專利名稱：一種對(duì)輻照危害有保護(hù)功能的產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能對(duì)輻照危害有保護(hù)功能和輔助治療功能的產(chǎn)品的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著和平和軍事目的核技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展(核試驗(yàn)、核電站、核工業(yè)中的鈾礦的開采，核燃料的生產(chǎn)、后處理，用于軍事目的的導(dǎo)彈、核潛艇、核動(dòng)力衛(wèi)星……)，隨著在醫(yī)學(xué)(應(yīng)用放射線進(jìn)行醫(yī)療診斷和治療)、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)(金屬X射線探傷、輻照育種、食品藥品的輻照殺菌……)和科研中放射性同位素輻射源日益廣泛的應(yīng)用，我國(guó)職業(yè)性受照人群日益增多，受輻照情況大致如下職業(yè)人均年有效照射劑量核工業(yè)4.5mSv/a醫(yī)用診斷X射線、核磁共振等醫(yī)務(wù)人員 2.08mSv/a工業(yè)探傷、測(cè)井、輻照加工等1.5mSv/a飛行機(jī)組人員(按年飛行時(shí)間<1000小時(shí)計(jì)> ＜10.6mSv/a當(dāng)前國(guó)際社會(huì)局部沖突不斷，核武器和貧鈾武器的不斷研制和使用。核彈或貧鈾彈爆炸產(chǎn)生的放射性核素釋放到環(huán)境中，對(duì)人體構(gòu)成外照射，也可通過污染飲水、食物進(jìn)入體內(nèi)形成內(nèi)照射。由于鈾的半衰期達(dá)萬年以上，因此在戰(zhàn)爭(zhēng)中乃至戰(zhàn)爭(zhēng)結(jié)束后，核輻射仍將長(zhǎng)期對(duì)人體構(gòu)成看不見的威脅。
放射性治療是腫瘤病人常用的治療方法之一。放射線在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)不可避免的會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成輻照損傷。
輻射可引起機(jī)體代謝紊亂，造成神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)障礙，破壞機(jī)體組織的蛋白質(zhì)、核蛋白和酶等。輻射可致機(jī)體產(chǎn)生各種損傷，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致骨髓型放射病，胃腸型放射病，腦型放射病，肺部纖維化，胎兒畸形、智力障礙、死胎，誘發(fā)腫瘤及造成衰老。因此，研究對(duì)輻照危害有保護(hù)功能的產(chǎn)品有重要意義。
目前用于放射病防治的第一類藥物為含硫基或巰基的化合物，其缺點(diǎn)是在體內(nèi)毒性大、代謝快、半衰期一般只有2-4小時(shí)。第二類藥物為雌激素類，不適合男性長(zhǎng)期使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用富硒麥芽，開發(fā)其在人體受到輻照危害時(shí)起保護(hù)作用方面的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用富硒麥芽作為制備能在人體受到輔照危害時(shí)起保護(hù)作用的產(chǎn)品方面的應(yīng)用；富硒麥芽除具有已有技術(shù)中的各種功能外，還在抗輻照損傷方面具有很好的保護(hù)作用，這里所述的富硒麥芽，既專利號(hào)為85107995·4中的富硒麥芽，在下述實(shí)驗(yàn)報(bào)告中簡(jiǎn)稱為硒麥芽；口服富硒麥芽可以在人體受到輻照傷害時(shí)起保護(hù)作用。
這種富硒麥芽可在職業(yè)性受照人群中或在放射性污染環(huán)境中生活的人群中長(zhǎng)期服用，用以減輕輻照對(duì)人體的傷害，且對(duì)人體無毒副作用；也可在進(jìn)行放療的腫瘤病人中服用富硒麥芽，可以起到減輕放療對(duì)正常細(xì)胞造成的傷害，從而起到輔助治療的作用。


圖1照射組 10G 15天圖2照射組 10G 30天圖3照射組 10G 60天圖4補(bǔ)硒照射組 10G 15天圖5補(bǔ)硒照射組 10G 30天圖6補(bǔ)硒照射組 10G 60天圖7照射組 20G 15天圖8照射組 20G 30天圖9補(bǔ)硒照射組 20G 15天圖10補(bǔ)硒照射組 20G 30天圖11硒麥芽對(duì)小鼠全身放射線照射血清蛋白質(zhì)指紋圖譜的影響具體實(shí)施方式
附件1富硒麥芽毒性報(bào)告書(北京市衛(wèi)生防疫站)附件2硒麥芽對(duì)放射性損傷的防護(hù)作用實(shí)驗(yàn)報(bào)告一(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)附件3用蛋白質(zhì)表達(dá)指紋圖譜研究硒麥芽對(duì)放射性損傷的防護(hù)作用實(shí)驗(yàn)報(bào)告二(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)通過附件1我們可以看到富硒麥芽對(duì)人體無毒副作用。
通過附件2、附件3我們可以看到富硒麥芽具有抗輻照損傷作用。
附件2中的實(shí)驗(yàn)以鈷60γ射線照射動(dòng)物肺部，建立輻照損傷動(dòng)物模型，試驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組、照射組、硒麥芽+照射組。
體重試驗(yàn)結(jié)果照射組動(dòng)物體重最輕，硒麥芽+照射組動(dòng)物體重高于照射組，表明硒麥芽+照射組動(dòng)物的健康狀況優(yōu)于照射組。
肺濕重試驗(yàn)結(jié)果動(dòng)物肺部經(jīng)放射線照射后會(huì)引起肺部水腫，使肺濕重增加。兩組經(jīng)照射的大鼠肺濕重均高于相應(yīng)的正常組，說明照射后早期能引起肺部水腫。硒麥芽+照射組動(dòng)物肺濕重低于照射組，說明對(duì)照射大鼠補(bǔ)硒麥芽，肺部水腫減輕，硒麥芽減輕了肺部的輻照損傷。
從外觀可見硒麥芽+照射組動(dòng)物毛色有光澤，而照射組毛色澤暗淡且脫毛嚴(yán)重，表明硒麥芽+照射組動(dòng)物健康明顯優(yōu)于照射組。
生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果輻照使機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基、引發(fā)脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致人體損害的重要原因。生化指標(biāo)丙二醛(MDA)含量反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化嚴(yán)重程度，而超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)能清除機(jī)體內(nèi)自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。因此，試驗(yàn)中用這些指標(biāo)考察硒麥芽對(duì)輻照的拮抗作用。試驗(yàn)結(jié)果硒麥芽+照射組MDA含量明顯低于照射組，而SOD活力、GSH-Px活力明顯高于照射組，表明對(duì)照射大鼠補(bǔ)硒麥芽能減輕輻照損傷。
病理結(jié)果大體觀察結(jié)果和光鏡觀察結(jié)果硒麥芽+照射組動(dòng)物肺部各種病變均比照射組減輕。顯示富硒麥芽可以減輕輻照損傷。
附件3進(jìn)一步用先進(jìn)的蛋白質(zhì)表達(dá)指紋圖譜技術(shù)研究硒麥芽對(duì)放射性損傷的防護(hù)作用，以鈷60γ射線對(duì)動(dòng)物實(shí)施全身照射，結(jié)果照射組由于放射性損傷，其血清蛋白質(zhì)指紋圖譜與正常組比有明顯變化。而硒麥芽+照射組由于硒麥芽對(duì)放射性損傷的防護(hù)作用，蛋白質(zhì)的異常表達(dá)得到改善，與正常組蛋白質(zhì)指紋圖譜基本一致。故通過蛋白質(zhì)表達(dá)指紋圖譜技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)硒麥芽對(duì)放射性損傷起防護(hù)作用。
綜合以上的實(shí)驗(yàn)報(bào)告我們可以看到，對(duì)于長(zhǎng)期受輻照危害的人群服用富硒麥芽可以減輕輻照對(duì)人體的傷害，且對(duì)人體無毒副作用；對(duì)于進(jìn)行放療的腫瘤病人服用富硒麥芽，可以起到減輕放療對(duì)正常細(xì)胞造成的傷害，從而起到輔助治療的作用。
富硒麥芽也可以和維生素E等營(yíng)養(yǎng)素或枸杞子等中草藥同時(shí)使用，減輕輻照對(duì)人體的危害。
實(shí)施例一，對(duì)于放療的腫瘤病人，從放療前一周開始及放療過程中至放療結(jié)束口服富硒麥芽，劑量為每天含硒800微克的富硒麥芽，可以減輕放療對(duì)正常細(xì)胞的損害。
實(shí)施例二，對(duì)于長(zhǎng)期受輻照危害的人群，堅(jiān)持長(zhǎng)期每天定量口服富硒麥芽，可以減輕輻照對(duì)人體的傷害，劑量為國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)(400微克硒/天)以內(nèi)。
北京市衛(wèi)生防疫站毒性報(bào)告書

試驗(yàn)者秦秦復(fù)核者姚噯硒麥芽對(duì)放射性損傷的防護(hù)作用實(shí)驗(yàn)一一.材料1.化學(xué)試劑硒麥芽北京食品工業(yè)研究所。
戊巴比妥鈉軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-PX)活力及丙二醛(Maleic Dialdehyde，MDA)和蛋白含量檢測(cè)試劑盒南京建成生物工程研究所。
磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)等其他試劑皆為分析純。
2.主要儀器恒溫水浴鍋余姚電訊儀表實(shí)業(yè)公司臺(tái)式離心機(jī)北京離心機(jī)廠低溫高速離心機(jī)SIGMA公司2K15萬分之一天平瑞士梅特勒公司生產(chǎn)紫外分光光度計(jì)PERKIN ELMER公司微量加樣器eppendorf公司旋渦混合器江蘇麒麟醫(yī)用儀器廠二.方法1.動(dòng)物及分組1.1大鼠 2月齡雌性Wistar大鼠75只(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重160～210g。隨機(jī)分為5組正常對(duì)照組、照射組(10Gy)、照射組(20Gy)、硒麥芽+照射組(10Gy)和硒麥芽+照射組(20Gy)，每組15只。其中硒麥芽+照射組從照射前7天開始喂硒麥芽4000mg/kg·d(硒160μg/kg·d)，灌胃7天，正常對(duì)照組和照射組同時(shí)喂蒸餾水，直至照射當(dāng)天停止喂硒麥芽和水。
1.2小鼠 KM種小鼠雌性30只(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重18～22g。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、照射組(6Gy)和硒麥芽+照射組(6Gy)，每組10只。其中硒麥芽+照射組從照射前7d開始喂硒麥芽4000mg/kg·d(硒160μg/kg·d)，灌胃7天，正常對(duì)照組和照射組同時(shí)喂蒸餾水，直至照射當(dāng)天停止喂硒麥芽和水。
2.照射方法Wistar大鼠用5％戊巴比妥鈉(90mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于自行設(shè)計(jì)的木板架上，胸部對(duì)準(zhǔn)鈷源，周圍用10cm厚鉛磚屏蔽，用60Coγ射線全胸照射(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院鈷源中心).照距為3m，照射野為4.5cm×4.0cm，劑量率為599.85×10-4C.kg-1，一次照射完成。10Gy組照射時(shí)間為3分鐘15秒，20Gy組照射時(shí)間為6分鐘36秒。
KM小鼠則實(shí)施一次性全身照射，照射劑量為6Gy。照距3m，劑量率599.85×10-4C.kg-1，照射時(shí)間為2分鐘。
3.標(biāo)本制備Wistar大鼠照射后第15天、30天、60天各組均活殺5只，取左肺凍存做組織損傷檢測(cè)，右肺浸于固定液中(1000ml固定液中含40％甲醛120ml，NaH2PO44g，Na2HPO413g)留做病理學(xué)觀察用的石蠟切片。
KM小鼠照射后第7天、第14天各組均活殺5只，留血清待測(cè)。
4.各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)4.1組織樣品準(zhǔn)備a.取肺組織塊0.5g在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入5ml的小燒杯內(nèi)；b.取9倍組織塊重量的0.86％生理鹽水，再用移液管移取總量2/3置于燒杯中，用眼科剪盡快剪碎組織塊放于燒杯中；c.將剪碎的組織倒入玻璃勻漿器中，再將剩余的1/3冷生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的組織塊，一起倒入勻漿器制成10％的組織勻漿；d.將制備好的勻漿液以3000rpm/min離心10～15分鐘，棄沉淀留上清液待用。
4.2蛋白含量測(cè)定按試劑盒要求進(jìn)行a.原理當(dāng)棕紅色的考馬斯亮蘭CBBG250顯色劑加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中時(shí)，染料上的陰離子與蛋白質(zhì)分子中的-NH3+結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{(lán)色，通過測(cè)吸光度可計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。
b.試劑準(zhǔn)備CBBG250貯備液60ml，用前用蒸餾水5倍稀釋，蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(70.7g/L)用生理鹽水稀釋成1.2mg/ml。
c.測(cè)定步驟(1)空白管加0.05ml蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)管加0.05ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定管加0.05ml樣品。
(2)各管加3ml顯示劑混勻，靜置10分鐘，倒入比色杯中測(cè)各管在波長(zhǎng)595nm吸光度，空白管調(diào)零。
(3)結(jié)果按下式計(jì)算蛋白含量 4.3超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)按試劑盒要求進(jìn)行a.原理通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2-)，后者與氧化羥胺形成亞硝酸鹽，而SOD對(duì)其有專一性抑制作用，亞硝酸鹽在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，可用分光光度計(jì)測(cè)吸光度。并與對(duì)照管比對(duì)，通過公式計(jì)算被測(cè)樣品中的SOD活力(即抑制率)。
b.試劑準(zhǔn)備1號(hào)試劑10ml，用時(shí)熱水浴溶解，加熱蒸餾水稀釋至100ml。
2號(hào)和3號(hào)試劑各7ml可直接應(yīng)用。
4號(hào)試劑0.5ml及稀釋液7ml，用時(shí)二者1∶14稀釋。
5號(hào)和6號(hào)試劑加蒸餾水75ml溶解后待用，顯色劑用5號(hào)試劑∶6號(hào)試劑∶冰乙酸＝3∶3∶2的體積比配成待用。
c.測(cè)定步驟(1)各管加1ml 1號(hào)試劑后，對(duì)照管加1ml蒸餾水，測(cè)定管加0.5ml樣品和0.51ml蒸餾水。
(2)各管分別加0.1ml 4號(hào)試劑后用充分混勻，置37℃恒溫水浴箱水浴40分鐘。
(3)各管加2ml顯色劑后混勻，10分鐘后倒入1cm直徑比色杯中，波長(zhǎng)550nm處比色，蒸餾水調(diào)零。
(4)按下式計(jì)算出組織勻漿中SOD活力計(jì)算公式 ※一個(gè)亞硝酸鹽單位指每毫克組織蛋白在1ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50％是所對(duì)應(yīng)的SOD量。
4.4丙二醛(MDA)檢測(cè)按試劑盒要求進(jìn)行a.原理丙二醛為過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物，可與硫代巴比妥酸(TBA)縮和形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰。
b.試劑準(zhǔn)備1號(hào)試劑6ml用前適當(dāng)水浴加溫以加速溶解，直至透明后應(yīng)用。
2號(hào)試劑6ml用時(shí)加170ml雙蒸水混勻。
3號(hào)試劑用時(shí)加入到90℃～100℃的熱雙蒸水30ml中，充分溶解后混勻，避光待用。
標(biāo)準(zhǔn)品為乙氧基丙烷5ml(10nmol/ml)混合試劑以1號(hào)試劑、2號(hào)試劑、3號(hào)試劑體積比為1∶3∶1比例配制而成。
c.測(cè)定步驟(1)標(biāo)準(zhǔn)管加1ml標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)空白管加1ml無水乙醇，各測(cè)定管加1ml樣品。
(2)各管加入4ml混合試劑后混勻，試管口用保鮮膜扎緊，刺一小孔，95℃水浴40分鐘。
(3)取出后冷卻，以3500～4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。
(4)取上清倒入比色杯中于波長(zhǎng)532nm處比色測(cè)各管吸光度值，蒸餾水調(diào)零。
(5)按下面公式計(jì)算組織中MDA含量 4.5谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力檢測(cè)按試劑盒要求進(jìn)行a.原理谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)可以促進(jìn)過氧化氫(H2O2)與還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)生成H2O及氧化型谷脫甘肽(GSSG)，測(cè)定此酶促反應(yīng)中還原型谷胱甘肽的消耗，可求出酶的活力。
b.試劑準(zhǔn)備1號(hào)試劑用時(shí)現(xiàn)取1ml加蒸餾水至100ml配成應(yīng)用液。
2號(hào)試劑用時(shí)加90℃～100℃的熱蒸餾水至210ml，充分溶解后濾紙過濾，待用。
3號(hào)試劑加蒸餾水200ml溶解，室溫保存。
4號(hào)和5號(hào)試劑用時(shí)分別加蒸餾水50ml/支和10ml/支溶解待用。
1mmol/L和20μmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液配制見試劑盒說明。
c.測(cè)定步驟(1)對(duì)照管和測(cè)試管加1mmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2ml，然后在測(cè)試管中加0.2ml樣品，37℃水浴預(yù)溫5分鐘。后各管加入0.1ml 1號(hào)試劑。
(2)每管加入2ml 2號(hào)試劑后在對(duì)照管中加入0.2ml樣品后混勻，3500-4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清2ml準(zhǔn)備測(cè)試。并準(zhǔn)備2號(hào)試劑2ml做空白管，取20μmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液2ml做標(biāo)準(zhǔn)管。
(3)每管加2ml 3號(hào)試劑，0.5ml 4號(hào)試劑和0.1ml 5號(hào)試劑后混勻，15分鐘后倒入比色杯于412nm處測(cè)各管OD值，蒸餾水調(diào)零。
(4)按下式計(jì)算GPX酶活力 ※指每毫克蛋白質(zhì)，每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1μmol/L時(shí)定為一個(gè)酶活力單位。
5.病理切片由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事病理專業(yè)組按常規(guī)切片。
6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用SAS軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析三.結(jié)果
1.一般情況觀察動(dòng)物體重和肺濕重的變化結(jié)果(表1和表2)。
體重結(jié)果顯示照射組動(dòng)物體重最輕。硒麥芽+照射組(20Gy)和照射組(20Gy)與正常對(duì)照組相比在照射后體重有明顯的降低，但硒麥芽+照射組動(dòng)物體重高于照射組，表明硒麥芽+照射組動(dòng)物的健康狀況優(yōu)于照射組。
肺濕重結(jié)果顯示照射后大鼠肺濕重均高于相應(yīng)的正常組，說明照射后早期能引起肺部水腫。對(duì)照射大鼠補(bǔ)硒麥芽，肺部水腫減輕，說明補(bǔ)硒麥芽對(duì)大鼠肺部照射有一定的保護(hù)作用。
從外觀可見硒麥芽+照射組大鼠毛色有光澤，照射組色澤暗淡且脫毛較嚴(yán)重。表明硒麥芽+照射組動(dòng)物的健康狀況明顯優(yōu)于照射組。
表1.硒麥芽對(duì)大鼠胸放射照射后體重的影響組別 數(shù)目(只) 不同時(shí)間點(diǎn)的體重(g)0天15天 30天 60天對(duì)照組 15162.4±6.3 215.0±7.8 246.5±9.6261.5±9.61照射組(20Gy) 15160.0±4.0 178.0±14.0 192.0±9.2* 236.0±3.8*硒麥芽+照射組(20Gy) 15165.0±3.5 190.0±8.7 202.0±14.1* 244.0±9.8*注*與對(duì)照組相比P＜0.05表2.硒麥芽對(duì)大鼠胸放射照射后肺濕重的影響組別 數(shù)目(只) 不同時(shí)間點(diǎn)的肺濕重(g)15天30天對(duì)照組 15 1.19±0.11 1.36±0.04照射組(20Gy) 15 1.63±0.10* 2.64±0.17*硒麥芽+照射組(20Gy) 15 1.53±0.13* 2.43±0.15*注*與對(duì)照組相比P＜0.052.肺組織學(xué)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果通過對(duì)放射性照射大鼠肺中MDA含量和SOD及GSH-PX酶活性的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)①M(fèi)DA含量與對(duì)照組相比，照射組(10Gy)30天和60天MDA含量明顯升高(P＜0.05)，而硒麥芽+照射組(10Gy)只有照射60天MDA含量才出現(xiàn)較明顯升高。而與照射組相比，硒麥芽+照射組MDA含量明顯低于照射組(P＜0.05)；②SOD活力硒麥芽+照射組比相應(yīng)劑量照射組SOD活力明顯升高(P＜0.05)；③GSH-PX活力硒麥芽+照射組比相應(yīng)劑量照射組GSH-PX活力高。
表3.硒麥芽對(duì)大鼠胸放射照射后肺組織MDA含量的影響組別 數(shù)目(只) 肺組織MDA含量(nmol/mgprot)15天30天60天對(duì)照組 15 9.56±0.52 9.45±1.23 9.68±1.09照射組(10Gy) 15 11.34±0.81 19.93±1.56*21.89±0.96*硒麥芽+照射組(10Gy) 15 10.23±2.33 12.57±1.45△ 13.48±2.53*△照射組(20Gy) 15 24.24±2.61*26.74±4.51*31.43±3.85*硒麥芽+照射組(20Gy) 15 16.64±0.65*△ 17.36±9.37*△ 18.98±4.76*△注*與對(duì)照組相比P＜0.05△與相應(yīng)劑量照射組相比P＜0.05表4.硒麥芽對(duì)大鼠胸放射照射后肺組織SOD活力的影響組別 數(shù)目(只) 肺組織SOD活力(NU/mgprot)15天 30天 60天對(duì)照組 15 39.18±5.94 41.26±4.81 43.65±5.21照射組(10Gy) 15 41.39±7.18 50.13±2.39*53.00±2.33*硒麥芽+照射組(10Gy) 15 58.13±3.75*△ 69.20±6.22*△ 72.41±5.23*△照射組(20Gy) 15 52.03±6.43* 55.34±8.09*57.84±4.27*硒麥芽+照射組(20Gy) 15 75.69±3.72*△ 79.02±7.98*△ 86.28±4.65*△注*與對(duì)照組相比P＜0.05△與相應(yīng)劑量照射組相比P＜0.05表5.硒麥芽對(duì)大鼠胸放射照射后肺組織GSH-PX活力的影響組別 數(shù)目(只) 肺組織GSH-PX活力15天30天 60天對(duì)照組 15 59.25±19.6354.62±15.2753.79±17.64照射組(10Gy) 15 78.49±9.76*81.45±9.03*84.71±15.73*硒麥芽+照射組(10Gy) 15 67.51±10.35105.20±8.79* 96.44±4.24*照射組(20Gy) 15 77.03±24.71* 79.84±8.07*82.35±11.26*硒麥芽+照射組(20Gy) 15 87.02±5.37*85.25±5.94*92.64±4.57*注*與對(duì)照組相比P＜0.053.病理結(jié)果3.1大體觀察正常對(duì)照組動(dòng)物肺組織表面光滑，為海綿狀，色澤粉紅。照射組隨處可見肺部有濕性滲出，1個(gè)月時(shí)最為顯著，4個(gè)月減輕，動(dòng)物肺組織重量明顯增加，且肺表面呈灶性病變，有的動(dòng)物肺門附近有褐色斑點(diǎn)凝聚，嚴(yán)重者肺臟外形消失，個(gè)別動(dòng)物肺組織喪失彈性呈暗褐色。
3.2光鏡觀察(1)正常對(duì)照組為正常大鼠肺組織結(jié)構(gòu)。
(2)照射組(10Gy)照射后15天和30天，以滲出病變?yōu)橹?。肺間質(zhì)及肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、出血，肺泡壁和肺泡腔內(nèi)有蛋白滲出，肺泡隔可見中度增厚(見圖1和圖2)。照射后2個(gè)月，肺泡壁滲出病變?nèi)暂^明顯，肺仍有充血出血，且肺泡壁呈炎性增厚，肺泡腔變小，肺泡隔較30天時(shí)更加增厚，局部有重度增厚，使肺泡腔成裂隙狀，支氣管腔見炎細(xì)胞。個(gè)別部位亦見局部性肺不張，部分肺泡腔處有多個(gè)泡沫狀大細(xì)胞(見圖3)。
(3)硒麥芽+照射組(10Gy)照射后不同時(shí)間點(diǎn)，各種病變與單純照射10Gy相比均有所減輕(見圖4、圖5、圖6)，但仍可見肺充血、出血，肺泡壁增厚，以輕度肺泡隔增厚為主，肺泡腔內(nèi)病變少。肺泡腔變小，個(gè)別局部肺不張。
(4)單純照射20Gy組照射后15天(見圖7)，組織約中等程度肺泡隔增厚，與單純照射10Gy比其內(nèi)見大量細(xì)胞壞死，巨噬細(xì)胞增生，泡沫細(xì)胞增多，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。部分區(qū)域散在出血(肺泡腔、肺泡隔內(nèi))，小氣道周圍有淋巴細(xì)胞聚集，其內(nèi)見單核細(xì)胞；照射后30天，與15天相比肺泡隔增厚程度加重，部分區(qū)域肺泡腔被增厚的肺泡隔所填充，散在出血，肺泡腔內(nèi)滲出，呈小葉性肺炎的改變。泡沫細(xì)胞較半個(gè)月明顯增多，核見大量異常細(xì)胞，核大，核仁明顯，偶見多核，染色質(zhì)粗，位于肺泡隔內(nèi)，可能具有吞噬功能(見圖8)。
(5)硒麥芽+照射組(20Gy)照射后不同時(shí)間點(diǎn)，肺內(nèi)各種病變均較照射組有所減輕，可見充血、壞死，肺泡隔增厚程度減輕，肺泡腔內(nèi)有輕度滲出，支氣管內(nèi)有紅細(xì)胞(見圖9、圖10)。
3.3病理變化的半定量鑒定以肺泡壁增厚程度積分統(tǒng)計(jì)觀察硒麥芽對(duì)放射性肺損傷的防護(hù)作用。計(jì)分方法“-”未見肺泡壁增厚，計(jì)0分；“+”輕度增厚，計(jì)2分；“++”中度增厚，計(jì)4分；“+++”重度增厚，計(jì)6分。每張切片觀察10個(gè)視野。結(jié)果按平均值比較，如5個(gè)視野輕度，5個(gè)視野中度，則計(jì)(5×2+5×4)/10＝3.0分。
表6.硒麥芽對(duì)大鼠胸放射照射后肺病理變化的影響組別 數(shù)目(只) 肺組織病理變化程度15天 30天 60天對(duì)照組 150.3±0.2 0.1±0.1 0.2±0.2照射組(10Gy) 152.4±0.5*2.9±0.4* 3.2±0.5*硒麥芽+照射組(10Gy)152.0±0.4*1.9±0.5*△2.1±0.6*△照射組(20Gy) 153.5±0.7*5.5±0.8* 6.0±0.9*硒麥芽+照射組(20Gy)153.2±0.6*3.6±0.6*△3.8±0.8*△注*與對(duì)照組比較P＜0.01；△與相應(yīng)劑量照射組比較P＜0.05
實(shí)驗(yàn)二 用蛋白質(zhì)表達(dá)指紋圖譜研究硒麥芽對(duì)放射性損傷的防護(hù)作用一.材料1.主要試劑脲(Urea)、三氟乙酸(Triflouroacetic acid，TFA)、苯甲基磺酰氟(Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride，PMSF)、N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸((N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid]，HEPES)、3-環(huán)乙胺-1-丙磺酸(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-Propanesulfonate)，CHAPS)、Tris-HCl、1，4-二硫代蘇糖醇(1，4-Dithiothreitol，DTT)、對(duì)硝苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(n-Octyl-β-D-Galacto-Pyranoside，OGP)均為Sigma公司產(chǎn)品。
芥子酸(sinapinic acid，SPA)為Ciphergen公司產(chǎn)品。
硫酸銅(CuSO4)，乙酸銨，乙酸鈉均為分析純2.主要溶液U9.5緩沖液(9.5M Urea、2％CHAPS、1％DTT)精稱取脲30.0g加去離子溶解最后定容50ml，過濾后加CHAPS 1.0g，DTT 0.5g溶解，凍存于-80℃冰箱。
U1緩沖液用50mM Tris-HCl緩沖液將U9.5緩沖液稀釋9.5倍而成100mM硫酸銅(CuSO4)WCX2芯片緩沖液(兼作IMAC芯片平衡液)100mM乙酸鈉(NaAc)pH 4.0H4芯片緩沖液50mM HEPES pH 7.0+10％乙腈+250mM氯化鈉3.主要儀器蛋白質(zhì)芯片弱陽離子交換芯片(Weak Cationic Exchanger，WCX類)和疏水芯片(Reversed Phase or Hydrophobic ProteinChip Array，H類)(Ciphergen公司)表面加強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Surface Enhanced Laser DesorptionIonization-Time Of Flight-Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS)(Ciphergen公司)MillPore純水系統(tǒng)低溫高速臺(tái)式離心機(jī)Sigma公司萬分之一天平瑞士梅特勒公司玻璃勻漿器MS震蕩器微量加樣器Eppendorf公司二、血清樣品的蛋白質(zhì)芯片點(diǎn)樣和閱讀分析1.WCX芯片準(zhǔn)備將芯片放到操作平臺(tái)上，每孔中加入150ul 100mM乙酸鈉(NaAc)pH 4.0，置于振蕩器上室溫孵育5分鐘后除去緩沖液，重復(fù)以上操作一次。
2.H4芯片準(zhǔn)備將芯片放到操作平臺(tái)上，每孔中加入H4芯片緩沖液(50Mm HEPES pH 7.0+10％乙腈+250mM氯化鈉)，置于振蕩器上室溫孵育5分鐘后除去緩沖液，重復(fù)以上操作一次。
3.血清樣品制備3.1融解冰凍血清，4℃離心20000g 10分鐘。
3.2每個(gè)樣品取20ul血清，分別于1.5ml離心管中，每管加30ul U9.5緩沖液于振蕩器上4℃振蕩20分鐘，使蛋白變性。
3.3每管加入100ul U1緩沖液，蓋嚴(yán)后4℃振蕩30分鐘，制成150ul血清樣品待用。
4.蛋白質(zhì)芯片的點(diǎn)樣與沖洗4.1從上述150ul蛋白變性后的血清樣品中取50ul樣品，加入200ul相應(yīng)芯片緩沖液(按1∶5稀釋樣品，使最后上樣的樣品約共稀釋40倍)，取稀釋好的樣品50ul加到預(yù)先設(shè)計(jì)好的相應(yīng)的蛋白質(zhì)芯片相應(yīng)的加樣孔中。將芯片操作平臺(tái)置于振蕩器上于室溫下孵育60分鐘后除去樣品。
4.2每孔加入150ul相應(yīng)芯片緩沖液，置于振蕩器上于室溫下孵育5分鐘除去緩沖液，共3次。
4.3用去離子水沖洗各孔2次。
4.4用150ul pH7.0 1mmol/L HEPES緩沖液沖洗各孔1次，將操作平臺(tái)反扣到吸水紙上的方法除去多余的水分和緩沖液。
4.5將芯片移出生物操作平臺(tái)，除去芯片表面的水分使芯片自然晾干。
5.添加能量吸附分子5.1在每樣品孔周圍用PAP筆畫圈后風(fēng)干。
5.2取一個(gè)包裝的能量吸附劑SPA(芥子酸)加入200ul乙腈和200ul 1％TFA，充分振蕩5分鐘確保SPA全部溶解(使成飽和溶液)，5000rpm離心2分鐘。
5.3在已經(jīng)晾干的芯片上每孔分兩次加0.5ul SPA/次，兩次之間允許各孔風(fēng)干。
6.將制好的蛋白質(zhì)芯片放入芯片閱讀儀中閱讀閱讀條件激光強(qiáng)度設(shè)置為180，敏感性為8，分析條件峰的檢測(cè)設(shè)為自動(dòng)檢測(cè)，信噪比為5，分子量偏差小于0.3％。
三.結(jié)果分析小鼠血清樣品中蛋白質(zhì)指紋圖譜的表達(dá)情況然后整理圖譜，通過檢測(cè)得到157個(gè)蛋白峰，經(jīng)Biomarker Wizard軟件分析得出2個(gè)能將正常對(duì)照組和輻照損傷組區(qū)別開來的標(biāo)志性蛋白(見圖11)。且發(fā)現(xiàn)了硒麥芽對(duì)放射性損傷的防護(hù)作用。
蛋白表達(dá)顯示出的指紋圖譜結(jié)果如下①質(zhì)荷比8209.3±2的蛋白表達(dá)此蛋白在對(duì)照組有一定程度的表達(dá)；在照射組此蛋白的表達(dá)受到明顯抑制；而在硒麥芽+照射組此蛋白能夠恢復(fù)正常表達(dá)，與對(duì)照組相近。
②質(zhì)荷比9070.8±3的蛋白表達(dá)此蛋白在對(duì)照組有一定程度的表達(dá)；在照射組此蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，峰與對(duì)照組比明顯增高；而在硒麥芽+照射組該蛋白峰比正常組略高，與照射組比明顯降低，即該蛋白的異常表達(dá)現(xiàn)象得到顯著改善。
總之，照射組由于放射性損傷，其蛋白質(zhì)指紋圖譜與正常組比有明顯變化。而硒麥芽+照射組由于硒麥芽對(duì)放射性損傷的防護(hù)作用，蛋白質(zhì)的異常表達(dá)得到改善，與正常組蛋白質(zhì)指紋圖譜基本一致。
權(quán)利要求
1.用富硒麥芽作為制備在人體受到輻照危害時(shí)起保護(hù)作用的產(chǎn)品方面的應(yīng)用。
全文摘要
用富硒麥芽作為制備在人體受到輻照危害時(shí)起保護(hù)作用的產(chǎn)品方面的應(yīng)用，富硒麥芽除具有已有技術(shù)中的各種功能外，還在抗輻照損傷方面具有很好的保護(hù)作用，這里所述的富硒麥芽，既專利號(hào)為85107995·4中的富硒麥芽，在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中簡(jiǎn)稱為硒麥芽；口服富硒麥芽可以在人體受到輻照傷害時(shí)起保護(hù)作用；這種富硒麥芽可在職業(yè)性受照人群中或在放射性污染環(huán)境中生活的人群中長(zhǎng)期服用，用以減輕輻照對(duì)人體的傷害，且對(duì)人體無毒副作用；也可在進(jìn)行放療的腫瘤病人中服用富硒麥芽，可以起到減輕放療對(duì)正常細(xì)胞造成的傷害，從而起到輔助治療的作用。
文檔編號(hào)A61P17/00GK1647815SQ20041008366
公開日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2004年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月18日
發(fā)明者李巍, 肖平, 孫葆紅 申請(qǐng)人:北京力富生物科技有限責(zé)任公司, 肖平