專利名稱：用于抗日本腦炎病毒感染的滅活疫苗的增強(qiáng)免疫原及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗由黃病毒屬的日本腦炎病毒群引起的感染性疾病的滅活疫苗和其診斷試劑。具體地說，本發(fā)明涉及抗日本腦炎的滅活疫苗的一種增強(qiáng)免疫原或抗原，該免疫原或抗原用作疫苗的活性成分是優(yōu)異而實(shí)用的，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)該免疫原或抗原的方法。
背景技術(shù)：
下文中，作為由日本腦炎病毒群引起的感染性疾病的典型例子，將描述日本腦炎，并且將描述抗該腦炎的疫苗。第一個(gè)日本腦炎疫苗是1954年投入實(shí)際使用的，該疫苗含有作為活性成分的從鼠腦培養(yǎng)的病毒制備的抗原，這樣的疫苗的純度低，并且含有許多污染物，以致于它可能誘導(dǎo)中央神經(jīng)系統(tǒng)的過敏性神經(jīng)性紊亂。此后，在1965年一種通過乙醇沉淀，用魚精蛋白硫酸鹽處理，超濾等等獲得的改善的高純度疫苗投入了實(shí)際使用。因此，顯著提高了疫苗的質(zhì)量。直到現(xiàn)在一直在利用這樣的疫苗和生產(chǎn)技術(shù)(“疫苗手冊”，第103-113頁，研究者協(xié)會(huì)，國家健康研究院(日本)，Maruzen(東京)1996)。另一方面，一直在嘗試開發(fā)不利用鼠腦獲得滅活疫苗。更具體地說，在1965年建立了日本腦炎疫苗委員會(huì)，它們利用原代細(xì)胞組織培養(yǎng)開發(fā)疫苗。但是，就生產(chǎn)成本而言，獲得大規(guī)模生產(chǎn)滅活疫苗抗原所需的大量原代細(xì)胞組織培養(yǎng)物是不可能實(shí)施的。這樣的疫苗沒有投入實(shí)際使用，因?yàn)樵诋?dāng)時(shí)僅僅原代細(xì)胞培養(yǎng)被允許用于疫苗的生產(chǎn)，傳代細(xì)胞系的使用被認(rèn)為是危險(xiǎn)的并且沒有被允許。就利用組織培養(yǎng)獲得的日本腦炎活疫苗而言，在中國大約在1994年在中國倉鼠腎臟細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中生長的減毒病毒投入了實(shí)際使用。但是，沒有證實(shí)活疫苗的效果和安全性，除了中國以外還未知在其它各個(gè)國家被使用。此外，1986年以來已經(jīng)有人報(bào)導(dǎo)通過重組基因技術(shù)(例如利用包膜(E)蛋白抗原，重組病毒等等的第二代疫苗)獲得的各種日本腦炎疫苗。但是，所有這些疫苗均在實(shí)驗(yàn)階段或臨床前試驗(yàn)階段，它們沒有被投入實(shí)際使用(“疫苗”，第2版，第671-713頁，S.A.Plotokin和E.A.Mortimer，W.B.Sauders公司，1994；約旦報(bào)導(dǎo)，第26-27頁，1998)。
此外，就利用細(xì)胞系進(jìn)行大規(guī)模的用于滅活疫苗的抗原或免疫原的生產(chǎn)技術(shù)而言，例如已知利用Vero細(xì)胞進(jìn)行用于抗脊髓灰質(zhì)炎(美國專利4,525,349)，狂犬病(美國專利4,664,912)，甲型肝炎(美國專利4,783,407)和蜱傳腦炎(美國專利5,719,051)等等的疫苗的病毒抗原的大規(guī)模生產(chǎn)。其中，已知前兩者被投入實(shí)際使用，但是，就后兩者而言，沒有證實(shí)大規(guī)模生產(chǎn)的每種抗原作為疫苗的安全性和應(yīng)用效果，并沒有投入實(shí)際使用。
常規(guī)日本腦炎疫苗的活性成分是在鼠腦中培養(yǎng)的日本腦炎病毒的滅活顆粒。大量的小鼠，抗感染動(dòng)物的生物毒害的措施等等是大規(guī)模生產(chǎn)用于這樣的疫苗的抗原所需的，結(jié)果導(dǎo)致高生產(chǎn)成本。此外，來源于鼠腦的有害成分(例如引起脫髓鞘作用的堿性蛋白質(zhì))對(duì)產(chǎn)品的污染，和/或小鼠病毒的污染等等總是要考慮的因素。因此，純化步驟和質(zhì)量控制變得多樣而復(fù)雜。另外，近來，獲得用于疫苗生產(chǎn)的大量小鼠有困難，這成為有計(jì)劃的疫苗生產(chǎn)的障礙。此外，根據(jù)動(dòng)物保護(hù)和宗教的考慮犧牲小鼠的常規(guī)技術(shù)是不令人滿意的。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，通過利用細(xì)胞系代替小鼠大規(guī)模生產(chǎn)病毒顆粒以便解決上述問題。因此，生產(chǎn)成本顯著降低，就勞動(dòng)成本而言，抗生物毒害的措施，生產(chǎn)的操作程序，純化步驟，質(zhì)量控制，生產(chǎn)計(jì)劃等等是顯著有效的。特別是，本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)的新的病毒顆粒。更具體地說，根據(jù)本發(fā)明，提供了作為增強(qiáng)免疫原的新的病毒顆粒，其與包含于常規(guī)的滅活疫苗中的免疫原相比以中和抗體效價(jià)代表的免疫效力增強(qiáng)約2-10倍，本發(fā)明還提供了生產(chǎn)該病毒顆粒的方法。就是說，本發(fā)明提供了具有顯著的免疫原性或抗原性的日本腦炎病毒顆粒，其可用作為抗由日本腦炎病毒群引起的感染性疾病的滅活疫苗，特別是用作滅活的日本腦炎疫苗的免疫原或用于診斷試劑的抗原，本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)該病毒顆粒的方法。這樣的顆粒通過下面步驟產(chǎn)生在一種細(xì)胞系中培養(yǎng)屬于日本腦炎病毒群的病毒(例如日本腦炎病毒)，和/或一系列隨后的步驟，包括濃縮，純化和滅活?；谏鲜銮闆r，本文描述的發(fā)明提供了(1)作為增強(qiáng)的免疫原的滅活病毒顆粒，是從用屬于日本腦炎病毒群的病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物制備的，其中通過用該病毒顆粒免疫接種獲得的抗血清的中和抗體效價(jià)是通過用從鼠腦培養(yǎng)的病毒制備的滅活的病毒顆粒免疫接種獲得的抗血清的中和抗體效價(jià)的約2-10倍；(2)用于生產(chǎn)滅活的病毒顆粒的方法，包括在一個(gè)細(xì)胞系中培養(yǎng)屬于日本腦炎病毒群的病毒的步驟，以及滅活和純化細(xì)胞培養(yǎng)物；(3)如(2)描述的方法，其中細(xì)胞系是Vero細(xì)胞；(4)如(2)或(3)描述的方法，其中滅活是在純化之前進(jìn)行的；(5)如(2)-(4)任一項(xiàng)描述的方法，其中滅活是在約4℃-約10℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的；(6)如(2)-(5)任一項(xiàng)描述的方法，其中純化是采用物理手段進(jìn)行的；(7)如(2)-(6)任一項(xiàng)描述的方法，其中屬于日本腦炎病毒群的病毒是日本腦炎病毒的北京株或ThCMAr67/93株；(8)由如(2)-(7)任一項(xiàng)描述的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的滅活的病毒顆粒；(9)含有如(1)或(8)描述的滅活的病毒顆粒的滅活疫苗；
(10)用于由日本腦炎病毒群引起的感染性疾病的診斷試劑，含有完整或部分如(8)描述的滅活病毒顆粒作為抗原。


圖1顯示包含于測試疫苗的本發(fā)明的病毒顆粒(R顆粒；圖1A)和包含于來源于鼠腦的商品疫苗的由常規(guī)技術(shù)制備的病毒顆粒(MB顆粒；圖1B)的電子顯微鏡照片，兩種病毒均屬于北京株。
具體實(shí)施例方式
通過比較本發(fā)明的日本腦炎疫苗的免疫原與作為代表性例子的常規(guī)免疫原的材料和生產(chǎn)方法，本發(fā)明的實(shí)施方案的特征將變得明了?？紤]到這些，下文中以如下順序描述本發(fā)明免疫原和常規(guī)免疫原的免疫原性和形態(tài)學(xué)的差別，作為免疫原的病毒顆粒，病毒培養(yǎng)的宿主，病毒的滅活，病毒的純化，電子顯微鏡分析和效力測試。
常規(guī)日本腦炎疫苗的免疫原其是指抗日本腦炎的商購滅活疫苗的活性成分(免疫原)。根據(jù)“日本腦炎疫苗”或“冷凍干燥的日本腦炎疫苗”的規(guī)則生產(chǎn)該病毒顆粒，并且所述的病毒顆粒通過各種安全性和效力等等的測試確定其良好的性能，該規(guī)則是由日本生物產(chǎn)品制造者協(xié)會(huì)于1986出版的英語版本，其根據(jù)日本厚生省基于藥事法(1960年生效的第145號(hào)法)的第42條第1項(xiàng)的要求頒布的第217號(hào)告示“生物學(xué)制劑的基準(zhǔn)”制訂。該疫苗的活性成分或免疫原是日本腦炎病毒顆粒(即來源于鼠腦(MB)的滅活病毒顆粒)。通過以用于生產(chǎn)日本腦炎疫苗的病毒株接種鼠腦，使病毒在鼠腦中大量地繁殖，從鼠腦勻質(zhì)物高度純化該病毒，以滅活試劑使該病毒滅活獲得了該病毒顆粒。下文中，將來源于鼠腦(MB)的滅活的病毒顆?？s寫為“MB顆?！被颉癕B免疫原”。
本發(fā)明的日本腦炎疫苗的免疫原是指滅活的日本腦炎疫苗的活性成分(免疫原)，是根據(jù)上面提到的“日本腦炎疫苗”規(guī)則生產(chǎn)的，不同的是將細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)物用作為培養(yǎng)日本腦炎病毒的宿主，并且符合各種質(zhì)量控制測試。該免疫原是日本腦炎病毒顆粒(即來源于組織培養(yǎng)物的滅活的病毒顆粒)，通過以日本腦炎病毒接種細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)物，允使病毒大量地繁殖，從細(xì)胞培養(yǎng)物高度純化該病毒，以滅活試劑使該病毒滅活獲得了該病毒顆粒。該免疫原具有下列特征(1)并通常具有下列另外的特征(2)。
(1)如由下文描述的效力測試測量的，用上述顆粒免疫接種獲得的抗血清的中和抗體效價(jià)是通過用常規(guī)MB顆?；騇B免疫原免疫接種獲得的抗血清的中和抗體效價(jià)的約2-10倍(下文中，將上述免疫原稱之為“增強(qiáng)的免疫原”，縮寫為“R顆?！被颉癛免疫原”)；和(2)關(guān)于基于電子顯微鏡分析的顆粒結(jié)構(gòu)，MB顆粒的包膜層的表面或表觀是光滑的，而R顆粒是粗糙或絨毛狀的。
應(yīng)該注意到日本腦炎疫苗的免疫原被描述為抗由本發(fā)明的日本腦炎病毒群引起的感染性疾病的疫苗的免疫原的代表性例子。本發(fā)明的疫苗(例如日本腦炎疫苗)是以液態(tài)或干燥狀態(tài)提供在密封的小管或加熱密封的安瓿瓶中。對(duì)于液態(tài)制劑的情況，將其皮下注射到待接種的個(gè)體，劑量為每人約0.1-1.0毫升。對(duì)于干燥制劑的情況，在與溶解溶液重新溶解之后注射。
作為免疫原的病毒本發(fā)明的日本腦炎病毒群包括日本腦炎病毒，Kunjin病毒，墨累山谷腦炎病毒，圣路易腦炎病毒，和西尼羅病毒等等。詳細(xì)情況描述于病毒學(xué)檔案，增刊10，第415-427頁，1995(“病毒分類學(xué)”，病毒的分類和命名；國際病毒分類委員會(huì)第6次報(bào)告)。在這些病毒中，就日本腦炎病毒而言，例如可以使用下面的毒株來源于鼠腦的北京-1毒株和由我們在鼠腦傳代北京-1獲得的JWS-P-4毒株(Am29Sm1Am5；更具體地說，由在成年小鼠(Am)傳代29代，在乳鼠(Sm)傳代1代和在Am中傳代5代獲得的病毒株)，由在Vero細(xì)胞中將JWS-P-4傳2代獲得的原種(master seed)JMSV001(下文中，這3個(gè)毒株稱之為“北京株”)，Nakayama-Yoken毒株(下文中，稱之為“Nakayama毒株”)，JaOArS982毒株，JaOH0566毒株，和由Igarashi等人，在1990年新分離的ThCMAr67/93毒株和ThCMAr44/92毒株(Ali等人，病毒學(xué)檔案，140，1557-1575，1995，Ali和Igarashi，微生物學(xué)和免疫學(xué)，41，241-252，1977)等等。
根據(jù)本發(fā)明，日本腦炎病毒株中，北京株和ThCMAr67/93毒株作為免疫原是特別優(yōu)選的。當(dāng)使用這些毒株時(shí)，可以獲得具有廣譜抗原性的疫苗(即具有非常滿意的抗除了疫苗生產(chǎn)使用的病毒株以外的多個(gè)毒株的保護(hù)作用)。在北京株中，JMSV001是優(yōu)選的。
根據(jù)本發(fā)明，通過將從兩個(gè)病毒株(即北京株和ThCMAr67/93毒株)產(chǎn)生的疫苗混合可以制備二價(jià)疫苗。優(yōu)選的是混合比例為基于抗原蛋白質(zhì)的含量為0.5∶1-1∶0.5。由于這樣的混合，與常規(guī)一價(jià)疫苗相比，可以獲得具有抗感染的保護(hù)作用的更廣譜的抗原性的疫苗。
通過將病毒接種合適的宿主細(xì)胞系，以及保持培養(yǎng)感染的細(xì)胞而培養(yǎng)病毒。培養(yǎng)方法與后面的“細(xì)胞培養(yǎng)”描述的相同。下文中，為了方便，將通過病毒培養(yǎng)物的低速離心獲得的上清液中的病毒稱之為“胞外病毒”。將離心沉淀收集的感染的細(xì)胞懸浮于原始體積的添加了0.2％(w/v)牛血清白蛋白的伊格爾氏基本必需培養(yǎng)基(MEM)中，隨后超聲處理，低速離心，獲得的上清液中的病毒稱之為“胞內(nèi)病毒”。從胞外或胞內(nèi)病毒可以獲得本發(fā)明的滅活的病毒顆粒。由于其產(chǎn)量高，胞外病毒是優(yōu)選的；它是成熟的病毒粒；由于來自細(xì)胞的成分污染少，它易于被純化。
用于病毒培養(yǎng)的宿主可以將已知的細(xì)胞系用作為病毒培養(yǎng)的宿主。例如，可以使用二倍體細(xì)胞系例如WI-38，MRC-5，F(xiàn)RhL-2等等，和連續(xù)傳代的細(xì)胞系例如Vero，BHK-21，CHO等等。連續(xù)傳代細(xì)胞系是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈円子诖笠?guī)模生產(chǎn)和按照程序生產(chǎn)，并且它們特征是熟知的且被證實(shí)不含有其它病毒。此外，也可以使用常規(guī)用于生產(chǎn)病毒疫苗的普遍使用的CV-1，BSC-1，MA104，MDCK，CaCO-2等等，和DBS-FLC-1，DBS-FLC-2，DBS-FRhL-2，ESK-4，HEL，IMR-90，WRL68等等(“可以利用的ATCC微生物和細(xì)胞”，第2版，第144頁，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)1991，美國)。對(duì)于上面提到的用于培養(yǎng)日本腦炎病毒株的宿主，優(yōu)選的是選擇能使病毒良好生長的準(zhǔn)許用的細(xì)胞。例如，優(yōu)選使用的是Vero細(xì)胞(ATCC NoCCL-81)，BHK-21(C-13)(ATCCNoCCL-10)，C6/36(ATCC NoCRL-1660)等等。但是，當(dāng)使用這些細(xì)胞系時(shí)，需要根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞使用的要求的對(duì)生物物質(zhì)第50號(hào)要求對(duì)污染物，致瘤力等等進(jìn)行各種測試，從而證實(shí)這些細(xì)胞系是否具備作為用于生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞的特性(WTO技術(shù)報(bào)導(dǎo)序列，No.878，第19-52頁，1998)。
細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)于上面提到的細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)，可采用靜止培養(yǎng)，灌流系統(tǒng)培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，滾瓶培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)等等。例如，可以將各種類型的商購Cytodex(Pharmacia Biotech，瑞典)用作為微載體，可以使用各種商購動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)裝置。
病毒的滅活可以將滅活試劑例如福爾馬林，β-丙內(nèi)酯和戊二醛加入到病毒懸浮液以滅活該病毒。例如，當(dāng)利用福爾馬林時(shí)，加入的量約0.005％-約0.1％(V/V)，滅活的溫度是約4℃-約38℃，滅活的時(shí)間主要依賴于滅活的溫度(例如在38℃，約5-約180小時(shí)，在4℃約20-90天)。
病毒的純化采用物理手段或化學(xué)手段對(duì)病毒進(jìn)行純化。物理手段利用物理特性，例如待純化物質(zhì)的大小，密度，沉積常數(shù)等等，并且包括例如區(qū)帶超離心，密度梯度離心，過濾等等。通常利用物理手段不改變周圍環(huán)境的pH和鹽濃度?；瘜W(xué)手段利用通過化學(xué)或物理化學(xué)反應(yīng)的吸附/脫附，并且包括例如離子交換柱層析，親和層析，鹽析等等。純化是在室溫下約4℃進(jìn)行。
病毒的濃縮在滅活和/或純化之前，可以進(jìn)行濃縮，例如通過用超濾膜進(jìn)行低速離心。
根據(jù)本發(fā)明，令人滿意的是在純化之前在約4℃-約10℃進(jìn)行R顆粒的滅活。此外，令人滿意的是通過物理純化方法進(jìn)行純化。與純化之后滅活的顆?；蚧瘜W(xué)純化的顆粒相比，由此獲得的顆?？梢员３指叩拿庖咴曰蚩乖浴?br> 電子顯微鏡分析例如，在電子顯微鏡(日立公司)下可以觀察到由用2％(W/V)醋酸鈾酰進(jìn)行的負(fù)染色方法制備的病毒樣品。在約20000到約100000的放大倍數(shù)成象分析病毒顆粒。
疫苗的制備利用合適的稀釋液可以稀釋本發(fā)明的滅活病毒顆粒以便獲得需要的效價(jià)。可以加入任何已知的載體或賦形劑。非強(qiáng)制性地，疫苗可以含有防腐劑，穩(wěn)定劑等等。
效力測試根據(jù)上面提到的“生物制品的最低要求”中的“日本腦炎疫苗”規(guī)則制訂的“效價(jià)測試”進(jìn)行該測試。例如，在各個(gè)組中使用15只4周齡的ddY小鼠。用每種疫苗0.5毫升/小鼠給各個(gè)組的動(dòng)物腹膜注射，所述的疫苗已經(jīng)2倍系列稀釋，7天之后，給動(dòng)物加強(qiáng)注射。在加強(qiáng)之后第7天從各個(gè)小鼠收集血液。之后，在各個(gè)組合并等量的血清，在約56℃滅活30分鐘。獲得的血清作為免疫血清用于中和測試。在中和測試中，將雞胚細(xì)胞培養(yǎng)物用作為病毒培養(yǎng)的宿主，將用作為疫苗抗原或免疫原的病毒(例如北京株，Nakayama毒株，ThCMAr67/93毒株等等)用作為攻擊病毒。上面提到的免疫血清將由攻擊病毒形成的噬斑數(shù)目降低了50％的最大稀釋度代表中和抗體效價(jià)。
在另一個(gè)方面，將本發(fā)明獲得的病毒顆粒(R顆粒)用作為診斷抗原(例如，在免疫沉淀方法，血凝集抑制(HI)測試，補(bǔ)體固定(CF)反應(yīng)，ELISA，放射性免疫測試，免疫熒光方法等等中的抗原)。R顆粒作為診斷抗原的特征在于，與MB顆粒相比，該顆粒與多克隆抗體和某些單克隆抗體的反應(yīng)性高出約2-10倍。更具體地說，利用完整或部分本發(fā)明的滅活病毒顆粒，可以提供具有高靈敏性的用于檢測日本腦炎病毒群的感染，特別是日本腦炎病毒的感染的診斷試劑。如本文所述，術(shù)語“部分”滅活病毒顆粒是指保留了來源于病毒顆粒所需的免疫原性的病毒組分，包括例如在實(shí)施例1描述的純化步驟期間溶解的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。
下文中，本發(fā)明的實(shí)施方案，構(gòu)成部分，結(jié)構(gòu)和效果將通過說明性的實(shí)驗(yàn)和實(shí)施例進(jìn)行描述，但是本發(fā)明不僅限于此。
參考實(shí)施例北京株和ThCMAr67/93毒株的序列表為了有助于鑒定特別適用于本發(fā)明的日本腦炎病毒的北京株和ThCMAr67/93毒株，SEQ ID NO1-4顯示與兩個(gè)毒株的基因組RNA互補(bǔ)的包膜蛋白基因cDNA的堿基序列和由該堿基序列編碼的推測的氨基酸序列。SEQ ID NO1和2對(duì)應(yīng)于ThCMAr67/93毒株(病毒學(xué)檔案，140，1557-1575，1995)，SEQ ID NO3和4對(duì)應(yīng)于北京株的原種JMSV001。用于下面的實(shí)施例的“北京株”是JMSV001。
采用上面提到的Ali等人的文章描述的方法測定cDNA的堿基序列。更具體地說，從Vero細(xì)胞的病毒培養(yǎng)物提取基因組RNA。之后，利用一對(duì)引物通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增編碼包膜蛋白的區(qū)域，通過雙脫氧鏈終止方法測定獲得的cDNA片段的堿基序列。此外，利用通用密碼解碼由堿基序列編碼的氨基酸序列。
實(shí)驗(yàn)1病毒感染效價(jià)的測定通過用下文描述的Vero-M細(xì)胞進(jìn)行噬斑計(jì)數(shù)方法計(jì)算病毒感染效價(jià)PFU(噬斑形成單位)/毫升。
病毒抗原量的測定利用抗日本腦炎病毒單克隆抗體IgG(組-8克隆503(由東京都神經(jīng)科學(xué)綜合研究所Yasui博士惠贈(zèng)，K.Yasui等人，普通病毒學(xué)雜志，67，2663-2672，1986)進(jìn)行ELISA測定日本腦炎病毒抗原的量。將來源于鼠腦的自制標(biāo)準(zhǔn)品(北京株)的值定義為100單位，通過平行線測試計(jì)算相對(duì)ELISA值。
HA測試使用U形微平板。將等量的用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)到最適pH的0.33％(v/v)鵝紅血細(xì)胞懸浮液與病毒溶液混合。之后，使其在37℃相互反應(yīng)60分鐘。由此，測定血凝集反應(yīng)的存在。血凝集反應(yīng)是陽性的病毒溶液的最大稀釋度代表HA效價(jià)。
牛血清抗原量的測定利用抗牛血清山羊IgG進(jìn)行ELISA測定牛血清抗原的量。通過平行線測試計(jì)算牛血清標(biāo)準(zhǔn)抗原中的蛋白質(zhì)含量的相對(duì)值，測定獲得的值作為抗原量。
實(shí)驗(yàn)2病毒培養(yǎng)中細(xì)胞系的增殖粘著性2-系Vero細(xì)胞Vero-A(ATCC NoCCL-81)，Vero-M(從國立感染癥研究所獲得的Vero)；3系BHK-21細(xì)胞BHK/WI2(從大阪府立公眾衛(wèi)生研究所獲得的粘著性BHK-21)，BHK/JNIH(從國立家畜衛(wèi)生試驗(yàn)場獲得的懸浮的BHK-21)和BHK-21(C-13)(ATCC NoCCL-10)，和來源于蚊子的C6/36細(xì)胞(ATCC NoCRL-1660)作為病毒培養(yǎng)的候選細(xì)胞系，觀察各個(gè)細(xì)胞系中病毒的繁殖。以約1.5×105個(gè)細(xì)胞/毫升在生長培養(yǎng)基中制備Vero-A，Vero-M，BHK/WI2和BHK-21(C-13)。在約37℃將它們培養(yǎng)3天，之后，分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。以相同的方式，以約2.0×105個(gè)細(xì)胞/毫升制備懸浮的BHK/JNIH，并且在37℃振蕩培養(yǎng)3天。之后，計(jì)數(shù)細(xì)胞的數(shù)目。以約1.0×105個(gè)細(xì)胞/毫升制備C6/36，在約28℃培養(yǎng)7天。之后，計(jì)數(shù)細(xì)胞的數(shù)目。使用補(bǔ)充了8％(V/V)(終濃度)牛血清的MEM作為生長培養(yǎng)基。結(jié)果，Vero-A，Vero-M，BHK/WI2和BHK-21(C-13)的細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)且測定為7.0×105個(gè)細(xì)胞/毫升至約9.0×105個(gè)細(xì)胞/毫升，懸浮的BHK/ANIH和C6/36的細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)且測定為約2.8×106個(gè)細(xì)胞/毫升。
實(shí)驗(yàn)3在候選細(xì)胞系中繁殖日本腦炎病毒在約28℃將C6/36培養(yǎng)7天，用于實(shí)驗(yàn)2的其它細(xì)胞在37℃培養(yǎng)3天。之后，以0.1的感染復(fù)數(shù)(MOI)以北京株接種各個(gè)細(xì)胞，并且測定病毒感染效價(jià)(PFU)，病毒抗原量(ELISA效價(jià))和HA效價(jià)，從而比較胞外病毒量變化的時(shí)間過程。表1顯示其結(jié)果。各個(gè)數(shù)值是兩個(gè)重復(fù)設(shè)置實(shí)驗(yàn)中各個(gè)細(xì)胞系的病毒生長曲線的最高值的平均值。C6/36在培養(yǎng)的第3天顯示最高病毒感染效價(jià)，并且在第4天顯示最高ELISA效價(jià)和HA效價(jià)。其它細(xì)胞系在培養(yǎng)的第2天顯示最高病毒感染效價(jià)，并且分別在第3和第4天顯示最高ELISA效價(jià)和HA效價(jià)。
表1細(xì)胞 PFU/ml ELISA效價(jià) HA效價(jià)粘著性Vero-A 1.2×10858640Vero-M 5.7×10735320BHK-21/WI2 1.5×1082740BHK-21[C13] 2.3×10848320懸浮的BHK-21/JNIH 7.0×1073740C6/362.6×108103 320實(shí)驗(yàn)4Cytodex的類型和Vero-A細(xì)胞的增殖將Cytodex 1，2或3之一以約1.5克/升的量加入到3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶含有約500毫升的Vero-A細(xì)胞懸浮液，每毫升含有1.5×105個(gè)細(xì)胞。之后，將細(xì)胞在37℃和約40rpm攪拌培養(yǎng)7天。獲得如下所述的結(jié)果。對(duì)于Cytodex 1，2或3從培養(yǎng)開始到第7天每毫升的細(xì)胞數(shù)分別為約7.5×105，8.3×105和約9.4×105。此外，當(dāng)以Cytodex 1將細(xì)胞培養(yǎng)7天時(shí)，有100個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞粘著到所有珠的表面而沒有縫隙。
實(shí)驗(yàn)5Cytodex的濃度和Vero-A細(xì)胞的增殖將Cytodex 1加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶A，B，C和D，各培養(yǎng)瓶含有約500毫升的細(xì)胞懸浮液，濃度為約1.5×105個(gè)細(xì)胞/毫升，以使瓶A和B中最終量為約1.5克/升，瓶C中最終量為約3.0克/升，瓶D中最終量為約4.5克/升。之后，將細(xì)胞在37℃和約40rpm攪拌培養(yǎng)7天。計(jì)細(xì)胞數(shù)和粘著有細(xì)胞的珠的分?jǐn)?shù)(即粘著到珠上的百分?jǐn)?shù))。為計(jì)數(shù)粘著有細(xì)胞的珠的百分?jǐn)?shù)，每個(gè)瓶至少觀察200個(gè)珠，至少粘著了5個(gè)細(xì)胞的珠計(jì)為粘著有細(xì)胞的珠。在加入了約1.5克/升的Cytodex 1的瓶A中的細(xì)胞在整個(gè)培養(yǎng)過程中以相同的培養(yǎng)基培養(yǎng)。在瓶B，C和D中，在培養(yǎng)開始后第3，4和5天以新鮮的培養(yǎng)基替代一半培養(yǎng)基。獲得了下述結(jié)果。培養(yǎng)基的替代不影響細(xì)胞數(shù)(A和B)。在培養(yǎng)7天之后每毫升的細(xì)胞數(shù)，B瓶約為9.1×105，C瓶約為7.7×105，D瓶約為8.0×105。在第一天，瓶A和B中粘著了細(xì)胞的珠的百分?jǐn)?shù)為98％或以上，在第4天達(dá)到100％。在瓶C和D中粘著了細(xì)胞的珠的百分?jǐn)?shù)較低(即分別為約39％和約80％)。但是，在第6天，在瓶A，B，C和D中該百分?jǐn)?shù)達(dá)到100％。
實(shí)驗(yàn)6以高密度與Cytodex 1培養(yǎng)的Vero-A細(xì)胞的增殖在Cytodex的濃度和細(xì)胞數(shù)分別為三倍的條件下進(jìn)行高密度培養(yǎng)。將Cytodex 1加入到濃度為4.5×105個(gè)細(xì)胞/毫升的Vero-A細(xì)胞懸浮液中達(dá)到終濃度為約4.5克/升，在用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的裝置中培養(yǎng)細(xì)胞，所述的裝置含有約50升的培養(yǎng)基。在開始的24小時(shí)每分鐘的轉(zhuǎn)速設(shè)置為約15rpm，在24小時(shí)之后設(shè)置為約20rpm。pH設(shè)置為7.0，溶解氧設(shè)置為5ppm。在培養(yǎng)開始后第3和第5天以新鮮生長培養(yǎng)基替代一半培養(yǎng)基。獲得下述結(jié)果。在第5和第7天的細(xì)胞數(shù)分別為約2.0×106個(gè)細(xì)胞/毫升和約2.6×106個(gè)細(xì)胞/毫升。此外，在第2天粘著了細(xì)胞的珠的百分?jǐn)?shù)是100％。
實(shí)驗(yàn)7用于在Vero-A細(xì)胞中生產(chǎn)疫苗的候選病毒毒株的繁殖以0.1的MOI將上面提到的來源于鼠腦的日本腦炎病毒的四個(gè)候選病毒毒株(北京株，Nakayama毒株，JaOH0566和JaOArS982)分別接種在培養(yǎng)皿中靜止培養(yǎng)3天的Vero-A細(xì)胞。將病毒吸附到Vero-A上約90分鐘。然后，將補(bǔ)充了2％(V/V)的牛血清的MEM加入到獲得的Vero-A中，隨后在37℃培養(yǎng)7天。對(duì)于胞外和胞內(nèi)病毒觀察該時(shí)間過程中感染的效價(jià)和抗原量的變化。獲得下述結(jié)果。就感染效價(jià)而言，除了Nakayama毒株以外，三個(gè)毒株的病毒效價(jià)在培養(yǎng)開始后第2天顯示最高值(約1.0×108PFU/毫升或更多)，胞內(nèi)病毒顯示的值為胞外病毒的1/3或更低。Nakayama毒株的胞外病毒在第3天顯示最高感染效價(jià)，是其它3個(gè)毒株的1/5或更低。就ELISA抗原效價(jià)而言，除了Nakayama毒株以外，三個(gè)毒株的胞外病毒在第3-5天顯示最高值(約70個(gè)單位)，胞內(nèi)病毒顯示的值為胞外病毒的1/5或更低。Nakayama毒株的ELISA抗原效價(jià)在第5-7天顯示達(dá)到穩(wěn)定(約30單位)。就HA效價(jià)而言，在第2-4天，Nakayama毒株胞外病毒顯示值約為160，其它三個(gè)毒株顯示值約640-約1280。
實(shí)驗(yàn)8北京株在與Cytodex 1培養(yǎng)的Vero-A細(xì)胞中的繁殖以0.1的MOI將在Vero-A中傳代4次的北京株病毒接種到20升的與Cytodex 1培養(yǎng)的Vero-A細(xì)胞(約1.96×106個(gè)細(xì)胞/毫升)中。將細(xì)胞在無牛血清的MEM中培養(yǎng)。獲得下述結(jié)果。胞內(nèi)病毒在培養(yǎng)開始后第2天顯示最高感染效價(jià)(約1.3×108PFU/毫升或更多)，胞外病毒在第3天顯示最高感染效價(jià)(約4.0×108PFU/毫升)，胞外病毒在第4天顯示最高ELISA抗原效價(jià)(約67個(gè)單位)，胞內(nèi)病毒在第3天顯示最高ELISA抗原效價(jià)(約26個(gè)單位)。在培養(yǎng)的第3天，胞外病毒顯示HA效價(jià)為320和胞內(nèi)病毒顯示約為40的HA效價(jià)。
實(shí)驗(yàn)9毒株的遺傳穩(wěn)定性通過將小鼠衍生的病毒(JWS-P-4)在Vero細(xì)胞中傳代2次制備原種(JMSV001)。在Vero-A細(xì)胞中連續(xù)傳代7次該原種仍遺傳穩(wěn)定，沒有發(fā)現(xiàn)編碼核蛋白，前-M蛋白和包膜蛋白的基因的堿基序列有突變。此外，由這些基因編碼的氨基酸序列與JWS-P-4相同。通過參考實(shí)施例1中描述的方法進(jìn)行遺傳分析。
實(shí)施例1測試疫苗的制備以0.1的MOI將通過在Vero-A中將小鼠衍生的病毒(JWS-P-4)傳代4次制備的北京株接種到與Cytodex 1培養(yǎng)的Vero-A細(xì)胞，并且在沒有牛血清的MEM中37℃培養(yǎng)4天。收集培養(yǎng)上清液(即胞外病毒)。利用具有截止分子量為100千道爾頓的超濾膜將上清液濃縮到約1/10體積。之后，加入福爾馬林至終濃度為1/1500(V/V)，從而使病毒滅活。在約4℃滅活50天。接著，將滅活的病毒懸浮液進(jìn)行兩次蔗糖密度梯度區(qū)帶超離心，從而純化該病毒。利用P35ZT轉(zhuǎn)頭(Nissei Sangyo有限公司)以約25％到約50％(W/W)蔗糖濃度梯度和30000rpm進(jìn)行第1次和第2次超速離心13小時(shí)。收集病毒組分(蔗糖密度41％)，在磷酸緩沖鹽水(PBS)中透析。透析過的組分用作為疫苗原液。根據(jù)上面提到的“生物制品的基本要求”將疫苗原液進(jìn)行安全性和效果的各種測試，其作為疫苗合格。然后，將疫苗原液在TC培養(yǎng)基199(Difco實(shí)驗(yàn)室，美國)中稀釋以便其中的蛋白質(zhì)含量變成約7.8微克/毫升。將獲得的經(jīng)過稀釋的疫苗溶液以1毫升的等份分配于3毫升小瓶。之后，密封各個(gè)小瓶獲得測試疫苗。根據(jù)上面提到的“生物制品的基本要求”的常規(guī)測試方法(其中蛋白質(zhì)用熱三氯乙酸(TCA)沉淀并且采用Lowry的方法定量)測量測試疫苗的蛋白質(zhì)含量。
實(shí)施例2主要步驟過程中測試疫苗的特性在生產(chǎn)實(shí)施例1所述的測試疫苗過程中完成各個(gè)主要步驟的時(shí)間點(diǎn)收集樣品，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)1描述的各種測試。獲得了下面的結(jié)果。病毒培養(yǎng)物的上清液(即病毒懸浮液)顯示約2.2×108PFU/毫升的感染效價(jià)和約70單位的ELISA抗原效價(jià)，以及約160的HA效價(jià)。當(dāng)利用超濾膜將病毒懸浮液濃縮到1/10體積時(shí)，感染效價(jià)和抗原量增高(約10倍)。第一次區(qū)帶超離心之后，在蔗糖濃度為約41％和約34％的兩個(gè)組分中觀察到病毒抗原量的峰值。電子顯微鏡表明蔗糖濃度為約41％的組分含有病毒顆粒，蔗糖濃度為約34％的組分含有病毒抗原性顆粒，該顆粒比病毒顆粒小很多。此外，在蔗糖濃度為約28％或更低的組分中檢測到來源于細(xì)胞培養(yǎng)物的牛血清抗原，并與病毒顆粒組分分離。將上面提到的病毒顆粒組分再次利用區(qū)帶超速離心純化，證實(shí)病毒顆粒以單峰形式存在于蔗糖濃度為約40％的組分中。從該組分制備測試疫苗。測試疫苗顯示約45單位的ELISA抗原效價(jià)，蛋白質(zhì)濃度為7.8微克/毫升。
實(shí)施例3測試疫苗的電子顯微鏡照相將測試疫苗和來源于鼠腦的商購疫苗進(jìn)行上面提到的電子顯微鏡分析(圖1)。結(jié)果，商購疫苗中MB顆粒的包膜層表面或表觀是光滑(圖1B)，而本發(fā)明測試疫苗中R顆粒是粗糙或絨毛狀的(圖1A)。
實(shí)施例4基于中和反應(yīng)的測試疫苗的效力根據(jù)上面提到的“效力測試”對(duì)含有滅活的北京株作為活性成分的三個(gè)疫苗(實(shí)施例1獲得的測試疫苗，來源于鼠腦的商購疫苗，和效力測試的參照疫苗)的效價(jià)進(jìn)行測量。更具體地說，將各個(gè)疫苗在PBS中2倍系列稀釋并且接種小鼠。將抗北京株病毒血清的中和抗體效價(jià)進(jìn)行比較。表2顯示了疫苗的稀釋比例和中和抗體效價(jià)的常用對(duì)數(shù)值之間的關(guān)系。
對(duì)于稀釋8-32倍的疫苗，由免疫接種測試疫苗和商購疫苗(相等的蛋白質(zhì)含量)獲得的抗血清的中和抗體效價(jià)的常用對(duì)數(shù)值之間的差異分別是約0.38到約1.11。就是說，由測試疫苗免疫原獲得的中和抗體效價(jià)是由商購疫苗免疫原獲得的中和抗體效價(jià)的約2-約10倍。此外，經(jīng)平行線測試推測的這些測量值的結(jié)果是，計(jì)算的本發(fā)明的測試疫苗的效價(jià)(中和抗體效價(jià))對(duì)商購疫苗的值是約3倍。
表2蛋白質(zhì)含量 疫苗稀釋度中和抗體效價(jià) 差值μg/ml 的常用對(duì)數(shù)值 (A-B)測試疫苗(A)8 3.87 0.647.8163.51 0.38323.33 1.11商購疫苗(B)8 3.237.5163.13322.21參照疫苗5.4161.87差值(A-B)(A的中和抗體效價(jià))的常用對(duì)數(shù)值—在相同稀釋度的(B的中和抗體效價(jià))的公用對(duì)數(shù)值。例如，疫苗稀釋度為8時(shí)，3.87-3.24＝0.64。
蛋白質(zhì)含量采用TCA蛋白質(zhì)定量方法測定的值(用熱三氯乙酸沉淀疫苗中的蛋白質(zhì)，并通過Lowry方法定量測定)。
實(shí)施例5基于交叉中和反應(yīng)的測試疫苗之間的免疫原性差異將三個(gè)毒株(在Vero-A細(xì)胞傳代四次的北京株，和來源于泰國，在Vero-A細(xì)胞傳代二次的ThCMAr67/93和ThCMAr44/92)用作為種病毒，含有各個(gè)毒株的滅活病毒作為活性成分的的測試疫苗按照實(shí)施例1描述的相同方法制備。之后，以實(shí)施例4描述的相同方式測量和比較從用相應(yīng)的疫苗免疫接種的小鼠獲得的抗血清的中和抗體效價(jià)，從而分析毒株之間的交叉反應(yīng)。為了進(jìn)行比較，使用來源于鼠腦的含有北京株和Nakayama毒株的滅活的病毒作為活性成分的商購疫苗和作為參照疫苗的來源于鼠腦的含有5.4微克/毫升的TCA蛋白質(zhì)的疫苗(北京株)。此外，對(duì)于小鼠免疫接種，將五個(gè)疫苗的每一個(gè)的TCA含量調(diào)節(jié)到約7.5微克/毫升，然后將疫苗在PBS中稀釋16倍。作為中和測試的攻擊病毒，使用上面提到的4個(gè)病毒，即北京株，Nakayama株，ThCMAr67/93和ThCMAr44/92。表3顯示上面提到的用PBS稀釋16倍的5個(gè)疫苗的結(jié)果。根據(jù)交叉反應(yīng)譜，北京株和ThCMAr67/93毒株的病毒抗原作為滅活的日本腦炎疫苗的滅活的免疫原是優(yōu)異的。
表3疫苗 病毒北京株 Nakayama株 Ar67Ar44測試疫苗(北京株)3.683.042.872.66商購疫苗(北京株)3.092.691.881.88商購疫苗(Nakayama株)0.862.051.451.04測試疫苗(Ar67) 2.843.153.022.97參照疫苗(北京株)1.85NT NT NTAr67ThCMAr67/93毒株，Ar44ThCMAr44/92毒株測試疫苗在Vero-A細(xì)胞中生產(chǎn)的滅活疫苗商購疫苗來源于鼠腦的滅活疫苗參照疫苗來源于鼠腦的自制標(biāo)準(zhǔn)滅活疫苗數(shù)值中和抗體效價(jià)的常用對(duì)數(shù)值(log)NT未試驗(yàn)實(shí)施例6測試二價(jià)疫苗的制備按照實(shí)施例1的相同方法制備北京株和ThCMAr67/93毒株的疫苗原液，之后，將各疫苗原液在PBS中稀釋以獲得10微克/毫克的蛋白質(zhì)含量。然后，將獲得的溶液等量互相混合，將混合物分散到試管以獲得二價(jià)疫苗。該二價(jià)疫苗具有比相應(yīng)的單價(jià)疫苗更寬的交叉反應(yīng)譜。
實(shí)施例7
診斷試劑的制備按照實(shí)施例1制備的北京株疫苗原液的R顆粒用作為治療抗原，采用上面描述的“病毒抗原量的測量”相同的方法進(jìn)行ELISA測定其效果。作為比較對(duì)照抗原，使用商購北京株疫苗的MB顆粒。作為抗體，可以使用單克隆抗體503(MAb503抗所有日本腦炎病毒共有和特異性的中和表位的抗體)，MAb302(抗日本腦炎病毒群的特異性表位的抗體)，和多克隆抗體(PAb來源于小鼠的超免疫系統(tǒng))。當(dāng)抗原量保持不變時(shí)(蛋白質(zhì)的量7.6微克/毫升)，系列稀釋抗體并且測量ELISA的值。就R顆粒的ELISA值/MB顆粒的ELISA值，Mab503顯示為53/47，Mab302顯示為226/22，PAb顯示為120/52?；谶@些結(jié)果，判斷R顆粒對(duì)Mab302和PAb的靈敏度比MB顆粒高約2-10倍。此外，根據(jù)MAb302的結(jié)果可以認(rèn)為本發(fā)明的抗原可用作為制備性檢測日本腦炎病毒群的抗原。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，通過利用易于處理和非昂貴的細(xì)胞系替代昂貴的且飼養(yǎng)和控制困難的小鼠可以大規(guī)模生產(chǎn)病毒顆粒。由于沒有殺死許多小鼠，本發(fā)明對(duì)于動(dòng)物保護(hù)是令人滿意的。此外，生產(chǎn)成本顯著降低，并且抗生物毒害的措施，用于生產(chǎn)的操作程序，純化步驟，質(zhì)量控制，生產(chǎn)計(jì)劃等等也是顯著節(jié)約了勞動(dòng)力。根據(jù)本發(fā)明，提供了顯示的效價(jià)比常規(guī)的滅活疫苗高2-10倍的可用作增強(qiáng)免疫原的新的病毒顆粒及其生產(chǎn)方法。特別是，根據(jù)本發(fā)明，提供了具有作為用于日本腦炎病毒疫苗的免疫原和作為診斷試劑的抗原的免疫原性或抗原性的新的日本腦炎病毒顆粒，及其生產(chǎn)方法。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了優(yōu)質(zhì)和廉價(jià)疫苗和診斷試劑，可改進(jìn)并迅速傳播對(duì)由日本腦炎病毒群引起的感染疾病的預(yù)防和診斷。
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<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1500<212>DNA<213>
<220>日本腦炎病毒<221>CDS<222>(1)..(1500)<400>1ttt aac tgt ctg gga atg ggg aat cgg gat ttc ata gaa gga gcc agt 48Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser1 5 10 15gga gcc act tgg gtg gat ttg gtg tta gaa gga gat agt tgt ttg aca 96Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr20 25 30atc atg gca aac gac aaa cca aca cta gat gtc cgc atg atc aac att144Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile35 40 45gaa gct agc caa ctt gct gaa gtc agg agt tac tgc tat cac gct tca192Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser50 55 60gtc act gac att tca acg gtg gct cga tgc ccc acg act gga gaa gcc240Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala65 70 75 80cac aac gag aaa cgt gct gac agc agc tac gtg tgc aaa caa ggc ttt288His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe85 90 95
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權(quán)利要求
1.一種作為增強(qiáng)免疫原的滅活的病毒顆粒，是從用屬于日本腦炎病毒群的病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物制備的，其中該病毒顆粒是完全通過物理方法而純化的，其中用該病毒顆粒免疫接種獲得的抗血清的中和抗體效價(jià)是用從鼠腦培養(yǎng)的病毒制備的滅活的病毒顆粒免疫接種獲得的抗血清的中和抗體效價(jià)的約2-10倍。
2.用于生產(chǎn)滅活的病毒顆粒的方法，包括在一個(gè)細(xì)胞系中培養(yǎng)屬于日本腦炎病毒群的病毒，以及滅活和純化細(xì)胞培養(yǎng)物，其中該純化是完全通過物理方法而進(jìn)行的，其中用該病毒顆粒免疫接種獲得的抗血清的中和抗體效價(jià)是用從鼠腦培養(yǎng)的病毒制備的滅活的病毒顆粒免疫接種獲得的抗血清的中和抗體效價(jià)的約2-10倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述細(xì)胞系是Vero細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其中滅活是在純化之前進(jìn)行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中滅活是在約4℃-約10℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中屬于日本腦炎病毒群的病毒是日本腦炎病毒的北京株或ThCMAr67/93株。
7.含有權(quán)利要求1所述的滅活的病毒顆粒的滅活疫苗。
8.用于由日本腦炎病毒群引起的感染性疾病的診斷試劑，含有完整或部分如權(quán)利要求1所述的滅活病毒顆粒作為抗原。
9.權(quán)利要求1的滅活的病毒顆粒，其中根據(jù)電子顯微鏡分析，該顆粒結(jié)構(gòu)的表面或被膜層的外觀是粗糙的或是絨毛狀的。
10.權(quán)利要求2的方法，其中根據(jù)電子顯微鏡分析，該顆粒結(jié)構(gòu)的表面或被膜層的外觀是粗糙的或是絨毛狀的。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有比常規(guī)疫苗高約2－10倍的效價(jià)的新的滅活病毒顆粒以及增強(qiáng)免疫原，及其制備方法。本發(fā)明的滅活病毒顆?？捎糜谟扇毡灸X炎病毒群引起的感染性疾病的診斷試劑。
文檔編號(hào)A61K39/12GK1618464SQ20041004731
公開日2005年5月25日 申請(qǐng)日期1999年6月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月5日
發(fā)明者石川豐數(shù), 吉井洋紀(jì), 大西敏之, 今川忠, 石橋正英 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人阪大微生物病研究會(huì)