專利名稱：多糖硫酸酯氨基酸鹽類藥物和制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化制藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物和制備方法及其在制備治療慢性腎炎和腎衰竭疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腎衰竭是由各種原因引起的腎實(shí)質(zhì)損害所導(dǎo)致的水、電解質(zhì)紊亂，酸堿平衡失調(diào)及涉及多個(gè)器官功能紊亂的綜合征，治療較為困難，且醫(yī)療費(fèi)昂貴。據(jù)有關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，我國(guó)約有腎臟病人3000萬(wàn)，慢性腎衰發(fā)生率約為總?cè)丝诘娜f(wàn)分之五，其中死于尿毒癥者每年就有數(shù)萬(wàn)人。近幾十年來(lái)，血液凈化技術(shù)的問(wèn)世和不斷改進(jìn)以及營(yíng)養(yǎng)治療、抗生素等技術(shù)的發(fā)展，使腎衰病人的成活率有了突破性的提高，但在合并嚴(yán)重感染、多臟器功能障礙及衰竭時(shí)，死亡率仍高至50-75％以上，因此探索如何發(fā)展治療腎臟疾病的新療法和新藥物仍是當(dāng)前面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。
天然多糖是構(gòu)成生命基礎(chǔ)的四大類物質(zhì)之一，迄今為止，有300多種多糖的免疫調(diào)節(jié)作用已為人們所發(fā)現(xiàn)。基于對(duì)腎臟疾病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，人們發(fā)現(xiàn)用糖胺聚糖及其衍生物治療慢性腎臟疾病有顯著效果(Shestakova et al.Terapevticheskii Arkhiv.1997，69(6)34-37；Skrha et al.Diabetes Research and Clinical Practice.1997，38(1)25-31)。如Akima等以酸性粘多糖和具有抗凝血活性的葡聚糖硫酸酯用作治療間質(zhì)腎炎、腎小球腎炎和狼瘡腎炎(日本專利08-301771；美國(guó)專利5981509)；Egidio等以粘多糖來(lái)源的2-氨基葡萄糖醛酸-2-脫氧葡聚糖硫酸酯治療糖尿病腎病，降低尿白蛋白效果尤佳(日本專利06-091713)；徐祖洪等公開(kāi)了一種褐藻多糖硫酸酯新的制備方法和作為治療腎衰疾病藥品中的應(yīng)用(中國(guó)專利95112292.4、98120283.7)；畢愛(ài)芳等申請(qǐng)了用褐藻多糖硫酸酯作為治療腎小球疾病的藥品專利(中國(guó)專利98110201.8)。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)真菌來(lái)源多糖經(jīng)硫酸酯化修飾后具有顯著的降血肌酐、血尿素氮和尿蛋白等治療慢性腎炎和腎衰竭的功能(中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?00410013931.1)。
氨基酸對(duì)腎功能的保護(hù)是多方面的，雖然機(jī)理上尚存在許多爭(zhēng)議。L-鳥氨酸、L-精氨酸是尿素循環(huán)中重要的代謝中間物，促進(jìn)血氨轉(zhuǎn)變成尿素。L-精氨酸是NO的前體物質(zhì)，NO是舒血管因子，可以顯著改善腎臟微循環(huán)，提高腎小球?yàn)V過(guò)率，保護(hù)腎臟組織減輕缺血、缺氧的損傷。尿素循環(huán)中L-鳥氨酸接受2個(gè)氨基轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-精氨酸。很久以前人們已發(fā)現(xiàn)L-鳥氨酸和L-精氨酸有保護(hù)人體減輕銨鹽的毒性作用，并嘗試用L-鳥氨酸、L-精氨酸治療高血氨病人(Bimbaum et al.Arch Biochem Biophys.1956，64(2)319；342；Harper et al.Proc Soc ExpBiol Med.1956，92(3)560；Fahey et al.Am J Med.1957，23(6)860；Michel et al.Presse Med.1971，79(19)867)。Schramm認(rèn)為在大鼠缺血性急性腎功能衰竭中，L-精氨酸能改善其腎功能，其主要機(jī)制可能和來(lái)源于L-精氨酸的NO有關(guān)(Schramm et al.Ren Fail，1994，16(5)555)。Reckelhoff等實(shí)驗(yàn)表明L-精氨酸能防止與老齡有關(guān)的腎小球損傷和GFR的減少(Reckelhoffetal.Am J Physiol，1997，272(6 Pt 2)R1768)。McGivan實(shí)驗(yàn)表明，L-鳥氨酸被L-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶分解的速度和L-鳥氨酸進(jìn)入線粒體參與尿素循環(huán)的速度幾乎是一樣的(McGivan et al.Biochemistry Journal 162147-156(1977))，補(bǔ)充L-鳥氨酸有助于加速尿素循環(huán)。
甘氨酸能夠保護(hù)多種細(xì)胞，減輕由缺氧、過(guò)氧化和多種毒物造成的損傷。甘氨酸對(duì)于缺氧誘導(dǎo)的腎近曲小管損傷是一種非常有效的保護(hù)因子。大劑量的甘氨酸對(duì)順鉑引起的腎毒性能產(chǎn)生明顯的保護(hù)和修復(fù)作用(Li et al.J Pharm Pharmacol，1995，47(3)223)。Schneider發(fā)現(xiàn)甘氨酸抑制環(huán)孢菌素A誘導(dǎo)的大鼠腎小球?yàn)V過(guò)率的下降，阻止血肌酐、尿素氮和堿性磷酸酶的升高，改善近曲小管的膨脹和壞死以及吞噬細(xì)胞的浸潤(rùn)(美國(guó)專利6096785)。
其它氨基酸如L-丙氨酸能對(duì)體外的兔近曲小管的缺氧性損傷起保護(hù)作用，L-絲氨酸也有類似的保護(hù)作用。L-賴氨酸能保護(hù)溶血引起的腎功能減退，主要是因?yàn)閹в姓姾傻腖-賴氨酸能抑制對(duì)血紅蛋白的重吸收(秦杰.國(guó)外醫(yī)學(xué)泌尿系統(tǒng)分冊(cè)，2003，23(4)374)。
腎衰病人由于限制蛋白飲食，體內(nèi)必須/半必須氨基酸血濃度很低，正常的、必要的蛋白質(zhì)合成受阻，氮代謝平衡被打破。因此以一個(gè)合理的比例給腎衰病人補(bǔ)充一定量的必須氨基酸，既是滿足營(yíng)養(yǎng)支持和平衡的需要，又有保護(hù)病變腎臟的功能。早些時(shí)候的發(fā)明給氨氮排泄障礙的病人補(bǔ)充一定量的包括L-精氨酸、L-組氨酸在內(nèi)的必須/半必須氨基酸以糾正體內(nèi)蛋白質(zhì)的缺乏(美國(guó)專利2457820；3764703)。后來(lái)的發(fā)明將去氨氮的必須/半必須氨基酸的α-酮酸、α-羥基酸類似物和無(wú)法獲得這些類似物的必須/半必須氨基酸混合補(bǔ)充給病人，即補(bǔ)充了必要的氨基酸，又促進(jìn)了氨氮轉(zhuǎn)換，減輕腎臟尿素排泄的負(fù)擔(dān)(美國(guó)專利4100160；4100161；4100293；4228099)。但這些專利產(chǎn)品均存在口感差、反胃以及某些氨基酸或α-酮酸、α-羥基酸類似物溶解度低的缺點(diǎn)。Walser將L-精氨酸和L-鳥氨酸與人體必須的支鏈氨基酸(L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸)的α-酮酸類似物組合形成復(fù)合鹽用于治療以高血氨為特征的肝病、腎衰和腦病，產(chǎn)品口感得到改善(美國(guó)專利4320146)。國(guó)內(nèi)謝立平等發(fā)明了含有8種L-氨基酸的復(fù)合制劑具有明顯的對(duì)抗順鉑和缺血導(dǎo)致的急性腎功能障礙作用(中國(guó)專利1439364A)。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供一類多糖硫酸酯氨基酸鹽復(fù)合藥物和制備方法及其在治療慢性腎炎和腎衰竭制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。將多糖硫酸酯與氨基酸復(fù)合的目的在于融合它們各自的免疫調(diào)節(jié)活性和治療慢性腎炎、腎衰竭的藥理活性，從而產(chǎn)生正向協(xié)同作用，使多糖硫酸酯氨基酸鹽對(duì)腎病患者腎功能的保護(hù)作用強(qiáng)于多糖硫酸酯和天然氨基酸的獨(dú)自藥效。
2、技術(shù)方案一類多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物，其特征在于它是由多糖硫酸酯聚陰離子載體與氨基酸成鹽形成的復(fù)合物，其組分重量百分比為多糖硫酸酯占該復(fù)合物10％-95％，氨基酸占該復(fù)合物5％-90％。
上述的多糖硫酸酯包括天然多糖硫酸酯和人工半合成多糖硫酸酯。硫酸根占多糖硫酸酯的重量百分比為2％-60％。
上述多糖硫酸酯中的多糖包括動(dòng)物多糖、植物多糖和/或微生物多糖。微生物多糖優(yōu)選為真菌多糖，最優(yōu)選為茯苓多糖、豬苓多糖和裂褶菌多糖動(dòng)物多糖優(yōu)選為糖胺聚糖；植物多糖優(yōu)選為海藻多糖。
上述成鹽氨基酸種類包括全部天然氨基酸，優(yōu)選為L(zhǎng)-鳥氨酸、L-精氨酸和甘氨酸。
多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物加入相應(yīng)的輔料可制備成片劑、丸劑、膠囊劑和針劑。
一類多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物的制備方法，其特征在于多糖硫酸酯和氨基酸的結(jié)合包括在溶液中以分子離子的形式化學(xué)合成和/或采用物理方式進(jìn)行機(jī)械混合制備的兩種制備方法。其化學(xué)合成制備方法步驟如下(1)植物多糖的提取采用熱水抽提法，動(dòng)物多糖、微生物多糖的提取采用酶解和堿提相結(jié)合的方法。提取物經(jīng)脫色、透析和真空濃縮后，乙醇沉淀、真空干燥；(2)多糖硫酸酯的制備采用氯磺酸-吡啶法。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)堿中和、脫色、透析和真空濃縮后，乙醇沉淀、真空干燥；
(3)多糖硫酸酯氨基酸鹽制備步驟如下a.多糖硫酸酯堿金屬或堿土金屬鹽配成5％-20％溶液，緩慢攪拌加入氫型酸性樹脂，離子交換去除多糖硫酸酯堿金屬或堿土金屬鹽中的金屬離子，反應(yīng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)溶液pH值，當(dāng)pH至0.5-2時(shí)過(guò)濾分離出樹脂；b.將氨基酸配成1％-70％的溶液；c.向酸性樹脂處理好的多糖硫酸酯溶液中緩慢攪拌加入氨基酸溶液，成鹽反應(yīng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)溶液pH值，當(dāng)pH至3-8時(shí)停止加入氨基酸溶液；d.活性碳脫色，真空濃縮和干燥，機(jī)械粉碎，即得多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物。
上述藥物的制備方法，在步驟(2)中所述的多糖硫酸酯，其分子量在0.2萬(wàn)-80.0萬(wàn)之間，優(yōu)選0.5萬(wàn)-30.0萬(wàn)；上述藥物的制備方法，在步驟(3)中b和c所述的氨基酸，包括一種和/或多種，多糖硫酸酯和一種氨基酸形成多糖硫酸酯單氨基酸鹽，多糖硫酸酯和多種氨基酸形成多糖硫酸酯混合氨基酸鹽。
一類多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物在制備治療慢性腎炎和腎衰竭疾病藥物中的應(yīng)用。該藥物經(jīng)藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，多糖硫酸酯氨基酸鹽進(jìn)入體內(nèi)后，在血液和組織液中以多糖硫酸酯和氨基酸游離的形式存在，各自發(fā)揮它們的腎功能保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)作用，從而產(chǎn)生正向協(xié)同作用，使多糖硫酸酯氨基酸鹽對(duì)腎病患者腎功能的保護(hù)。作用強(qiáng)于多糖硫酸酯和天然氨基酸的獨(dú)自藥效。
經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，多糖硫酸酯氨基酸鹽使腎衰動(dòng)物腎臟系數(shù)顯著下降；明顯提高腎衰動(dòng)物的終尿量、尿肌酐的排放量，提高血清總蛋白、白蛋白水平，使其接近正常水平；降低血清肌酐、血清尿素氮水平，減少尿蛋白的排放。病理切片顯示，和模型對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的腎泌尿功能組織的萎縮、腎小體數(shù)量的減少、腎小球體積的增大、腎小球囊腔的擴(kuò)大、細(xì)胞間質(zhì)的增生等現(xiàn)象得到明顯改善，腫脹、變性、壞死的近曲小管數(shù)量減少，遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張程度明顯減輕，腎組織內(nèi)的棕黑色結(jié)晶沉積顯著減少。
3、有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有以下優(yōu)點(diǎn)
(1)本產(chǎn)品生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，工藝條件溫和，對(duì)設(shè)備無(wú)特殊要求；產(chǎn)品原材料來(lái)源豐富，動(dòng)物多糖來(lái)源于大型哺乳動(dòng)物和海洋動(dòng)物，植物多糖取自天然中藥寶庫(kù)和海洋資源，真菌多糖原材料——食用菌在我國(guó)的年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的60％以上，2002年產(chǎn)量為876萬(wàn)噸。生產(chǎn)過(guò)程無(wú)固體廢料，溶劑可回收套用。因此本發(fā)明產(chǎn)品成本低廉，適應(yīng)低收入腎臟病患者藥物治療的需求。
(2)本產(chǎn)品制備采用樹脂離子交換技術(shù)去除多糖硫酸酯堿金屬或堿土金屬鹽中的金屬離子，消除以往多糖硫酸酯產(chǎn)品中金屬離子對(duì)腎臟病人造成的不利影響。
(3)本產(chǎn)品水溶性好，易于藥物在體內(nèi)吸收，有利于制備成各種藥物劑型。
(4)將多糖硫酸酯與氨基酸復(fù)合成鹽融合了它們的免疫調(diào)節(jié)活性和治療慢性腎炎和腎衰竭的藥理活性，并產(chǎn)生正向協(xié)同作用，多糖硫酸酯氨基酸鹽對(duì)腎功能的保護(hù)作用強(qiáng)于多糖硫酸酯或天然氨基酸獨(dú)自藥效。
通過(guò)上述藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明多糖硫酸酯氨基酸鹽治療慢性腎炎和腎衰竭疾病的療效是顯著的，茯苓多糖硫酸酯氨基酸鹽對(duì)腎功能的保護(hù)作用強(qiáng)于茯苓多糖硫酸酯。急性毒理實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明本發(fā)明藥物的毒副作用小。
四、具體實(shí)施方案結(jié)合以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物、制備方法及對(duì)慢性腎炎和腎衰竭疾病的治療作用。
實(shí)施例1 多糖硫酸酯氨基酸鹽類藥物的組成(一)茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽L-精氨酸占成品重量百分比為38.4％，茯苓多糖硫酸酯占61.6％。其中茯苓多糖硫酸酯分子量分布范圍為0.6萬(wàn)-20.0萬(wàn)，硫酸根含量為48.6％。
(二)海藻多糖硫酸酯混合氨基酸鹽海藻多糖硫酸酯占產(chǎn)品重量的百分比為47.6％，混合氨基酸為52.4％。其中海藻多糖硫酸酯硫酸根含量為45.0％，分子量分布范圍為0.5萬(wàn)-15.0萬(wàn)；混合氨基酸中，L-鳥氨酸占海藻多糖硫酸酯混合氨基酸鹽的重量比為23.8％，L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸各占9.5％。
(三)硫酸軟骨素混合氨基酸鹽硫酸軟骨素占產(chǎn)品的重量百分比為57.4％，混合氨基酸占42.6％。其中硫酸軟骨素硫酸根含量為23％，分子量分布范圍為0.5萬(wàn)-3.0萬(wàn)；混合氨基酸中，L-賴氨酸、L-鳥氨酸和甘氨酸分別占硫酸軟骨素混合氨基酸鹽的重量比分別為17.8％、16.0％和8.9％。
實(shí)施例2 茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽的化學(xué)合成制備，其制備步驟如下1、茯苓多糖的提取(1)100g茯苓干粉置于5倍量的1mol/LNaOH稀堿溶液中室溫下浸泡4小時(shí)；(2)抽濾分離出粘稠的液體，殘?jiān)?倍量堿液再提取一次，合并兩次的提取液；(3)提取液以10％的醋酸液中和至pH6，加入3倍量的95％乙醇，于4℃放置過(guò)夜，離心分離出沉淀，流水透析兩天；(4)依次用蒸餾水、無(wú)水乙醇洗滌后，真空干燥，得63.7g白色粉末。
2、茯苓多糖硫酸酯的制備(1)1000ml平底燒瓶中加入吡啶240ml，冷卻至4℃并攪拌，用分液漏斗慢慢滴加氯磺酸40ml，制備磺化試劑；(2)向磺化試劑中加入12g茯苓多糖，于75-80℃下劇烈攪拌反應(yīng)1小時(shí)；(3)4N NaOH調(diào)pH6，減壓蒸餾去除水和吡啶，一直到蒸干為止；(4)反應(yīng)瓶中加500ml熱水溶解，流水透析1天，收集溶液用活性碳脫色；(5)3倍量的95％乙醇沉淀茯苓多糖硫酸酯，無(wú)水乙醇洗滌，真空干燥，得淺黃色粉末38.5g；(6)改良的BaSO4濁度法檢測(cè)所得產(chǎn)品硫酸根含量，結(jié)果為48.6％；硝酸銀法檢測(cè)NaCl含量小于0.15％；(7)經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳，甲苯胺藍(lán)染色，以已知分子量范圍的肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸為對(duì)照品，檢測(cè)到所得產(chǎn)品分子量分布范圍為0.6萬(wàn)-20.0萬(wàn)。
3、茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽的化學(xué)合成制備步驟為(1)100g茯苓多糖硫酸酯溶于蒸餾水成10％溶液，緩慢攪拌加入JK00g氫型強(qiáng)酸樹脂，離子交換反應(yīng)過(guò)程中檢測(cè)溶液pH值，當(dāng)pH至1.3時(shí)停止樹脂的加入；(2)過(guò)濾分離出樹脂，少量蒸餾水洗滌樹脂2次，洗滌液合并入酸化的茯苓多糖硫酸酯溶液中；(3)用市售的50g L-精氨酸配成10％的溶液；
(4)向酸性茯苓多糖硫酸酯溶液中緩慢攪拌加入L-精氨酸溶液，成鹽反應(yīng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)溶液pH值，當(dāng)pH至7時(shí)停止加入L-精氨酸溶液，L-精氨酸實(shí)際用量為43g；(5)活性碳脫色、濃縮、干燥后得淺黃色粉末，重112g；(6)L-精氨酸占成品重量百分比為38.4％，茯苓多糖硫酸酯占61.6％。
實(shí)施例3 茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽的化學(xué)合成制備1、茯苓多糖和茯苓多糖硫酸酯的制備過(guò)程同實(shí)施例2；2、100g茯苓多糖硫酸酯去鈉離子的酸化過(guò)程同實(shí)施例2；3、將50g市售L-鳥氨酸配成20％的溶液；4、向酸性茯苓多糖硫酸酯溶液中緩慢攪拌加入L-鳥氨酸溶液，成鹽反應(yīng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)溶液pH值，當(dāng)pH至6.5時(shí)停止加入L-鳥氨酸溶液，L-鳥氨酸實(shí)際用量為44g；5、活性碳脫色、濃縮、干燥后得淺黃色粉末，重124g；6、L-鳥氨酸占成品重量百分比為35.5％，茯苓多糖硫酸酯占64.5％。
實(shí)施例4 海藻多糖硫酸酯混合氨基酸鹽的物理方法制備，其制備步驟如下1、海藻多糖硫酸酯的制備(1)1000ml平底燒瓶中加入吡啶200ml，冷卻至4℃并攪拌，用分液漏斗慢慢滴加氯磺酸30ml，制備磺化試劑；(2)向磺化試劑中加入12g市售海藻酸鈉，于80-90℃下劇烈攪拌反應(yīng)1.5小時(shí)；(3)4N NaOH調(diào)pH6，減壓蒸餾去除水和吡啶，一直到蒸干為止；(4)反應(yīng)瓶中加500ml熱水溶解，流水透析1天，收集溶液用活性碳脫色；(5)3倍量的95％乙醇沉淀海藻多糖硫酸酯，無(wú)水乙醇洗滌，真空干燥，得淺黃色粉末30.7g；(6)改良的BaSO4濁度法檢測(cè)所得產(chǎn)品硫酸根含量，結(jié)果為45.0％；(7)經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳，甲苯胺藍(lán)染色，以已知分子量范圍的肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸為對(duì)照品，檢測(cè)到所得產(chǎn)品分子量分布范圍為0.5萬(wàn)-15.0萬(wàn)。
2、海藻多糖硫酸酯混合氨基酸鹽的物理方法制備(1)干燥的海藻多糖硫酸酯粉碎成粉末，稱取100g；
(2)分別稱取市售L-鳥氨酸50g，L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸各20g，機(jī)械混勻成混合L-氨基酸粉末；(3)海藻多糖硫酸酯和混合L-氨基酸粉末混勻即為目的產(chǎn)品，海藻多糖硫酸酯占產(chǎn)品重量的百分比為47.6％，混合氨基酸為52.4％，其中L-鳥氨酸23.8％，L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸分別為9.5％。
實(shí)施例5 硫酸軟骨素鳥氨酸、賴氨酸、甘氨酸混合氨基酸鹽的化學(xué)合成制備1、市售硫酸軟骨素通過(guò)BaS2O4濁度法測(cè)出硫酸根含量為23％，醋酸纖維素薄膜電泳法測(cè)得產(chǎn)品分子量分布范圍為0.5萬(wàn)-3.0萬(wàn)；2、100g市售硫酸軟骨素酸化過(guò)程同實(shí)施例3；3、30g市售L-賴氨酸、27g市售L-鳥氨酸和15g市售甘氨酸以1∶0.9∶0.5的比例配成25％等摩爾的混合氨基酸溶液；4、向酸化的硫酸軟骨素溶液中緩慢攪拌加入氨基酸混合溶液，至溶液pH6.8時(shí)停止。實(shí)際消耗L-賴氨酸26.3g，L-鳥氨酸23.7g，甘氨酸13.2g；5、活性碳脫色、濃縮、干燥后得白色粉末，重148g；6、硫酸軟骨素占產(chǎn)品的重量百分比為57.4％，混合氨基酸占42.6％。
實(shí)施例6 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽急性毒性實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小白鼠，體重20±2g；2、實(shí)驗(yàn)樣品配制 取茯苓多糖硫酸酯及其L-精氨酸鹽、L-鳥氨酸鹽各6g完全溶解于40ml生理鹽水中，制成濃度為150mg/ml的溶液；3、毒性實(shí)驗(yàn) 每種樣品取小白鼠20只，雌雄各半，每只小白鼠按體重計(jì)算一次性灌胃給藥0.04ml/g，相當(dāng)于6000mg/kg，觀察10天。茯苓多糖硫酸酯及其L-精氨酸鹽、L-鳥氨酸鹽各自給藥后動(dòng)物均健康生存，經(jīng)解剖觀察肝、腎等臟器未發(fā)現(xiàn)異常。因此多糖硫酸酯及其L-精氨酸鹽、L-鳥氨酸鹽各自對(duì)小白鼠口服的最大耐受量在6000mg/kg以上，屬于低毒類物質(zhì)(標(biāo)準(zhǔn)是LD50＞5000mg/kg)。
實(shí)施例7 茯苓多糖硫酸酯氨基酸鹽類藥物治療腎衰竭的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)
1、腺嘌呤腎衰動(dòng)物模型 SD雄性大鼠適應(yīng)1周后，按體重隨機(jī)分為5組，每組14只，每天給予腺嘌呤250mg/kg體重，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)21天。腺嘌呤配成25mg/ml的混懸液，灌胃容量10ml/kg鼠重。另有10只大鼠為正常對(duì)照組，不給予腺嘌呤。
2、動(dòng)物分組 正常對(duì)照組，給于等量蒸餾水；模型對(duì)照組，給于等量蒸餾水；地塞米松組，0.1mg/kg；茯苓多糖硫酸酯組，500mg/kg；茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽組，800mg/kg；茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽組，800mg/kg。所有組均灌胃給藥。
3、采樣檢測(cè) 造模開(kāi)始第5天給予藥物治療，每天1次，連續(xù)30天。所有動(dòng)物造模之日稱體重，以后一周稱1次，共稱5次。治療結(jié)束時(shí)，代謝籠單喂收取12小時(shí)尿，期間禁食禁水，量取尿量，測(cè)尿總蛋白；蒸餾水稀釋10倍，測(cè)定尿肌酐；眼眶靜脈采血，離心取血清，測(cè)定肌肝，尿素氮，總蛋白和白蛋白。治療結(jié)束眼眶采血后，脫頸椎處死大鼠，剖腹取出腎臟，稱重后，置于10％甲醛溶液固定，HE染色，光鏡觀察。內(nèi)容包括腎小球、近曲小管、腎髓質(zhì)、腎間質(zhì)結(jié)締組織及血管，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)腎皮質(zhì)被膜下4個(gè)視野的腎小球數(shù)(×100)，并計(jì)算其均值。
4、結(jié)果4.1一般情況觀察 正常對(duì)照組大鼠被毛光澤，緊密貼身，活動(dòng)敏捷，食量較多，飲水適量，體重逐步增加，大便呈顆粒狀，尾色淡紅。造模各組大鼠，1周后出現(xiàn)多飲多尿，食量減少，被毛干枯蓬松少光澤，活動(dòng)減少，精神不振。茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽各組與模型組和地塞米松組相比，大鼠活動(dòng)較多，飲水、尿量多，體重減輕較少，灌胃時(shí)掙扎有力。地塞米松組較模型組體重下降快，活動(dòng)、食量少。各組體重增重情況見(jiàn)表1。
表1 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽對(duì)腺嘌呤致腎衰大鼠體重增重的影響組別 第一周(g)第二周(g) 第三周(g)第四周(g)第五周(g)正常對(duì)照組268.73±16.32274.80±15.64 291.95±15.91309.13±15.73329.60±14.25269.45±15.86278.57±19.45288.40±22.76模型對(duì)照組268.62±18.64260.10±17.96△△ △△ △△246.33±12.40238.33±21.23250.55±21.20地塞米松組277.33±14.59267.04±15.95△△**△△*△△*270.96±19.12282.54±20.33茯苓多糖硫酸酯272.82±17.24261.81±19.26306.16±20.53*△ △273.55±16.79茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽組 274.50±14.74268.73±16.58295.64±18.45*311.00±17.41**△315.77±27.25茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽組 274.38±16.02260.38±20.73 273.38±26.28295.69±25.83*與模型對(duì)照組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對(duì)照組比，△P＜0.05，△△P＜0.01
4.2死亡情況 造模1周后有動(dòng)物死亡，多數(shù)發(fā)生在造模后2-4周內(nèi)。正常對(duì)照組無(wú)大鼠死亡，模型組有4只死亡(4/14)，地塞米松組有5只死亡(5/14)，茯苓多糖硫酸酯組有2只死亡(2/14)，茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽組有3只死亡(3/14)，茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽組有1只死亡(1/14)。
4.3對(duì)大鼠腎臟系數(shù)的影響 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽對(duì)腺嘌呤致腎衰大鼠腎臟系數(shù)的影響見(jiàn)表2。
表2 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽對(duì)腺嘌嶺致腎衰大鼠腎臟系數(shù)的影響組別體重(g) 雙腎重(g) 腎系數(shù)(g/100g)正常對(duì)照組 329.60±14.252.19±0.19 0.67±0.05模型對(duì)照組 288.40±22.76△△9.64±2.78△△ 3.37±1.06△△地塞米松組 250.55±21.20△△*8.16±1.51△△**3.24±0.58△△茯苓多糖硫酸酯 306.16±20.53*7.93±1.64△△*2.58±0.47△△*茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽組311.0±17.41**9.25±1.33△△ 2.98±0.42△△茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽組315.77±27.25*8.19±1.94△△ 2.58±0.50△△*與模型對(duì)照組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對(duì)照組比，△P＜0.05，△△P＜0.01造模后大鼠腎臟重量顯著增加。茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽治療后，腎臟系數(shù)較模型對(duì)照組有明顯下降，茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽效果優(yōu)于地塞米松。
4.4對(duì)血液肌酐、尿素氮、總蛋白和白蛋白的影響 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽對(duì)腺嘌呤致腎衰大鼠腎功能的影響見(jiàn)表3。
表3 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽對(duì)腺嘌呤致腎衰大鼠腎功能的影響組別Scr(μmol/L) Bun(mmol/L)TP(g/L)ALB(g/L)正常對(duì)照組 41.50±7.148.77±1.61 88.69±5.6238.49±3.02模型對(duì)照組 78.40±23.14△△ 35.18±4.05△△75.13±4.34△△28.69±3.12△△地塞米松組 135.22±14.75△△**31.24±5.81△△76.46±4.49△△31.44±3.53△△茯苓多糖硫酸酯 132.42±18.73△△**29.66±5.13△△*85.17±5.62**34.59±2.92*茯苓多糖硫酸酯精氨129.64±22.77**△△ 26.62±6.68△△*86.09±5.54**38.74±2.56**酸鹽組茯苓多糖硫酸酯鳥氨113.08±26.41△△**21.89±4.88△△**85.02±6.59**36.79±3.11**酸鹽組與模型對(duì)照組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對(duì)照組比，△P＜0.05，△△P＜0.01
動(dòng)物造模后，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，血清肌酐(Scr)、尿素氮(Bun)有極為顯著的升高(P＜0.001)，而總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)則表現(xiàn)為明顯的降低(P＜0.01)。經(jīng)茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽治療后，血清Scr和Bun水平有明顯的降低，其中血肌酐下降更為顯著。茯苓多糖硫酸酯氨基酸鹽降血肌酐和血尿素氮的能力強(qiáng)于茯苓多糖硫酸酯，茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽強(qiáng)于茯苓多糖精氨酸鹽。茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽各組明顯升高血清總蛋白和白蛋白，和正常對(duì)照組差別已不顯著，且升高的幅度大于地塞米松。
4.5對(duì)尿量、尿肌酐和尿蛋白的影響 影響結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽對(duì)腺嘌呤致腎衰大鼠尿量、尿肌酐和尿蛋白的影響組別尿量(ml) 尿肌酐(μmol/L) 尿蛋白(mg/L)正常對(duì)照組 6.02±1.72 3103.00±746.98 970.00±294.58模型對(duì)照組 13.08±2.72△△ 1178.20±388.68△△ 2080.00±500.67△△地塞米松組 14.53±2.61△△ 1730.00±336.64△△*1244.44±335.82**茯苓多糖硫酸酯 16.73±3.83△△*1847.72±352.81△△**1162.92±431.54**茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽組21.48±3.94△△**2079.09±408.64△△**1136.36±385.42**茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽組18.50±3.08△△**1992.31±495.10△△**1253.85±411.53**與模型對(duì)照組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對(duì)照組比，△P＜0.05，△△P＜0.01動(dòng)物造模后，尿量大量增多(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)后期，模型組和地塞米松組尿量開(kāi)始減少，而茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽各組繼續(xù)維持高尿量狀態(tài)。造模各組經(jīng)尿排泄的肌酐顯著減少，尿蛋白的排出顯著增加，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，差異極為顯著(P＜0.01)。經(jīng)茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽治療后，尿肌酐排出顯著增多，尿蛋白排出則明顯減少，尿蛋白和正常對(duì)照組相比沒(méi)有差異。茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽效果優(yōu)于地塞米松，茯苓多糖硫酸酯氨基酸鹽優(yōu)于茯苓多糖硫酸酯。
4.6腎臟的病理學(xué)檢查 病理切片顯示，和模型對(duì)照組相比，各治療組動(dòng)物腎泌尿功能組織的萎縮、腎小體數(shù)量的減少、腎小球體積的增大、腎小球囊腔的擴(kuò)大、細(xì)胞間質(zhì)的增生等現(xiàn)象得到明顯改善，腫脹、變性、壞死的近曲小管數(shù)量減少，遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張程度明顯減輕，腎組織內(nèi)的棕黑色結(jié)晶沉積顯著減少?？傮w按腎臟病變程度排序模型對(duì)照組＞地塞米松組＞茯苓多糖硫酸酯組＞茯苓多糖硫酸酯氨基酸鹽組＞正常對(duì)照組。正常對(duì)照組每視野腎小球平均為17.8個(gè)，模型對(duì)照組每視野腎小球平均為6.5個(gè)，地塞米松組每視野腎小球平均為6.9個(gè)，茯苓多糖硫酸酯組每視野腎小球平均為10.6個(gè)，茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽組每視野腎小球平均為13.6個(gè)，茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽組每視野腎小球平均為12.7個(gè)。
總之，茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽對(duì)腺嘌呤致腎衰大鼠有很好的腎功能保護(hù)作用，茯苓多糖硫酸酯及其氨基酸鹽的保護(hù)作用強(qiáng)于地塞米松，且無(wú)地塞米松顯著降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重的副作用，茯苓多糖硫酸酯氨基酸鹽的保護(hù)作用強(qiáng)于茯苓多糖硫酸酯。
實(shí)施例8 多糖硫酸酯氨基酸鹽類藥物的試用實(shí)例1、李××，女，60歲，干部。高血壓，高血糖，慢性腎炎。血肌酐1100，血尿素氮28，沒(méi)有做血透。服用茯苓多糖硫酸酯精氨酸鹽，每天二次，每次服用2000mg，持續(xù)服藥一個(gè)月。服藥后療效明顯，起效迅速，體質(zhì)增強(qiáng)，食欲增加，睡眠質(zhì)量提高，精神好轉(zhuǎn)，血肌酐和血尿素氮下降速度快，不反彈。血肌酐下降到850，血尿素氮下降到22。
2、蔡××，男，36歲，企業(yè)經(jīng)理，遺傳性高血壓。后肺部感染誘發(fā)急性腎衰，血肌酐1700，血尿素氮38，后即進(jìn)行腎透析，每周2次。透析一年后服用茯苓多糖硫酸酯鳥氨酸鹽，開(kāi)始每天4000mg分二次服用，持續(xù)三個(gè)月。服藥后療效明顯，食欲增加，精神好轉(zhuǎn)，血肌酐和血尿素氮下降速度快。血透前檢查血肌酐下降到1200，血尿素氮下降到25。
3、江××，女，52歲，公司職員。糖尿病腎衰早期，嘔吐，惡心。血肌酐1000，血尿素氮25，沒(méi)有做血透。服用海藻多糖硫酸酯混合氨基酸鹽，每天二次，每次服用2000mg，持續(xù)服藥一個(gè)月。服藥后療效明顯，起效迅速，血肌酐下降到600，血尿素氮下降到18，惡心癥狀消失。
4、周××，男，46歲，出租車司機(jī)?；寄蚨景Y，口腔有嚴(yán)重的氨臭味，皮膚騷癢，惡心，頭暈，血肌酐1500，血尿素氮35，每周血透2次。服用硫酸軟骨素混合氨基酸鹽，每天二次，每次服用2500mg，持續(xù)服藥一個(gè)月。服藥后療效明顯，血透減少為每周一次，血肌酐下降到950，血尿素氮下降到26，皮膚騷癢、頭暈癥狀減輕。
權(quán)利要求
1.一類多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物，其特征在于它是由多糖硫酸酯聚陰離子載體與氨基酸成鹽形成的復(fù)合物，其組分重量百分比為多糖硫酸酯占該復(fù)合物10％-95％，氨基酸占該復(fù)合物5％-90％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于上述的多糖硫酸酯包括天然多糖硫酸酯和人工半合成多糖硫酸酯，硫酸根占多糖硫酸酯的重量百分比為2％-60％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物，其特征在于上述多糖硫酸酯中的多糖包括動(dòng)物多糖、植物多糖和/或微生物多糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物，其特征在于所述的微生物多糖優(yōu)選為真菌多糖，最優(yōu)選茯苓多糖、豬苓多糖和裂褶菌多糖；動(dòng)物多糖優(yōu)選為糖胺聚糖；植物多糖優(yōu)選為海藻多糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于成鹽氨基酸種類包括全部天然氨基酸，優(yōu)選為L(zhǎng)-鳥氨酸、L-精氨酸和甘氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于該藥物加入相應(yīng)的輔料，可制備成片劑、丸劑、膠囊劑和針劑。
7.一類多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物的制備方法，其特征在于多糖硫酸酯和氨基酸的結(jié)合包括在溶液中以分子離子的形式化學(xué)合成和/或采用物理方式進(jìn)行機(jī)械混合兩種制備方法，其化學(xué)制備方法步驟如下(1)植物多糖的提取采用熱水抽提法，動(dòng)物多糖、微生物多糖的提取采用酶解和堿提相結(jié)合的方法，提取物經(jīng)脫色、透析和真空濃縮后，乙醇沉淀、真空干燥；(2)多糖硫酸酯的制備采用氯磺酸-吡啶法，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)堿中和、脫色、透析和真空濃縮后，乙醇沉淀、真空干燥；(3)多糖硫酸酯氨基酸鹽制備步驟如下a.多糖硫酸酯堿金屬或堿土金屬鹽配成5％-20％溶液，緩慢攪拌加入氫型酸性樹脂，離子交換去除多糖硫酸酯堿金屬或堿土金屬鹽中的金屬離子，反應(yīng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)溶液pH值，當(dāng)pH至0.5-2時(shí)過(guò)濾分離出樹脂；b.將氨基酸配成1％-70％的溶液；c.向酸性樹脂處理好的多糖硫酸酯溶液中緩慢攪拌加入氨基酸溶液，成鹽反應(yīng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)溶液pH值，當(dāng)pH至3-8時(shí)停止加入氨基酸溶液；d.活性碳脫色，真空濃縮和干燥，機(jī)械粉碎，即得多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述藥物的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的多糖硫酸酯，其分子量在0.2萬(wàn)-80.0萬(wàn)之間，優(yōu)選0.5萬(wàn)-30萬(wàn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述藥物的制備方法，其特征在于步驟(3)中b和c所述的氨基酸，包括一種和/或多種，多糖硫酸酯和一種氨基酸形成多糖硫酸酯單氨基酸鹽，多糖硫酸酯和多種氨基酸形成多糖硫酸酯混合氨基酸鹽。
10.一類多糖硫酸酯氨基酸鹽藥物在制備治療慢性腎炎和腎衰竭疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一類多糖硫酸酯氨基酸鹽類藥物及其制備方法，該藥物是由多糖硫酸酯聚陰離子載體與氨基酸成鹽形成的復(fù)合物，其中多糖硫酸酯占該復(fù)合物的重量比為10％－95％，氨基酸占5％－90％。該類藥物的制備方法，其步驟為(1)多糖的提?。?2)多糖硫酸酯的制備；(3)多糖硫酸酯氨基酸鹽的制備。該藥物由于將多糖硫酸酯與氨基酸復(fù)合成鹽，有助于去除多糖硫酸酯制備過(guò)程中產(chǎn)生的金屬離子，并融合了它們的免疫調(diào)節(jié)活性和治療慢性腎炎和腎衰竭的藥理活性，從而產(chǎn)生正向協(xié)同作用，使多糖硫酸酯氨基酸鹽對(duì)腎病患者腎功能的保護(hù)作用強(qiáng)于多糖硫酸酯和天然氨基酸的獨(dú)自藥效。此類藥物水溶性好，療效顯著且低毒無(wú)副作用，是治療慢性腎炎和腎衰竭疾病的良好藥物。
文檔編號(hào)A61K9/20GK1634126SQ20041006476
公開(kāi)日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月27日
發(fā)明者焦慶才, 陳群, 李緒亮, 劉茜 申請(qǐng)人:南京大學(xué)