專利名稱：神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)壞死的抑制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防由神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)神經(jīng)元壞死的藥理學(xué)組合物，更特別地是，涉及通過(guò)抗氧化劑預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡以及通過(guò)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與抗氧化劑的協(xié)同效應(yīng)來(lái)增強(qiáng)神經(jīng)元存活的促進(jìn)作用的方法。
背景技術(shù)：
中樞和外周神經(jīng)元的存活在很大程度上依賴于與從它們的靶細(xì)胞釋放出的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的接觸(Levi-Montalcini，1987，EMBO J.，6，1145-1154；Barde，1994，Prog.Clin.Biol.Res.，390，45-56)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)效果是通過(guò)與具有酪氨酸激酶活性、高親和性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體TrkA、TrkB或TrkC的結(jié)合啟動(dòng)的(Patapoutian and Reichardt，2001，Curr.Opin.Neurobiol.，11，272-280；Kaplan and Miller，2000，Curr.Opin.Neurobiol.，10，381-391)。該Trk酪氨酸激酶可激活在小腦顆粒神經(jīng)元、皮層神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元、交感神經(jīng)元和感覺(jué)神經(jīng)元的多種神經(jīng)元存活中起重要作用的小GTP-結(jié)合蛋白R(shí)as、PI-3K和PLC(Borasio et al.，1993，J.Cell.Biol.，121，665-672；Stephens et al.，1994，Neuron，12，691-705；Yaoand Cooper，1995，Science.，267，2003-2006；Nobes et al.，1996，Neuroscience.，70，1067-1079；Nonomura et al.，1996，Brain Res Dev BrainRes.，97，42-50；Alcantara et al.，1997，J Neurosci.，17(10)，3623-3633；Hetman et al.，1999，J Biol Chem.，274，22569-22580；Atwal et al.，2000，Neuron.，27，265-227)。
神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò)干擾正常發(fā)育過(guò)程中的程序性細(xì)胞死亡或凋亡來(lái)增強(qiáng)神經(jīng)元的存活(Barde，1994，Prog.Clin.Biol.Res.，390，45-56；Deshmukh and Johnson，1997，Mol.Pharmacol.，51，897-906)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的神經(jīng)保護(hù)作用可在遭受病理性傷害的中樞神經(jīng)元中觀察到。例如，通過(guò)體內(nèi)的軸索顯微外科術(shù)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可以改善基底前腦膽堿能神經(jīng)元，視網(wǎng)膜腦神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元以及脊椎感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退行性改變(Hefti，1986，J.Neurosci.，6，2155-2162；Yan et al.，1993，.Neurobiol.，24，1555-1577；Mey and Thanos，1993，Brain Res.，602，304-317；Morse et al.，1993，J.Neurosci.，13，4146-4156；Cohen et al.，1994，J.Neurobiol.，25，953-959；Friedman et al.，1995，J.Neurosci.，15，1044-1056)。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NT)-4/5可以減少缺氧-缺血性損傷后的神經(jīng)元死亡(Hefti，1986，J.Neurosci.，6，2155-2162；Yanet al.，1993，J.Neurobiol.，24，1555-1577；Mey and Thanos，1993，Brain Res.，602，304-317；Morse et al.，1993，J.Neurosci.，13，4146-4156；Cohen et al.，1994，J.Neurobiol.，25，953-959；Friedman et al.，1995，J.Neurosci.，15，1044-1056)。BDNF可保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元使之免于1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶和6-羥基多巴胺的影響(Spina et al.，1992，J.Neurochem.，59，99-106；Frim et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91，5104-5108)。
以上發(fā)現(xiàn)顯示神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)于缺氧-缺血性和各種神經(jīng)退行性疾病的治療潛力。然而神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的有益效果會(huì)被神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可加重某些類型的神經(jīng)元損傷這一觀點(diǎn)所抵消。BDNF、NT-3或NT-4/5可能通過(guò)增加Ca2+內(nèi)流和通過(guò)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)谷氨酸受體產(chǎn)生的NO(一氧化氮)使神經(jīng)元對(duì)氧和葡萄糖剝奪高度易感(Femandez-Sanchezand Novelli，1993，F(xiàn)EBS Lett.，335，124-131；Koh et al.，1995，Science，268，573-575；Samdani et al.，1997，J.Neurosci.，17，4633-4641)。在皮層細(xì)胞培養(yǎng)中，BDNF、NGF和NT-4/5可加強(qiáng)由氧化應(yīng)激或鋅誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞壞死(Gwag et al.，1995，Neuroreport，7，93-96；Park et al.，1998，Neuroreport，9，687-690；Won et al.，2000，Neurobiol Dis，7，251-259)。
最近，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可直接誘導(dǎo)皮層細(xì)胞培養(yǎng)和成年大鼠中神經(jīng)元細(xì)胞壞死以及誘導(dǎo)對(duì)某些神經(jīng)元損傷的強(qiáng)化作用(Kim et al.，2002，J Cell Biol，159，821-831)。據(jù)此，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的意外神經(jīng)毒性似乎解釋了對(duì)神經(jīng)性疼痛和肌萎縮性側(cè)索硬化臨床試驗(yàn)的失敗(Apfel et al.，2001，Clin.Chem.Lab.Med.，39(4)，351-61)。
因此，發(fā)明人描述了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子毒性作用的發(fā)生機(jī)理，研究了預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子毒性的藥物，通過(guò)使用抗氧化劑開(kāi)發(fā)了優(yōu)化神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子治療效果的方法以完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了通過(guò)抗氧化劑給藥預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞壞死的方法，以及提供了通過(guò)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和抗氧化劑同時(shí)給藥預(yù)防神經(jīng)元凋亡和壞死的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)抗氧化劑給藥預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞壞死的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和抗氧化劑同時(shí)給藥同時(shí)預(yù)防神經(jīng)元凋亡和壞死的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)四氟芐基(tetrafluorobenzyl)衍生物給藥預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞壞死的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和四氟芐基衍生物同時(shí)給藥預(yù)防神經(jīng)元凋亡和壞死的方法。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明結(jié)合附圖，從以下的詳細(xì)描述中，可以對(duì)本發(fā)明的以上或其它的目的、特征和其它優(yōu)點(diǎn)有更清楚的理解。


圖1所示為在皮層細(xì)胞培養(yǎng)中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)神經(jīng)元壞死的曲線圖。
A用BDNF處理；B用NT-3處理；C用NT-4/5處理。
圖2所示為紋狀體內(nèi)注射鹽水或BDNF 2天后，蘇木精-伊紅(H&E)對(duì)大腦切片中神經(jīng)元壞死的染色圖。
A紋狀體內(nèi)注射鹽水后，經(jīng)H&E染色的大腦切片明視野顯微照相圖；B紋狀體內(nèi)注射BDNF后，經(jīng)H&E染色的大腦切片明視野顯微照相圖；C如圖所示為鹽水或BDNF注射后，H&E染色的大腦切片中退行性神經(jīng)元的定量分析。
圖3所示假洗或暴露于BDNF后32小時(shí)皮層神經(jīng)元的顯微照片，A假洗的相差顯微照片；BBDNF的相差顯微照片；C假洗的電子顯微照片；DBDNF的電子顯微照片。
圖4所示為BDNF誘導(dǎo)神經(jīng)元的死亡形式，從將皮層細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于BDNF后32小時(shí)，假洗組和對(duì)照組中，退行性神經(jīng)元被定義為正常、壞死(見(jiàn)以上描述)或凋亡。
圖5所示為持續(xù)地暴露于單獨(dú)的BDNF、或暴露于BDNF和抗-BDNF封閉抗體、BDNF和trolox、或BDNF和CHX(放線菌酮)之后，通過(guò)對(duì)皮層神經(jīng)元流出到洗浴培養(yǎng)液(bathing medium)中的LDH對(duì)神經(jīng)元死亡進(jìn)行分析的圖。
圖6所示為在指定的時(shí)間通過(guò)檢測(cè)氧化的DCDHF-DA(DCF)的熒光強(qiáng)度對(duì)假洗或BDNF的皮層神經(jīng)元暴露的ROS水平進(jìn)行分析的圖。
圖7所示為將皮層細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于假洗或單獨(dú)100ng/ml BDNF，或在CHX或trolox存在時(shí)暴露于100ng/ml BDNF 32h后在皮層神經(jīng)元中DCF熒光定量的圖。
圖8所示為在指定時(shí)間暴露于BDNF時(shí)在皮層細(xì)胞培養(yǎng)物中NADPH氧化酶和GAPDH mRNA表達(dá)的RT-PCR分析圖。
圖9所示為在指定時(shí)間暴露于BDNF時(shí)在皮層細(xì)胞培養(yǎng)物中NADPH氧化酶和GAPDH mRNA表達(dá)的mRNA水平定量圖。
圖10所示為在指定時(shí)間暴露于BDNF之后在皮層細(xì)胞培養(yǎng)物中NADPH氧化酶和肌動(dòng)蛋白(actin)表達(dá)的western印記分析圖。
圖11所示為假洗和BDNF暴露后經(jīng)過(guò)免疫標(biāo)記的皮層細(xì)胞培養(yǎng)物的熒光顯微照片；A假洗，使用與FITC連接的抗p47-phox或抗-山羊IgG進(jìn)行免疫標(biāo)記；B假洗，使用得克薩斯紅(Texas red)連接的NeuN或抗-山羊IgG進(jìn)行免疫標(biāo)記；
C用BDNF處理，使用與FITC連接的抗p47-phox或抗-山羊IgG進(jìn)行免疫標(biāo)記；D用BDNF處理，使用與得克薩斯紅連接的NeuN或抗-山羊IgG進(jìn)行免疫標(biāo)記。
圖12所示為假洗和BDNF之后經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記的皮層細(xì)胞培養(yǎng)物的熒光顯微照片。
A假洗，使用使用與FITC連接的抗p67-phox或抗-山羊IgG進(jìn)行免疫標(biāo)記；B假洗，使用與得克薩斯紅連接的NeuN或抗-山羊IgG進(jìn)行免疫標(biāo)記；C用BDNF處理，使用使用與FITC連接的抗p67-phox或抗-山羊IgG進(jìn)行免疫標(biāo)記；D用BDNF處理，使用與得克薩斯紅連接的NeuN或抗-山羊IgG進(jìn)行免疫標(biāo)記。
圖13所示為在指定時(shí)間利用抗p47-phox和抗p67-phox抗體對(duì)從暴露于BDNF的皮層細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得胞質(zhì)體組分(C)和膜組分(M)進(jìn)行western印記分析的圖。
圖14所示為通過(guò)檢測(cè)在指定時(shí)間暴露于假洗或BDNF并在DPI有無(wú)時(shí)的皮層培養(yǎng)物中細(xì)胞色素c的還原水平來(lái)對(duì)過(guò)氧化物產(chǎn)生進(jìn)行分析的圖。
圖15所示為假洗、BDNF或加入DPI的BDNF后皮層神經(jīng)元中氧化的Het和DCF的熒光顯微照片。
A暴露于假操作后皮層神經(jīng)元中的氧化的氫乙啡啶(hydroethydine)(HEt)；B暴露于BDNF后皮層神經(jīng)元中的氧化的氫乙啡啶(HEt)；C暴露于加入DPI的BDNF后皮層神經(jīng)元中的氧化的氫乙啡啶(HEt)；D暴露于假操作后皮層神經(jīng)元中的氧化DCF；E暴露于BDNF后皮層神經(jīng)元中的氧化DCF；F暴露于加入DPI的BDNF后皮層神經(jīng)元中的氧化DCF。
圖16所示為通過(guò)對(duì)暴露于BDNF，BDNF+DPI，BDNF+AEBSF或BDNF+2-羥基-TTBA后皮層神經(jīng)元中進(jìn)入洗浴培養(yǎng)液中的LDH外流的檢測(cè)對(duì)神經(jīng)元死亡進(jìn)行分析的圖。
圖17所示為暴露于無(wú)血清、單獨(dú)或有BDNF存在、加入的DPI的BDNF、DPI、加入trolox的BDNF或trolox后，在富含神經(jīng)元的皮層細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)神經(jīng)元凋亡進(jìn)行分析的圖。
本發(fā)明的詳細(xì)描述以下是本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了通過(guò)給予具有阻斷氧化應(yīng)激的藥物來(lái)預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)產(chǎn)生壞死的方法。
本發(fā)明中的抗氧化劑可選自NADPH氧化酶抑制劑、維生素E、維生素E類似物或四氟芐基衍生物。NADPH氧化酶抑制劑可選自二亞苯基碘(diphenylene iodonium)(DPI)或4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟(AEBSF)。維生素E類似物是trolox，一種維生素E的膜透過(guò)性形式。四氟芐基衍生物可選自BAS(5-芐基氨基水楊酸)、TBAS(5-(4-三氟甲基芐基)氨基水楊酸)、NBAS(5-(4-硝基芐基)氨基水楊酸)、CBAS(5-(4-氯芐基)氨基水楊酸)、MBAS(5-(4-甲氧芐基)氨基水楊酸)、FBAS(5-(4-氟芐基)水楊酸)、及2-羥基-TTBA(2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4三氟甲基-芐基氨基)-安息香酸。
本發(fā)明中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可選自神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)和NT-4/5，更優(yōu)選BNDF。
BNDF通過(guò)誘導(dǎo)NADPH氧化酶的表達(dá)和活化以及隨后產(chǎn)生的具有反應(yīng)活性氧類(ROS)引起神經(jīng)元細(xì)胞壞死。
DPI或AEBSF的給藥可以通過(guò)抑制NADPH氧化酶和ROS的產(chǎn)生預(yù)防BDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞壞死。維生素E或其類似物trolox可以通過(guò)阻斷ROS的產(chǎn)生來(lái)預(yù)防BDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。四氟芐基衍生物BAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS和2-羥基-TTBA可以作為抗氧化劑(WO 01/79153)來(lái)封阻自由基神經(jīng)毒性，這些抗氧化劑可以預(yù)防BDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。
因此，本發(fā)明中的抗氧化劑能夠預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞壞死。
本發(fā)明提供了采用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和抗氧化劑共同給藥預(yù)防神經(jīng)元凋亡和壞死的方法。
本發(fā)明中的抗氧化劑選自NADPH氧化酶抑制劑、維生素E、維生素E類似物或四氟芐基衍生物。NADPH氧化酶抑制劑選自DPI或AEBSF。優(yōu)選的維生素E類似物是trolox，一種維生素E的膜透過(guò)性形式。四氟芐基衍生物選自BAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS和2-羥基-TTBA。
本發(fā)明中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子選自腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)和NT-4/5，更優(yōu)選BDNF。
盡管神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可以通過(guò)阻止凋亡來(lái)提升神經(jīng)元的存活，但也有可能通過(guò)ROS的產(chǎn)生引起神經(jīng)元壞死。后者可以通過(guò)抗氧化劑給藥得以阻止。有意思的是，抗氧化劑共同給藥極大地提升通過(guò)阻止神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的促壞死(pro-necrotic)作用以提高神經(jīng)元存活的效果。
因此，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和抗氧化劑共同給藥可以應(yīng)用于預(yù)防缺氧-缺血性損傷(Holtzman et al.，1996，Ann.Neurol.，39(1)，114-122；Ferrer et al.，2001，Acta neuropathol.(Berl.)，101(3)，229-38)、慢性脊髓損傷(Jin et al.，2002，Exp.Neurol.，177(1)，265-75)、阿耳茨海默病(Siegel and Chauhan，2000，Brain Res.Brain Res.Rev.，33，2-3)、帕金森氏病(Bradford et al.，1999，Adv.Neruol.80，19025)、ALS(Louvel et al.，1997，Trends.Pharmacol.Sci.，18(6)，196-203)、亨廷頓氏舞蹈病(Perez-Navarro et al.，2000，J.Neurochem.，75(5)，2190-9)、青光眼(Ko et al.，2000，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，41(10)，2967-71)或視網(wǎng)膜脫落(Lewis et al.，1999，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，40(7)，1530-1544)中的凋亡和壞死。
本發(fā)明提供預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞壞死的抑制劑，并因此通過(guò)四氟芐基衍生物給藥提高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的存活作用。
含有四氟芐基衍生物作為有效組分的藥物可以用于預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生以及神經(jīng)元細(xì)胞壞死。本發(fā)明中的四氟芐基衍生物選自BAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS和2-羥基-TTBA。
本發(fā)明中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子選自腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)和NT-4/5，更優(yōu)選BDNF。
本發(fā)明中的組合物可以通過(guò)口服給藥、靜脈注射或非口服給藥方式進(jìn)行治療，以及通過(guò)諸如片劑、膠囊、粉劑、顆粒、滅菌溶液、懸浮液或直腸給藥栓劑的多種形式進(jìn)行治療。所述組合物中的主要有效成分能夠采用藥物載體制成固體片劑，該載體例如諸如玉米糊精，乳糖，蔗糖，山梨醇，滑石，硬脂酸，硬脂酸鎂，磷酸鈣(decalcium phosphate)或樹膠常用的片劑成分，以及其它的藥物稀釋溶液。本發(fā)明中具有藥物組合物的片劑或丸劑，可使用適合的產(chǎn)業(yè)中的公知包被方法等制備易化形式給藥的緩釋劑型。例如，片劑或丸劑可由內(nèi)部和外部給藥成分組成。片劑或丸劑的內(nèi)部給藥成分可通過(guò)外部給藥成分包裹來(lái)制備。制造用于口服給藥或注射的本發(fā)明組合物的液體形式包括溶液，適合口味的糖漿，水溶性懸浮液，水不溶性懸浮液，由諸如棉花油、芝麻油、椰子油或花生油等可食性油制成的乳濁液，酏劑以及類似的藥物載體。黃芪膠、阿拉伯樹膠、褐藻酸鈉鹽、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或諸如明膠等合成或天然的樹膠可在制備水溶性懸浮液時(shí)用作適合添加劑進(jìn)行分散和懸浮。
對(duì)神經(jīng)退行性改變的治療所采用藥物治療的量可通過(guò)諸如疾病、年齡、性別、體重以及患者的疾病程度等一些相關(guān)因素來(lái)確定。
以下將對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳述。
然而，方案中所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明中的代表，其還可以包括更多的例子。
實(shí)施例1原代皮層細(xì)胞培養(yǎng)從17天齡胎鼠大腦制備大鼠皮層細(xì)胞培養(yǎng)物，并如前所述(Noh andGwag，1997)，將新皮質(zhì)機(jī)械性磨碎。將分離的細(xì)胞接種于6-孔板和24-孔板(每板大約3塊皮質(zhì))，或接種于玻璃底面的35mm培養(yǎng)皿以用于ROS成像。接種培養(yǎng)基由添加了5％馬血清、5％胎牛血清、21mM葡萄糖，26.5mM碳酸氫鈉和2mM L-谷氨酰胺的Eagle’s極限必須培養(yǎng)基(MEM，Earle’s鹽，不合補(bǔ)充的谷氨酰胺)組成。
對(duì)于神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)的混合培養(yǎng)物，在DIV5-7，當(dāng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元下方生長(zhǎng)至融合時(shí)，加入10μM胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara C)終止非神經(jīng)元細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)。兩天后，用缺乏胎兒血清的接種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每周更換培養(yǎng)基兩次。將培養(yǎng)物放置于維持37℃，濕潤(rùn)的5％ CO2培養(yǎng)箱中。對(duì)于富含神經(jīng)元的培養(yǎng)物(＞95％)，如前所述(Gwag et al.，1997)，在體外培養(yǎng)2-3天(DIV 2-3)時(shí)，2.5μM的Ara C被加入到培養(yǎng)物中。
實(shí)施例2細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)和分析為了檢測(cè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是否會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)元壞死，通過(guò)檢測(cè)釋放到洗浴培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)水平來(lái)對(duì)BDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡進(jìn)行分析。
用不含血清的MS(添加了26.5mM碳酸氫鈉和21mM葡萄糖的MEM)沖洗混合的皮層細(xì)胞培養(yǎng)物(DIV12-14)，然后將其暴露于不同NGF，BDNF或NT-3濃度的無(wú)血清MS中。通過(guò)檢測(cè)釋放到洗浴培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)水平來(lái)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞死亡進(jìn)行分析。通過(guò)相對(duì)假洗對(duì)照(定義為0％)或者持續(xù)暴露于500μM NMDA 24hr(定義為100％)后釋放LDH的平均值對(duì)神經(jīng)元死亡百分比進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。后者在24小時(shí)內(nèi)能夠產(chǎn)生全部神經(jīng)元的死亡。對(duì)無(wú)血清的實(shí)驗(yàn)，富含神經(jīng)元的培養(yǎng)物(DIV 7)被放置于如所述的(Gwag et al.，1995)含有1μM MK-801的無(wú)血清MS中。24和48小時(shí)后，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色排除方法計(jì)數(shù)活存神經(jīng)元來(lái)對(duì)神經(jīng)元死亡進(jìn)行分析。
在持續(xù)暴露于不同濃度(10，30或100ng/ml)的BDNF或NT-3達(dá)36-48小時(shí)的情況下，皮層細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)生廣泛的神經(jīng)元死亡(圖1A)。在暴露于BDNF或NT-3后48小時(shí)之內(nèi)可以觀察到神經(jīng)元幾乎全部死亡(圖1)。神經(jīng)元死亡通過(guò)測(cè)量洗浴培養(yǎng)基中的LDH的外流來(lái)進(jìn)行評(píng)估的，平均值±SEM(n＝16培養(yǎng)孔/每個(gè)條件下)。*為P＜0.05，使用方差分析和Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，與相關(guān)對(duì)照(假洗對(duì)照)相比較具有顯著性差異。
所以，發(fā)現(xiàn)諸如BDNF、NT-3和NT-4/5的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子都能引發(fā)細(xì)胞壞死。
實(shí)施例3大鼠大腦的BDNF紋狀體內(nèi)注射為了確認(rèn)BDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死，使用水合三氯乙醛(400mg/ml)對(duì)體重250-300g的Sprague-Dawley成年雄性大鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)麻醉。將動(dòng)物放置在Kopf立體固定器上，以下列坐標(biāo)在紋狀體中進(jìn)行1g/l BDNF(溶解于0.9％氯化鈉(鹽水))，或單獨(dú)的鹽水注射前囟點(diǎn)嘴側(cè)1.0mm，中線側(cè)方3.0mm以及硬腦膜表面腹側(cè)5.0mm。對(duì)每一次注射，都使用10ulHamilton注射器用10分鐘注射5ul體積。在拔出注射器和傷口閉合之前允許有3分鐘時(shí)間。這些大鼠在2天后實(shí)施安樂(lè)死。將動(dòng)物進(jìn)行麻醉，然后用磷酸緩沖液(PBS)和3％多聚甲醛進(jìn)行穿心灌注。將大腦立即取出，后固定，并在切片機(jī)(TPI，Inc.，MO)上進(jìn)行切片(8μm)。將收集包括注射位置的切片并用蘇木精和伊紅(H&E)進(jìn)行染色。如前所述對(duì)損傷區(qū)域進(jìn)行分析(Won et al.，2000)。對(duì)每只動(dòng)物損傷分析包括含有針跡和隨染色強(qiáng)度降低的最嚴(yán)重?fù)p傷區(qū)域事件等的六張連續(xù)切片。
使用電腦輔助影像分析系統(tǒng)(SigmaScan，CA/TINA 2.0，KAIST，Daejeon，Korea)來(lái)對(duì)H&E染色的紋狀體切片進(jìn)行掃描分析。在紋狀體內(nèi)注射BDNF 2天后成年大鼠大腦的紋狀體區(qū)域觀察到NT的神經(jīng)毒性作用(圖2)。
實(shí)施例4透射電子顯微鏡觀察為了確定BDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡形式，我們?cè)谙嗖罨蛲干潆娮语@微鏡下對(duì)假洗或持續(xù)暴露于100ng/ml BFNF 32小時(shí)后的神經(jīng)元進(jìn)行了觀察。
將培養(yǎng)物在Karnovskys固定液(1％多聚甲醛，2％戊二醛，2mM氯化鈣，100mM二甲砷酸鹽緩沖液，pH7.4)中固定2小時(shí)，用二甲砷酸鹽緩沖液沖洗，并用1％四氧化鋨和1.5％亞鐵氰化鉀后固定1小時(shí)。細(xì)胞隨后用0.5％乙酸雙氧鈾進(jìn)行整體(en bloc)染色，乙醇梯度進(jìn)行脫水，并包埋于Poly/Bed 812樹脂中(Pelco，CA)。使用Reichert Jung Ultracut S(Leica，Cambridge，UK)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行切片。乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，使用Zeiss EM 902A對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察和照相。
對(duì)在經(jīng)過(guò)BDNF處理的皮層培養(yǎng)物中退行性神經(jīng)元的超顯微結(jié)構(gòu)分析顯示出細(xì)胞漿細(xì)胞器的膨脹，與核膜相比較早期的質(zhì)膜塌陷以及核染色質(zhì)的散在凝集(圖3和圖4)。選擇對(duì)照和BDNF處理的神經(jīng)元在透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察，并將退行性神經(jīng)元定義為正常，壞死或凋亡(細(xì)胞漿皺縮，核膜破裂而質(zhì)膜完整)，說(shuō)明BDNF會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)元壞死。
實(shí)施例5BDNF在皮層神經(jīng)元中產(chǎn)生ROS許多研究都暗示升高的反應(yīng)活性氧類(ROS)會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)元壞死，我們檢測(cè)了BDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死是否會(huì)產(chǎn)生ROS。
向生長(zhǎng)在玻璃底面培養(yǎng)皿的皮層細(xì)胞培養(yǎng)物(DIV 12-15)中加入10uM二氯二氫醋酸熒光素(DCDHF-DA)或5mM氫乙啡啶(hydroethidium)(Molecular Probes，Eugene，OR)和加入2％Pluronic F-127溶于含有(mM單位)120NaCl，5KCl，1.6MgCl2，2.3CaCl2，15葡萄糖，20HEPES，及10NaOH的HEPES-緩沖對(duì)照鹽水(HCSS)緩沖液。將培養(yǎng)物在37℃孵育20分鐘后用HCSS緩沖液沖洗三遍。在室溫下用配備有100W氙燈和濾光片(對(duì)氧化DCDHF而言，激發(fā)波長(zhǎng)＝488nm，發(fā)射波長(zhǎng)＝510nm；對(duì)氫乙啡啶而言，激發(fā)波長(zhǎng)＝546nm，發(fā)射波長(zhǎng)＝590nm)的Nikon Diaphot倒置顯微鏡觀察氧化DCDHF的熒光信號(hào)。使用QuantiCell 700系統(tǒng)對(duì)熒光圖像進(jìn)行分析(Applied Imaging，UK)。
在皮層神經(jīng)元暴露于BDNF 16小時(shí)的情況下，DCF的熒光強(qiáng)度有所增加(圖6)。神經(jīng)元內(nèi)的ROS水平([ROS]i)在24-32小時(shí)后進(jìn)一步增加。同時(shí)加入放線菌酮和trolox可以預(yù)防BDNF誘導(dǎo)的[ROS]i產(chǎn)生(圖7)。
所以，BDNF有可能通過(guò)促氧化蛋白(pro-oxidant)的合成產(chǎn)生ROS。
實(shí)施例6RDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死機(jī)理為了確定BDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死機(jī)理，皮層細(xì)胞培養(yǎng)物(DIV12-15)被持續(xù)的暴露于單獨(dú)的100ng/ml BDNF，或100ng/ml BDNF與100μg/ml抗BDNF封閉抗體、100μM trolox、或1μg/ml放線菌酮一同36小時(shí)后，通過(guò)測(cè)量洗浴培養(yǎng)基中的LDH外流量對(duì)神經(jīng)元死亡進(jìn)行分析。抗BDNF封閉抗體的同時(shí)給藥完全封阻了BDNF的神經(jīng)毒性。
有意思的是，BDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞壞死也可以通過(guò)添加放線菌酮、一種蛋白合成抑制劑，以及trolox、一種維生素E的親脂性類似物，來(lái)阻斷(圖5)。{平均值±SEM(n＝每個(gè)條件16培養(yǎng)孔)。*，P＜0.05，使用方差分析和Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，與相關(guān)對(duì)照組(單獨(dú)進(jìn)行BDNF處理)相比較具有顯著性差異。}所以，對(duì)具有反應(yīng)活性的氧類(ROS)產(chǎn)生的阻斷伴隨對(duì)BDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死的神經(jīng)保護(hù)性作用。
實(shí)施例7BDNF處理后在大鼠皮層細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)的基因(7-1)cDNA微陣列分析我們利用cDNA微陣列分析在皮層細(xì)胞培養(yǎng)物中篩選BDNF活化的促-氧化劑靶基因。
使用RNA zol B(Tel-Test INC.，F(xiàn)riendswood，TX)從皮層細(xì)胞培養(yǎng)物中提取總RNA。使用大約1μg總RNA來(lái)合成由[α-33P]dATP標(biāo)記的cDNA，其與大鼠基因?yàn)V膜(Research Genetics，Huntsville，AL)在42℃雜交12-18小時(shí)。在2×檸檬酸鈉鹽水(SSC)和1％十二烷基磺酸鈉(SDS)的溶液中50℃洗膜20分鐘，在0.5×SSC和1％SDS中室溫15分鐘，隨后塑料膜包裹起來(lái)并置于磷成像暗盒中?；?yàn)V膜經(jīng)過(guò)曝光后，使用PathwayTM4通用微陣列分析軟件(Invitrogen，Netherlands)對(duì)雜交模式進(jìn)行分析。
微陣列分析顯示在暴露于BDNF 8小時(shí)的皮層細(xì)胞培養(yǎng)物中有多個(gè)基因被調(diào)節(jié)(表1)。BDNF的靶基因在有可能反應(yīng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的分化、胞吞、代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有最主要的作用。在BDNF敏感基因中，因?yàn)槠錁?gòu)成NADPH氧化酶的p22-phox和gp91-phox亞基、一種從氧中產(chǎn)生過(guò)氧化物的促-氧化酶，細(xì)胞色素b558被選為NT神經(jīng)毒性作用的一個(gè)候選基因。
(7-2)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)因?yàn)槠錁?gòu)成NADPH氧化酶的p22-phox和gp91-phox亞基、一種從氧中產(chǎn)生過(guò)氧化物的促-氧化酶，通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證來(lái)源于cDNA表達(dá)微陣列的BDNF敏感基因、細(xì)胞色素b558。
將總RNA(每份1μg)在含有dNTP(每份2.5mM)，RNasin(0.5單位)，寡聚dT引物(100ng)和MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(200單位)的反應(yīng)混合物中在37℃孵育1小時(shí)。樣品在92℃中孵育10分鐘后轉(zhuǎn)移到4℃。根據(jù)制造商(TakaraShuzo Co.，Japan)的步驟依次(變性-退火-延伸)按下列條件對(duì)p47-phox而言，94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒(28個(gè)循環(huán))；對(duì)p22-phox(與在微陣列中的細(xì)胞色素b558同源)和gp91-phox而言，94℃45秒，60℃60秒，72℃120秒(33個(gè)循環(huán))；對(duì)GAPDH而言，94℃35秒，55℃45秒，72℃90秒(25個(gè)循環(huán))進(jìn)行PCR反應(yīng)。所采用的引物序列如下(5’-3’)對(duì)p22-phox而言，GAATTCCGATGGGGCAGATCGAGTGGGCCA(正向)和GGATCCCGTCACACGACCTCATCTGTCACT(反向)；對(duì)p47-phox而言，CAGCCAGCACTATGTGTACA(正向)和GAACTCGTAGATCTCGGTGAA(反向)；對(duì)gp91-phox而言，GAATTCCGATGGGGAACTGGGCTGTGAATG(正向)和GGATCCCGTTAGAAGTTTTCCTTGTTGAAA(反向)；對(duì)GAPDH而言，TCCATGACAACTTTGGCATCGTGG(正向)和GTTGCTGTTGAAGTCACAGGAGAC(反向)。PCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳并在溴化乙錠存在下可見(jiàn)。針對(duì)GAPDH mRNA水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用LAS-1000系統(tǒng)(Fuji Photofilm Co.，Japan)對(duì)mRNA的相對(duì)量進(jìn)行度量。使用來(lái)自于Perkin Elmer Applied Biosystems的Big DyeTerminator Chemistry在ABI PRISMTM377 DNA測(cè)序儀(Foster City，CA)上進(jìn)行DNA測(cè)序。
反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析表明在BDNF處理后2小時(shí)內(nèi)p22-phox和gp91-phox的mRNA水平有上升。兩種mRNA水平在隨后的4小時(shí)上升到最大，并持續(xù)在接下來(lái)的12小時(shí)。在BDNF給藥后30分鐘，p47-phox亞基的mRNA水平也在逐漸上升(圖8和圖9)。
所以，BDNF表現(xiàn)出可以增加NADPH氧化酶的表達(dá)。
(7-3)Western blot分析使用提供的針對(duì)gp91-phox、p47-phox和p67-phox的抗體通過(guò)Western印記實(shí)驗(yàn)對(duì)NADPH氧化酶亞基的蛋白水平進(jìn)行分析。
在含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1％Nonidet P-40、150mM氯化鈉、0.5％脫氧膽酸、0.1％十二烷基磺酸鈉(SDS)、1mM PMSF(苯基甲基磺酰氟)、10mg/ml pepstain A和100mg/ml亮肽酶素(leupeptin)的裂解緩沖液中對(duì)皮層細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行裂解。將細(xì)胞裂解物在12,000g離心10分鐘，大約25μg蛋白被用來(lái)在12％ SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將印記在2.5％牛血清白蛋白中孵育1小時(shí)，與含有抗-gp91-phox、抗-p67-phox和抗-p47-phox抗體(1∶1000，Santa Cruz，SantaCruz，CA)的山羊多克隆第一抗體孵育，然后再與生物素偶聯(lián)的抗-山羊第二抗體進(jìn)行反應(yīng)。使用Vectastain ABC試劑盒(Vector Laboratory，Burlingame，CA，USA)對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，并使用發(fā)光氨以獲得增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(Intron，Korea)。使用LAS-1000系統(tǒng)(Fuji Photofilm Co.，Japan)通過(guò)定量光密度測(cè)定法對(duì)信號(hào)進(jìn)行分析。
將皮層細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于BDNF 16-32小時(shí)后，NADPH氧化酶亞基gp91-phox、p47-phox和p67-phox的蛋白水平升高(圖10)。
所以，表明BDNF可以表達(dá)NADPH氧化酶的蛋白水平。
(7-4)免疫細(xì)胞化學(xué)使用免疫細(xì)胞化學(xué)用來(lái)鑒定在含有神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的皮層培養(yǎng)物中哪個(gè)種類的細(xì)胞表達(dá)NADPH氧化酶。
使用4％多聚甲醛對(duì)生長(zhǎng)于玻璃底面培養(yǎng)皿上的皮層細(xì)胞培養(yǎng)物(DIV12-14)固定30分鐘，在10％馬血清中孵育1小時(shí)，使用抗NeuN的小鼠單克隆抗體(1∶400稀釋，Chemicon，Temecula，CA)和抗p47-phox或p67-phox的山羊多克隆抗體(1∶200稀釋，Santa Cruz，Santa Cruz，CA)進(jìn)行雙免疫標(biāo)記2-4小時(shí)。隨后將培養(yǎng)物與異硫氰酸熒光素-連接的抗-山羊IgG(1∶200稀釋，Organon Teknika Corp.，NC)和德克薩斯紅-連接的抗小鼠IgG(1∶200，Vector Laboratory，Burlingame，CA)反應(yīng)1-2小時(shí)。使用配備有Real-14TM精密數(shù)碼相機(jī)(Apogee Instrument，Tucson，AZ)和ImagePro Plus插件(Silver Spring，MD)的熒光顯微鏡(Zeiss，Germany)對(duì)熒光圖像進(jìn)行采集和分析。
經(jīng)過(guò)假洗處理后在皮層神經(jīng)元而不是星形細(xì)胞中稍微地觀察到p47-phox或p67-phox抗體的免疫反應(yīng)性。在將皮層細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于BDNF后32小時(shí)，只有神經(jīng)元中的p47-phox和p67-phox信號(hào)升高(圖11和圖12)。
(7-5)亞細(xì)胞分部分離
NADPH氧化酶的活化涉及細(xì)胞溶質(zhì)p47-phox和p67-phox亞基向質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)移((Clark et al.，1989，Trans.Assoc.Am.Physicians.，102，224-230)。我們通過(guò)分離細(xì)胞溶質(zhì)和細(xì)胞膜組分檢測(cè)了BDNF的處理是否會(huì)活化NADPH氧化酶。
用冰預(yù)冷的PBS沖洗皮層細(xì)胞培養(yǎng)物并將其重懸于含有10mMHEPES，pH8.0，250mM蔗糖，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM二硫蘇糖醇(DTT)，2mM PMSF，100μg/ml亮肽酶素和10μg/ml胃蛋白酶抑制劑A的等滲緩沖液中。為了分離細(xì)胞溶質(zhì)和細(xì)胞膜組分，將裂解物用勻漿器勻漿(KONTE，Vineland，New jersey)，9,000g離心10分鐘，再將上清液在100,000g離心1小時(shí)。
用50μl裂解緩沖液重懸沉淀以獲得細(xì)胞膜組分同時(shí)從上清液中獲得胞質(zhì)組分。如實(shí)施例7-4所示，使用提供的gp91-phox、p47-phox和p67-phox抗體進(jìn)行western印記試驗(yàn)來(lái)對(duì)NADPH氧化酶亞基的蛋白水平進(jìn)行分析。
在暴露于BDNF 16-32小時(shí)的皮層細(xì)胞培養(yǎng)物中p47-phox和p67-phox的水平在胞質(zhì)組分中降低而在細(xì)胞膜組分中升高(圖13)，說(shuō)明BDNF誘導(dǎo)的NADPH氧化酶活化處理在細(xì)胞膜組分中升高，通過(guò)ROS的產(chǎn)生在皮層神經(jīng)元中誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激。
實(shí)施例8BDNF處理的皮層細(xì)胞培養(yǎng)物中NADPH氧化酶活性的檢測(cè)我們檢測(cè)了NADPH氧化酶活化是否有助于BDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。
采用基于細(xì)胞色素c還原(Mayo and Curnutte，1990)的定量動(dòng)態(tài)分析對(duì)過(guò)氧化物生成進(jìn)行檢測(cè)。將皮層細(xì)胞培養(yǎng)物用PBS重懸，并在含有0.9mM氯化鈣，0.5mM氯化鎂，7.5mM葡萄糖，75μM細(xì)胞色素c(Sigma，St.Louis，MO)和60μg/ml超氧化物岐化酶(Sigma，St.Louis，MO)的反應(yīng)混合物中37℃孵育3分鐘。通過(guò)使用Thermomax microplate reader和SOFTMAX Version 2.02軟件(Molecular Devices Corp.，Menlo Park，CA)在550nm檢測(cè)細(xì)胞色素c的吸光度來(lái)確定過(guò)氧化物的產(chǎn)量。
3-10nM DPI或10-30μM 4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟(AEBSF)的NADPH氧化酶抑制劑的共同給藥在將皮層細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于BDNF 36小時(shí)后顯著性地減少神經(jīng)元細(xì)胞體的膨脹和神經(jīng)元死亡(圖14)。
所以，NADPH氧化酶選擇性抑制劑存在時(shí)，NADPH氧化酶介導(dǎo)的過(guò)氧化物產(chǎn)生降低。
實(shí)施例9通過(guò)NADPH氧化酶活化BDNF產(chǎn)生ROSNADPH氧化酶最早是在吞噬細(xì)胞中通過(guò)對(duì)氧的一個(gè)電子的還原作為過(guò)氧化物產(chǎn)生酶被發(fā)現(xiàn)的。我們實(shí)驗(yàn)了通過(guò)NADPH氧化酶活化BDNF是否會(huì)產(chǎn)生ROS的檢測(cè)。
通過(guò)NADPH氧化酶活化的過(guò)氧化物產(chǎn)生，是皮層神經(jīng)元暴露于假操作、100ng/ml BDNF或100ng/ml BDNF加上3nM DPI后32小時(shí)通過(guò)檢測(cè)HEt和DCDHF分別至乙啡啶和DCF的氧化來(lái)進(jìn)行分析(圖15)。BDNF的處理導(dǎo)致Het和DCDHF氧化增加，DPI完全封阻了BDNF-誘導(dǎo)的過(guò)氧化物產(chǎn)生(圖15)。
所以，通過(guò)NADPH氧化酶介導(dǎo)的過(guò)氧化物產(chǎn)生BDNF在皮層神經(jīng)元中產(chǎn)生了氧化應(yīng)激。
實(shí)施例10NADPH氧化酶介導(dǎo)的BDNF神經(jīng)毒性的活化我們檢測(cè)了NADPH氧化酶的活化是否有助于BDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。
將皮層細(xì)胞培養(yǎng)物(DIV12-15)單獨(dú)暴露于100ng/ml BDNF或暴露于100ng/ml BDNF與NADPH氧化酶抑制劑3-10nM DPI、10-30mM 4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟(AEBSF)或1mM 2-羥基-TTBA((2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-芐基氨基)-苯甲酸)一起的情況下。通過(guò)檢測(cè)36小時(shí)后外流到洗浴培養(yǎng)基中的LDH對(duì)神經(jīng)元死亡進(jìn)行分析。
3nM DPI，10mM AEBSF或1mM 2-羥基-TTBA的共同給藥在將皮層培養(yǎng)細(xì)胞暴露于BDNF 36小時(shí)后顯著的減低了神經(jīng)元壞死(圖16)。平均值±SEM(每個(gè)條件下n＝16培養(yǎng)孔)。*，為P＜0.05，使用方差分析和Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，與相關(guān)對(duì)照(單獨(dú)BDNF)相比較具有顯著性差異。
所以，BDNF的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)效果通過(guò)NADPH抑制劑或抗氧化劑對(duì)氧化應(yīng)激的阻斷得到了增強(qiáng)。
實(shí)施例11NT的抗凋亡作用有報(bào)道認(rèn)為BDNF可以防止神經(jīng)元凋亡。如前所述，我們檢測(cè)了諸如NADPH氧化酶抑制劑或抗氧化劑對(duì)BDN F作用的阻斷是否會(huì)影響B(tài)DNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死。
將富含神經(jīng)元的皮層細(xì)胞培養(yǎng)物(DIV 7)去除血清，單獨(dú)(無(wú)血清)或在100ng/ml BDNF，100ng/ml BDNF添加3nM DPI，3nM DPI，100ng/mlBDNF添加100μM trolox或100μM trolox存在的情況下，24或48小時(shí)后對(duì)活的神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)神經(jīng)元死亡進(jìn)行評(píng)估。
無(wú)論DPI還是trolox都不能單獨(dú)地降低去除血清誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。在含有DPI和trolox的情況下BDNF的抗-凋亡作用并不敏感。有意思的是，去除血清后48小時(shí)內(nèi)BDNF的保護(hù)性效果消失了。同時(shí)添加DPI或trolox能夠減弱BDNF引起的延遲神經(jīng)元死亡(圖17)。平均值±SEM(n＝從4個(gè)培養(yǎng)孔中隨機(jī)選出的16個(gè)視野/每個(gè)條件下)。*，P＜0.05，使用方差分析和Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，與相關(guān)對(duì)照(單獨(dú)去除血清)相比較具有顯著性差異。
BDNF給藥可以預(yù)防神經(jīng)元凋亡，而對(duì)BDNF延長(zhǎng)時(shí)間的暴露產(chǎn)生神經(jīng)元細(xì)胞壞死而不會(huì)阻斷BDNF的抗凋亡作用。
以上結(jié)果表明BDNF誘導(dǎo)的NADPH氧化酶的活化和表達(dá)能夠引起氧化性神經(jīng)元壞死，以及NT的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用可在對(duì)促-壞死作用進(jìn)行阻斷情況下達(dá)到最高?？寡趸瘎┗蚱渖窠?jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)具體疾病應(yīng)用如下所述。
以下描述的應(yīng)用實(shí)施例是本發(fā)明實(shí)施例的一部分。本發(fā)明不僅限于這些應(yīng)用實(shí)施例。
應(yīng)用實(shí)施例1阿耳茨海默病(AD)AD的病理性特征為大腦皮層和海馬結(jié)構(gòu)中谷氨酸能(glutamaergic)神經(jīng)元的退行性改變以及在基底前腦中膽堿能神經(jīng)元的退行性改變，淀粉樣蛋白斑的細(xì)胞外沉積，和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(例如神經(jīng)生長(zhǎng)因子[NGF])能夠促進(jìn)諸如基底前腦中膽堿能神經(jīng)元的AD中易受損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)[CNS]神經(jīng)元亞群的活存和表型，表明該分子能夠用于治療神經(jīng)退行性改變相關(guān)的人類疾病(Hefti，1994，J Neurobiol.，25，1418-1435)。在AD中，已有關(guān)于脂過(guò)氧化、8-羥脫氧鳥苷、蛋白羰基、硝化作用或由過(guò)量自由基產(chǎn)生導(dǎo)致的蛋白氧化交聯(lián)的產(chǎn)生的報(bào)道，說(shuō)明氧化應(yīng)激在AD神經(jīng)元死亡中起到成因作用[Vitek et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，914766-4770(1994)；Smith et al.，Trends.Neurosci.，18172-176(1995)，Mol.Chem.Neuropathol.，2841-48(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，949866-9868(1997)；Montine et al.，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55202-210(1996)]。事實(shí)上，抗氧化劑的治療效果在AD患者中已進(jìn)行了深入的調(diào)查。Zn2+在AD患者大腦(杏仁核、海馬、頂下小葉和顳回中部)中，主要在淀粉樣蛋白斑的中心或周圍的積累，并且誘導(dǎo)β淀粉樣蛋白的聚集[Lovell et al.，J.Neurol.Sci.，15847-52(1998)]。所以，本發(fā)明中具有對(duì)氧化應(yīng)激和Zn2+毒性具有保護(hù)效果的化合物能夠作為AD的治療藥物使用。
應(yīng)用實(shí)施例2帕金森氏病(PD)PD是一種由于黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的選擇性死亡而表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能紊亂的神經(jīng)退行性改變疾病。在PD患者中，氧化應(yīng)激已被證明作為神經(jīng)元細(xì)胞死亡的一個(gè)主要機(jī)理，已有產(chǎn)生脂過(guò)氧化反應(yīng)、8-羥脫氧鳥苷、蛋白羰基或硝化作用的報(bào)導(dǎo)，說(shuō)明氧化應(yīng)激在PD神經(jīng)元死亡中是重要的原因(Tatton and Kish，1997，Neuroscience，77，1037-1048；He et al.，2000，Brain Research，858，163-166；Turmel et al.，2001，Mov.Disord.，16，185-189)。許多體內(nèi)研究證明帕金森氏黑質(zhì)凋亡發(fā)生的一些證據(jù)，以及諸如BDNF或GDNF(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子也可在體內(nèi)預(yù)防多巴胺能神經(jīng)元的死亡(Bradford et al.，1999，Adv.Nerurol.，80，19-25；Levivier et al.，1995，J.Neurosci.，15，7810-7820；Olson，1996，Nat.Med.，2，400-401；Gash et al.，1996，Nature，380，252-255)。
所以，本發(fā)明中具有NT神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用和抗氧化劑作用的化合物能夠作為PD的治療藥物使用。
應(yīng)用實(shí)施例3肌萎縮性側(cè)索硬化肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)是一種成年發(fā)作的神經(jīng)學(xué)病癥，其特征在于在臨床發(fā)作2-5年內(nèi)選擇性的下肢和/或上肢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行性改變并導(dǎo)致進(jìn)行性無(wú)力，骨骼肌萎縮和最終的癱瘓和死亡。常染色體顯性的家族性ALS(FALS)在編碼Cu/Zn過(guò)氧化物岐化酶(SOD1)的基因上具有點(diǎn)突變，與對(duì)照患者相比較，蛋白羰基成分，一種氧化破壞的標(biāo)記在SALS患者中增加(Bowling et al.，1993，J.Neurochem.，61，2322-2325)。最近，在肌萎縮性側(cè)索硬化中的BDNF的臨床試驗(yàn)并沒(méi)有表現(xiàn)出有益的效果(Apfel et al.，2001，Clin.Chem.Lab.Med.，39(4)，351-61)。這種不理想的效果可能歸因于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子導(dǎo)致的氧化性神經(jīng)元死亡。所以，可以采用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和抗氧化劑同時(shí)給藥能夠應(yīng)用于有效治療ALS。
應(yīng)用實(shí)施例4缺氧-缺血性損傷當(dāng)局部血栓、血栓顆?；蜓芷屏阎袛嘌毫飨虼竽X的時(shí)候會(huì)發(fā)生中風(fēng)。在缺氧缺血性中，細(xì)胞膜的去極化引發(fā)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)中過(guò)量的Ca2+內(nèi)流，反映出隨后在線粒體中Ca2+的積累([Ca2+]m)。線粒體中過(guò)量的Ca2+導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生。細(xì)胞中積累的ROS會(huì)隨機(jī)地攻擊DNA、脂類和蛋白質(zhì)；因此它們有助于形成缺氧-缺血性神經(jīng)元壞死。ROS和RNS的藥理學(xué)或遺傳學(xué)干涉可對(duì)缺氧-缺血性神經(jīng)元壞死具有神經(jīng)保護(hù)作用(Holtzman et al.，1996，Ann.Neurol.，39(1)，114-122；Ferrer et al.，2001，Actaneuropathol.(Berl.)，101(3)，229-38；Hall et al.，1990，Stroke，21，11183-11187)。由于在發(fā)生神經(jīng)元死亡過(guò)程的缺氧缺血性大腦區(qū)域中，觀察到了DNA梯狀帶、TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元和染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象；所以凋亡以及壞死被認(rèn)為是缺氧缺血性神經(jīng)元死亡其它形式。因此，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和抗氧化劑的同時(shí)給藥能夠用于有效治療缺氧-缺血性損傷。
應(yīng)用實(shí)施例5慢性脊髓損傷對(duì)脊髓的創(chuàng)傷損傷可以導(dǎo)致組織破壞，部分原因是啟動(dòng)反應(yīng)性生物化學(xué)改變。眾多研究為脂過(guò)氧化反應(yīng)、Ca2+內(nèi)流和在脊髓損傷中的細(xì)胞膜破裂提供了相當(dāng)多的支持(Brown and Hall，1992，J.Am.Vet.Med.Assoc.，200，1849-1859；Springer et al.，1997，J.Neurochem.，68，2469-2476；Juurlink andPaterson，1998，J.Spinal cord Med.，21，309-334)，近來(lái)的證據(jù)提供出諸如谷氨酸興奮性中毒、Ca2+過(guò)載和氧化應(yīng)激的神經(jīng)元壞死也會(huì)引起第二次損傷，特異性的Caspase 3酶抑制劑可在大腦創(chuàng)傷模型中明顯地降低神經(jīng)元凋亡(Zhang et al.，1990，J.Neurochem.，59，733-739)。所以，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和抗氧化劑的同時(shí)給藥能夠用于有效治療慢性脊髓損傷。
應(yīng)用實(shí)施例6亨廷頓氏舞蹈病(HD)紋狀體凸出神經(jīng)元在HD中極其易感形成凋亡，氧化應(yīng)激有助于紋狀體凸出的凋亡，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是支持神經(jīng)元存活，維持它們的功能和保護(hù)它們免受不同種類的侵害的蛋白。最近的報(bào)道指出移植諸如GDNF或BDNF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌細(xì)胞系，可以在亨廷頓氏舞蹈病的大鼠模型中保護(hù)紋狀體凸出神經(jīng)元(Perez-Navarro et al.，2000，J.Neurochem.，75(5)，2190-9)。所以，本發(fā)明中的與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和抗氧化劑的同時(shí)給藥顯示神經(jīng)保護(hù)作用的化合物能夠作為HD的有效治療藥物使用。
應(yīng)用實(shí)施例7青光眼或視網(wǎng)膜脫落青光眼是一種慢性的、漸進(jìn)性的通常導(dǎo)致失明的視神經(jīng)病。升高的眼內(nèi)壓(IOP)是青光眼形成過(guò)程中最重要的危險(xiǎn)因素。與在不同的物種中證實(shí)的一樣凋亡導(dǎo)致了青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的死亡。降低IOP一直是青光眼的最重要治療方法。最近的研究表明，在動(dòng)物模型中自由基清除劑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以及其他生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)RGC的存活并且控制由升高IOP誘導(dǎo)的損傷(Ko et al.，2000，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，41(10)，2967-71)。最近的證據(jù)表明BDNF可以通過(guò)維持光受體細(xì)胞的存活、降低在Muller細(xì)胞中的神經(jīng)膠質(zhì)化作用和有可能通過(guò)促進(jìn)外部片斷再生在再附著后的視網(wǎng)膜恢復(fù)中起到輔助作用(Lewiset al.，1999，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，40(7)，1530-1544)。所以，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和抗氧化劑的同時(shí)給藥能夠用于有效地治療青光眼和視網(wǎng)膜脫落。
實(shí)用性應(yīng)用于本發(fā)明中的抗氧化劑能夠阻斷神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死而不影響神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的抗凋亡作用，抗氧化劑和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的共同給藥能夠在諸如中風(fēng)、外傷的急性腦疾病以及諸如阿耳茨海默病和帕金森氏病神經(jīng)退行性改變疾病中用于預(yù)防神經(jīng)元損傷和促進(jìn)再生。
權(quán)利要求
1.通過(guò)抗氧化劑給藥預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的方法。
2.如權(quán)利要求1中所述的預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的方法，其中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與所述抗氧化劑同時(shí)給藥。
3.如權(quán)利要求1或2中所述的預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的方法，其中所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子選自神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3和NT-4/5。
4.如權(quán)利要求1或2中所述的預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的方法，其中所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是BDNF。
5.如權(quán)利要求1或2中所述的預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的方法，其中所述抗氧化劑選自NADPH氧化酶抑制劑、維生素E、維生素E類似物和四氟芐基衍生物。
6.如權(quán)利要求5所述的預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的方法，其中所述NADPH氧化酶抑制劑選自二亞苯碘(DPI)和4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟(AEBSF)中的至少一種。
7.如權(quán)利要求5中所述的預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的方法，其中所述維生素E類似物是trolox。
8.如權(quán)利要求5中所述的預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的方法，其中所述的四氟芐基衍生物選自BAS(5-芐基氨基水楊酸)、TBAS(5-(4-三氟甲基芐基)氨基水楊酸)、NBAS(5-(4-硝基芐基)氨基水楊酸)、CBAS(5-(4-氯芐基)氨基水楊酸)、MBAS(5-(4-甲氧芐基)氨基水楊酸)、FBAS(5-(4-氟芐基)水楊酸)及2-羥基-TTBA(2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4三氟甲基-芐基氨基)-安息香酸。
9.如權(quán)利要求2中所述的預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的方法，其中所述方法用于預(yù)防或治療缺氧-缺血性損傷、慢性脊髓損傷、阿耳茨海默病、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、亨廷頓氏舞蹈病、青光眼或視網(wǎng)膜脫落。
10.如權(quán)利要求1或2中所述的預(yù)防神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的方法，其中所述的神經(jīng)元死亡是神經(jīng)元凋亡和/或壞死。
11.神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的抑制劑，其特征在于所述抑制劑包含選自四氟芐基衍生物中的至少一種，所述衍生物包括作為有效組分的BAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS和2-羥基-TTB。
12.如權(quán)利要求11中所述的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的抑制劑，還含有作為有效組分的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
13.如權(quán)利要求11或12中所述的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的抑制劑，其中所述的神經(jīng)元死亡是神經(jīng)元凋亡和/或壞死。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抑制由神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)產(chǎn)生壞死的方法，更特別的是通過(guò)氧化應(yīng)激抑制劑給藥來(lái)抑制壞死的方法，以及通過(guò)氧化應(yīng)激抑制劑和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子給藥同時(shí)抑制壞死和凋亡的方法。本發(fā)明中的氧化應(yīng)激抑制劑可以抑制由神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞壞死。此外，通過(guò)氧化應(yīng)激抑制劑和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子給藥，本方法可以用于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受與阿耳茨海默病、帕金森氏病和退行性腦病有關(guān)疾病的破壞以及促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的再生。
文檔編號(hào)A61K31/60GK1738627SQ20048000248
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2004年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月20日
發(fā)明者郭秉周, 尹性和, 金宣希, 元碩駿 申請(qǐng)人:紐羅特