專利名稱：六味地黃湯提取物，其藥物組合物及其醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及六味地黃湯提取物(簡(jiǎn)稱LW-ABC)、其提取方法、含有該提取物的藥物組合物及其醫(yī)藥用途，所述醫(yī)藥用途包括治療或輔助治療疾病的用途，所涉及的疾病包括腫瘤、腫瘤化學(xué)或放射治療的副作用、白細(xì)胞減少癥、衰老性免疫功能低下、感染等；自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、腎炎、支氣管炎及支氣管哮喘、前列腺炎、再生障礙性貧血、血小板減少性紫癜、重癥肌無(wú)力，及老年性疾病等患者所表現(xiàn)的免疫功能紊亂；以及伴有腎陰虛證生殖內(nèi)分泌功能低下或紊亂疾病包括更年期綜合征、卵巢功能低下、不孕癥、習(xí)慣性流產(chǎn)、植物神經(jīng)紊亂、黃褐斑、男性乳房發(fā)育、老年性性功能衰退、更年期骨質(zhì)疏松，老年骨質(zhì)疏松等。
背景技術(shù)：
六味地黃湯是由熟地、山茱萸、山藥、澤瀉、丹皮和茯苓六味中藥以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍組成，主要用于治療腰膝酸軟，頭暈?zāi)垦＃Q耳聾，遺精，消渴，盜汗，骨蒸潮熱，牙齒動(dòng)搖，小便淋瀝等腎陰不足之證，在中醫(yī)臨床中廣為應(yīng)用，并在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中得到不斷發(fā)展，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。在現(xiàn)代臨床醫(yī)療中仍被廣泛應(yīng)用于具有腎陰虛證表現(xiàn)的上百種疾病的治療或輔助治療，包括腫瘤、自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、腎炎白細(xì)胞減少癥支氣管炎及支氣管哮喘、前列腺炎、再生障礙性貧血血小板減少性紫癜、重癥肌無(wú)力，更年期綜合征，前列腺肥大、不孕癥、妊娠中毒癥神經(jīng)衰弱、帕金森氏綜合征、高血壓、冠心病、心率失常、腎盂腎炎、糖尿病等，獲得了良好的治療效果。但目前該方在實(shí)際應(yīng)用中，無(wú)論作為湯劑、丸劑、膠囊劑或其它劑型，都存在明顯不足，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面一是劑量大，用藥不方便，難以作成方便使用的藥物劑型；二是有效成分不明確，沒有以有效成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)，難以保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定和可控；三是當(dāng)各種原因?qū)е滤幉闹杏行С煞趾砍霈F(xiàn)大的變化時(shí)，沒有有效的手段保證產(chǎn)品中有效成分含量的穩(wěn)定，從而無(wú)法保證臨床用藥的有效性。因此，改進(jìn)傳統(tǒng)的六味地黃湯，確定其有效成分及含量范圍，從而制成有效成分穩(wěn)定的六味地黃湯具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)研究，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過對(duì)傳統(tǒng)六味地黃湯進(jìn)行科學(xué)地處理，在保持原六味地黃湯各種藥效的同時(shí)，可大大降低六味地黃湯使用時(shí)的體積，明顯提高六味地黃湯中有效成分含量，確定六味地黃湯中有效成分的分布及含量，從而有效地保證六味地黃湯安全而有效地使用。本發(fā)明六味地黃湯提取物有良好的使用性，在常溫下水中溶解度為≥1.5g/ml。
因此，本發(fā)明第一方面涉及六味地黃湯提取物，其包括以六味地黃湯提取物重量計(jì)，11.4-17重量％的多糖，和/或1.85-2.27％重量％的總苷(莫諾苷、馬錢素、芍藥苷)和/或23.5-35.5重量％的甘露三糖，其中六味地黃湯由熟地、山茱萸、山藥、澤瀉、丹皮和茯苓六味中藥以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍組成。
本發(fā)明另一方面涉及藥物組合物，其包括含有11.4-17重量％的多糖，和/或1.85-2.27％重量％的總苷(莫諾苷、馬錢素、芍藥苷)和/或23.5-35.5重量％的甘露三糖的六味地黃湯提取物及藥用載體，其中六味地黃湯由熟地、山茱萸、山藥、澤瀉、丹皮和茯苓六味中藥以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍組成。
本發(fā)明再一方面涉及六味地黃提取物的制備方法，其包括i)將由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、丹皮和茯苓按8∶4∶4∶3∶3∶3組成的混合物用沸水蒸煮兩次，然后濃縮至浸膏；ii)伴隨攪拌往浸膏中加入乙醇至乙醇濃度30％(v/v)放置，離心，沖洗，將上清液與洗液合并為上清液；iii)濃縮上清液，伴隨攪拌往濃縮液中加95％乙醇至乙醇濃度60％(v/v)，放置，分離得部位A和上清液；iv)將iii)中上清液進(jìn)行柱層析，用水和極性有機(jī)溶劑洗脫，有機(jī)溶劑洗脫液濃縮后得部位B；v)iv)中水洗脫液濃縮后上活性炭柱，用乙醇洗脫，乙醇洗脫液濃縮后得部位C；vi)將iii)中部位A，iv)中部位B和v)中部位C混合。
根據(jù)本發(fā)明，六味地黃湯提取物可按下面工藝流程得到 具體講，按經(jīng)典六味地黃湯各單味藥的配比，組成生藥。加沸水煎煮，過濾，得提取液。提取液濃縮至適當(dāng)體積，加醇至終濃度30％，攪拌，放置過夜。離心處理(2500轉(zhuǎn)/分)，沉淀?xiàng)?。上清液合并濃縮至適量，將醇濃度調(diào)節(jié)為60％，攪拌，放置，同法離心處理。沉淀同法再進(jìn)行二次醇沉淀處理。所得沉淀用水溶解濃縮除醇后，冷凍干燥為部位A。三次上清液合并，旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)，除去醇，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析，用水和極性有機(jī)溶劑依次洗脫，極性有機(jī)溶劑洗脫部位濃縮除去溶劑后凍干，為部位B。水洗脫部位濃縮后進(jìn)行活性炭柱層析，用水和乙醇依次洗脫，醇洗脫部位濃縮除醇后凍干，為部位C。將A、B和C三個(gè)部位合并，即為六味地黃湯提取物L(fēng)W-ABC。
上述LW-ABC制備方法中所用大孔吸附樹脂為所有型號(hào)的弱極性大孔吸附樹脂；兩次醇沉淀所用醇為C1-4低級(jí)烷基醇(如甲醇、乙醇等)，濃度范圍分別為10％-40％和50％-95％；大孔吸附樹脂層析洗脫所用的極性有機(jī)溶劑為所有大孔樹脂所能允許使用的極性有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇、丙醇和丙酮等)，濃度范圍為10％-95％。活性炭層析洗脫所用醇為甲醇和乙醇，洗脫濃度為20％-95％。
本發(fā)明還涉及六味地黃湯提取物在制備用于預(yù)防或治療腫瘤、腫瘤化學(xué)或放射治療過程中的副作用、白細(xì)胞減少癥、衰老性免疫功能低下、感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、腎炎、支氣管炎及支氣管哮喘、前列腺炎、再生障礙性貧血、血小板減少性紫癜、重癥肌無(wú)力、老年性免疫功能低下或紊亂、更年期綜合征、卵巢功能低下、習(xí)慣性流產(chǎn)、不孕癥、黃褐斑、男性乳房發(fā)育、更年期骨質(zhì)疏松、老年性骨質(zhì)疏松、植物神經(jīng)紊亂的產(chǎn)品中用途，其中六味地黃湯提取物包括以六味地黃湯提取物重量計(jì)，11.4-17重量％的多糖，和/或1.85-2.27％重量％的總苷(莫諾苷、馬錢素、芍藥苷)和/或23.5-35.5重量％的甘露三糖，其中六味地黃湯由熟地、山茱萸、山藥、澤瀉、丹皮和茯苓六味中藥以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍組成。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明六味地黃湯中總苷的含量是莫諾苷含量，馬錢素含量和芍藥苷的含量之和。
根據(jù)本發(fā)明，提取物A(部位A)是以含多糖為特征的六味地黃湯提取物。
根據(jù)本發(fā)明，提取物B(部位B)是以含苷類為特征的六味地黃湯提取物。
根據(jù)本發(fā)明，提取物C(部位C)是以含甘露三糖為特征的六味地黃湯提取物。


圖1-1為六味地黃湯提取物的總離子流批紋圖譜圖1-2為六味地黃湯提取物的HPLC-DAD指紋圖譜圖2為莫諾苷對(duì)照品色譜圖3為馬錢素對(duì)照品色譜圖4為芍藥苷對(duì)照品圖5為樣品高效液相色譜圖6為樣品總離子流色譜圖7為樣品中莫諾苷負(fù)離子質(zhì)譜8為樣品中馬鐵素負(fù)離子質(zhì)譜9為樣品中芍藥苷負(fù)離子質(zhì)譜10為苷露三糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜11為寡糖部分樣品色譜12為L(zhǎng)W-ABC對(duì)SAMP8動(dòng)情周期的影響圖13為L(zhǎng)W-ABC對(duì)SAMP8血清雌二醇水平的影響圖14為L(zhǎng)W-ABC對(duì)SAMP8垂體LH含量的影響圖15為L(zhǎng)W-ABC對(duì)SAMP8下丘腦GnRH含量的影響圖16為L(zhǎng)W-ABC對(duì)皮質(zhì)酮處理(腎陰虛)小鼠卵巢重量的影響圖17為L(zhǎng)W-ABC對(duì)皮質(zhì)處理(腎陰虛)小鼠血清二醇水平的影響圖18為L(zhǎng)W-ABC對(duì)皮質(zhì)處理(腎陰虛)小鼠垂體LH含量的影響根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的六味地黃湯提取物按如下方法定性鑒別(1)α-萘酚反應(yīng)(Molish反應(yīng))
六味地黃湯提取物以適量水溶解，加10％α-萘酚乙醇溶液三滴，然后沿試管壁緩緩加入濃硫酸，使形成上下兩層，稍后在兩層界面處可見紫色環(huán)，表示有寡糖、苷類和多糖類成分存在。
(2)以馬錢素為代表的環(huán)烯醚萜甙的定性檢查六味地黃湯提取物以適量95％乙醇浸取，浸出液為待測(cè)液。以馬錢素和莫諾甙的乙醇溶液作為對(duì)照品。待測(cè)液和對(duì)照液分別點(diǎn)樣于硅膠G薄層板和硅膠G-0.3％CMC-Na薄層板上，分別以展開劑A(正丁醇/乙醇/水，15∶3∶3)和展開劑B(氯仿/甲醇，16∶4)展開，分別用10％香草醛溶液(后再噴72％的硫酸)和Godin試劑顯色，分別在105℃和80-90℃烘5分鐘，待測(cè)液和對(duì)照液具有相同的顯色斑點(diǎn)。
(3)六味地黃湯提取物的HPLC指紋圖譜液相色譜條件Zorbax Eclipse XDB C-8柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相流速1.00ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，柱溫7℃，CH3CN-H2O二元梯度洗脫(0min2:98；50min24:76，60min56:44)，進(jìn)樣量20μl，所有組分60min內(nèi)洗脫完畢。
結(jié)果如圖1-1，圖1-2所示根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的六味地黃湯提取物按如下方法定量鑒別一、提取物中苷類成分的含量測(cè)定儀器與試劑Agilent 1100高效液相系統(tǒng)，含四元梯度泵、DAD檢測(cè)器、柱溫箱和化學(xué)工作站。美國(guó)ABI公司API 3000液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有Turbo Ionspray離子化源以及Analyst 1.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。
莫諾苷、馬錢素對(duì)照品為本室自制，經(jīng)光譜確定結(jié)構(gòu)，HPLC面積歸一化法測(cè)得純度在98.0％以上。芍藥苷對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。熟地、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉、牡丹皮均購(gòu)自北京同仁堂藥材批發(fā)站。甲醇為色譜純，水為去離子水。
實(shí)驗(yàn)方法1.色譜條件Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水(33∶67)，流速1.0mL.min-1，柱溫30℃，DAD檢測(cè)波長(zhǎng)236nm，進(jìn)樣量20μL。理論塔板數(shù)按馬錢素峰計(jì)算大于3000，在此條件下，莫諾苷、馬錢素、芍藥苷均能與其他組分達(dá)到良好的基線分離。
2.質(zhì)譜條件負(fù)離子檢測(cè)，噴射電壓為-4000V，DP電壓-70V，F(xiàn)P電壓-290V，TEM 300℃，NEB為8，CUR為11。
3.對(duì)照品溶液的制備精密稱取莫諾苷、馬錢素、芍藥苷對(duì)照品各10mg，置于10mL容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇定容至刻度，搖勻。分別從中吸取75，100，150，300，600μL，加水稀釋成10mL，制備成5份對(duì)照品溶液。
4.樣品溶液的制備取該提取物8.92g，加60％乙醇80毫升，充分?jǐn)嚢?，放置，離心處理(2500轉(zhuǎn)/分，25min)，沉淀再用60％乙醇沉淀，沉淀?xiàng)?。合并兩次上清液，?jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)，除去乙醇，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析，用水和30％乙醇依次洗脫，30％乙醇洗脫部位濃縮除醇后凍干，為甙類部位。取適量加加水配成濃度為40mg/mL，共3份，過濾(0.45μm的濾膜)后按上述色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算莫諾苷、馬錢素、芍藥苷的含量。
結(jié)果在上述色譜條件下，分別對(duì)3個(gè)對(duì)照品進(jìn)行HPLC-DAD和HPLC-MS分析。莫諾苷、馬錢素、芍藥苷保留時(shí)間分別為6.0，11.0，12.0min，電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)確證質(zhì)量數(shù)與計(jì)算值相符；再對(duì)樣品進(jìn)行HPLC-DAD和HPLC-MS分析，主要成分的色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)均與對(duì)照品相符，結(jié)果見圖2-9。
結(jié)果莫落苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A＝2772.8C-13.28，r＝0.9998，線性范圍7.4～60mg.L-1；馬錢素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A＝2676.3C-4.14，r＝0.9996，線性范圍7.7～62mg.L-1；芍藥苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A＝2541.3C-42.49，r＝0.9991，線性范圍8.5～68mg.L-1。
表1 六味地黃水煎液中莫諾苷、馬錢素、芍藥苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果稱樣量加入量測(cè)得量 回收率 平均回收率對(duì)照品(g) (mg) (mg) (％) (％)莫諾苷 0.25122.5 4.53 100.8 98.80.25082.6 4.68 102.80.25102.3 4.22 96.20.25062.2 4.10 95.20.25092.2 4.18 98.8馬錢素 0.25121.6 2.64 102.2 98.30.25081.3 2.26 96.70.25101.4 2.39 99.00.25061.2 2.15 95.70.25091.2 2.18 98.0芍藥苷 0.25121.5 2.69 98.9 99.60.25081.6 2.85 102.90.25101.4 2.56 96.70.25061.5 2.72 101.10.25091.4 2.58 98.3RP-HPLC分析結(jié)果表明，提取物中主要成分莫諾苷(a)、馬錢素(b)、芍藥苷(c)的相對(duì)保留時(shí)間分別為1.0，1.75～1.85，1.90～2.10。HPLC-MS分析表明，樣品中的主要成分a、b和c在(-)ESI-MS二級(jí)質(zhì)譜中分別具有[M-H]的準(zhǔn)分子離子和[M-glc]碎片峰(a為405和243；b為389和227；c為479和317)，見圖6～圖9。
樣品含量測(cè)定樣品中莫諾苷、馬錢素、芍藥苷含量分別為6.2-7.6％、3.3-4.1％、3.0-3.6％，三部分加和為12.5-15.3％。折算為在六味地黃湯提取物中三部分加和為1.85-2.27％。
二、提取物中寡糖(甘露三糖)的含量測(cè)定儀器及試劑甘露三糖為本實(shí)驗(yàn)室制備，經(jīng)過光譜、HPLC-MS確定為甘露三糖，通過面積歸一化法測(cè)定其純度達(dá)到98％以上；乙腈為色譜純；水為去離子水。
儀器Waters 600泵，Waters 410示差檢測(cè)器。
實(shí)驗(yàn)方法1、色譜條件 Intersil氨基柱(4.6mm×250mm)；柱溫為室溫；流動(dòng)相為乙腈-水(67∶33，v/v)；流速為1.0mL/mL；20uL進(jìn)樣閥；示差檢測(cè)器。
2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 稱取甘露三糖對(duì)照品0.0170g，加水配成5mL溶液，搖勻后過0.45μm的濾膜，然后分別從中吸取3，2.5，1.5，1.25mL加水配成5mL水溶液，搖勻，共是5份對(duì)照品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣分析，將色譜峰積分面積與對(duì)照品濃度做回歸分析，考察線性范圍。
3、精密度實(shí)驗(yàn) 按上述色譜條件，將同一對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD值，考察儀器的精密程度。
4、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按上述色譜條件，將同一樣品溶液進(jìn)樣，在0，30min，1h，2h，4h，8h測(cè)定，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。
5、樣品測(cè)定 取該提取物8.92g，加60％乙醇80毫升，充分?jǐn)嚢?，放置。離心處理(2500轉(zhuǎn)/分，25min)，沉淀再用60％乙醇沉淀，沉淀?xiàng)墶：喜纱紊锨逡?，?jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)，除去乙醇，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析，水洗脫部位濃縮后進(jìn)行活性炭柱層析，用水和30％乙醇依次洗脫，30％乙醇洗脫部位濃縮除醇后凍干，為寡糖部位。稱取按寡糖樣品3份0.0757g，0.0755g，0.0835g，置于25mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，過濾后按上述色譜條件進(jìn)樣，根據(jù)測(cè)得的峰面積計(jì)算寡糖的含量。
6、重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按工藝，在同樣的條件下同時(shí)制備3份樣品，稱取一定量配成濃度為3mg/mL的水溶液，在上述色譜條件進(jìn)樣分析。
結(jié)果在上述色譜條件下，甘露三糖對(duì)照品水溶液在0.85mg/mL～3.5mg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝6.53×10-8A-0.023[Y為濃度mg/mL，A為峰面積]。精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所用儀器精密度良好；樣品水溶液室溫下8小時(shí)內(nèi)測(cè)定，結(jié)果十分穩(wěn)定，；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表2)表明，利用水煎醇沉后醇溶部分過大孔樹脂得到水洗脫部分，再經(jīng)活性碳柱層析得到活性寡糖的提取分離工藝重復(fù)性好。
分析結(jié)果顯示，樣品中的寡糖部分中主要成分是甘露三糖，還有少量的水蘇糖和二糖。二糖、甘露三糖和水蘇糖的相對(duì)保留時(shí)間分別為1，1.40～1.53，1.55～1.70(見圖10，11)。在部位C中，甘露三糖平均占36.8-56.8％，折算為在六味地黃湯提取物中甘露三糖平均占23.5-35.5％。
表2 HPLC測(cè)定寡糖樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)樣品代號(hào)1 2 3樣品質(zhì)量(g) 0.0726 0.0752 0.0765峰面積 20348086 22157259 23037208含量44.96％47.3％ 48.4％平均含量 46.8％RSD3.7％三、提取物中多糖的含量測(cè)定儀器與試劑試劑間羥基聯(lián)苯(AR.)以0.5％氫氧化鈉配置成質(zhì)量比為0.15％，冰箱保存一月內(nèi)有效；四硼酸鈉(AR.)-硫酸試液0.0125mol/mL四硼酸鈉的濃硫酸溶液；半乳糖醛酸(Sigma)標(biāo)準(zhǔn)液80℃干燥至恒重后配置成60μg/mL，冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ蛩釣榉治黾?；苯酚為分析純，重蒸后冰箱保存，用前加水配置?％的水溶液；葡萄糖為分析純，105℃干燥至恒重。
儀器cintra-20(澳大利亞)紫外分光光度儀實(shí)驗(yàn)方法1.間羥基聯(lián)苯法1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取Gala A標(biāo)準(zhǔn)液0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5mL分別置于6個(gè)25mL的容量瓶中，各補(bǔ)加水至1.5mL，搖勻，冰浴冷卻，加入四硼酸鈉-濃硫酸9.0mL搖勻，沸水浴5min，取出冰浴冷卻，加入間羥聯(lián)苯溶液0.15mL，搖勻，放置半小時(shí)后，于525nm下測(cè)定吸收值。
1.2精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取GalaA標(biāo)準(zhǔn)溶液0.9mL6份，余操作同上，在同樣條件下考察儀器的精密度。
1.3樣品的制備取該提取物8.83g，加60％乙醇80毫升，充分?jǐn)嚢?，放置，離心處理(2500轉(zhuǎn)/分，25min)，沉淀再用60％乙醇沉淀一次，棄去上清。沉淀水溶解后，冷凍干燥備用。
1.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 稱取樣品配置一定濃度的溶液，吸取1.0mL，余按第一項(xiàng)下操作，在0，20min，40min，1h，3h，5h，8h測(cè)定吸光度值，考察樣品及與反應(yīng)試劑生成有色物的穩(wěn)定性。
1.5樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按工藝處理方法在同樣條件下同時(shí)制備樣品3份，按樣品測(cè)定項(xiàng)下配置溶液，吸取1.0mL，同上操作，測(cè)定吸光度，考察此分離方法的穩(wěn)定性。
1.6樣品測(cè)定 稱取同一樣品6份，配置成濃度為0.4mg/mL，吸取1.0mL，將其分為兩組，按第一項(xiàng)操作，第一組加顯色劑，第二組加同等量的0.5％氫氧化鈉溶液，第一組測(cè)得吸光度值扣除第二組后，計(jì)算60％醇沉酸性多糖的含量。
1.7加樣回收率 精密稱取樣品五份，每份精密依次加入半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，加水定容，搖勻后，吸取1.0mL按第一項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度值，計(jì)算回收率，考察此定量方法的穩(wěn)定性。
2.苯酚-硫酸法2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品，配成濃度為0.3mg/mL備用液。分別吸取備用液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0置于50mL的容量瓶中，加水定容至刻度搖勻，配成標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.0mL置于25mL量瓶中，加入5％(g/v)苯酚溶液1.8mL，混勻，迅速加入濃硫酸7.5mL(10～20s)，混勻，置沸水浴中加熱20min，取出后冷水浴中冷卻30min，另以2.0mL蒸餾水同上平行操作為空白對(duì)照，于490nm下測(cè)定吸光度值。
2.2校正曲線的制備 精密稱取80℃烘干的半乳糖醛酸0.0595g，加水配成100mL溶液，搖勻后，從中取出1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL于6個(gè)50mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻后，從中取2.0mL，置于25mL容量瓶中，余操作同第一項(xiàng)。
2.3精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0mL共6份，按第一項(xiàng)下操作，測(cè)定吸收值A(chǔ)，在同樣條件下考察儀器的精密度。
2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取樣品溶液2.0mL，按第一項(xiàng)下操作，在0，10min，30min，1.0h，1.5h，2.5h，4.0h時(shí)間點(diǎn)測(cè)吸收值，考察樣品的穩(wěn)定性。
2.5樣品測(cè)定 稱取同一樣品3份，配置成濃度為0.04mg/mL，吸取樣品溶液2.0mL，置于25mL容量瓶，余操作按第一項(xiàng)，測(cè)定吸光度值，計(jì)算60％醇沉中性多糖的含量。
2.6樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按工藝處理方法在同樣條件下同時(shí)制備樣品3份，按樣品測(cè)定項(xiàng)下配置溶液，吸取2.0mL置于25mL容量瓶，余同上操作，測(cè)定吸光度，考察此分離方法的重復(fù)性。
2.7加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取樣品5份，每份依次精密加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，加水定容，搖勻后，吸取2.0mL按第一項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度值，計(jì)算回收率，考察此定量方法的穩(wěn)定性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
采間羥基聯(lián)苯法與苯酚-硫酸法聯(lián)用，測(cè)定樣品經(jīng)處理后的大分子部位中的多糖的含量。先用間羥基聯(lián)苯法測(cè)定糖醛酸的含量，可靠準(zhǔn)確；然后用苯酚-硫酸法測(cè)定糖的含量，同時(shí)將糖醛酸做對(duì)照品，按此法做校正曲線，將第一步測(cè)得的糖醛酸含量帶入校正曲線進(jìn)行校正，得到計(jì)算吸光度值。從該法測(cè)得的吸光度值中扣除計(jì)算值后，帶入該法標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得到中性糖的含量，中性糖與酸性糖醛酸加和即得總多糖的量，再根據(jù)原樣品的重量折算出總多糖在樣品中的含量。測(cè)定結(jié)果表明，提取物中總多糖的含量在11.4-17％范圍之間。
表3.間羥基聯(lián)苯法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品NO. 123質(zhì)量(g) 0.0213 0.0212 0.0213吸收度 0.7877 0.7780 0.8209含量(％) 22.2 22.0 23.0平均含量 22.5％RSD 2.0％表4 苯酚-硫酸法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品NO. 1 23樣品質(zhì)量(g) 0.02130.0212 0.0213吸光度值0.22850.2408 0.2431含量(％)65.3 66.7 67.5平均含量 66.5％RSD 1.67％進(jìn)一步講，六味地黃湯中的多糖活性部位主要由酸性雜多糖構(gòu)成。多糖活性部位在酸性條件下水解后，將水解后樣品以纖維素薄層層析板上展開，與單糖標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，可清楚地檢出鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸。
多糖酸水解分析糖組成取5mg多糖樣品加入2M三氟乙酸3ml，封管，在100℃水解10小時(shí)，水解液40℃減壓蒸餾除去大量的三氟乙酸后，分五次加入3ml甲醇，共沸蒸餾，除去殘留的三氟乙酸，殘?jiān)苡?.3ml水中得到待測(cè)樣品。
將待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)單糖水溶液點(diǎn)樣于水飽和的纖維素薄層層析板上，用乙酸乙酯∶吡啶∶冰醋酸∶水(5∶5∶1∶3)混合溶液為展開劑，展開八小時(shí)，約展開16厘米后，取出，吹干展開劑，噴以顯色劑苯胺-鄰苯二甲酸，100℃烘5分鐘。將多糖樣品顯色斑點(diǎn)的Rf值及斑點(diǎn)顏色與標(biāo)準(zhǔn)單糖比較，可確定樣品多糖的單糖組成。
按上述方法可得到六味地黃湯中的多糖活性部位的特征薄層層析圖。分析結(jié)果顯示，六味地黃多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸構(gòu)成，并含有微量木糖和甘露糖。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明六味地黃湯提取物L(fēng)W-ABC具有明顯改善或調(diào)節(jié)免疫功能的活性，對(duì)伴有腎陰虛證并具有免疫功能低下的各種疾病以及生殖內(nèi)分泌功能低下或紊亂的各種疾病，特別是腫瘤、腫瘤化學(xué)或放射治療過程中、白細(xì)胞減少癥、衰老性免疫功能低下、感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、腎炎、支氣管炎及支氣管哮喘、前列腺炎、再生障礙性貧血、血小板減少性紫癜、重癥肌無(wú)力、老年性免疫功能低下或紊亂、更年期綜合征、卵巢功能低下、習(xí)慣性流產(chǎn)、不孕癥、黃褐斑、男性乳房發(fā)育、更年期骨質(zhì)疏松、老年性骨質(zhì)疏松、植物神經(jīng)紊亂等疾病具有治療或輔助治療作用。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的六味地黃湯提取物由多糖類部位，苷類部位和寡糖類部位三部分組成，可測(cè)定成分的含量范圍為總多糖11.4-17％，總苷類1.85-2.27％，寡糖23.5-35.5％。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明還涉及藥物組合物，包括作為活性成分的本發(fā)明六味地黃湯提取物及一種或多種藥用載體或賦形劑。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明還涉及六味地黃湯提取物用于制備治療伴有腎陰虛證并具有免疫功能低下的各種疾病以及生殖內(nèi)分泌功能低下或紊亂的各種疾病，如腫瘤、腫瘤化學(xué)或放射治療時(shí)的副作用、白細(xì)胞減少癥、衰老性免疫功能低下、感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、腎炎、支氣管炎及支氣管哮喘、前列腺炎、再生障礙性貧血、血小板減少性紫癜、重癥肌無(wú)力、老年性免疫功能低下或紊亂、更年期綜合征、卵巢功能低下、習(xí)慣性流產(chǎn)、不孕癥、黃褐斑、男性乳房發(fā)育、更年期骨質(zhì)疏松、老年性骨質(zhì)疏松、植物神經(jīng)紊亂等病的藥物的用途。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明六味地黃湯提取物可單獨(dú)或以藥物組合物形式使用，其給藥方式可根據(jù)具體情況而定，可通過口服、非腸道或局部給藥，給藥劑型可以是例如片劑，丸劑、膠囊，膏劑，口服液等。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例下面的實(shí)施例和生物活性實(shí)驗(yàn)，是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。
實(shí)施例1六味地黃湯提取物L(fēng)W-ABC的制備按六味地黃湯各單味藥的配比，即熟地黃∶山茱萸∶山藥∶澤瀉∶丹皮∶茯苓(8∶4∶4∶3∶3∶3)或?qū)Σ糠炙幬都?、減量后，組成生藥共1500克，加六倍生藥重量的沸水煎煮兩次，每次兩小時(shí)，用紗布(六層)加脫脂棉過濾，減壓濃縮至生藥(重量)與浸膏(體積)比1∶1。
浸膏伴隨攪拌加乙醇至乙醇終濃度30％(v/v)，攪拌，放置過夜。離心處理(2500轉(zhuǎn)/分，25min)。沉淀用30％乙醇沖洗4次，離心，沉淀?xiàng)?。上清液合并濃縮至1000毫升，用95％乙醇將乙醇終濃度調(diào)節(jié)為60％，攪拌，放置過夜，同法離心處理。沉淀用60％乙醇再進(jìn)行二次醇沉淀處理。所得沉淀用水溶解濃縮除醇后，冷凍干燥，得到灰白色粉末(部位A，51.92克)。三次上清液合并，旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)，除去乙醇，進(jìn)行HP-20大孔吸附樹脂柱層析，樹脂柱床體積(毫升)與上樣量(克)比為10∶1，然后用水和30％乙醇依次洗脫，30％乙醇洗脫部位濃縮除醇后凍干，得到棕黃色粉末(部位B，38.6克)。水洗脫部位濃縮后進(jìn)行活性炭柱層析，活性炭柱床體積(毫升)與上樣量(克)比(20∶1)，用水和30％乙醇依次洗脫，30％乙醇洗脫部位濃縮除醇后凍干，得到白色粉末(部位C，151克)。將A、B和C三個(gè)部位合并，形成提取物。
其具有前述的定性反應(yīng)特征。
以前述的定量方法測(cè)得所得提取物中多糖14.2重量％，總苷類2.06重量％，寡糖29.5重量％。
實(shí)施例2實(shí)施例1六味地黃湯提取物L(fēng)W-ABC的生物活性實(shí)驗(yàn)一、LW-ABC對(duì)免疫功能的作用1.LW-ABC對(duì)“腎陰虛”小鼠免疫功能的影響“腎陰虛”小鼠模型的制備按下述方法進(jìn)行給Balb/c小鼠皮下注射皮質(zhì)酮混懸液，25mg/kg，2次/日，連續(xù)7天。于造摸當(dāng)天開始灌胃給予六味地黃湯或六味地黃湯活性成分組方LW-ABC，1次/日，連續(xù)7天，于末次給藥后4小時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠稱重后斷頭處死，分別取出胸腺和脾臟，稱重，計(jì)算胸腺和脾指數(shù)。淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠斷頭處死，無(wú)菌取脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，用完全RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106細(xì)胞/ml，取50μl不同濃度的受試藥物、50μl Con A(終濃度為0.5ug/ml)和100μl細(xì)胞懸液依次加入96孔板內(nèi)，對(duì)照組用1640培養(yǎng)液代替Con A或(和)藥物，置37℃、5％CO2孵溫箱孵育56小時(shí)，每孔加入20μl 3H-TdR(10μCi/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)至72小時(shí)，以多道細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上，80℃烘干后，將玻璃纖維濾紙置于閃爍液內(nèi)，用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)cpm值。每樣品4平行孔，結(jié)果用平均cpm值表示。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型小鼠胸腺和脾臟指數(shù)明顯下降，脾細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)明顯下降；口服給予LW-ABC對(duì)模型小鼠胸腺指數(shù)和脾細(xì)胞增殖反應(yīng)能力的降低具有明顯改善作用(表5)。
表5.LW-ABC對(duì)“腎陰虛”小鼠免疫功能的影響劑量 脾臟 胸腺淋巴細(xì)胞增殖(cpm)分組(g/kg)重量(mg) 系數(shù)重量(mg) 系數(shù) Con A(-) Con A(+)對(duì)照組 / 148.0±25.7 6.6±0.747.0±12.22.0±0.5 799±147 41683±7049模型組 / 27.6±1.3**1.4±0.0**15.6±5.3**0.8±0.3**343±85**8247±306**模型+LW 10.0 34.4±6.41.3±0.828.5±7.8## 1.4±0.4##549±69## 19199±1247##模型+0.8 26.6±5.21.3±0.231.5±8.1## 1.5±0.4##784±106##34447±6419##LW-ABC 1.6 25.8±2.81.3±0.136.9±4.8## 1.8±0.3##419±85 15403±2395##3.2 25.7±1.91.3±0.133.4±4.5## 1.7±0.2##233±27 10012±1477注腎陰虛造摸方法25mg/kg皮質(zhì)酮混懸液sc，2/日；造摸當(dāng)天開始灌胃給藥，1次/日，連續(xù)7天，末次給藥后4小時(shí)開始實(shí)驗(yàn)；LW六味地黃湯全方。*p＜0.05，**p＜0.01與對(duì)照組比較；#p＜0.05，##p＜0.01與腎陰虛組比較；Mean±SD，n＝10。
2.LW-ABC對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠脾細(xì)胞抗體生成反應(yīng)的影響實(shí)驗(yàn)用Balb/c小鼠，灌胃給藥7天，1次/日。于給藥第3天時(shí)每只小鼠腹腔注射綿羊紅細(xì)胞(SRBC)懸液0.2ml(5×107個(gè)紅細(xì)胞)/只，免疫當(dāng)天，除正常對(duì)照組外，各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，15mg/kg，次日以同劑量重復(fù)注射一次。以SRBC免疫后第4天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)小鼠斷頭處死，取脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×106/ml。取脾細(xì)胞懸液400μl與50％SRBC(50μl)及50％補(bǔ)體(按1∶1稀釋的新鮮豚鼠血清50μl)混合，取100μl加入Cunningham氏小室中，石蠟封口后置于37℃孵箱中孵育1小時(shí)，記數(shù)小室內(nèi)溶血空斑(PFC)形成數(shù)，結(jié)果以PFC/106個(gè)脾細(xì)胞表示。結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺處理小鼠脾細(xì)胞抗體生成反應(yīng)能力較對(duì)照組明顯下降，口服給予六味地黃湯及LW-ABC均具有明顯改善作用(表6)。
表6.LW-ABC對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠抗體生成反應(yīng)的影響組別 劑量(g/kg)PFC/106脾細(xì)胞正常對(duì)照組 / 228±24模型對(duì)照組 15mg 90±18**模型+LW 10157±30##模型+LW-ABC 0.8 115±171.6 188±29##3.2 333±42##注LW六味地黃湯。**P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與Cy模型組比較。
3.LW-ABC對(duì)荷瘤小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響移植瘤小鼠模型的制備按下述方法進(jìn)行取S180腹水傳代小鼠，無(wú)菌取腹水，以生理鹽水稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml。給Balb/c小鼠右前腋皮下注射S180細(xì)胞懸液，0.2ml/只小鼠。小鼠于移植腫瘤細(xì)胞后24小時(shí)口服給予六味地黃湯或LW-ABC，連續(xù)12天，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)按前述方法進(jìn)行。結(jié)果表明，口服給予六味地黃湯對(duì)Con A誘導(dǎo)的荷瘤小鼠脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)具有明顯改善作用，但對(duì)LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)無(wú)明顯作用；口服給予LW-ABC對(duì)Con A和LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)均具有明顯改善作用(表7)。
表7.LW-ABC對(duì)荷S180肉瘤小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響劑量3H-TdR(cpm)組別(g/kg) 1640 Con A LPS荷瘤對(duì)照 /236±72 1949±398 6801±930荷瘤+Cy 15mg 147±6**224±54**1182±118**荷瘤+LW 10 351±59 3675±607**6124±620荷瘤+LW-ABC 0.8 470±57**5059±718**8039±5571.6 406±41 6209±852**8369±10563.2 262±47 5207±572**9473±634**
注*P＜0.05，**P＜0.01，與荷瘤對(duì)照組比較。
以動(dòng)物腎上腺皮質(zhì)功能改變模擬腎虛證的主要依據(jù)是臨床腎陽(yáng)虛患者表現(xiàn)為腎上腺皮質(zhì)功能低下，腎陰虛患者臨床表現(xiàn)有腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)的現(xiàn)象，腎上腺皮質(zhì)激素在衰老過程中也明顯增高。此外，臨床因治療需要長(zhǎng)期大量使用腎上腺皮質(zhì)激素病人表現(xiàn)為腎陰虛，激素停用后表現(xiàn)為腎陽(yáng)虛。根據(jù)以上結(jié)果，設(shè)計(jì)了應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素制備“腎虛證”動(dòng)物模型的方法。動(dòng)物給予腎上腺糖皮質(zhì)激素制備腎虛證的造模方法是目前廣泛使用的動(dòng)物腎虛證的造模方法。在大量研究中，動(dòng)物應(yīng)用皮質(zhì)激素期為“腎陰虛”，停用后為“腎陽(yáng)虛”。本研究所采用的外源性皮質(zhì)酮處理小鼠7天造“腎陰虛”模型的方法，已基本得到學(xué)者認(rèn)可，并已被大量文獻(xiàn)應(yīng)用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，口服給予六味地黃湯提取物的配伍組合物L(fēng)W-ABC對(duì)“腎陰虛”模型小鼠、環(huán)磷酰胺處理小鼠及荷瘤小鼠所表現(xiàn)的免疫功能低下均具有明顯的改善作用，其作用強(qiáng)度不低于等劑量推算的六味地黃湯全方的作用，表明LW-ABC基本反應(yīng)了六味地黃湯全方的藥效，提示LW-ABC對(duì)于伴有腎陰虛證的多種原因所導(dǎo)致的免疫功能低下或平衡失調(diào)均具有明顯改善或調(diào)節(jié)作用，臨床可用于伴有腎陰虛證的各種原因所致免疫功能低下或平衡紊亂表現(xiàn)之疾病的治療或輔助治療。
二、LW-ABC對(duì)生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用1.LW-ABC對(duì)快速老化模型小鼠(SAM)下丘腦-垂體-性腺軸功能的作用(1)LW-ABC對(duì)SAMP8動(dòng)情周期的影響動(dòng)情周期的測(cè)定按下述方法進(jìn)行用消毒的棉簽浸生理鹽水插入小鼠陰道約0.5cm，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)后取出，將棉簽上的陰道脫落細(xì)胞均勻涂于潔凈的載玻片上，待涂片自然風(fēng)干后用堿性美藍(lán)溶液染色5min，然后用蒸餾水慢慢沖洗，自然風(fēng)干后于顯微鏡下現(xiàn)察細(xì)胞形態(tài)，確定動(dòng)情周期。
動(dòng)情周期的判斷方法動(dòng)情周期 持續(xù)時(shí)間卵巢變化 涂片細(xì)胞變化(h)動(dòng)情前期 18 卵泡加速生長(zhǎng) 全為有核上皮細(xì)胞，偶有少量角化細(xì)胞動(dòng)情期42 卵泡成熟，排卵 全為無(wú)核角化細(xì)胞，或間有少量上皮細(xì)胞動(dòng)情后期 12 黃體生成 白細(xì)胞、角化細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞均有動(dòng)情間期 48-72 黃體退化 大量白細(xì)胞和少量上皮細(xì)胞或粘液選用9-12月齡SAM快速老化亞系SAMP8用于實(shí)驗(yàn)，以同月齡抗快速老化亞系SAMR1為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)立六味地黃湯全方對(duì)照組，劑量為10g/kg。結(jié)果表明，與同月齡SAMR1相比，SAMP8動(dòng)情周期及動(dòng)情間期明顯延長(zhǎng)，動(dòng)情期有縮短，六味地黃湯能明顯縮短模型小鼠動(dòng)情周期及動(dòng)情間期，延長(zhǎng)其動(dòng)情期；口服給予LW-ABC亦能明顯縮短模型小鼠動(dòng)情周期和動(dòng)情間期，在劑量為3.2g/kg時(shí)能明顯延長(zhǎng)模型小鼠動(dòng)情期(見圖12)。
(2)LW-ABC對(duì)SAMP8血清E2水平的影響應(yīng)用放射免疫分析檢測(cè)試劑盒(天津協(xié)和生物技術(shù)研究所產(chǎn)品)檢測(cè)小鼠血清E2水平。具體操作過程按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，操作程序及加樣量(μl)如下表所示，標(biāo)準(zhǔn)品、NSB、T均為雙管。
小鼠血清E2檢測(cè)操作程序T T NN00S1-S6 質(zhì)控品和待測(cè)樣品去激素標(biāo)準(zhǔn)血清- - 20 20 20 20 - -0000標(biāo)準(zhǔn)血清 - - ----200-質(zhì)控品和待測(cè)樣品 - - ----- 200抗E2血清 - - --10 10 10010000混勻，37℃水浴溫育2h125I-E210 10 10 10 10 10 1001000 0 0000混勻，37℃水浴溫育1h分離劑(冷)- - 50 50 50 50 5005000000充分搖勻，離心3000g×20min，4℃傾去上清液沉淀物計(jì)數(shù)cpm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，用計(jì)算機(jī)計(jì)算E2濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與同月齡SAMR1比較，SAMP8血清E2水平明顯降低；口服給予六味地黃湯對(duì)SAMP8血清E2水平的下降具有明顯改善作用，口服LW-ABC對(duì)SAMP8血清E2水平的降低亦有明顯改善作用(圖13)。
(3)LW-ABC對(duì)SAMP8垂體LH水平的影響應(yīng)用時(shí)間分辨免疫熒光分析法檢測(cè)小鼠垂體LH含量。斷頭處死小鼠，取處垂體，迅速置于液氮中，檢測(cè)時(shí)從液氮中取出垂體，待液氮揮發(fā)至穩(wěn)定后稱重，然后移至盛有400μl裂解液(Na3PO4 10mM、NaCl 0.14M、BSA 1％的水溶液)的離心管中，將離心管置于冰浴中，用超聲法制備勻漿，4℃離心分離上清，用于LH水平的測(cè)定。測(cè)定前垂體樣品按1∶29比例稀釋。應(yīng)用96孔測(cè)定板進(jìn)行測(cè)定，加樣前用洗滌液洗滌測(cè)試孔，然后依次加入50μl hLH標(biāo)準(zhǔn)品或血清樣品和200μl示蹤劑工作液。于振蕩器上快速震蕩2分鐘，4-10℃靜置過夜，然后于室溫下緩震1小時(shí)，用洗滌液洗滌測(cè)定孔6次，每孔加入200μl增強(qiáng)液，于震蕩器上緩慢震動(dòng)5分鐘，10-15分鐘后用時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定熒光。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中LH的含量。結(jié)果表明，與同月齡SAMR1對(duì)照組相比，SAMP8垂體LH含量明顯升高。口服給予六味地黃湯能明顯降低SAMP8垂體LH的含量；口服給予LW-ABC對(duì)SAMP8垂體LH的水平升高亦具有明顯降低的作用(見圖14)。
(4)LW-ABC對(duì)SAMP8下丘腦GnRH含量的影響小鼠下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)的檢測(cè)采用海軍放射免疫技術(shù)研究所生產(chǎn)的放射免疫分析試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。SAMP8斷頭處死，分離取出下丘腦，置于液氮中保存?zhèn)溆?。測(cè)定時(shí)從液氮中取出下丘腦，待液氮揮發(fā)至穩(wěn)定后，稱重，置于盛有300μl煮沸生理鹽水的離心管中，繼續(xù)煮沸3min，然后加入150μl冰醋酸，置于冰浴中，超聲法制備勻漿，加入150μl NaOH中和冰醋酸，然后加入25μl抑肽酶，混勻，4℃離心分離上清，分裝后置于-70℃保存?zhèn)溆?。測(cè)試時(shí)按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，操作程序及加樣量(μl)如下表所示，T、NSB、標(biāo)準(zhǔn)品均為雙管。
小鼠下丘腦GnRH含量測(cè)定操作程序TTNN00S1-S8待測(cè)樣品標(biāo)準(zhǔn)品 ------100 -待測(cè)樣品-------200抗GnRH血----100 100 100 100清緩沖液 --300 300 200 200 100 -混勻，4℃放置24h125I-GnRH 100 100 100 100 100 100 100 100混勻，37℃水浴溫育1h分離劑(冷) --500 500 500 500 500 500充分搖勻，室溫放置15min，4℃離心3000g×15min傾去上清液沉淀物計(jì)數(shù)cpm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，用計(jì)算機(jī)計(jì)算GnRH濃度結(jié)果表明，與SAMR1對(duì)照組比較，SAMP8下丘腦GnRH含量明顯升高。口服給予六味地黃湯能明顯降低SAMP8下丘腦GnRH含量，口服給予LW-ABC對(duì)SAMP8下丘腦GnRH含量的升高亦具有明顯降低作用(見圖15)。
2.LW-ABC對(duì)“腎陰虛”小鼠下丘腦-垂體-卵巢軸功能紊亂的作用(1)LW-ABC對(duì)“腎陰虛”小鼠卵巢重量的影響斷頭處死小鼠，取卵巢稱重。結(jié)果表明，用皮質(zhì)酮處理5天后小鼠卵巢重量較對(duì)照組明顯下。口服給予LW對(duì)皮質(zhì)酮所致小鼠卵巢重量降低具有明顯改善作用，口服給予LW-ABC亦能明顯提高模型小鼠的卵巢重量(圖16)。
(2)LW-ABC對(duì)“腎陰虛”小鼠血清E2水平的影響應(yīng)用放射免疫分析方法(如前述)測(cè)定小鼠血清E2水平。結(jié)果表明，“腎陰虛”小鼠血清E2水平較對(duì)照組明顯下降。口服給予六味地黃湯對(duì)模型小鼠血清E2水平的下降具有明顯改善作用，口服給予LW-ABC對(duì)模型小鼠血清E2水平降低也具有明顯改善作用(圖17)。
(3)LW-ABC對(duì)“腎陰虛”小鼠垂體LH含量的影響應(yīng)用時(shí)間分辨免疫熒光分析法(如前述)檢測(cè)小鼠垂體LH含量。結(jié)果表明，模型小鼠垂體LH的含量較正常對(duì)照組明顯下降，口服六味地黃湯及LW-ABC均能明顯提高模型小鼠垂體LH的含量(圖18)。
3.LW-ABC對(duì)“腎陰虛”小鼠睪丸重量及血清睪酮水平的影響“腎陰虛”模型小鼠制備方法同前述。小鼠稱體重后斷頭處死，取睪丸稱重，計(jì)算睪丸指數(shù)。血清睪酮應(yīng)用貝克曼庫(kù)爾特Access全自動(dòng)微粒體化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒測(cè)定，該儀器的檢測(cè)靈敏度為0.5ng/ml。測(cè)定時(shí)將待測(cè)血清分別置于0.2ml測(cè)定管中，放入儀器測(cè)試架中，設(shè)定儀器測(cè)定程序，由儀器自動(dòng)進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算血清睪酮含量。結(jié)果表明，模型小鼠血清睪酮水平較對(duì)照組明顯降低，口服給予六味地黃湯對(duì)模型小鼠血清睪酮水平的下降無(wú)明顯改善作用，口服給予LW-ABC對(duì)模型小鼠血清睪酮水平的下降具有明顯改善作用(表8)。
表8.LW-ABC對(duì)“腎陰虛”小鼠睪丸重量及血清皮質(zhì)酮水平的影響睪丸分組 劑量(g/kg) 睪酮(ng/ml)重量(mg) 系數(shù)對(duì)照組/169.4±9.8 7.4±0.68.2±3.4模型組/164.5±11.67.4±2.84.4±1.6*模型+LW 10.0 160.7±13.27.9±0.46.0±1.7模型+LW-ABC 0.8 163.7±16.28.0±0.69.9±5.0##1.6 161.8±13.28.0±0.88.7±4.2#3.2 160.6±12.38.2±0.68.2±4.6#注*p＜0.05，**p＜0.01與對(duì)照組比較；#p＜0.05，##p＜0.01與腎陰虛組比較；Mean±SD，n＝10。
快速老化模型小鼠(senescence-accelerated mouse，SAM)是由日本京都大學(xué)竹田教授于培育成功的一種快速老化的小鼠，包括快速老化的P系(senescence-accelerated mouse-prone，SAMP)和抗快速老化的R系(senescence-accelerated mouse-resistant，SAMR)，P系的特點(diǎn)是隨增齡出現(xiàn)快速、進(jìn)行性全身各系統(tǒng)的老化，R系則具有正常小鼠的生理特征，為P系的對(duì)照。SAMP8是快速老化亞系之一，其特點(diǎn)是隨增齡其中樞學(xué)習(xí)記憶功能及免疫功能快速進(jìn)行性衰退。我室自1994年從日本京都大學(xué)竹田教授實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了SAMR1和SAMP8亞系的種鼠，在我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室繁殖和飼養(yǎng)，并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。
我們以往研究表明，SAMP8隨增齡快速出現(xiàn)下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)和性腺(HPG)軸功能的平衡失調(diào)，與人類衰老性HPA軸和HPG軸的變化十分相似，表現(xiàn)為在增齡過程中血清皮質(zhì)激素水平進(jìn)行性升高；雌性SAMP8動(dòng)情期縮短，間期延長(zhǎng)，血清E2水平下降，垂體LH水平和下丘腦GnRH水平升高，與人類腎陰虛證、衰老、婦女更年期以及HPG軸功能低下或平衡失調(diào)相關(guān)的許多疾病具有相似的表現(xiàn)。動(dòng)情周期的延長(zhǎng)或不規(guī)則是衰老過程中生殖內(nèi)分泌功能低下的直接表現(xiàn)，因此，性功能的早期快速衰退也是SAMP8快速衰老的重要表現(xiàn)之一，其垂體LH水平的增齡性升高是卵巢功能低下，導(dǎo)致雌激素水平降低，從而使下丘腦-垂體負(fù)反饋抑制減弱所致。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，口服給予LW-ABC對(duì)SAMP8所表現(xiàn)的HPG軸功能低下具有明顯改善或調(diào)節(jié)作用，其作用與六味地黃湯全方相似，表明LW-ABC對(duì)衰老性HPG軸的功能低下或平衡紊亂具有明顯改善或調(diào)節(jié)作用。LW-ABC對(duì)腎上腺皮質(zhì)激素所致“腎陰虛”模型小鼠卵巢重量降低、血清E2和垂體LH水平的降低亦具有明顯改善作用；對(duì)雄性“腎陰虛”小鼠血清睪酮水平的下降亦具有明顯改善作用，表明LW-ABC對(duì)“腎陰虛”小鼠所表現(xiàn)的HPG軸功能低下或平衡失調(diào)具有明顯改善或調(diào)節(jié)作用。上述結(jié)果提示，LW-ABC對(duì)衰老、腎陰虛所致HPG軸功能低下或平衡紊亂均具有改善或調(diào)節(jié)作用，臨床可用于衰老和伴有腎陰虛證的HPG軸功能低下疾病如更年期綜合癥、卵巢功能低下、不孕癥、習(xí)慣性流產(chǎn)、植物神經(jīng)紊亂、黃褐斑、男性乳房發(fā)育、老年性功能衰退、更年期骨質(zhì)疏松，老年骨質(zhì)疏松等預(yù)防和治療。
權(quán)利要求
1.六味地黃湯提取物，其包括以六味地黃湯提取物重量計(jì)，11.4-17重量％的多糖，和/或1.85-2.27％重量％的總苷(莫諾苷、馬錢素、芍藥苷)和/或23.5-35.5重量％的甘露三糖，其中六味地黃湯由熟地、山茱萸、山藥、澤瀉、丹皮和茯苓六味中藥以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍組成。
2.藥物組合物，其包括含有11.4-17重量％多糖，和/或1.85-2.27％重量％總苷(莫諾苷、馬錢素、芍藥苷)和/或23.5-35.5重量％的甘露三糖的六味地黃湯提取物及藥用載體，其中六味地黃湯由熟地、山茱萸、山藥、澤瀉、丹皮和茯苓六味中藥以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍組成。
3.六味地黃湯提取物的制備方法，其包括i)將由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、丹皮和茯苓按8∶4∶4∶3∶3∶3組成的混合物用沸水蒸煮兩次，然后濃縮至浸膏；ii)伴隨攪拌往浸膏中加入乙醇至乙醇濃度30％(v/v)放置，離心，沖洗，將上清液與洗液合并為上清液；iii)濃縮上清液，伴隨攪拌往濃縮液中加95％乙醇至乙醇濃度60％(v/v)，放置，分離得部位A和上清液；iv)將iii)中上清液進(jìn)行柱層析，用水和極性有機(jī)溶劑洗脫，有機(jī)溶劑洗脫液濃縮后得部位B；v)iv)中水洗脫液濃縮后上活性炭柱，用乙醇洗脫，乙醇洗脫液濃縮后得部位C；vi)將iii)中部位A，iv)中部位B和v)中部位C混合。
4.權(quán)利要求3所述方法，其中所用大孔吸附樹脂為所有型號(hào)的弱極性大孔吸附樹脂；兩次醇沉淀所用醇為C1-4低級(jí)烷基醇，濃度范圍分別為10％-40％和50％-95％；大孔吸附樹脂層析洗脫所用的極性有機(jī)溶劑為所有大孔樹脂所能允許使用的極性有機(jī)溶劑，濃度范圍為10％-95％?；钚蕴繉游鱿疵撍么紴榧状己鸵掖?，醇濃度為20％-95％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的六味地黃湯提取物，其中所述提取物是用于治療腫瘤、腫瘤化學(xué)或放射治療過程中的副作用、白細(xì)胞減少癥、衰老性免疫功能低下、感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、腎炎、支氣管炎及支氣管哮喘、前列腺炎、再生障礙性貧血、血小板減少性紫癜、重癥肌無(wú)力、老年性免疫功能低下或紊亂、更年期綜合征、卵巢功能低下、習(xí)慣性流產(chǎn)、不孕癥、黃褐斑、男性乳房發(fā)育、更年期骨質(zhì)疏松、老年性骨質(zhì)疏松、植物神經(jīng)紊亂等的提取物。
6.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述組合物是治療腫瘤、腫瘤化學(xué)或放射治療過程中的副作用、白細(xì)胞減少癥、衰老性免疫功能低下、感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、腎炎、支氣管炎及支氣管哮喘、前列腺炎、再生障礙性貧血、血小板減少性紫癜、重癥肌無(wú)力、老年性免疫功能低下或紊亂、更年期綜合征、卵巢功能低下、習(xí)慣性流產(chǎn)、不孕癥、黃褐斑、男性乳房發(fā)育、更年期骨質(zhì)疏松、老年性骨質(zhì)疏松、植物神經(jīng)紊亂的藥物化合物。
7.權(quán)利要求1的提取物在制備治療腫瘤、腫瘤化學(xué)或放射治療過程中的副作用、白細(xì)胞減少癥、衰老性免疫功能低下、感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、腎炎、支氣管炎及支氣管哮喘、前列腺炎、再生障礙性貧血、血小板減少性紫癜、重癥肌無(wú)力、老年性免疫功能低下或紊亂、更年期綜合征、卵巢功能低下、習(xí)慣性流產(chǎn)、不孕癥、黃褐斑、男性乳房發(fā)育、更年期骨質(zhì)疏松、老年性骨質(zhì)疏松、植物神經(jīng)紊亂的產(chǎn)品中用途。
全文摘要
六味地黃湯提取物，其包括以六味地黃湯提取物重量計(jì)，11.4－17重量％的多糖，和/或1.85－2.27％重量％的總苷(莫諾苷、馬錢素、芍藥苷)和/或23.5－35.5重量％的甘露三糖，其中六味地黃湯由熟地、山茱萸、山藥、澤瀉、丹皮和茯苓六味中藥以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍組成。
文檔編號(hào)A61P7/06GK1626228SQ200410058600
公開日2005年6月15日 申請(qǐng)日期2004年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月19日
發(fā)明者趙毅民, 喬善義, 張永祥, 周文霞, 馬淵, 齊春會(huì), 董劍英, 孫磊, 程軍平, 趙修南, 童靜, 任鳳霞, 熊善麗, 郭繼芬 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所