專利名稱：低分子量海藻硫酸多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋藥物的研究與開發(fā)，具體講是一種低分子量海藻硫酸多糖的制備方法，其屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
硫酸多糖是多糖組成單位中的一個或多個羥基位置發(fā)生硫酸酯化的多糖。在植物界中，只有藻類中存在天然的硫酸多糖。海藻硫酸多糖是海藻所特有的一類多糖。海藻硫酸多糖具有廣泛的生物活性，包括抗病毒、抗腫瘤、對生長因子作用、對免疫系統(tǒng)作用和抗凝活性等。有報道褐藻多糖硫酸酯和卡拉膠等具有抗HIV-1細胞毒活性(CD4+T淋巴細胞)，可抑制HIV-1對CD4+淋巴細胞系MT-4的感染。此外，海藻硫酸多糖還對其它被膜病毒具有抑制作用，包括單純皰疹病毒HSV、巨細胞病毒、流感A型病毒等。海藻硫酸多糖還是堿性成纖維細胞(bFGF)附著和bFGF依賴性細胞增至的抑制劑，能夠抑制內(nèi)皮細胞形成管狀結(jié)構(gòu)，并具有抗鼠RIF-1腫瘤生長活性。海藻硫酸多糖有兩種抗腫瘤機制。一種通過激活巨噬細胞，直接抑制腫瘤細胞增殖而殺死腫瘤，一種是直接抑制腫瘤生長而不影響正常組織生長，因而是一種安全有效的抑瘤成分。海藻硫酸多糖還表現(xiàn)出一些類肝素多糖的特性，通過肝素輔酶II發(fā)揮抗凝血作用。到目前為止，有些海藻硫酸多糖已經(jīng)表現(xiàn)出潛在的臨床應用前景。
目前存在的問題是天然的海藻硫酸多糖多為大分子量的多糖。由于分子量巨大，因而其粘度較大，不易被機體吸收利用。高分子的海藻硫酸多糖很難通過機體不同的屏障，，甚至細胞膜而達到足夠的血液濃度，或者只能停留在血管內(nèi)而不能達到治療組織。而低分子量多糖可較容易地通過這些屏障。例如肝素寡糖在鼠經(jīng)口給藥實驗中，在血液中發(fā)現(xiàn)了寡糖，表明寡糖在體內(nèi)具有更好地擴散性。大量研究表明，不同海藻硫酸多糖顯示最優(yōu)生物活性的分子量范圍并不相同，因此一種優(yōu)良地降解方法，制備出不同低分子量多糖，對研究海藻硫酸多糖作用機制，改善其已有活性，開發(fā)其新的功用具有重要意義。
目前，國內(nèi)外對多糖降解一般采用酸解法、堿解法、酶解法和超聲波法。這些方法都存在以下不足
1.酸降解，在酸性條件下，多糖降解產(chǎn)品分子量分布較難控制，硫酸根含量變化較大。2004年4月7日公開了一項用酸降解褐藻多糖的專利申請，“海洋硫酸多糖20001地制造方法及其應用(申請?zhí)?3138969.4)”。該專利中提到酸降解后需用硫磺酸補充硫酸根。
2.堿解法，在堿性條件下，往往引起酸性多糖的改性及硫酸根的脫落，影響產(chǎn)品的活性，因此不適用于海藻硫酸多糖。
3.酶解法，酶解法是利用專一性糖苷酶通過開裂多糖中的某一糖苷鍵來達到降解的目的。2003年6月4日公開了一項關(guān)于酶降解褐藻多糖的專利申請，“硫酸化藻聚糖寡糖(申請?zhí)?2147139.8)”。但是由于酶的專一性強，因此不具有廣泛的適用性，而且酶生產(chǎn)周期長，容易失去活性，成本高。這些缺點都使得該法目前無法推廣應用。
4.物理降解法，包括超聲波和微波等方法。這兩種方法由于能耗高，儀器設備條件要求高，樣品處理量小，目前無法應用于工業(yè)生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上對海藻硫酸多糖降解的不足，本發(fā)明提供了一種低分子量海藻硫酸多糖的制備方法。該制備方法是一種氧化降解方法。其降解速度快，試劑用量極少，工藝簡單，成本低廉，所得產(chǎn)品具有與原料相同的特征結(jié)構(gòu)，硫酸根和總糖含量基本保持不變，且分子量分布集中，分子量范圍可以控制。
本發(fā)明的任務是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，研制了一種低分子量海藻硫酸多糖的制備方法，該方法是以天然海藻硫酸多糖為原料，按下列步驟進行(1)稱取定量的海藻硫酸多糖，加熱溶于蒸餾水中，攪拌均勻制成粗制海藻硫酸多糖溶液；(2)在該多糖溶液中加入抗壞血酸和過氧化氫，并按兩者物質(zhì)量的比為1∶0.1～10的比例控制加入；控制加入降解反應液體系中的抗壞血酸和過氧化氫物質(zhì)的量，攪拌均勻后，致使抗壞血酸和過氧化氫物質(zhì)量的最終濃度分別為0.1～50mmol/L和0.1～100mmol/l；(3)控制降解反應液體系的溫度進行恒溫降解，反應時間在0.5～3h；(4)反應完畢后，對反應液進行透析或超濾，除去殘存的抗壞血酸和過氧化氫；(5)將(4)中的透析液或超濾液，進行減壓濃縮，再將濃縮液冷凍干燥；制得分子量為4～100KDa的低分子量海藻硫酸多糖產(chǎn)物；所述的海藻硫酸多糖原料，其為分子量不小于100KDa的海藻硫酸多糖，其包括紅藻中的紫菜多糖和卡拉膠，綠藻中的孔石莼多糖，褐藻中的褐藻多糖硫酸酯。
所述的海藻硫酸多糖溶液，其溶液濃度為0.1～5％。
所述的(2)步控制降解反應液體系中的抗壞血酸和過氧化氫物質(zhì)量的濃度，分別為5～50mmol/l和8～100mmol/l，并在降解反應液體系中控制抗壞血酸與過氧化氫兩者物質(zhì)量的比達到1∶0.3～10，即得海藻硫酸多糖產(chǎn)物的分子量為4～10kD。
所述的(2)步控制降解反應液體系中的抗壞血酸和過氧化氫物質(zhì)的量的濃度，分別為1～30mmol/l和2～50mmol/l，并在降解反應液體系中控制抗壞血酸與過氧化氫兩者物質(zhì)量的比達到1∶0.2～10，即得海藻硫酸多糖產(chǎn)物的分子量為50kD以下。
所述的(2)步控制降解反應液體系中的抗壞血酸和過氧化氫物質(zhì)的量的濃度，分別為0.1～30mmol/l和0.1～50mmol/l，并在降解反應液體系中控制抗壞血酸與過氧化氫兩者物質(zhì)量的比達到1∶0.1～10，即得海藻硫酸多糖產(chǎn)物的分子量為100kD以下。
上述低分子量海藻硫酸多糖的制備方法，所述的(3)步控制降解反應液體系恒溫降解的溫度在4～80℃。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比優(yōu)點在于由于本低分子量海藻硫酸多糖的制備方法是利用具有還原性的抗壞血酸和具有強烈氧化性的過氧化氫協(xié)同作用體系，反應生成適當活潑的氧自由基，攻擊多糖骨架，從而使海藻硫酸多糖降解的分子量范圍可以通過調(diào)控該抗壞血酸和過氧化氫兩試劑的用量和兩試劑之間比例，來對適當活潑的氧自由基攻擊多糖骨架的攻擊程度加以控制，從而實現(xiàn)降解后的多糖分子量范圍可以控制。本發(fā)明的方法成本低廉，僅用兩種試劑(抗壞血酸和過氧化氫)且試劑用量極少；而且工藝簡單，在常溫下，即可獲得分子量分布集中，均一性好的海藻硫酸多糖降解產(chǎn)物；該產(chǎn)物與原料具有相同的特征結(jié)構(gòu)，硫酸根和總糖含量也與原料保持相同水平，而且該產(chǎn)物的溶解性卻大大提高，其生物活性也明顯增強。
附圖及其實施例本發(fā)明的實施例結(jié)合附圖進一步說明如下

圖1為低分子量壇紫菜多糖的高效液相色譜。
圖2為低分子量壇紫菜多糖的紅外圖譜。
圖3為低分子量條斑紫菜多糖的紅外圖譜。
圖4為低分子量條斑紫菜多糖的高效液相色譜。
參見圖1的高效凝膠滲透色譜，其是實例1的壇紫菜多糖的高效凝膠滲透色譜。該圖顯示所得產(chǎn)物的重均分子量(Mw)為34537，數(shù)均分子量(Mn)為13800，多分散指數(shù)(MWD)為2.5。
參見圖2的紅外圖譜，其是實例1的壇紫菜多糖的紅外圖譜。圖中顯示3600～3200cm-1，3000～2800cm-1，1400～1200cm-1，1200～1000cm-1處有多糖特征性吸收峰存在。1224cm-1是硫酸根特征性吸收峰，934cm-1是3，6內(nèi)醚半乳糖特征性吸收峰。
參見圖3的紅外圖譜，其是實例4的條斑紫菜多糖的紅外圖譜。圖中顯示3600～3200cm-1，3000～2800cm-1，1400～1200cm-1，1200～1000cm-1處有多糖特征性吸收峰存在。1226.34cm-1是硫酸根特征性吸收峰，933cm-1是3，6內(nèi)醚半乳糖特征性吸收峰。
參見圖4的高效凝膠滲透色譜，其是實例4的條斑紫菜多糖的高效凝膠滲透色譜，該圖顯示所得產(chǎn)物的重均分子量(Mw)為29695，數(shù)均分子量(Mn)為11991，多分散指數(shù)(MWD)為2.48。
本發(fā)明的粗制海藻硫酸多糖的提取實施例如下所述的粗制海藻硫酸多糖原料，其為分子量在100KDa以上的海藻硫酸多糖，其包括紅藻中的紫菜多糖、卡拉膠，綠藻中的石莼多糖，褐藻中的褐藻多糖硫酸酯。
例如紫菜多糖的提取稱取定量的自然晾干的紅藻中的壇紫菜，剪碎；加40倍量的蒸餾水，120℃提取3小時，將提取液過濾，濾渣再加40倍量的蒸餾水重復提取一次，合并兩次濾液；用硅藻土做助濾劑過濾；濾液用透析袋透析，取透析液；減壓濃縮至1/3體積濃縮液用硅藻土做助濾劑過濾；將上述濾液加入到95％的乙醇溶液中，使該溶液的最終乙醇濃度為75％；將上述乙醇濃縮液中的沉淀物用篩絹過濾之后，再將沉淀物置于95％的乙醇溶液中脫水；將上述沉淀物干燥后粉碎，得到提純的白色纖維狀的粗制的壇紫菜多糖。
本發(fā)明的低分子量海藻硫酸多糖的制備方法是以上述海藻硫酸多糖為原料，按下列步驟進行(1)稱取定量的海藻硫酸多糖，加熱溶于蒸餾水中，攪拌均勻制成粗制海藻硫酸多糖溶液；(2)再在該多糖溶液中加入抗壞血酸和過氧化氫，并按兩者物質(zhì)量的比為1∶0.1～10的比例控制加入；控制加入降解反應液體系中的抗壞血酸和過氧化氫物質(zhì)的量，攪拌均勻后，使抗壞血酸和過氧化氫物質(zhì)的量的最終濃度分別為0.1～50mmol/L和0.1～100mmol/l；(3)控制降解反應液體系的恒溫降解，反應時間在0.5～3h；(4)反應完畢后，對反應液進行透析或超濾，除去殘存的抗壞血酸和過氧化氫；
(5)將(4)中的透析液或超濾液，進行減壓濃縮，再將濃縮液冷凍干燥；制得形狀呈白色至淺黃色的低分子量海藻硫酸多糖產(chǎn)物；具體工藝條件見表1表1，海藻硫酸多糖降解工藝條件及產(chǎn)物分子量 實例1.壇紫菜多糖降解之后6000r/m離心20min，上清液透析24h，除去殘存的抗壞血酸和過氧化氫；之后再濃縮干燥，得產(chǎn)物。產(chǎn)物的分子量測定方法是用凝膠滲透色譜法，示差檢測器，采用0.7％Na2SO4做流動相，柱溫35攝氏度，測得上述數(shù)據(jù)。
實例2——5海藻硫酸多糖降解實例，其多糖制備方法同實例1操作，多糖濃度、抗壞血酸和過氧化氫的量、反應時間和溫度如表1所示。降解之后6000r/m離心20min，上清液透析24h，除去殘存的抗壞血酸和過氧化氫；之后再濃縮干燥，得產(chǎn)物。
實例6——14海藻硫酸多糖降解實例，其多糖多糖濃度、抗壞血酸和過氧化氫的量、反應時間和溫度如表1所示。制備步驟同實例1操作。降解之后反應溶液透析48h，除去殘存的抗壞血酸和過氧化氫；之后再濃縮干燥，得產(chǎn)物。具體產(chǎn)物的理化參數(shù)實施例見表2。
表2，本發(fā)明產(chǎn)物的理化參數(shù)

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會理解，在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，對于上述實施例進行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種低分子量海藻硫酸多糖的制備方法，其特征在于該方法是以粗制海藻硫酸多糖為原料，按下列步驟進行(1)稱取定量的海藻硫酸多糖，加熱溶于蒸餾水中，攪拌均勻制成海藻硫酸多糖溶液；(2)在該多糖溶液中加入抗壞血酸和過氧化氫，并按兩者物質(zhì)量的比為1∶0.1～10的比例控制加入；控制加入降解反應液體系中的抗壞血酸和過氧化氫物質(zhì)的量，攪拌均勻后，致使抗壞血酸和過氧化氫物質(zhì)量的最終濃度分別為0.1～50mmol/L和0.1～100mmol/l；(3)控制降解反應液體系的溫度進行恒溫降解，反應時間在0.5～3h；(4)反應完畢后，對反應液進行透析或超濾，除去殘存的抗壞血酸和過氧化氫；(5)將(4)中的透析液或超濾液，進行減壓濃縮，再將濃縮液冷凍干燥；制得分子量在4～100KDa的低分子量海藻硫酸多糖產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述低分子量海藻硫酸多糖的制備方法，其特征在于所述的海藻硫酸多糖原料，其為分子量不小于100KDa的海藻硫酸多糖，包括紅藻中的紫菜多糖、卡拉膠，綠藻中的石莼多糖，褐藻中的褐藻多糖硫酸酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述低分子量海藻硫酸多糖的制備方法，其特征在于所述的海藻硫酸多糖溶液，其濃度為0.1～5％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述低分子量海藻硫酸多糖的制備方法，其特征在于所述的(2)步控制降解反應液體系中的抗壞血酸和過氧化氫物質(zhì)量的濃度，分別為5～50mmol/l和8～100mmol/l，并在降解反應液體系中控制抗壞血酸與過氧化氫兩者物質(zhì)量的比達到1∶0.3～10，即得海藻硫酸多糖產(chǎn)物的分子量為4～10kD。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述低分子量海藻硫酸多糖的制備方法，其特征在于所述的(2)步控制降解反應液體系中的抗壞血酸和過氧化氫物質(zhì)的量的濃度，分別為1～30mmol/l和2～50mmol/l，并在降解反應液體系中控制抗壞血酸與過氧化氫兩者物質(zhì)量的比達到1∶0.2～10，即得海藻硫酸多糖產(chǎn)物的分子量為50kD以下。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述低分子量海藻硫酸多糖的制備方法，其特征在于所述的(2)步控制降解反應液體系中的抗壞血酸和過氧化氫物質(zhì)的量的濃度，分別為0.1～30mmol/l和0.1～50mmol/l，并在降解反應液體系中控制抗壞血酸與過氧化氫兩者物質(zhì)量的比達到1∶0.1～10，即得海藻硫酸多糖產(chǎn)物的分子量為100kD以下。
7.根據(jù)權(quán)利要求1——6中任一項所述低分子量海藻硫酸多糖的制備方法，其特征在于所述的(3)步控制降解反應液體系恒溫降解的溫度在4～80℃。
全文摘要
本發(fā)明的低分子量海藻硫酸多糖的制備方法是以天然海藻硫酸多糖為原料，將海藻硫酸多糖溶液中加入抗壞血酸和過氧化氫，按兩者物質(zhì)的量的比1∶0.1～10控制加入，攪拌致使兩物質(zhì)量的最終濃度分別為0.1～50mmol/L和0.1～100mmol/l，控制反應溫度，恒溫降解時間在0.5～3h，再透析或超濾，減壓濃縮，冷凍干燥，制得分子量為4～100KDa的低分子量海藻硫酸多糖產(chǎn)物。該方法降解速度快，試劑用量極少，工藝簡單，常溫下可獲得分子量分布集中，均一性好的海藻硫酸多糖降解產(chǎn)物。該產(chǎn)物與原料有相同的結(jié)構(gòu)，硫酸根和總糖含量基本保持不變，分子量范圍可控，其溶解性大大提高，生物活性也明顯增強。
文檔編號A61K31/734GK1616494SQ20041008368
公開日2005年5月18日 申請日期2004年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月18日
發(fā)明者張全斌, 趙婷婷, 牛錫珍, 張虹, 綦慧敏, 徐祖洪, 李智恩 申請人:中國科學院海洋研究所