專(zhuān)利名稱(chēng)：針對(duì)中期因子基因的小干擾核糖核酸分子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及有效殺傷腫瘤細(xì)胞，針對(duì)中期因子(midkine，MK)基因mRNA的小干擾核糖核酸分子(SiRNA)的特征及其在制備有效殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤是一種危害人類(lèi)生命健康的主要疾病，但迄今為止對(duì)此仍然沒(méi)有有效的治療手段。長(zhǎng)期以來(lái)科學(xué)家們一直在試圖研制可以有效治療腫瘤的新藥。已經(jīng)知道腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，這些因素的作用導(dǎo)致了腫瘤相關(guān)基因表達(dá)異常，對(duì)于腫瘤正相關(guān)基因表達(dá)的抑制，能夠起到一定的腫瘤干預(yù)作用。對(duì)于基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控，目前常用到的干細(xì)胞基因敲除、正反義RNA干擾技術(shù)，因其周期長(zhǎng)、費(fèi)用高，或者效果不明顯等原因，一直不是理想的方案。最近發(fā)現(xiàn)的雙鏈RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象，對(duì)于目的基因表達(dá)mRNA具有更高效率的作用，由此而建立起來(lái)的SiRNA技術(shù)，能夠從目的基因表達(dá)mRNA豐度上抑制基因的表達(dá)，成為了一個(gè)嶄新的、具有重大影響的科學(xué)成就。
人類(lèi)MK基因是新近發(fā)現(xiàn)的組織生長(zhǎng)正相關(guān)基因，其表達(dá)產(chǎn)物具有促神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制凋亡的特點(diǎn)，這種特性注定了該基因與腫瘤的親近關(guān)系。已有研究表明，在成人體內(nèi)除腎臟可檢出表達(dá)外，其余的均在腫瘤組織中有較高的表達(dá)，幾乎包括了人類(lèi)的所有腫瘤組織。目前已經(jīng)了解得比較清楚的是，該基因在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、愈后整個(gè)過(guò)程中如影相隨，癌組織、癌旁組織及正常組織中，MK基因表達(dá)呈現(xiàn)高、中、低的現(xiàn)象，隨著肝癌患者的康復(fù)，該基因表達(dá)水平趨向正常?；贛K基因的特征和表現(xiàn)情況，抑制它的表達(dá)在腫瘤治療方面具有重要的實(shí)際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抑制針對(duì)中期因子(midkine MK)基因mRNA的小干擾核糖核酸分子(SiRNA)，由正、反兩條RNA鏈配對(duì)形成的雙鏈，為人工合成，具有SEQ ID NO1-6的核苷酸序列，與其他基因少于70％的同源度，正義鏈和負(fù)義鏈的長(zhǎng)度均為21個(gè)核苷酸，正義鏈和負(fù)義鏈各自的3’端為兩個(gè)連續(xù)的不配對(duì)脫氧胸苷酸(TT)，兩條鏈除去3’端的TT以外的19個(gè)核苷酸上的堿基互補(bǔ)形成雙鏈，這19個(gè)核苷酸的堿基可以是腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)，每條鏈中的堿基為鳥(niǎo)嘌呤(G)的核苷酸數(shù)量與堿基為胞嘧啶(C)的核苷酸數(shù)量之和，占除去3’端的TT以外的19個(gè)核苷酸數(shù)量的比例在25％與75％之間(即G/C比例)，SEQ ID NO1-6核苷酸序列為SEQ ID NO 1CUUCUUCACCUUAUCUUUCTTSEQ ID NO 2UCCAAACUCCUUCUUCCAGTTSEQ ID NO 3CCAGUUCUCAAACUUGUACTTSEQ ID NO 4GGUCUCCUGGCACUGAGCATTSEQ ID NO 5AGGCUUGGCGUCUAGUCCUTTSEQ ID NO 6GCUCUGGGACUCACAUUGCTT表1為本發(fā)明的核苷酸序列

攻擊位點(diǎn)是指該核苷酸序列在MK基因mRNA序列中識(shí)別結(jié)合的序列位置。
本發(fā)明還包括針對(duì)MK基因mRNA的SiRNA序列的任何部份，或全部經(jīng)化學(xué)修飾后所形成的小干擾RNA分子。
所述化學(xué)修飾主要包括以下三類(lèi)第一、對(duì)連接相鄰兩個(gè)核苷酸的磷酸二酯鍵的部份修飾或用其它任何化學(xué)鍵取代，典型的磷酸二酯鍵的部份修飾是將磷酸雙鍵上的氧置換成硫(硫化)或其它元素，或?qū)⒘姿釂捂I上的氧變成氮(氮化)或其它元素和化學(xué)基團(tuán)，對(duì)磷酸二酯鍵本身的全部取代，也包括對(duì)其本身或其部份，以及和它相連的兩個(gè)核糖的部份或全部改變，典型的例證是將磷酸二酯鍵和兩個(gè)相鄰的核糖變成肽鍵，使得核酸變成肽核酸(peptide nucleicacid，PNA)；第二、對(duì)核苷中核糖的五元環(huán)進(jìn)行改變或其側(cè)鏈上的化學(xué)基團(tuán)作修飾。改變核糖環(huán)的典型例證如將五元的核糖環(huán)變成六環(huán)的Morpholino環(huán)；對(duì)核糖側(cè)鏈上的修飾主要是指將核糖2’位上OH變成其它元素(如鹵素元素)，或用其它化學(xué)基團(tuán)替代OH中的H(例如烷基)；第三、將核苷酸上的堿基環(huán)作整體的改變或側(cè)鏈的修飾。
本發(fā)明提供的針對(duì)midkine(MK)基因mRNA的小干擾核糖核酸分子可作為活性成分在制備有效殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案1、設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因MK表達(dá)mRNA的siRNA，2、利用軟件進(jìn)行篩選滿足一定條件的SiRNA，3、純化合成產(chǎn)物，并測(cè)試含量，4、SiRNA轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，5、RT-PCR分析細(xì)胞中MK基因mRNA豐度，6、評(píng)估SiRNA的作用。
本發(fā)明具有以下特點(diǎn)(1)本發(fā)明為雙鏈RNA分子并且其核苷酸序列具有以下特征SiRNA為人工合成，與其他基因少于70％的同源度，正義鏈和負(fù)義鏈的長(zhǎng)度均為21個(gè)核苷酸，正義鏈和負(fù)義鏈各自的3’端為兩個(gè)連續(xù)的不配對(duì)脫氧胸苷酸(TT)，兩條鏈除去3’端的TT以外的19個(gè)核苷酸上的堿基互補(bǔ)形成雙鏈，這19個(gè)核苷酸的堿基可以是腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)，每條鏈中的堿基為鳥(niǎo)嘌呤(G)的核苷酸數(shù)量與堿基為胞嘧啶(C)的核苷酸數(shù)量之和，占除去3’端的TT以外的19個(gè)核苷酸數(shù)量的比例在25％與75％之間(即G/C比例)。
(2)本發(fā)明的SiRNA分子是通過(guò)化學(xué)合成，有利于企業(yè)化生產(chǎn)，原材料及合成儀器簡(jiǎn)單，為四種核糖核苷酸腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)核苷酸。合成及純化技術(shù)成熟。
(3)該產(chǎn)品的本質(zhì)是核酸成分，是人體內(nèi)的組成部分，由于效率高，用量少，很少有副作用，在生產(chǎn)過(guò)程中也不會(huì)有工業(yè)危害。而且產(chǎn)品可以干燥保存，有利于運(yùn)輸和長(zhǎng)期保存。
(4)本發(fā)明所提供的針對(duì)MK基因mRNA分子的SiRNA，可以有效的剔除腫瘤細(xì)胞的MK基因mRNA分子，為治療腫瘤找到了新型的分子。它的最大抑制濃度在幾個(gè)到幾十個(gè)納摩爾(nM)，這比反義核酸的有效濃度要低10-100倍。


圖1為6種siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞株作用48小時(shí)后，細(xì)胞中MK基因表達(dá)的mRNA水平。
圖2為3種siRNA在不同的濃度作用48小時(shí)后，細(xì)胞中MK基因表達(dá)的mRNA水平。
圖3為3種siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞株作用不同時(shí)間后，細(xì)胞中MK基因表達(dá)的mRNA水平。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例1 SiRNA的合成SiRNA的合成可委托公開(kāi)對(duì)外開(kāi)展合成業(yè)務(wù)的商業(yè)公司，比如美國(guó)Dharmacon公司，具體可通過(guò)www.dharmacon.com獲知，所有的SiRNA分子都經(jīng)過(guò)2位上脫保護(hù)、脫鹽、純化、和退火形成雙鏈處理，然后溶于DEPC處理的蒸餾水中。
本發(fā)明提供的SiRNA制備方法也可采用現(xiàn)有的固相化學(xué)合成法。該方法可參見(jiàn)Wincott F，DiRenzo A，Shaffer C，Grimm S，Tracz D，Workman C，Sweedler D，Gonzalez C，Scaringe S and Usman N.Synthesis，deprotection，analysis and purification of RNA and ribozymes.Nucleic Acids Res.1995，232677-84。
以前表編號(hào)MDK2的SiRNA為例整個(gè)化學(xué)合成可大致分成四個(gè)的過(guò)程(1)寡聚核糖核酸的合成；(2)脫保護(hù)；(3)純化分離；(4)脫鹽退火無(wú)菌消毒。
具體制備操作如下(1)寡聚核糖核酸的合成SiRNA的合成是在自動(dòng)DNA/RNA合成儀(例如Applied Biosystems EXPEDITE 8909)上進(jìn)行，根據(jù)2號(hào)的小干擾RNA分子的核酸序列(正義鏈5’-GAAAGAUAAGGUGAAGAAGTT，反義鏈5’-CUUCUUCACCUUAUCUUUCTT)的次序?qū)?duì)應(yīng)的核苷酸逐個(gè)連接起來(lái)。由于SiRNA是由一段19聚的寡聚核糖核酸和一個(gè)2聚的脫氧胸苷酸組成。因此起始物為固相(CPG)連接的5’-O-對(duì)二甲氧基三苯甲基-胸苷(1-2umol).具體每一個(gè)循環(huán)合成可分為四步來(lái)完成。第一步是將與固相連接的胸苷上5’位的保護(hù)基在3％三氯乙酸的作用下洗脫；第二步在活性催化劑S-乙基四唑的作用下，將5’-O-對(duì)二甲氧基三苯甲基-胸苷亞磷酰胺偶聯(lián)到已脫去保護(hù)的上一個(gè)胸苷上，形成二胸苷亞磷酸三酯.偶合時(shí)間和偶合循環(huán)的次數(shù)均按儀器使用說(shuō)明提供程序來(lái)完成；第三步是將偶合的二胸苷亞磷酸三酯在0.05M碘水的作用下氧化成二胸苷磷酸三酯；第四步是乙?；瑢⒐滔嗌系纳倭课捶磻?yīng)的活性基團(tuán)(例如羥基和胺基)在乙酸酐的作用下形成酯或酰胺，從而達(dá)到封閉作用，用以減少整體副產(chǎn)物的產(chǎn)生。重復(fù)此循環(huán)直至完成全部核酸序列的合成。
(2)脫保護(hù)將合成好的固相SiRNA放入一個(gè)可以密封的小瓶，并與加入1毫升的甲胺水溶液(10M，50％乙醇)，靜置在室溫.兩小時(shí)后，取出溶液，并將固相CPG再次用乙醇；水和乙腈的混合液淋洗，并將淋洗液和前面取出的溶液合并一處，將其溶劑抽干。在小瓶中繼續(xù)加入1毫升四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液(1M)，將溶液在室溫靜置12個(gè)小時(shí)，脫去所有寡聚核糖核酸上的保護(hù)基(包括堿基，核苷磷酸和核苷2’位的硅烷化保護(hù)基)。再經(jīng)過(guò)乙醇沉淀，產(chǎn)生SiRNA的粗產(chǎn)物。
(3)純化分離將SiRNA的粗產(chǎn)物溶解在2毫升的乙酸銨的水溶液中，然后經(jīng)過(guò)反相C18高壓液相色譜的分離，運(yùn)用梯度淋洗的方法，收集SiRNA的主產(chǎn)物(淋洗液A0.1M的乙酸銨；淋洗液b20％的0.1M的乙酸銨和80％的乙腈)，將SiRNA的主產(chǎn)物的溶劑除去，并加入5毫升80％乙酸水溶液，在室溫靜置15分鐘，然后將此溶液進(jìn)行陰離子交換的分離(DEAE-5PW，陰離子交換柱)，即可得到純度在90％以上的SiRNA(梯度淋洗，淋洗液A0.025M的Tris-HCl，0.025M NaCl pH＝8，5％乙腈；淋洗液b0.025M的Tris-HCl，2.0M NaCl，pH＝8，5％乙腈)。
(4)脫鹽退火無(wú)菌消毒純化的SiRNA經(jīng)過(guò)透析，除去鹽份，SiRNA的溶液進(jìn)行過(guò)濾消毒和干燥結(jié)晶，然后將正義鏈和反義鏈的寡聚核糖核酸進(jìn)行退火處理形成穩(wěn)定的雙股交鏈的SiRNA.其方法是將正義鏈和反義鏈的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的緩沖溶液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)。將此溶液加熱到95℃，然后緩緩將此溶液冷卻致室溫(此過(guò)程應(yīng)不少于一個(gè)小時(shí))，最后將此溶液存放在4℃冰箱中保存，以便隨時(shí)可以使用。
經(jīng)過(guò)純化后的SiRNA的純度和鑒定有兩種比較常用的辦法。其一用毛細(xì)管凝膠電泳法來(lái)鑒定SiRNA的純度，該方法可參見(jiàn)Paulus A，Ohms JI.Analysis ofoligonucleotides by capillary gelelectrophoresis.J Chromatogr 1990，507113-123。其二是用MALDI-TOF質(zhì)譜來(lái)準(zhǔn)確測(cè)量其分子量，從而確定SiRNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)組成。
本發(fā)明所說(shuō)的所有SiRNA都可以根據(jù)其序列采用上述方法制備，鑒定方法可采用毛細(xì)管凝膠電泳和MALDI-TOF質(zhì)譜。
實(shí)施例2 細(xì)胞培養(yǎng)和SiRNA的轉(zhuǎn)染(1)細(xì)胞培養(yǎng)SMMC-7721是從肝癌組織中分離出來(lái)的一種肝癌細(xì)胞系[董榮春等，SMMC-7721人體肝癌細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性的初步觀察，第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1980.6；(1)5-9]。該細(xì)胞在體外用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)劑基來(lái)培養(yǎng)。
(2)SiRNA的轉(zhuǎn)染SiRNA轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞借助于Invitrogen(www.invitrogen.com)公司的Oligofectamine來(lái)進(jìn)行，具體步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。簡(jiǎn)述如下，5×104的腫瘤細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板上過(guò)夜，第二天被轉(zhuǎn)入SiRNA，然后繼續(xù)培養(yǎng)到一定時(shí)間后用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中MK基因mRNA的水平。
(3)SMMC-7721細(xì)胞MK基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)腫瘤細(xì)胞MK基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)用實(shí)時(shí)定量PCR的技術(shù)來(lái)進(jìn)行。具體可以分為以下三步第一，細(xì)胞中RNA的提取，該方法可以參照現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)來(lái)進(jìn)行[見(jiàn)第四章，Current protocols in Molecular Biology，John & Wiley，2003]；第二步，cDNA的合成，合成方法也可參照標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)來(lái)進(jìn)行[見(jiàn)第五章，Currentprotocols in Molecular Biology，John & Wiley，2003]；第三步，實(shí)時(shí)PCR的進(jìn)行，實(shí)時(shí)PCR是在ABI7700序列檢測(cè)儀上進(jìn)行，具體方法參照ABI公司的標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)進(jìn)行。在本專(zhuān)利中用于檢測(cè)MK基因的5’端引物的序列是5’-GCGCGCTACAATGCTCAGT-3’，對(duì)應(yīng)于MK基因cDNA序列中的372到391位，3’端引物的序列是5’-CCCTTCCCTTTCTTGGCTTT-3’，對(duì)應(yīng)于MK基因cDNA序列中的467到447位，實(shí)時(shí)PCR探針的序列是5’-CCAGGAGACCATCCGCGTCACC-3’，對(duì)應(yīng)于MK基因cDNA序列中的392到414位。
實(shí)施例3 SiRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞MK基因mRNA的抑制作用(1)SiRNA的選擇本發(fā)明選擇了針對(duì)MK基因mRNA編碼區(qū)的SiRNA分子共6個(gè)，即SEQ ID NO1-6所列的6個(gè)SiRNA分子，攻擊位點(diǎn)從起始密碼的95-693之間，每條SiRNA分子中19個(gè)互補(bǔ)成雙鏈的核苷酸序列中的G/C在32％-74％之間。
(2)6種SiRNA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞MK基因mRNA表達(dá)的作用A、濃度為75nM的6個(gè)SiRNA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞MK基因mRNA的作用用75nM的這6種SiRNA作用于SMMC-7721細(xì)胞48小時(shí)后，觀察它們對(duì)MK基因mRNA水平的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)第3、4、6號(hào)SiRNA分子對(duì)MK的抑制作用最為明顯，分別達(dá)到97％、98％和98％。另外，第1、4、6對(duì)MK基因mRNA的抑制作用也大于50％，參見(jiàn)圖1，圖1為6種75nM的siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721作用48小時(shí)后，細(xì)胞中MK基因表達(dá)的mRNA水平，對(duì)照組是指細(xì)胞在同等條件下僅用轉(zhuǎn)染試劑處理?？v坐標(biāo)表示SiRNA處理組MK基因表達(dá)的mRNA水平占對(duì)照組的相對(duì)百分率。圖中的每一個(gè)數(shù)據(jù)表示三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。
B、不同濃度的3個(gè)SiRNA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞MK基因mRNA的作用對(duì)上述3個(gè)高抑制MK基因mRNA水平的第3、4、6號(hào)SiRNA分子，從10nM濃度對(duì)倍稀釋5個(gè)梯度到0.625nM，發(fā)現(xiàn)所有的組對(duì)MK基因mRNA水平均有抑制作用，第3、4號(hào)在5nM最強(qiáng)分別達(dá)76％和81％，第6號(hào)在10nM最強(qiáng)達(dá)73％，參見(jiàn)圖2，圖2為3種siRNA在不同的濃度下對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721作用48小時(shí)后，細(xì)胞中MK基因表達(dá)的mRNA水平，對(duì)照組是指細(xì)胞在同等條件下用轉(zhuǎn)染試劑作處理?？v坐標(biāo)表示SiRNA處理組MK基因表達(dá)的mRNA水平占對(duì)照組的相對(duì)百分率。圖中的每一個(gè)數(shù)據(jù)表示三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。
C、10nM濃度的3個(gè)SiRNA不同時(shí)間對(duì)SMMC-7721細(xì)胞MK基因mRNA的作用取10nM的第3、4、6號(hào)3個(gè)SiRNA，作用SMMC-7721細(xì)胞24、48、72小時(shí)后，觀察SMMC-7721細(xì)胞MK基因mRNA的水平，SiRNA從24小時(shí)開(kāi)始就對(duì)MK基因mRNA產(chǎn)生抑制作用，一直到72小時(shí)，3、6號(hào)作用48小時(shí)后抑制最強(qiáng)分別達(dá)70％和74％，4號(hào)72小時(shí)作用最強(qiáng)達(dá)79％，參見(jiàn)圖3，圖3為3種10nM的siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721作用不同時(shí)間后，細(xì)胞中MK基因表達(dá)的mRNA水平，對(duì)照組是指細(xì)胞在同等條件下用轉(zhuǎn)染試劑作處理?？v坐標(biāo)表示SiRNA處理組MK基因表達(dá)的mRNA水平占對(duì)照組的相對(duì)百分率。圖中的每一個(gè)數(shù)據(jù)表示三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。
實(shí)施例4 SiRNA的修飾本發(fā)明對(duì)SiRNA修飾的方法的種類(lèi)可分三大類(lèi)，并且每一類(lèi)中有許多變化，因此它們各自的合成方法不盡一樣。這里列舉兩種最為常見(jiàn)的SiRNA修飾方法。并且，下述的方法并不限制本發(fā)明所述的有關(guān)對(duì)SiRNA修飾的保護(hù)范圍。
(1)硫化硫化是指將核苷磷酸二酯鍵上的一個(gè)氧原子轉(zhuǎn)變成硫原子形成核苷硫代磷酸二酯.由于整個(gè)SiRNA的其它組成結(jié)構(gòu)沒(méi)有變化，因此它的合成和實(shí)施例1的SiRNA合成過(guò)程基本一樣。只需將合成過(guò)程中的氧化反應(yīng)變成硫化反應(yīng)，在此反應(yīng)中加入適當(dāng)?shù)牧蚧噭?，例?H-1，2-benzodithiol-3-one1，1-dioxide(又稱(chēng)Beaucage試劑)。
(2)核苷2’位羥基的修飾核苷2’位羥基的修飾是指用各種飽和烷氧基或不飽和烷氧來(lái)取代核苷五員糖環(huán)上的2’位羥基.其中最常見(jiàn)的是用甲氧基來(lái)取代核苷2’位的羥基。SiRNA的核苷2’位甲氧基化的合成和實(shí)施例1的SiRNA的合成步驟基本一致，只需要在偶合反應(yīng)中用2’-甲氧基核苷亞磷酰胺來(lái)取代2’-叔丁基二甲基硅氧基核苷亞磷酰胺即可。
本發(fā)明是結(jié)合最佳實(shí)施例進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)中期因子基因mRNA的小干擾核糖核酸分子，由正、反兩條RNA鏈配對(duì)形成的雙鏈，為人工合成，具有SEQ ID NO 1-6的核苷酸序列，與其他基因少于70％的同源度，正義鏈和負(fù)義鏈的長(zhǎng)度均為21個(gè)核苷酸，正義鏈和負(fù)義鏈各自的3’端為兩個(gè)連續(xù)的不配對(duì)脫氧胸苷酸，兩條鏈除去3’端的TT以外的19個(gè)核苷酸上的堿基互補(bǔ)形成雙鏈，這19個(gè)核苷酸的堿基可以是腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，每條鏈中的堿基為鳥(niǎo)嘌呤的核苷酸數(shù)量與堿基為胞嘧啶的核苷酸數(shù)量之和，占除去3’端的TT以外的19個(gè)核苷酸數(shù)量的比例在25％與75％之間，SEQ ID NO 1-6的核苷酸序列為SEQ ID NO 1CUUCUUCACCUUAUCUUUCTTSEQ ID NO 2UCCAAACUCCUUCUUCCAGTTSEQ ID NO 3CCAGUUCUCAAACUUGUACTTSEQ ID NO 4GGUCUCCUGGCACUGAGCATTSEQ ID NO 5AGGCUUGGCGUCUAGUCCUTTSEQ ID NO 6GCUCUGGGACUCACAUUGCTT
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小干擾核糖核酸分子，其特征是包括針對(duì)中期因子基因mRNA的序列的任何部份，或全部經(jīng)化學(xué)修飾后所形成的小干擾RNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小干擾核糖核酸分子，其特征是所述化學(xué)修飾是指對(duì)連接相鄰兩個(gè)核苷酸的磷酸二酯鍵的部份修飾或用其它任何化學(xué)鍵取代，或?qū)⒘姿釂捂I上的氧變成氮、氮化或其它元素和化學(xué)基團(tuán)
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的對(duì)磷酸二酯鍵本身的全部取代，也包括對(duì)其本身或其部份，以及和它相連的兩個(gè)核糖的部份或全部改變。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小干擾核糖核酸分子，其特征是所述化學(xué)修飾是指對(duì)核苷中核糖的五元環(huán)進(jìn)行改變或其側(cè)鏈上的化學(xué)基團(tuán)作修飾.
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的對(duì)核糖側(cè)鏈上的修飾，主要是指將核糖2’位上OH變成其它元素，或用其它化學(xué)基團(tuán)替代OH中的H。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小干擾核糖核酸分子，其特征是所述化學(xué)修飾是指將核苷酸上的堿基環(huán)作整體的改變或側(cè)鏈的修飾。
8.權(quán)利要求1-7任一所述的小干擾核糖核酸分子，其特征是在制備有效殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供針對(duì)中期因子基因mRNA的小干擾核糖核酸分子，包括針對(duì)中期因子基因mRNA的小干擾核糖核酸分子序列的任何部分，或全部經(jīng)化學(xué)修飾后所形成的小干擾RNA分子。本發(fā)明的SiRNA分子是通過(guò)化學(xué)合成，有利于企業(yè)化生產(chǎn)，原材料及合成儀器簡(jiǎn)單，為四種核糖核苷酸，合成及純化技術(shù)成熟，在生產(chǎn)過(guò)程中也不會(huì)有工業(yè)危害，而且產(chǎn)品可以干燥保存，有利于運(yùn)輸和長(zhǎng)期保存。本發(fā)明提供的小干擾核糖核酸分子可以有效的剔除腫瘤細(xì)胞的MK基因mRNA分子，為治療腫瘤找到了新型的分子，可作為活性成分在制備有效殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK1663957SQ200410068000
公開(kāi)日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2004年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日
發(fā)明者丁佳逸, 鄭樹(shù), 陳功星, 張佳煒 申請(qǐng)人:浙江大學(xué), 杭州新瑞佳生物醫(yī)藥技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司