專利名稱：二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺－脂肪酸酰胺、含有該化合物的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺、含有該化合物的組合物或藥物。
背景技術(shù)：
流感是每年都在世界中流行的傳染病，盡管有疫苗，但是每年還是有很多人被傳染，為發(fā)燒、頭痛、筋關(guān)節(jié)痛等煩惱。另外，作為并發(fā)癥的流感腦炎·腦癥會導(dǎo)致最壞的情況死亡。盡管存在疫苗，但到目前為止流感病毒仍然成為人們恐懼的原因是由于流感病毒容易發(fā)生基因突變，抗原的形式發(fā)生變化，由疫苗在體內(nèi)增加的抗體不能識別那些變化的抗原，所以疫苗的效果降低。即使每年都在某種程度上預(yù)測什么樣的流感可能流行，問題是由于有時新型病毒突然發(fā)生，不能迅速供給相應(yīng)的疫苗。所以必須開發(fā)對于多種流感病毒都有效的特效藥。近年來，流感病毒的感染機制、在分子·基因水平上的闡明由于科學(xué)技術(shù)的飛躍進步能夠?qū)崿F(xiàn)，各種各樣的流感病毒感染抑制劑的合成正在研究中。
流感病毒的感染、增殖的機制如下所述。首先，病毒侵入生物體內(nèi)，當(dāng)接近宿主細胞時，病毒表層上的稱為血細胞凝集素的3聚體蛋白質(zhì)與宿主細胞上的受體唾液酸糖鏈特異結(jié)合。唾液酸糖鏈在末端含有唾液酸，主要是這個唾液酸參與與血細胞凝集素的結(jié)合。然后，病毒與宿主細胞的膜發(fā)生融合，病毒的RNA流入到宿主細胞內(nèi)，接下來病毒基因在宿主細胞內(nèi)被復(fù)制，出現(xiàn)子代病毒。然后病毒出芽到宿主細胞外，完成增殖。當(dāng)病毒出芽時，血細胞凝集素與唾液酸糖鏈再度結(jié)合，處于同一病毒表層上的稱為唾液酸酶的酶將唾液酸從唾液酸糖鏈上切下，可以進行出芽。
近年來，已經(jīng)制作了可以抑制在該病毒感染的最終階段發(fā)生的唾液酸酶反應(yīng)作用的新的治療藥。其為ザナミビル(商品名リレンザ、グラクソ·ウエルカム公司)和磷酸オセルタミビル(商品名タミフル、日本ロシエ公司)。然而，由于這兩個唾液酸酶抑制劑抑制感染的最終階段，所以當(dāng)病毒增殖達到高峰之后效果小，所以希望發(fā)病后48小時以內(nèi)給藥。由于這一原因，作為有效的治療藥，希望合成能夠抑制病毒結(jié)合到宿主細胞的最初階段的化合物。
在血細胞凝集素抑制劑的開發(fā)中，已知與單價性的唾液酸糖鏈衍生物相比，分子內(nèi)具有多個唾液酸糖鏈的多價性唾液酸糖鏈衍生物對流感病毒具有更高的抑制作用。這是由于對于病毒表面上存在的許多血細胞凝集素，與多個單價性唾液酸糖鏈衍生物結(jié)合相比，分子內(nèi)結(jié)合了多個唾液酸糖鏈衍生物的多價性分子結(jié)合一方可以增大配體與受體的親和力的緣故。
到現(xiàn)在為止，合成了很多預(yù)期具有這樣效果的多價性唾液酸糖鏈衍生物。蟹江等人合成了結(jié)合了唾液酸乳糖的苯乙烯聚合物(1)，并進行了與流感的結(jié)合的研究，與作為唾液酸糖鏈蛋白質(zhì)的胎球蛋白相比，具有1000倍的強抑制活性。
另外，Whitesides等人合成了結(jié)合了唾液酸衍生物的聚丙烯酰胺聚合物(2)，表明越是高分子聚合物抑制活性越高。
然而，作為高分子化合物的聚合物由于是具有各種各樣分子量的聚合物的混合物，結(jié)構(gòu)還沒有搞清楚。另外，如果該化合物內(nèi)含有具有60KDa以上分子量的分子，這些化合物由于分子量過大，在腎臟的馬耳皮基小體中不能通過腎小球囊，由于不能排出體外，所以殘存在體內(nèi)，使肝臟中的代謝平衡破壞，有對人體造成傷害的可能性。因此，即使實際上這樣的聚合物型的化合物是有效的流感感染抑制劑，由于安全性方面存在問題，F(xiàn)DA(The Food Drug Administration)也不承認。
本發(fā)明的目的在于提供新型的二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺、含有該化合物的組合物或藥物。
另外本發(fā)明的目的還在于提供具有優(yōu)異的病毒感染和/或增殖抑制作用的流感病毒感染病等病毒疾病的預(yù)防劑和/或治療劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺。
另外本發(fā)明涉及含有二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺的組合物或藥物。
另外本發(fā)明涉及含有二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺的藥物。
本發(fā)明的二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺是使二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺與脂肪酸反應(yīng)獲得的化合物。
二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺是如下所示的糖鏈天冬酰胺(3)
該二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺可以根據(jù)例如特愿2002-196821的參考例1合成。
在本發(fā)明中作為構(gòu)成脂肪酸酰胺的脂肪酸，可以列舉碳數(shù)6～32的脂肪族飽和或脂肪族不飽和脂肪酸以及并用2種以上這樣的脂肪酸。作為脂肪族飽和脂肪酸，可以列舉直鏈或支鏈的己酸(己酸、2-乙基丁酸等)、庚酸(庚酸等)、辛酸(辛酸、2-乙基己酸等)、壬酸(壬酸等)、癸酸(癸酸等)、十一烷酸(十一酸等)、十二烷酸(月桂酸、2-乙基癸酸等)、十三烷酸(十三酸等)、十四烷酸(肉豆蔻酸等)、十六烷酸(棕櫚酸等)、十八烷酸(硬脂酸等)、二十烷酸(花生酸等)、二十二烷酸(山萮酸等)、二十四烷酸(二十四酸等)等。
作為脂肪族不飽和脂肪酸，可以列舉直鏈或支鏈的辛烯酸、癸烯酸、十一碳烯酸(十一烯酸等)、十二碳烯酸、十八碳烯酸(油酸、反油酸等)、亞油酸以及亞麻酸等。這些脂肪酸中優(yōu)選碳數(shù)為8～24、更優(yōu)選碳數(shù)10～22的脂肪酸，特別優(yōu)選癸酸、十二碳酸、十四碳酸、十六碳酸、十八碳酸、二十碳酸、二十二碳酸以及十八碳烯酸，作為直鏈脂肪酸最優(yōu)選的是辛酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸和油酸。
二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺與脂肪酸的反應(yīng)優(yōu)選是在反應(yīng)活化劑存在下反應(yīng)。作為反應(yīng)活化劑，可以列舉例如N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基苯并三唑(HOBT)等。
二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺與脂肪酸的反應(yīng)比例，相對于1摩爾二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺優(yōu)選使用約0.1～10摩爾脂肪酸。反應(yīng)活化劑相對于1摩爾二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺優(yōu)選使用約0.1～10摩爾。反應(yīng)通常在0～80℃下進行，優(yōu)選10～60℃，通常在約10分鐘～5小時內(nèi)結(jié)束。
得到的二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺可以通過例如過濾、高效液相色譜(HPLC)等純化。這些化合物可以通過NMR、HPLC(ODS柱)中UV的檢測時間等進行鑒定。
本發(fā)明的二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺由于同時兼有二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺的親水基團和具有長碳鏈的脂肪酸的疏水基團，所以在水溶液中容易發(fā)生如圖1所表示的膠束化，可以得到低分子型，分子量、結(jié)構(gòu)明確的多價性糖鏈天冬酰胺衍生物。
如果如上所述利用單價性分子的膠束化，分子量沒有差異，化合物被控制在低分子，與聚合物相比可以比較簡單地合成。而通過膠束化，做成多價性，可以對例如流感病毒表現(xiàn)出極優(yōu)異的抑制活性。
本發(fā)明的藥物是作為有效成分含有上述二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺的藥物。另外本發(fā)明的藥物是作為有效成分含有二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺的藥物。
本發(fā)明的藥物是以含有上述有效成分和制劑用添加物(載體、賦形劑等)的藥物組合物的方式提供的。作為載體可以列舉乳糖、甘油等。作為賦形劑可以列舉乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等。藥物中有效成分的量約為0.01～95重量％、優(yōu)選約1～80重量％。
本發(fā)明的藥物給藥途徑?jīng)]有特別限定，無論是經(jīng)口給藥或非經(jīng)口給藥(例如肌肉內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、腹腔內(nèi)給藥、向鼻腔等的粘膜給藥、或吸入給藥等)哪一種方式都可以。本發(fā)明的藥物的形態(tài)沒有特別限定，作為用于經(jīng)口給藥的制劑，可以列舉例如片劑、膠囊、細粒劑、粉末劑、顆粒劑、液劑、糖漿等，作為用于非經(jīng)口給藥的制劑，可以列舉例如注射劑、點滴劑、坐劑、吸入劑、經(jīng)粘膜吸收劑、經(jīng)皮吸收劑、點鼻劑、點耳劑等。
本發(fā)明的藥物的形態(tài)、可使用的制劑用添加物、制劑的制造方法等本領(lǐng)域技術(shù)人員都可以適當(dāng)選擇。本發(fā)明的藥物給藥量可以在綜合考慮了患者的性別、年齡或體重、癥狀的重癥度、預(yù)防或治療的給藥目的、或有無其他并發(fā)癥等之后適當(dāng)選擇。給藥量一般是0.001μg/kg體重/日～1000μg/kg體重/日，優(yōu)選0.001μg/kg體重/日～100μg/kg體重/日。


圖1是表示二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺的膠束的圖。
圖2是表示實施例1～4的各個二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺的化學(xué)式的圖。
圖3是表示Dansyl-LacNAc的唾液酸化的反應(yīng)方式圖。
圖4是表示以各個抑制劑的唾液酸量作為基準(zhǔn)的唾液酸酶抑制活性的圖。
圖5是表示以各個抑制劑的摩爾濃度作為基準(zhǔn)的唾液酸酶抑制活性的圖。
具體實施例方式
以下舉出參考例、實施例、試驗例，對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明并不限定于這些例子。
1H-NMR用Bruker的AVANCE 400(表記為400MHz)進行測定。使用重溶劑時用溶劑峰作為基準(zhǔn)?；瘜W(xué)位移用δ(ppm)表示，結(jié)合常數(shù)用J(Hz)表示。作為反應(yīng)檢測用(以下表示為TLC)使用E.Merck公司生產(chǎn)DC-Platten Kiesegel 60 F254(Art 1，05715)。高效液相色譜(HPLC)柱使用ナカライテスク公司的COSMOSIL PACKED ODSCOLUMN(φ4.6×150mm)、昭和電工公司生產(chǎn)的Shodex C18-5B。分光熒光光度計使用JASCO公司生產(chǎn)的FP-210 Spectrofluorometer。
參考例1二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-1的合成使粗純化的SGP(唾液酸糖肽)(238.3mg，80.6μmol)和疊氮化鈉(4.77mg，80.8μmol)溶解于7.15ml Tris-鹽酸-氯化鈣緩沖液(TRIZUMA BASE 0.05mol/l，氯化鈣0.01mol/l，pH＝7.5)。然后向該溶液中加肌動蛋白酶(アクチナ一ゼ)-E(53.8mg)，于37℃下使其反應(yīng)。165小時后，用TLC確認反應(yīng)結(jié)束后，進行過濾，將濾液冷凍干燥。冷凍干燥后，將殘留物用凝膠過濾柱色譜(sephadex G-25φ2.5cm×100cm)進行純化，得到目的物天冬酰胺二唾液酸十一糖1(收量100.5mg，收率53％)。
1H-NMR(400MHz，D2O)δ5.22(1H，s，Man 4-H1)，5.16(1H，d，J＝9.6Hz，Glc NAc-H1)，5.04(1H，s，Man 4’-H1)，4.86(1H，s，Man 3-H1)，4.70-4.68(3H，m，Glc NAc2-H1Glc NAc 5，5’-H1)，4.53(2H，d，J＝6.7Hz，Gal 6，6’-H1)，4.34(1H，b d，Man 3-H2)，4.28(1H，b d，Man 4’-H2)，4.20(1H，b d，Man 4-H2)，3.03(2H，dd，J＝4.2Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.95(2H，dd，J＝6.9Hz，17.1Hz，Asn-βCH)，2.76(2H，dd，J＝4.6H2，12.4Hz，NeuAc 7，7’-H3eq)，2.14(18H，s×6，-Ac)，1.80(2H，dd，J＝12.2Hz，12.1Hz，NeuAc 7，7’-H3ax)實施例1二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-癸酸酰胺3的合成將癸酸(22mg，127.6μmol)溶解于1ml二甲基甲酰胺中，然后加入二環(huán)己基碳二亞胺(23.9mg，115.8μmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(13.4mg，116.4μmol)，于室溫下反應(yīng)。6小時后進行過濾，對濾液進行濃縮，取出殘留物(癸酸琥珀酰亞胺體)。然后，將天冬酰胺二唾液酸十一糖1(10.0mg，4.27μmol)溶解于0.8ml水中，然后加入碳酸氫鈉(1.4mg，16.7μmol)。再加入溶于1.2ml丙酮的癸酸琥珀酰亞胺體(3.2mg，11.8μmol)，于室溫下進行攪拌。180分鐘后通過TLC確認原料消失后，對溶液進行冷凍干燥。冷凍干燥后，將殘留物用凝膠過濾柱色譜(sephadex G-25 φ1.0cm×20cm)進行純化，進行冷凍干燥。冷凍干燥后，用高效液相色譜(ODS柱φ4.6×150mm，洗脫溶劑為60分鐘內(nèi)水100％→乙腈100％的梯度，流速1.0ml/min)進行純化，得到目的物癸酸-天冬酰胺二唾液酸十一糖3(收量7.7mg，收率72％)。
1H-NMR(400MHz，D2O)δ5.23(1H，s，Man 4-H1)，5.12(1H，d，J＝9.6Hz，Glc NAc-H1)，5.04(1H，s，Man 4’-H1)，4.87(1H，s，Man 3-H1)，4.71-4.69(3H，m，Glc NAc 2-H1Glc NAc 5，5’-H1)，4.59(1H，dd，J＝4.5Hz，8.0Hz，Asn-αCH)，4.53(2H，d，J＝7.9Hz，Gal 6，6’-H1)，4.34(1H，b d，Man 3-H2)，4.29(1H，b d，Man 4’-H2)，4.21(1H，b d，Man 4-H2)，2.88(2H，dd，J＝4.4Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.78-2.70(3H，m，Neu Ac 7，7’-H3eq，Asn-βCH)，2.34(2H，t，J＝7.4Hz，COCH2)，2.14(18H，s×6，-Ac)，1.80(2H，dd，J＝12.2Hz，12.0Hz，NeuAc 7，7’-H3ax)，1.71-1.60(2H，m，CH2)，1.42-1.30(12H，m，CH2)，0.95(3H，t，J＝6.5Hz，CH3)實施例2二唾液酸十一天冬酰胺-肉豆蔻酸酰胺4的合成將肉豆蔻酸(22.0mg，96.3μmol)溶解于1ml二甲基甲酰胺中，然后加入二環(huán)己基碳二亞胺(18.2mg，88.2μmol)和N-羥基苯并三唑(11.9mg，96.7μmol)，于室溫下反應(yīng)。6小時后進行過濾，對濾液進行濃縮，取出殘留物(肉豆蔻酸苯并三唑體)。然后，將天冬酰胺二唾液酸十一糖1(6mg，2.57μmol)溶解于0.8ml水中，然后加入碳酸氫鈉(0.86mg，10.3μmol)。再加入溶于1.2ml丙酮的肉豆蔻酸苯并三唑體(2.8mg，7.70μmol)，于室溫下進行攪拌。180分鐘后通過TLC確認原料消失后，對溶液進行冷凍干燥。冷凍干燥后，將殘留物用凝膠過濾柱色譜(sephadex G-25 φ1.0cm×20cm)進行純化，進行冷凍干燥。冷凍干燥后，用高效液相色譜(ODS柱φ4.6×150mm，洗脫溶劑為60分鐘內(nèi)水100％→乙腈100％的梯度，流速1.0ml/min)進行純化，得到目的物肉豆蔻酸-天冬酰胺二唾液酸十一糖4(收量5.3mg，收率81％)。
1H-NMR(400MHz，D2O)δ5.23(1H，s，Man 4-H1)，5.12(1H，d，J＝9.6Hz，Glc NAc-H1)，5.04(1H，s，Man 4’-H1)，4.87(1H，s，Man 3-H1)，4.70-4.69(3H，m，Glc NAc 2-H1Glc NAc 5，5’-H1)，4.59(1H，dd，J＝4.6Hz，8.1Hz，Asn-αCH)，4.54(2H，d，J＝7.8Hz，Gal 6，6’-H1)，4.34(1H，b d，Man 3-H2)，4.29(1H，b d，Man 4’-H2)，4.20(1H，b d，Man 4-H2)，2.88(2H，dd，J＝4.6Hz，15.6Hz，Asn-βCH)，2.83-2.70(3H，m，Neu Ac 7，7’-H3eq，Asn-βCH)，2.34(2H，t，J＝7.4Hz，COCH2)，2.14(18H，s×6，-Ac)，1.80(2H，dd，J＝12.1Hz，12.1Hz，NeuAc 7，7’-H3ax)，1.71-1.60(2H，m，CH2)，1.42-1.30(20H，m，CH2)，0.95(3H，t，J＝6.5Hz，CH3)實施例3二唾液酸十-天冬酰胺-硬脂酸酰胺5的合成將硬脂酸(22.0mg，77.3μmol)溶解于1ml二甲基甲酰胺中，然后加入二環(huán)己基碳二亞胺(14.4mg，69.8μmol)和N-羥基苯并三唑(9.5mg，77.2μmol)，于室溫下反應(yīng)。6小時后進行過濾，對濾液進行濃縮，取出殘留物(硬脂酸苯并三唑體)。然后，將天冬酰胺二唾液酸十一糖1(8.0mg，3.36μmol)溶解于1.2ml水中，然后加入碳酸氫鈉(3.2mg，38.1μmol)。再加入溶于1.8ml丙酮的硬脂酸苯并三唑體(8.8mg，20.2μmol)，于37℃下進行攪拌。195分鐘后通過TLC確認反應(yīng)結(jié)束后，對溶液進行冷凍干燥。冷凍干燥后，將殘留物用凝膠過濾柱色譜(sephadex G-25 φ1.0cm×20cm)進行純化，進行冷凍干燥。冷凍干燥后，用高效液相色譜(ODS柱φ4.6×150mm，洗脫溶劑為60分鐘內(nèi)水100％→乙腈100％的梯度，流速1.0ml/min)進行純化，得到目的物硬脂酸-天冬酰胺二唾液酸十一糖5(收量6.2mg，收率69％)。
1H-NMR(400MHz，D2O)δ5.23(1H，s，Man 4-H1)，5.12(1H，d，J＝9.5Hz，Glc NAc-H1)，5.04(1H，s，Man 4’-H1)，4.86(1H，s，Man 3-H1)，4.71-4.69(3H，m，Glc NAc 2-H1Glc NAc 5，5’-H1)，4.59(1H，dd，J＝4.6Hz，8.2Hz，Asn-αCH)，4.54(2H，d，J＝7.8Hz，Gal 6，6’-H1)，4.34(1H，b d，Man 3-H2)，4.29(1H，b d，Man 4-H2)，4.20(1H，b d，Man 4-H2)，2.88(2H，dd，J＝4.7Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.78-2.70(3H，m，Neu Ac 7，7’-H3eq，Asn-βCH)，2.34(2H，t，J＝7.3Hz，COCH2)，2.16(18H，s×6，-Ac)，1.80(2H，dd，J＝12.1Hz，12.1Hz，NeuAc 7，7’-H3ax)，1.71-1.60(2H，m，CH2)，1.42-1.30(28H，m，CH2)，0.96(3H，t，J＝6.7Hz，CH3)實施例4二唾液酸十一天冬酰胺山萮酸酰胺6的合成將山萮酸(20.0mg，58.7μmol)溶解于3ml二甲基甲酰胺中，然后加入二環(huán)己基碳二亞胺(10.3mg，50.0μmol)和N-羥基苯并三唑(6.8mg，50.3μmol)，于室溫下反應(yīng)。19小時后進行過濾，對濾液進行濃縮，取出殘留物(山萮酸苯并三唑體)。然后，將天冬酰胺二唾液酸十一糖1(5mg，2.1μmol)溶解于1.2ml水中，然后加入碳酸氫鈉(2.0mg，21.0μmol)。再加入溶于1.8ml丙酮的山萮酸苯并三唑體(8.8mg，18.9μmol)，于37℃下進行攪拌。20小時后通過TLC確認反應(yīng)結(jié)束后，對溶液進行冷凍干燥。冷凍干燥后，將殘留物用凝膠過濾柱色譜(sephadex G-25 φ1.0cm×20cm)進行純化，進行冷凍干燥。冷凍干燥后，用高效液相色譜(ODS柱φ4.6×150mm，洗脫溶劑為60分鐘內(nèi)水100％→乙腈100％的梯度，流速1.0ml/min)進行純化，得到目的物山萮酸-天冬酰胺二唾液酸十一糖6(收量3.24mg，收率57％)。
1H-NMR(400MHz，D2O)(δ5.23(1H，s，Man 4-H1)，5.12(1H，d，J＝9.2Hz，Glc NAc-H1)，5.04(1H，s，Man 4’-H1)，4.86(1H，s，Man 3-H1)，4.70-4.69(3H，m，Glc NAc 2-H1Glc NAc 5，5’-H1)，4.59(1H，dd，J＝4.5Hz，8.0Hz，Asn-αCH)，4.54(2H，d，J＝7.4Hz，Gal 6，6’-H1)，4.34(1H，b d，Man 3-H2)，4.29(1H，b d，Man 4’-H2)，4.21(1H，b d，Man 4-H2)，2.88(2H，dd，J＝4.4Hz，16.4Hz，Asn-βCH)，2.78-2.70(3H，m，NeuAc 7，7’-H3eq，Asn-βCH)，2.35(2H，t，J＝7.3Hz，COCH2)，2.13(18H，s×6，-Ac)，1.80(2H，dd，J＝12.1Hz，12.0Hz，NeuAc7，7’-H3ax)，1.71-1.60(2H，m，CH2)，1.42-1.30(36H，m，CHx)，0.95(3H，t，J＝6.6Hz，CH3)上述實施例1～4的各個二唾液酸十一天冬酰胺-脂肪酸酰胺的化學(xué)式如圖2所示。
試驗例1流感病毒感染抑制劑的唾液酸酶抑制活性的測定(1)熒光標(biāo)記的N-乙酰乳糖胺衍生物的唾液酸化對二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺在水溶液中實際上是否膠束化進行研究。因此測定對熒光標(biāo)記的唾液酸糖鏈的唾液酸酶抑制活性，求IC50。對于熒光標(biāo)記的唾液酸糖鏈7分別使二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺1以及合成的4個糖脂質(zhì)衍生物共存，測定唾液酸酶抑制活性，如果抑制活性隨碳鏈長度增加而增加的話，那么該現(xiàn)象可以認為是膠束化的效果。首先合成熒光標(biāo)記的唾液酸糖鏈。在熒光標(biāo)記中使用Dansyl基。合成對N-乙酰乳糖胺衍生物進行Dansyl標(biāo)記的6-[(N-Dansyl)氨基]-己基-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖苷(以后表記為Dansyl-LacNAc)，然后使用α(2，6)唾液酸轉(zhuǎn)移酶將唾液酸轉(zhuǎn)移到半乳糖上，合成Dansyl標(biāo)記的唾液酸糖鏈(以后表記為NeuAc-LacNAc-Dansyl)。
將Dansyl-LacNAc、CMP-唾液酸、α(2，6)唾液酸轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、牛血清白蛋白溶解于二甲胂酸緩沖液(pH6.0，50mM)，于37℃下反應(yīng)65小時，通過高效液相色譜進行純化，可以得到NeuAc-LacNAc-Dansy17，收率為69％。在測定化合物7的1HNMR時，可以確認2.74ppm、1.80ppm分別為唾液酸中特有的峰的3位的赤道(equatorial)、軸向的質(zhì)子峰。與原料Dansyl-LacNAc的1HNMR比較可知由于7的半乳糖1位的質(zhì)子峰與原料的峰相比，漂移到高磁場，所以唾液酸結(jié)合在半乳糖6位上。通過上述那樣操作對化合物7進行了鑒定。圖3給出了上述反應(yīng)。
(2)二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺的唾液酸酶抑制活性測定在通過唾液酸酶使NeuAc-LacNAc-Dansyl水解的實驗中，作為抑制劑分別加入合成的糖脂質(zhì)衍生物3、4、5、6以及唾液酸乳糖、二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺1，求對應(yīng)于各個抑制劑的IC50。反應(yīng)條件如下所述。向100μM的NeuAc-LacNAc-Dansyl中按照10μM、100μM、300μM的3個條件加入各個抑制劑(溶劑為溶解了牛血清白蛋白的HEPES緩沖液)，然后加唾液酸酶，于37℃下溫育30分鐘。然后通過高效液相色譜對熒光標(biāo)記的NeuAc-LacNAc-Dansyl的分辨率進行定量，由該結(jié)果算出IC50。將該結(jié)果按照底物類別歸納為曲線。這些曲線的縱軸是使酶反應(yīng)抑制50％所必需的抑制劑濃度(IC50)。圖4中的曲線是相對于系統(tǒng)內(nèi)的唾液酸量求IC50得到的。天冬酰胺二唾液酸十一糖由于分子內(nèi)含有2個唾液酸，所以求得的IC50的實測值是唾液酸的量的2倍。結(jié)果如圖4所示。
相對于抑制劑本身的摩爾濃度求實測的IC50，唾液酸乳糖以外的抑制劑的IC50為圖4值的一半(圖5)。由圖4中的曲線可知，碳鏈最短的癸酸作為疏水基團只與天冬酰胺二唾液酸十一糖1結(jié)合，IC50的值為沒有結(jié)合疏水基團的二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺1值的3/4。這樣的現(xiàn)象可以認為疏水基團的羧酸與作為親水基團的二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺結(jié)合，該化合物進行膠束化，一個分子內(nèi)含有多個二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺，所以被唾液酸酶囚禁的頻率上升，抑制NeuAc-LacNAc-Dansyl的唾液酸除去的力提高。另外判明疏水基的碳鏈越長(癸酸→肉豆蔻酸→硬脂酸→山萮酸)，IC50的值系統(tǒng)性地變小。這被認為是由于疏水基的碳鏈越長，膠束體的表面積上升，其分子表面內(nèi)含有的二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺的數(shù)量上升，因此抑制NeuAc-LacNAc-Dansyl的唾液酸水解的能力提高。由圖5可知分子內(nèi)的唾液酸乳糖系只是增加一個，就可提高對唾液酸酶的抑制活性，而且碳鏈越長，其效果會變得更強。
(3)二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺的流感病毒抑制活性測定作為抑制劑分別加入實施例1～4的二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺(圖2的衍生物3、4、5、6)，求對應(yīng)的流感病毒(血細胞凝集素)抑制活性。反應(yīng)條件如下所述。
使用的流感病毒是A/ニエ一カレドニア/20/99(H1N1)。
向雞受精卵接種，采取小尿膜液(レょう尿膜液)，進行超離心純化，將經(jīng)福爾馬林鈍化的樣品作為純化病毒抗原使用。對該抗原進行醚處理之后，將收集了HA(血細胞凝集素)級分的組分作為HA分離級分。
1)將上述圖2的衍生物3、4、5、6各2mg溶解于PBS 1ml中。
2)將樣品用PBS稀釋成原液、2倍、4倍、8倍。
3)于96孔U板(三光純藥)將樣品各10μl和病毒稀釋液40μl混合。
4)于4℃下靜置60分鐘。
5)向混合物中加50μl PBS，制作50μl的2倍階段稀釋液。
6)將雞紅細胞(日本生物檢測研究所)調(diào)整到0.5％。
7)向各個孔添加血細胞懸浮液50μl，混合后于4℃下靜置60分鐘。
8)測定流感病毒(血細胞凝集素)抑制活性，結(jié)果表明衍生物3在190.0μmol、衍生物4在95.0μmol、衍生物5在47.5μmol、衍生物6在37.5μmol下表現(xiàn)出抑制活性。
本發(fā)明的二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺以及二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺具有特別優(yōu)異的病毒感染和/或增殖抑制作用，作為例如流感病毒感染病等的病毒疾病的預(yù)防劑和/或治療劑發(fā)揮優(yōu)異的效果。
權(quán)利要求
1.二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺。
2.權(quán)利要求1所述的二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺，其中脂肪酸是碳數(shù)為8～24的脂肪酸。
3.權(quán)利要求2所述的二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺，其中脂肪酸是碳數(shù)為10～22的脂肪酸。
4.權(quán)利要求3所述的二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺，其中脂肪酸是從癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸以及油酸中選擇的一種以上的脂肪酸。
5.含有權(quán)利要求1～4任一項所述的二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺以及制劑用添加物的組合物。
6.權(quán)利要求5所述的組合物，其中制劑用添加物是從乳糖、甘油、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇中選擇的一種以上的添加物。
7.含有二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺的藥物。
8.含有從二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺-脂肪酸酰胺以及二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺中選擇的一種以上以及制劑用添加物的藥物。
9.權(quán)利要求7或8所述的藥物，其是病毒疾病的預(yù)防劑和/或治療劑。
10.權(quán)利要求7～9任一項所述的藥物，其是流感病毒感染病的預(yù)防劑和/或治療劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺－脂肪酸酰胺、含有其的藥物以及含有二唾液酸十一糖鏈天冬酰胺的藥物。
文檔編號A61P31/16GK1809594SQ20048001744
公開日2006年7月26日 申請日期2004年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月30日
發(fā)明者梶原康宏, 前田廣景, 深江一博 申請人:大塚化學(xué)株式會社, 梶原康宏