性抗代謝物”包括但不限于5-氟尿嘧啶、卡培他濱、吉西他濱、阿糖胞苷、氟達拉濱、硫鳥嘌呤、甲氨蝶呤和依達曲沙。
本文所用的術(shù)語“鉑化合物”包括但不限于卡鉑、順鉑和奧沙利鉑。
本文所用的術(shù)語“靶向/降低蛋白或脂質(zhì)激酶活性的化合物或者進一步的抗血管生成化合物”包括但不限于蛋白酪氨酸激酶和/或絲氨酸和/或蘇氨酸激酶抑制劑或者脂質(zhì)激酶抑制劑，例如靶向、降低或抑制下列物質(zhì)活性的化合物表皮生長因子受體酪氨酸激酶家族(EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4的均或雜二聚物)、血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶家族(VEGFR)、血小板衍生的生長因子受體(PDGFR)、成纖維細胞生長因子受體(FGFR)、胰島素樣生長因子受體1(IGF-1R)、Trk受體酪氨酸激酶家族、Axl受體酪氨酸激酶家族、Ret受體酪氨酸激酶、Kit/SCFR受體酪氨酸激酶、c-Abl家族成員與它們的基因融合產(chǎn)物(例如BCR-Abl)、蛋白激酶C(PKC)與Raf家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶成員、MEK、SRC、JAK、FAK、PDK或PI(3)激酶家族成員或者PI(3)激酶相關(guān)激酶家族的成員，和/或細胞周期蛋白依賴性激酶家族(CDK)成員，和它們的活性具有另一種機理(例如與蛋白或脂質(zhì)激酶抑制作用無關(guān))的抗血管生成化合物。
靶向、降低或抑制VEGFR活性的化合物尤其是抑制VEGF受體酪氨酸激酶、抑制VEGF受體或與VEGF結(jié)合的化合物、蛋白質(zhì)或抗體，特別是一般與具體公開在下列文獻中的那些化合物、蛋白質(zhì)或單克隆抗體WO98/35958，例如1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪或其藥學上可接受的鹽，例如琥珀酸鹽；WO 00/27820，例如N-芳(硫代)鄰氨基苯甲酰胺衍生物，例如2-[(4-吡啶基)甲基]氨基-N-[3-甲氧基-5-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺或2-[(1-氧化-4-吡啶基)甲基]氨基-N-[3-三氟甲基苯基]苯甲酰胺；或WO00/09495、WO 00/59509、WO 98/11223、WO 00/27819和EP 0769947；M.Prewett等在Cancer Research59(1999)5209-5218中、F.Yuan等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93卷，14765-14770頁，1996年12月中、Z.Zhu等在Cancer Res.58，1998，3209-3214中和J.Mordenti等在ToxicologicPathology，27卷，第1期，14-21頁，1999中所述的那些；WO 00/37502和WO 94/10202；AngiostatinTM，如M.S.O’Reilly等，Cell 79，1994，315-328所述；EndostatinTM，如M.S.O’Reilly等，Cell 88，1997，277-285所述；鄰氨基苯甲酰胺類；ZD4190；ZD6474；SU5416；SU6668；或者抗-VEGF抗體或抗-VEGF受體抗體，例如RhuMab。
抗體表示完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少2種完整抗體構(gòu)成的多特異性抗體，和抗體片段，只要它們表現(xiàn)所需的生物活性即可。
靶向、降低或抑制表皮生長因子受體家族活性的化合物尤其是這樣的化合物、蛋白質(zhì)或抗體，它們抑制EGF受體酪氨酸激酶家族的成員，例如EGF受體、ErbB2、ErbB3和ErbB4，或者與EGF或EGF相關(guān)配體結(jié)合，或者它們對ErbB和VEGF受體激酶具有雙重抑制效果，特別是一般與具體公開在下列文獻中的那些化合物、蛋白質(zhì)或單克隆抗體WO 97/02266，例如實施例39化合物，或者EP 0564409、WO 99/03854、EP 0520722、EP 0566226、EP 0787722、EP 0837063、US 5,747,498、WO 98/10767、WO 97/30034、WO 97/49688、WO 97/38983，尤其是WO 96/30347(例如被稱為CP 358774的化合物)、WO 96/33980(例如化合物ZD 1839)和WO95/03283(例如化合物ZM105180)或PCT/EP02/08780；例如司徒曼布(HerpetinR)、cetuximab、Iressa、OSI-774、CI-1033、EKB-569、GW-2016、E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3或E7.6.3。
靶向、降低或抑制PDGFR活性的化合物尤其是抑制PDGF受體的化合物，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如伊馬替尼(imatinib)。
靶向、降低或抑制c-AbI家族成員和它們基因融合產(chǎn)物的化合物例如有N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如伊馬替尼；PD 180970；AG957或NSC680410。
靶向、降低或抑制蛋白激酶C、Raf、MEK、SRC、JAK、FAK和PDK家族成員或者PI(3)激酶或PI(3)激酶相關(guān)家族成員和/或細胞周期蛋白依賴性激酶家族(CDK)成員的活性的化合物尤其是公開在EP 0296110中的那些星形孢菌素衍生物，例如midostaurin；進一步的化合物實例例如包括UCN-01、safingol、BAY 43-9006、苔蘚蟲素1、Perifosine；Ilmofosine；RO 318220與RO 320432；GO 6976；Isis 3521；或者LY333531/LY379196。
進一步的抗血管生成化合物例如有沙利度胺(THALOMID)和TNP-470。
靶向、降低或抑制蛋白或脂質(zhì)磷酸酶活性的化合物例如有磷酸酶1、磷酸酶2A、PTEN或CDC25的抑制劑，例如岡田酸(okadaic acid)或其衍生物。
誘導(dǎo)細胞分化過程的化合物例如有視黃酸、α-、β-或γ-生育酚或α-、β-或γ-生育三烯酚。
本文所用的術(shù)語環(huán)加氧酶抑制劑包括但不限于例如塞來昔布(CelebrexR)、洛芬昔布(VioxxR)、依托考昔(etoricoxib)、伐地考昔(valdecoxib)或者5-烷基-2-芳基氨基苯基乙酸，例如5-甲基-2-(2′-氯-6′-氟苯胺基)苯基乙酸。
本文所用的術(shù)語“組蛋白脫乙酰酶抑制劑”包括但不限于MS-27-275、SAHA、pyroxamide、FR-901228或丙戊酸。
本文所用的術(shù)語“雙膦酸類”包括但不限于伊曲膦酸、氯膦酸、替魯膦酸、帕米膦酸、阿侖膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸和唑來膦酸。
本文所用的術(shù)語“基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑”包括但不限于膠原擬肽(peptidomimetics)與非擬肽抑制劑、四環(huán)素衍生物，例如異羥肟酸擬肽抑制劑巴馬司他及其口服生物可利用的類似物馬馬司他、prinomastat、BMS-279251、BAY 12-9566、TAA211或AAJ996。
本文所用的術(shù)語“mTOR抑制劑”包括但不限于雷帕霉素(西羅莫司)或其衍生物，例如32-脫氧雷帕霉素、16-戊-2-炔氧基-32-脫氧雷帕霉素、16-戊-2-炔氧基-32(S)-二氫雷帕霉素、16-戊-2-炔氧基-32(S)-二氫-40-O-(2-羥乙基)雷帕霉素和更優(yōu)選的40-O-(2-羥乙基)雷帕霉素。雷帕霉素衍生物的進一步實例例如包括CCI779或40-[3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基丙酸酯(propanoate)]雷帕霉素或其藥學上可接受的鹽，如USP 5,362,718中所公開；ABT578或40-(四唑基)雷帕霉素，特別是40-表-(四唑基)雷帕霉素，例如公開在WO 99/15530中；或者雷帕霉素類似物(rapalog)，例如公開在WO 98/02441和WO 01/14387中，例如AP 23573。
若式I化合物與其他免疫抑制性/免疫調(diào)控性、抗炎或化學治療療法聯(lián)合施用，則共同施用的免疫抑制性、免疫調(diào)控性、抗炎或化學治療化合物的劑量當然將依賴于所采用的共同藥物類型(例如它是類固醇還是鈣調(diào)磷酸酶抑制劑)、所采用的具體藥物、所治療的病癥等而各不相同。
按照上述，本發(fā)明在更進一步的方面提供5.如上所定義的方法，包括共同施用、例如同時或相繼施用治療有效無毒量的式I化合物與至少一種第二藥物物質(zhì)，例如免疫抑制性、免疫調(diào)控性、抗炎或化學治療藥，例如如上所示。
6.藥物組合，例如藥盒，包含a)第一活性劑，它是如本文所公開的游離形式或藥學上可接受的鹽形式的式I化合物，和b)至少一種活性助劑，例如免疫抑制性、免疫調(diào)控性、抗炎或化學治療藥，例如如上所公開。該藥盒可以包含其使用說明書。
本文所用的術(shù)語“共同施用”或“聯(lián)合施用”等表示涵蓋所選擇的治療劑對單一患者的施用，應(yīng)包括這樣的治療方案，其中各活性劑不必借助相同施用途徑或者在相同時間施用。
本文所用的術(shù)語“藥物組合”表示這樣一種產(chǎn)品，它由混合或合并一種以上活性成分而得到，包括活性成分的固定與非固定組合。術(shù)語“固定組合”意味著活性成分、例如式I化合物和活性助劑都是以單一實體或劑量形式同時對患者施用。術(shù)語“非固定組合”意味著活性成分、例如式I化合物和活性助劑都是作為獨立實體同時、并行或相繼對患者施用，沒有特定的時間限制，其中這類施用在患者體內(nèi)提供治療有效水平的2種化合物。后者也適用于雞尾酒療法，例如施用3種或3種以上活性成分。
制備本發(fā)明化合物的方法本發(fā)明也包括制備本發(fā)明免疫調(diào)控性化合物的方法。在所述反應(yīng)中，若反應(yīng)性官能團是終產(chǎn)物中所需的，可能有必要進行保護，例如羥基、氨基、亞氨基、硫代基或羧基，以避免它們不可取地參與反應(yīng)?？梢园凑諛藴蕦嵺`使用常規(guī)保護基團，例如參見T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“有機化學中的保護基”，John Wiley和Sons，1991。
式I化合物可以如下列反應(yīng)流程進行制備 其中n、x、R1、R2、R3、R4和R5如上式I所定義。式I化合物可按如下順序制備將式2化合物用適合的酸(例如TFA等)處理，在適合的胺存在下(例如DIEA等)與丙烯酸叔丁酯反應(yīng)，再用適合的酸(例如TFA等)除去叔丁基保護基團。反應(yīng)在約0至約120℃的溫度下進行，可能歷時達約24小時完成。
制備本發(fā)明化合物的另外方法通過使化合物的游離堿形式與藥學上可接受的無機或有機酸反應(yīng)，可以將本發(fā)明化合物制成藥學上可接受的酸加成鹽。作為替代選擇，本發(fā)明化合物的藥學上可接受的堿加成鹽可以通過使化合物的游離酸形式與藥學上可接受的無機或有機堿反應(yīng)而制備。作為替代選擇，可以使用原料或中間體的鹽制備本發(fā)明化合物的鹽形式。
本發(fā)明化合物的游離酸或游離堿形式可以分別從對應(yīng)的堿加成鹽或酸加成鹽形式制備。例如，通過用適合的堿(例如氫氧化銨溶液、氫氧化鈉等)處理，可以將酸加成鹽形式的本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的游離堿。通過用適合的酸(例如鹽酸等)處理，可以將堿加成鹽形式的本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的游離酸。
未氧化形式的本發(fā)明化合物可以由本發(fā)明化合物的N-氧化物通過用還原劑(例如硫、二氧化硫、三苯膦、硼氫化鋰、硼氫化鈉、三氯化磷、三溴化磷等)在適合的惰性有機溶劑(例如乙腈、乙醇、含水二噁烷等)中在0至80℃下處理而制備。
本發(fā)明化合物的前體藥物衍生物可以借助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法制備(例如關(guān)于進一步的細節(jié)，參見Saulnier等，(1994)，Bioorganic andMedicinal Chemistry Letters，第4卷，p.1985)。例如，適當?shù)那绑w藥物可以通過使本發(fā)明的非衍生化合物與適合的氨甲?；噭?例如1，1-酰氧基烷基碳酰氯(carbanochloridate)、對-硝基苯基碳酸酯等)反應(yīng)而制備。
本發(fā)明化合物的被保護衍生物可以借助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的手段制備?？捎糜趧?chuàng)建保護基團及其除去的技術(shù)的詳細說明可以參見T W.Greene，“有機化學中的保護基”，第3版，John Wiley和Sons，Inc.，1999。
本發(fā)明化合物可以適宜地在本發(fā)明方法期間被制成或生成溶劑合物(例如水合物)。本發(fā)明化合物的水合物可以適宜地通過使用有機溶劑如二氧芑、四氫呋喃或甲醇從水/有機溶劑混合物中重結(jié)晶而制備。
通過使化合物的外消旋混合物與旋光活性拆分劑反應(yīng)，生成一對非對映異構(gòu)化合物，分離非對映體，回收光學純的對映體，可以將本發(fā)明化合物制成它們的個別立體異構(gòu)體。盡管對映體的拆分可以使用本發(fā)明化合物的共價非對映體衍生物進行，不過可離解的配合物是優(yōu)選的(例如結(jié)晶性非對映體鹽)。非對映體具有不同的物理性質(zhì)(例如熔點、沸點、溶解度、反應(yīng)性等)，可以利用這些相異性容易地分離。非對映體可以借助色譜法分離，或者優(yōu)選借助基于溶解度差異的分離/拆分技術(shù)分離。然后借助任意不會導(dǎo)致外消旋化的實用手段回收光學純的對映體以及拆分劑?？捎糜趶钠渫庀旌衔锊鸱只衔锪Ⅲw異構(gòu)體的技術(shù)的更詳細說明可以參見JeanJacques，Andre Collet，Samuel H.Wilen，“對映體、外消旋物及拆分”，John Wiley和Sons，Inc.，1981。
總之，式I化合物可以借助這樣一種方法制備，它牽涉(a)上述反應(yīng)流程；和(b)可選地將本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為藥學上可接受的鹽；(c)可選地將本發(fā)明化合物的鹽形式轉(zhuǎn)化為非鹽形式；(d)可選地將本發(fā)明化合物的未氧化形式轉(zhuǎn)化為藥學上可接受的N-氧化物；(e)可選地將本發(fā)明化合物的N-氧化物形式轉(zhuǎn)化為其未氧化形式；(f)可選地從異構(gòu)體混合物拆分本發(fā)明化合物的個別異構(gòu)體；(g)可選地將非衍生化的本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為藥學上可接受的前體藥物衍生物；和(h)可選地將本發(fā)明化合物的前體藥物衍生物轉(zhuǎn)化為其非衍生化形式。
在沒有確切描述原料制備的情形中，這些化合物是已知的或者可以類似于本領(lǐng)域已知的方法或如下文實施例所公開加以制備。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會到，上述轉(zhuǎn)化作用僅僅是本發(fā)明化合物制備方法的代表，可以類似地采用其他熟知的方法。
實施例下列實施例提供制備代表性化合物的詳細說明，供闡述但不限制本發(fā)明。
實施例13-{6-[3-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，2，4]噁二唑-5-基]-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基}-丙酸的合成
向3，4-二氫-1H-異喹啉-2，6-二羧酸2-叔丁基酯(96mg，0.348mmol)的甲苯(4mL)懸液加入SOCl2(254μL，10eq.)。將混合物加熱至回流達3小時。在減壓下除去全部溶劑。將殘余物重新溶于甲苯，蒸發(fā)至干兩次，以除去過量HCl，在高真空下干燥2小時，得到粗制6-氯羰基-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-羧酸叔丁基酯。
在單獨的燒瓶中裝入N-羥基-2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-甲脒(82mg，0.29mmol)、DIEA(242μL，4eq.)和CH2Cl2(5mL)。利用冰-鹽浴將混合物冷卻至0℃。將來自前步的氯化物溶于CH2Cl2(2mL)，緩慢加入。加入后，使所得混合物升溫至室溫，攪拌2小時。蒸發(fā)全部溶劑，混合物經(jīng)過柱色譜純化(硅膠，EtOAc/己烷梯度)，得到120mg所需產(chǎn)物。在微波小瓶中將產(chǎn)物溶于THF(2mL)，與TBAF(444μL，2eq.)混合。利用微波照射將混合物加熱至100℃達15分鐘。蒸發(fā)全部溶劑，殘余物經(jīng)過柱色譜純化(硅膠，EtOAc/己烷梯度)，得到70mg 6-[3-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，2，4]噁二唑-5-基]-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-羧酸叔丁基酯。
向6-[3-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，2，4]噁二唑-5-基]-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-羧酸叔丁基酯(68mg，0.13mmol)的CH2Cl2(1mL)溶液加入TFA(2mL)。將混合物在室溫下攪拌30分鐘。在減壓下除去全部溶劑。將混合物溶于CH3OH(1.5mL)。然后加入DIEA(119μL，10eq.)和丙烯酸叔丁酯(38μL，2eq.)。利用微波照射將混合物加熱至90℃達20分鐘。蒸發(fā)全部溶劑，粗產(chǎn)物3-{6-[3-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，2，4]噁二唑-5-基]-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基}-丙酸叔丁基酯無需進一步純化即用于下一步。
向粗制3-{6-[3-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，2，4]噁二唑-5-基]-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基}-丙酸叔丁基酯的CH2Cl2(1mL)溶液加入TFA(1mL)。將混合物在室溫下攪拌1小時。蒸發(fā)全部溶劑，混合物經(jīng)過反相制備型LC/MS純化，得到3-{6-[3-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，2，4]噁二唑-5-基]-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基}-丙酸1H NMR(DMSO，400MHz)δ8.52(s，1H)，8.38(d，1H)，8.15(s，1H)，8.10(d，1H)，7.68(d，1H)，7.50(m，4H)，7.38(m，2H)，3.20-3.50(m，8H)，2.92(t，2H)，MS(ES+)(494.10，M+1)+。
實施例23-[6-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸的合成 向6-羥甲基-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-羧酸叔丁基酯(85mg，0.323mmol)的CH2Cl2(1.5mL)溶液加入4-氯-3-三氟甲基-苯酚(76mg，1.23eq.)的CH2Cl2(0.5mL)溶液、PPh3(127mg，1.5eq.)和1，1’-(偶氮二羰基)-二哌啶(122mg，1.5eq.)。將混合物在室溫下攪拌過夜。在減壓下除去全部溶劑，混合物經(jīng)過柱色譜純化(硅膠，EtOAc/己烷梯度)，得到70mg 6-(4-氯-3-三氟甲基-苯氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-羧酸叔丁基酯。
向6-(4-氯-3-三氟甲基-苯氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-羧酸叔丁基酯(70mg，0.158mmol)的CH2Cl2(1mL)溶液加入TFA(1mL)。將混合物在室溫下攪拌30分鐘。在減壓下除去全部溶劑。將混合物溶于CH3OH(1.5mL)。然后加入DIEA(269μL，10eq.)和丙烯酸叔丁酯(46μL，2eq.)。利用微波照射將混合物加熱至90℃達20分鐘。蒸發(fā)全部溶劑，混合物經(jīng)過柱色譜純化(硅膠，EtOAc/己烷梯度)，得到56mg 3-[6-(4-氯-3-三氟甲基-苯氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸叔丁基酯。
向微波小瓶裝入3-[6-(4-氯-3-三氟甲基-苯氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸叔丁基酯(56mg，0.119mmol)、苯基代硼酸(17mg，1.2eq.)、Pd(OAc)2(1.3mg，5mol％)、(二環(huán)己膦基)聯(lián)苯(4.2mg，10mol％)、KF(21mg，3eq.)和THF(0.25mL)。利用微波照射將所得混合物加熱至120℃達20分鐘。使混合物通過硅藻土過濾。硅藻土用EtOAc洗滌若干次。然后濃縮濾液，得到暗色的油。混合物經(jīng)過柱色譜純化(硅膠，EtOAc/己烷梯度)，得到3-[6-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸叔丁基酯。
向3-[6-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸叔丁基酯(35mg，0.068mmol)的CH2Cl2(1mL)溶液加入TFA(1mL)。將混合物在室溫下攪拌1小時。蒸發(fā)全部溶劑?；旌衔锝?jīng)過反相制備型LC/MS純化，得到3-[6-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸1H NMR(CD3OD，400MHz)δ7.45(m，2H)，7.38-7.41(m，3H)，7.35(s，1H)，7.16-7.23(m，5H)，4.85(s，2H)，4.54(s，2H)，3.68(m，2H)，3.60(t，2H)，3.27(t，2H)，2.96(t，2H)，MS(ES+)(456.20，M+1)+。
重復(fù)上述實施例所述工藝，使用適當?shù)脑?，得到下列式I化合物，如表1所鑒定。
表1
實施例3式I化合物表現(xiàn)生物活性
A.體外GPCR活化測定法測量GTP[γ-35S]與從表達人EDG受體的CHO細胞制備的膜的結(jié)合EDG-1(S1P1)GTP[γ-35S]結(jié)合測定法從穩(wěn)定表達N-末端c-myc標記人EDG-1的CHO細胞克隆體制備均質(zhì)化膜。使細胞懸浮生長在兩只850cm2轉(zhuǎn)瓶中達三或四天，然后收集。將細胞離心下來，用冷PBS洗滌一次，重新懸浮于≤20mL緩沖液A(20mM HEPES pH 7.4，10mM EDTA，無EDTA完全蛋白酶抑制劑合劑[1片/25mL])。利用Polytron均質(zhì)化器在30000rpm下將細胞懸液在冰上均質(zhì)化，間隔三次，每次15秒。先在桌面上在2000rpm下將均質(zhì)化物低速離心10分鐘。通過細胞濾器后，在4℃下將上清液在50,000xg下重新離心25分鐘。將沉淀重新懸浮于緩沖液B(15％甘油、20mM HEPES pH 7.4、0.1mM EDTA、無EDTA完全蛋白酶抑制劑合劑[1片/10mL])。利用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce)測定制備物的蛋白質(zhì)濃度，使用BSA作為標準。將膜分成等分試樣，在-80℃下冷凍保存。
在DMSO中制備供試化合物的溶液，濃度從10mM到0.01nM。將S1P稀釋在4％BSA溶液中作為陽性對照。將所需量的膜制備物用冰冷的測定緩沖液稀釋(20mM HEPES pH7.4、100mM NaCl、10mM MgCl2、0.1％無脂肪酸BSA、5μM GDP)，充分渦旋。將2μl或更少的化合物分配到圓底96孔聚苯乙烯測定平板的每一孔中，繼之以加入100μl經(jīng)稀釋的膜(3-10μg/孔)，保存在冰上，直至加入熱的GTPγS。將[35S]-GTPγS用冷測定緩沖液按1∶1000(v/v)稀釋，向每孔加入100μl。反應(yīng)在室溫下進行90分鐘，然后利用Packard Filtermate收集器將膜收集到Perkin-Elmer UnifilterGF/B-96過濾平板上。用洗滌緩沖液(20mM HEPES pH7.4、100mM NaCl、10mM MgCl2)洗滌若干次后，用95％乙醇沖洗，將濾器在37℃烘箱中干燥30分鐘。加入MicroScint-20，將平板密封，供TopCount閃爍計數(shù)。將GTP[γ-35S]結(jié)合曲線(原始數(shù)據(jù))用GraphPad Prism的劑量響應(yīng)曲線適配工具進行適配，得到EC50值。使用六種或十二種不同的濃度生成濃度響應(yīng)曲線(每一濃度使用三個數(shù)據(jù)點)。
使用來自穩(wěn)定表達c-末端c-myc標記或未標記的受體的CHO細胞的膜，按照與EDG-1GTP[γ-35S]結(jié)合測定法相當?shù)姆绞竭M行EDG-3、-5、-6與-8 GTP[γ-35S]結(jié)合測定法。就每種膜制備物而言，先用S1P對照進行滴定實驗，以確定向每一測定孔加入膜的最佳量。按照上述測定法測試本發(fā)明化合物，觀察到表現(xiàn)EDG-1受體選擇性。例如，3-[6-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐氧基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸(化合物9)在上述測定法中具有0.2nM的EC50，與一種或多種其他受體、包括EDG-3、EDG-5、EDG-6和EDG-8相比，對EDG-1的選擇性為至少1000倍。
B.體外FLIPR鈣流測定法利用FLIPR鈣流測定法測試本發(fā)明化合物對EDG-1、EDG-3、EDG-5和EDG-6的激動劑活性。簡而言之，將表達EDG受體的CHO細胞供養(yǎng)在F-12K培養(yǎng)基中(ATCC)，其中含有5％FBS和500μg/mL G418。在測定之前，在384黑色透明底平板中將細胞平板接種在含有1％FBS的F-12K培養(yǎng)基中，密度為10,000細胞/孔/25μL。第二天，將細胞用洗滌緩沖液洗滌三次(每次25μL)。向每孔加入約25μL染劑，在37℃和5％CO2下培育1小時。然后將細胞用洗滌緩沖液洗滌四次(每次25μL)。向每孔細胞加入25μL SEQ2871溶液后，測定鈣流。利用表達每種不同EDG受體的細胞進行相同的測定。經(jīng)3分鐘間隔記錄FLIPR鈣流測定法中的滴定值，并量化為相對于EDG-1活化的最大峰高百分比響應(yīng)。
C.體內(nèi)測量血液淋巴細胞衰竭和評估心臟效應(yīng)的篩選測定法循環(huán)淋巴細胞的測量將化合物溶于DMSO，稀釋得到最終濃度為4％DMSO(v/v，最終濃度)，然后進一步稀釋在恒定體積的吐溫80 25％/H2Ov/v中。分別包括吐溫8025％/H2O(200μL)、4％DMSO和FTY 720(10μg)作為陰性和陽性對照。在短時異氟烷麻醉下，借助管飼法向小鼠(C57bl/6雄性，6-10周齡)口服施用250-300μL化合物溶液。
在短時異氟烷麻醉下，在施用藥物后6和24小時從眼眶后竇收集血液。對全血樣品進行血液學分析。利用自動化分析儀測定外周淋巴細胞數(shù)。利用與熒光染料綴合的特異性抗體染色外周血液淋巴細胞亞群，利用熒光活化細胞分類器(Facscalibur)分析。每種所篩選的化合物使用兩只小鼠評估淋巴細胞衰竭活性。結(jié)果為ED50，它被定義為顯示50％血液淋巴細胞衰竭所需的有效劑量。按照上述測定法測試本發(fā)明化合物，優(yōu)選地發(fā)現(xiàn)ED50小于1mg/kg，更優(yōu)選ED50小于0.5mg/kg。例如，3-[6-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐氧基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸(化合物9)表現(xiàn)0.2mg/kg的ED50。
心臟效應(yīng)的評估利用AnonyMOUSE ECG篩選系統(tǒng)監(jiān)測化合物對心功能的影響。在化合物施用前后記錄有意識小鼠(C57bl/6雄性、6-10周齡)的心電圖。然后用e-MOUSE軟件加工和分析ECG信號。將進一步稀釋在200μL水、15％DMSO中的90μg化合物IP注射。每種化合物使用四只小鼠評估心臟效應(yīng)。
D體內(nèi)抗血管生成活性將含有(i)鞘氨醇-1-磷酸(5μM/室)或(ii)含人VEGF(1μg/室)的0.5mL0.8％w/v瓊脂(含有肝素20U/mL)的多孔室皮下植入在小鼠脅腹中。S1P或VEGF誘導(dǎo)多孔室周圍的血管化組織的生長。這種響應(yīng)是劑量依賴性的，通過測量組織的重量和血液含量可以量化。每天一次用式I化合物口服或靜脈內(nèi)處理小鼠，開始于植入多孔室之前4-6小時，持續(xù)4天。處死動物，在最后一次劑量后24小時測量血管化組織。測定多孔室周圍血管化組織的重量和血液含量。與用載體單獨處理的動物相比，用式I化合物處理的動物顯示血管化組織的重量和/或血液含量減少。當以約0.3至約3mg/kg的劑量施用時，式I化合物是抗血管生成的。
E體外抗腫瘤活性使用最初從乳腺癌分離的小鼠乳腺癌細胞系，例如JygMC(A)。在操作之前，將細胞數(shù)調(diào)節(jié)至5×105，供平板接種在新鮮培養(yǎng)基中。將細胞用含有2.5mM胸苷而無FCS的新鮮培養(yǎng)基培育12小時，然后用PBS洗滌兩次，繼之以加入含有10％FCS的新鮮培養(yǎng)基，另外培育另外12小時。然后，將細胞用含有2.5mM胸苷而無FCS的新鮮培養(yǎng)基培育12小時。為了從封閉中釋放細胞，將細胞用PBS洗滌兩次，重新平板接種在含有10％FCS的新鮮培養(yǎng)基中。同步化后，將細胞與或不與各種濃度的式I化合物培育3、6、9、12、18或24小時。用0.2％EDTA處理后收集細胞，用冰冷的70％乙醇溶液固定，在37℃下用250μg/mL RNA酶A(1-A型Sigma Chem.Co.)水解30分鐘，用10mg/mL碘化丙錠染色20分鐘。培育階段后，借助在Coulter計數(shù)器中計數(shù)并借助SRB比色測定法測定細胞數(shù)。在這些條件下，式I化合物在10-12至10-6M的濃度下抑制腫瘤細胞的增殖。。
將被理解的是，本文所述實施例和實施方式僅供說明目的，據(jù)此各種修改或變化將對本領(lǐng)域技術(shù)人員有所提示，包括在本申請的精神與理解范圍內(nèi)和所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文引用的全部出版物、專利和專利申請出于各種目的結(jié)合在此作為參考。
權(quán)利要求
1.式I化合物及其藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑合物、異構(gòu)體和前體藥物， 其中n是1、2或3；A選自-X1C(O)OR6、-X1OP(O)(OR6)2、-X1P(O)(OR6)2、-X1S(O)2OR6、-X1P(O)(R6)OR6和1H-四唑-5-基；其中X1選自鍵和C1-3亞烷基；每個R6獨立地選自氫和C1-6烷基；X是鍵或者選自C1-4亞烷基、-X1OX2-、-X1NR7X2-、-X1C(O)NR7X2-、-X1NR7C(O)X2-、-X1S(O)X2-、-X1S(O)2X2-、-X1SX2-和C2-9亞雜芳基；其中X1和X2獨立地選自鍵和C1-3亞烷基；R7選自氫和C1-6烷基；X的任意亞雜芳基可選地被選自鹵代和C1-6烷基的基團取代；Y選自C6-10芳基和C2-9雜芳基，其中Y的任意芳基或雜芳基可以可選地被1至3個基團取代，所述基團選自鹵代、羥基、氰基、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷基和鹵代C1-6烷氧基；R1選自C6-10芳基和C2-9雜芳基；其中R1的任意芳基或雜芳基可選地被選自以下的基團取代C6-10芳基C0-4烷基、C2-9雜芳基C0-4烷基、C3-8環(huán)烷基C0-4烷基、C3-8雜環(huán)烷基C0-4烷基或C1-6烷基；其中R1的任意芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基可以可選地被一至五個基團取代，所述基團選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷基和鹵代C1-6烷氧基；R1的任意烷基可以可選地具有被選自以下的原子或基團所代替的亞甲基-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR7-和-O-；其中R7選自氫或C1-6烷基；R2、R3、R4和R5獨立地選自氫、C1-6烷基、鹵代、羥基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷基和鹵代C1-6烷氧基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1是苯基、萘基、呋喃基或噻吩基，可選地被C6-10芳基C0-4烷基、C2-9雜芳基C0-4烷基、C3-8環(huán)烷基C0-4烷基、C3-8雜環(huán)烷基C0-4烷基或C1-6烷基取代；其中R1的任意芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基可以可選地被一至五個基團取代，所述基團選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷基和鹵代C1-6烷氧基；R1的任意烷基可以可選地具有被選自以下的原子或基團所代替的亞甲基-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR7-和-O-；其中R7是氫或C1-6烷基。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中Y選自苯基和苯并噁唑基；X是鍵或者選自-X1OX2-和C4-6亞雜芳基；其中X1和X2獨立地選自鍵和C1-3亞烷基；其中X的任意亞雜芳基可選地被選自鹵代和C1-6烷基的基團取代。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中R1選自 和 其中星號是R1與X的連接點；m選自1和2；R12選自氫、C6-10芳基C0-4烷基、C2-9雜芳基C0-4烷基、C3-8環(huán)烷基C0-4烷基、C3-8雜環(huán)烷基C0-4烷基或C1-6烷基；其中R12的任意芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基可以可選地被一至三個基團取代，所述基團選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷基和鹵代C1-6烷氧基；R12的任意烷基可以可選地具有被選自以下的原子或基團所代替的亞甲基-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR10-和-O-；其中R10是氫或C1-6烷基；R13選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷基和鹵代C1-6烷氧基。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中A是-(CH2)2C(O)OH；R2、R3、R4和R5是氫。
6.權(quán)利要求5的化合物，其中n是1或2；Y選自苯基和苯并噁唑基；X是鍵或者選自[1，2，4]噁二唑、-CH2O-、-OCH2-、異噁唑和[1，3，4]噁二唑。
7.權(quán)利要求6的化合物，其中R1選自 和 其中R12選自氫、苯基和環(huán)己基；其中R12的任意苯基或環(huán)己基可選地被甲基取代；R13選自三氟甲基、甲基和乙基。
8.權(quán)利要求7的化合物，選自3-{6-[3-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，2，4]噁二唑-5-基]-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基}-丙酸、3-[6-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸、3-{5-[5-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-異噁唑-3-基]-1，3-二氫-異吲哚-2-基}-丙酸、3-{5-[5-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-1，3-二氫-異吲哚-2-基}-丙酸、3-{5-[5-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，3，4]噁二唑-2-基]-1，3-二氫-異吲哚-2-基}-丙酸、3-[2-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-5，7-二氫-噁唑并[4，5-f]異吲哚-6-基]-丙酸、3-{7-[5-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基}-丙酸、3-{6-[5-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基}-丙酸、3-{6-[5-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)-[1，3，4]噁二唑-2-基]-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基}-丙酸、3-[6-(3-三氟甲基-芐基氧基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸、3-[6-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐基氧基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸、3-[6-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基甲氧基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸、3-[7-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐基氧基-)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸、3-[6-(4-環(huán)己基-3-甲基-苯氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸、3-[6-(4-環(huán)己基-3-乙基-苯氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸、3-[6-(2-乙基-聯(lián)苯-4-基氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸和3-[6-(2-乙基-3′-甲基-聯(lián)苯-4-基氧基甲基)-3，4-二氫-1H-異喹啉-2-基]-丙酸。
9.藥物組合物，包含治療有效量的權(quán)利要求1的化合物以及藥學上可接受的賦形劑。
10.治療動物疾病的方法，其中EDG/S1P受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變能夠預(yù)防、抑制或改善該疾病的病理學和/或癥狀學，該方法包括對該動物施用治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
11.在對象中預(yù)防或治療由淋巴細胞介導(dǎo)的障礙或疾病、預(yù)防或治療急性或慢性移植排斥或T-細胞介導(dǎo)的炎性或自體免疫疾病、抑制或控制血管生成失調(diào)或者預(yù)防或治療由新血管生成過程介導(dǎo)的或與血管生成失調(diào)有關(guān)的疾病的方法，包括對有需要的對象施用有效量的權(quán)利要求1的化合物或其藥學上可接受的鹽。
12.權(quán)利要求1的化合物在制備用于治療動物疾病的藥物中的用途，其中EDG/S1P受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變對該疾病的病理學和/或癥狀學起作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫抑制劑、它們的制備方法、它們的用途和含有它們的藥物組合物。本發(fā)明提供一類新穎的化合物，可用于治療或預(yù)防由淋巴細胞相互作用介導(dǎo)的疾病或障礙，特別是與EDG受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的疾病。
文檔編號A61K31/4725GK1816544SQ200480018860
公開日2006年8月9日 申請日期2004年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月19日
發(fā)明者潘世風, N·S·格雷, 范毅, W·高 申請人:Irm有限責任公司, 秘原