專利名稱：Vero細胞森林腦炎滅活疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物制藥領域，具體涉及一種Vero細胞森林腦炎滅活疫苗及其制備方法，特別是工業(yè)化制備Vero細胞森林腦炎滅活疫苗的方法及由此方法制備的疫苗。
背景技術：
森林腦炎是由森林腦炎病毒引起的，以蜱類為主要傳染源，以侵犯中樞神經系統(tǒng)為主的自然疫源性急性傳染病，病死率在20-30％，是一種嚴重危害人民健康的病毒性傳染病。
用于預防森林腦炎的疫苗。先后經歷了用鼠腦、雞胚、地鼠腎等基質制備森林腦炎滅活疫苗，目前我國使用的是地鼠腎細胞森林腦炎滅活疫苗；國外使用的是雞胚細胞森林腦炎滅活疫苗；重組基因工程疫苗正處于研究之中，但至今尚無重大突破。
中國當前生產使用的地鼠腎森林腦炎滅活疫苗，對于降低森林腦炎的發(fā)病率確實起到了重要的作用，使森林腦炎的發(fā)病率得以下降，但是其免疫效果并不理想，二針免疫后人體的抗體陽轉率33％左右，加強免疫一針后人體的抗體陽轉率50％左右，且30％發(fā)病者有疫苗接種史，加之接種后有嚴重的副反應，可見現用疫苗的應用效果并非理想。
現用技術中生產森林腦炎疫苗存在的主要問題是，疫苗生產中因使用動物原代細胞培養(yǎng)，所使用動物的飼養(yǎng)、繁殖、無菌條件的控制及解剖均存在諸多不便，從而限制了生產規(guī)模，且無法保證這些來自普通動物級的細胞基質不攜帶外源因子，更不適合大規(guī)模工業(yè)化生產。
因此，急需一種更安全、更有效的森林腦炎疫苗用于人們預防接種。使用一種既對森林腦炎病毒敏感又可用于旋轉培養(yǎng)的傳代細胞基質是解決問題的重要途徑之一。
Vero細胞是日本學者1962年從非洲綠猴(cercopithecus aethiopsmonkey)腎建立的猴腎細胞系。其93代被帶到美國NIH的過敏與傳染病研究所熱帶病毒研究室，第113代被提交給ATCC，編號為ATCCNO.CCL-81。經過全面的研究鑒定，Vero細胞具有胞核學穩(wěn)定，沒有外源因子污染和致瘤性的優(yōu)點，完全符合WHO關于用于生物制品的傳代細胞的規(guī)程要求，已被WHO證明可作為疫苗生產的基質(WHO Tech.Rep.Ser.，1987，1)。Vero細胞小兒麻痹滅活疫苗、小兒麻痹疫苗、Vero細胞狂犬病疫苗相繼在法國培養(yǎng)研制出來并獲批準生產，并且有關應用Vero細胞制備疫苗的研究時有報道，但關于應用Vero細胞制備森林腦炎疫苗的研究還未見報道。
我們通過試驗證明Vero細胞也是森林腦炎病毒的敏感細胞，用其制備森林腦炎疫苗，一方面可避免動物原代細胞培養(yǎng)可能帶來的外源因子的污染，可事先控制細胞的質量；另一方面可通過利用病毒在細胞系中繁殖和增殖來實現高度工業(yè)化的方法，大量生產疫苗，簡化工藝。這不僅由于可避免必須處理相當大數量的動物，而且用于感染的細胞基質容易控制在均一的水平，可控制并獲得滿意的產率。
綜上所述，本發(fā)明克服現有技術的缺點，提供了Vero細胞森林腦炎滅活疫苗及其生產的方法，該方法可在安全、迅速和經濟的條件下應用于大規(guī)模生產，并且可獲得高純度、理想工業(yè)產率的有效疫苗。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備Vero細胞森林腦炎滅活疫苗的方法，該方法的核心是利用Vero細胞工業(yè)化大規(guī)模生產森林腦炎滅活疫苗。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種安全有效的人Vero細胞森林腦炎滅活疫苗。通過細胞系的Vero細胞培養(yǎng)而獲得的疫苗，包含森林腦炎病毒，并且細胞DNA含量小于100pg/劑。該疫苗既具有功效又具有對可能與病毒接觸的任何人進行全身性給藥時所必需的安全性。
本發(fā)明的其他目的，在下面對本發(fā)明的具體描述中體現出來。


附圖1是本發(fā)明優(yōu)選的制備Vero細胞森林腦炎滅活疫苗的工業(yè)化生產流程示意圖。
本申請人經過長期研究發(fā)現，Vero細胞也是森林腦炎病毒的敏感細胞，適合于森林腦炎病毒滅活疫苗的生產，特別是選擇森“張”病毒株作為森林腦炎病毒，采用Vero細胞生產森林腦炎病毒滅活疫苗。
Vero細胞最早來源于ATCC，本發(fā)明采用的Vero細胞來源于中國藥品生物制品檢定所，代次為126代。
將126代Vero細胞經過傳代擴增后液氮凍存，作為細胞主代種子庫；由細胞主代種子庫細胞傳代擴增后，液氮凍存作為生產細胞工作種子庫(MWCB)；由生產細胞工作種子庫細胞制備生產用細胞。
細胞傳至170代，進行細胞致腫瘤原性試驗Vero細胞致腫瘤原性試驗陰性，證實Vero細胞安全可靠、未發(fā)生致瘤性變異；細胞傳代穩(wěn)定性試驗細胞形態(tài)特征觀察用顯微鏡觀察，發(fā)現細胞貼壁及生長良好，與生產細胞工作種子庫細胞無變異，證實細胞傳代是穩(wěn)定的；細胞外源因子檢查試驗傳代細胞的無菌試驗、支原體檢查及外源因子檢查均為陰性；核型的染色體數目分布高峰(56-58條)分析表明，與美國ATCC報告的(47-60條)基本一致。按鑒定代次前推10代即160代，作為疫苗生產用細胞最高代次，在此限定代次內，可提供大批量的培養(yǎng)基質，滿足生產需要，并能保證其用于疫苗生產是安全可行的。結果見表1。
根據本發(fā)明，一種Vero細胞森林腦炎滅活疫苗，其特征在于該疫苗包含有效量的在Vero細胞上增殖的滅活森林腦炎病毒及其疫苗佐劑，其中該滅活森林腦炎病毒優(yōu)選來自森“張”病毒株P9-3。
森“張”株病毒在病毒學屬于黃病毒屬黃病毒科(Flaviviridae-Flavivirus)。該病毒株的鼠腦株，森“張”株P9-3，由本申請人保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢的武漢大學，其保藏號為CCTCC V202004，保藏日期為2002年9月9日。
該Vero細胞森林腦炎滅活疫苗的疫苗病毒株的病毒感染滴度，可達到并穩(wěn)定在8.001gLD50/ml，經全面檢定，證明病毒生物學活性穩(wěn)定，抗原性廣譜和免疫原性良好，無污染外源因子。檢定結果見表2。
本發(fā)明的Vero細胞森林腦炎滅活疫苗，還含有常用病毒穩(wěn)定劑，優(yōu)選為人血清白蛋白。
根據本發(fā)明，該佐劑為常用疫苗佐劑，如Al(OH)3等等。
根據本發(fā)明，一種Vero細胞森林腦炎病毒滅活疫苗的制備方法，包括通過Vero細胞用森林腦炎病毒株制備病毒液，以及用諸如佐劑、穩(wěn)定劑等把純化的病毒液配制成疫苗。
(1)細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)采用Vero細胞。Vero細胞可在適宜的細胞培養(yǎng)瓶中靜止或旋轉瓶旋轉進行培養(yǎng)。Vero細胞的培養(yǎng)，可使用適宜的動物細胞培養(yǎng)液，PH為7.0-8.0，培養(yǎng)溫度36-38℃，細胞的接種濃度為1.0×104-106/ml。待細胞長成單層時接種病毒。
根據本發(fā)明，所用的適宜動物細胞培養(yǎng)液，可以是常用的細胞培養(yǎng)液，例如，4-10％(優(yōu)選6-8％)的小牛血清的MEM液或199液等等。PH為7.0-8.0，培養(yǎng)溫度36-38℃。
(2)病毒接種在Vero細胞長成單層時接種森林腦炎病毒，如森“張”病毒株。病毒的感染劑量(M.O.I)為0.01-1.0，優(yōu)選為0.01-0.05，更優(yōu)選為0.01。
(3)病毒液收獲病毒在感染細胞中繁殖和增殖，產生病毒懸液形式的病毒液，將森林腦炎疫苗株病毒接種到上述的細胞基質中，收獲培養(yǎng)3-5天后的細胞培養(yǎng)病毒液。
收獲病毒液后，可添加新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待病毒增殖后再次收獲病毒液；可連續(xù)多次添加培養(yǎng)液和收獲病毒液。多次收獲病毒液可為1-9次。
(4)病毒滅活病毒液用化學試劑，如福爾馬林，滅活病毒。如果是多次收獲病毒液，可合并各次的病毒液，然后用化學試劑滅活病毒。滅活前后均需取樣進行無菌試驗，測定病毒滴度以及滅活后需進行病毒滅活試驗。
根據細胞培養(yǎng)液的不同，按照本發(fā)明收獲的病毒液，可為含有動物血清或不含動物血清的病毒培養(yǎng)液。
采用適當濃度的滅活劑，在合適的溫度和時間下，使病毒失去感染力，但保持病毒的抗原性和免疫原性。例如，滅活時，甲醛的濃度為1/2000～1/6000；滅活條件在37℃，2～3天；20～25℃，7～14天；4～8℃，14～21天，均可滅活病毒，本發(fā)明優(yōu)選甲醛的濃度為1/4000，滅活溫度和時間為20～25℃，16～24小時；4～8℃，14天。
(5)疫苗原液純化離心或澄清膜處理上述收獲的病毒液，去除細胞碎片的雜質，取上清液，待進一步純化。按照本發(fā)明，此步驟中連續(xù)離心的條件為8000-10000轉/分，4-8℃。澄清膜優(yōu)選0.4um澄清膜。
以傳代細胞制備生物制品安全性的關鍵是細胞殘余DNA的含量。按WHO規(guī)程的要求，疫苗的細胞基質DNA必須小于100pg/劑量。
有關疫苗的進一步純化方法，經反復試驗和研究，本發(fā)明提出了優(yōu)選的疫苗原液的進一步純化方法離心后的疫苗原液濃縮后，通過柱層析來實現。
柱層析優(yōu)選凝膠過濾層析。凝膠過濾層析技術簡單，條件最溫和，對保持生物大分子的活性是最有力的方法，適合分離分子量懸殊的物質。森林腦炎病毒的分子量在3×106以上，與疫苗中的雜蛋白分子量相差較大，故使用凝膠過濾層析可以非常方便有效地去除疫苗中殘留的小分子雜質。凝膠過濾的洗脫速度為10～200ml/分鐘，溫度為4～25℃。
(6)疫苗配制將純化的病毒懸液用佐劑配制成藥物形式，如疫苗，以便于保存和使用。如果需要，疫苗中可以加入病毒穩(wěn)定劑，如人白蛋白等等，或添加其他輔劑。
本發(fā)明的純化疫苗還含有常用防腐劑，例如硫柳汞。
根據本發(fā)明，病毒滅活，可以在疫苗原液純化之后進行，優(yōu)選在疫苗原液純化之前進行。
根據本發(fā)明的具體特征，細胞的病毒感染是在病毒培養(yǎng)液的存在下進行。所用的病毒培養(yǎng)液，可以是常用的病毒培養(yǎng)液，如含0.1-0.2％人白蛋白的MEM液；0.5-2.0％小牛血清的MEM液；含0.1-0.2％人白蛋白或0.5-2.0％小牛血清的199液。根據具體情況，選擇合適的細胞維持時間。例如，多次換含1-2％小牛血清的MEM液可維持30天，最多可達50天。PH為7.0-8.0，培養(yǎng)溫度32-35℃。
根據本發(fā)明的具體特征，Vero細胞感染病毒后可以多次收集病毒液的方法，特別有利于工業(yè)化生產本發(fā)明的Vero細胞森林腦炎滅活疫苗。
根據實施本發(fā)明的另一具體優(yōu)選方案，該方法中純化病毒懸液的步驟，是用連續(xù)流離心機離心滅活的病毒液后，經超濾濃縮，再經過Sepharose 4FF柱層析，來得到本發(fā)明的純化疫苗。超濾優(yōu)選100Kd的超濾膜。
本發(fā)明與目前使用的來自動物原代細胞培養(yǎng)的疫苗相比，最主要的優(yōu)點如下(1)Vero細胞已被證明不含任何污染外源因子和致瘤性，作為生產疫苗的基質，明顯優(yōu)與于現行疫苗的動物原代細胞培養(yǎng)；(2)Vero細胞疫苗的毒種是細胞培養(yǎng)毒種，從根本上避免使用動物腦組織；(3)用傳代細胞-Vero細胞生產疫苗的工藝，適合于工業(yè)化生產批量的均質疫苗，這是現行動物原代細胞培養(yǎng)疫苗辦不到的；(4)本發(fā)明的Vero細胞森林腦炎滅活疫苗經純化后疫苗中的抗原含量、免疫原性明顯提高，雜蛋白減少，疫苗的質量大大提高。
本發(fā)明的森林腦炎病毒滅活疫苗，可用于預防森林腦炎病毒的感染。本發(fā)明的森林腦炎病毒滅活疫苗，可以采用肌肉注射的方式給藥，也可以采用其他合適的方式給藥。
下面參照附圖1，對本發(fā)明的工業(yè)化生產Vero細胞森林腦炎滅活疫苗的一種優(yōu)選實施方案，作進一步的描述。本文中所涉及的原材料和設備，如無特別說明，均可從市場上購得。
1.細胞系細胞(Vero細胞)的制備取細胞主代種子庫細胞制備生產細胞種子庫細胞；再用生產細胞種子庫細胞制備生產用細胞；方法為取已長成單層的種子批Vero細胞，棄去細胞生長液后加入pH7.6-8.0的0.1-0.5％的胰酶，置37℃消化15-40分鐘，棄去胰酶液，用新鮮細胞生長液輕輕分散細胞，使之懸于含有6-8％的小牛血清MEM液的細胞生長液內，制備成細胞懸液，搖均后分裝于3立升培養(yǎng)瓶，200ml-600ml/瓶。將細胞培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫室旋轉培養(yǎng)2-3日后，在細胞瓶的瓶壁上可形成均勻、致密的細胞單層。
2.病毒感染、病毒液收獲、滅活方法一選擇細胞生長均勻、致密的單層細胞瓶，棄去細胞生長液，用Earle′s液或生理鹽水沖洗2-3分鐘后感染，毒種接種劑量為感染復數為0.02-0.5，毒種稀釋液為含0.1-0.5％人白蛋白MEM液，將感染病毒后的細胞瓶置32-34℃恒溫室內旋轉培養(yǎng)16-20小時，棄去病毒液，加入含0.1-0.2％人白蛋白MEM液，繼續(xù)置32-34℃恒溫室內旋轉培養(yǎng)至60-72小時，視細胞病變情況收獲病毒液，抽樣作無菌試驗和病毒滴定，將收獲的病毒液合并后加入1/2000-1/6000福爾馬林液(滅活劑)和1/20000硫柳汞，置37℃，16-24小時后再于4-8℃滅活14日；或于4-8℃滅活21日方法二選擇細胞生長均勻、致密的單層細胞瓶棄去生長液后感染疫苗株病毒毒種，毒種接種劑量為感染復數為0.02-0.5，毒種稀釋液為含0.5-1.5％小牛血清MEM液，將已感染病毒的細胞瓶置32-34℃恒溫室內旋轉培養(yǎng)60-72小時，視細胞病變情況收獲病毒液，收獲的同時再加入含0.5-1.5％小牛血清MEM液，置32-34℃恒溫室內旋轉培養(yǎng)24-48小時，視病變情況再次收獲病毒液，如此連續(xù)收獲病毒培養(yǎng)液，各次收獲液均抽樣作無菌試驗和病毒滴定，并按方法一的方法滅活。滅活后得到的病毒液即為疫苗原液。
3.疫苗原液的離心(粗提)將經無菌試驗、滅活試驗檢定合格后的疫苗原液，經連續(xù)流離心或澄清膜除去細胞碎片等雜質后待進一步純化。
4.疫苗的純化(精提)此方法適合于Vero細胞森林腦炎疫苗的純化。將經連續(xù)流離心已除去細胞碎片等雜質的疫苗原液，用截留分子量100kd的超濾膜超濾濃縮，并用pH7.6-7.8的0.01MPBS緩沖液平衡，濃縮30-80倍，收集濃縮液。然后選擇Sepharose 4FF介質，用pH7.6-7.8的0.01MPBS緩沖液平衡后，進行柱層析，用紫外監(jiān)測儀(A280nm)檢測洗脫液，收集洗脫的第一峰為森林腦炎病毒抗原，抽樣檢測蛋白或抗原含量，根據蛋白或抗原含量稀釋到一定濃度后進行除菌過濾，并加入終濃度為0.1-0.2％人白蛋白和0.45-0.55mg/ml的AL(OH)3佐劑。然后作無菌試驗、熱原質試驗，檢定合格后進行分裝，即為成品。成品檢定包括外觀檢查、無菌試驗、效力試驗、毒性試驗、細胞DNA含量測定、甲醛含量測定、硫柳汞含量測定、AL(OH)3含量測定、pH值測定等。
本發(fā)明制備的Vero細胞森林腦炎滅活疫苗，適合于森林腦炎疫區(qū)易感人群及進入該地區(qū)的易感人員使用。
下面通過實施例，對本發(fā)明的內容作更進一步的描述。
實施例1取已長成單層的生產用Vero細胞瓶，棄去細胞生長液后加入pH7.6-8.0的0.1-0.5％的胰酶，置37℃消化15-40分鐘，棄去胰酶液，用新鮮細胞生長液輕輕分散細胞，使之懸于含有6-8％的小牛血清MEM液的細胞生長液內，制備成細胞懸液，搖均后分裝于3立升培養(yǎng)瓶，200ml-600ml/瓶。將細胞培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫室旋轉培養(yǎng)至細胞長成均勻、致密的單層。
選擇細胞生長均勻、致密的單層細胞瓶，棄去細胞生長液，用Earle′s液沖洗2-3分鐘后感染疫苗病毒株毒種(毒種感染劑量為感染復數為0.02-0.5，毒種稀釋液為0.1-0.2％人白蛋白MEM液)，將毒種液加入待感染的細胞瓶內，400-1000ml/瓶，置32-34℃恒溫室內旋轉培養(yǎng)18小時，棄去病毒液，加入含0.1-0.2％人白蛋白MEM液，繼續(xù)置32-34℃恒溫室內旋轉培養(yǎng)至68小時，收獲病毒液，抽樣作無菌試驗和病毒滴定，將收獲的病毒液加入1/4000福爾馬林液(滅活劑)及1/20000硫柳汞，置37℃，16-24小時后再于4-8℃滅活14日；或于4-8℃滅活21日，滅活后得到的病毒液即為疫苗原液。
經無菌試驗、滅活試驗檢定合格后的疫苗原液，經連續(xù)流離心或澄清膜處理除去細胞碎片等雜質后，用截留分子量100kd的超濾膜超濾濃縮，并用pH7.6-7.8的0.01MPBS緩沖液平衡，濃縮50倍，收集濃縮液。然后用Sepharose 4FF介質，經pH7.6-7.8的0.01MPBS緩沖液平衡后，進行柱層析，用紫外監(jiān)測儀(A280nm)檢測洗脫液，收集洗脫的第一峰為森林腦炎病毒抗原，抽樣檢測抗原含量，稀釋后進行除菌過濾，并加入終濃度為0.1-0.2％人白蛋白和0.45-0.55mg/ml AL(OH)3佐劑。然后作無菌試驗、熱原試驗、細胞DNA含量測定，檢定合格后分裝，即為本發(fā)明的純化疫苗成品。成品檢定包括外觀檢查、無菌試驗、效力試驗、毒性試驗、細胞DNA含量測定、甲醛含量測定、硫柳汞含量測定、AL(OH)3含量測定、pH值測定等。檢定結果見表3。
實施例2取已長成單層的生產用Vero細胞瓶，棄去細胞生長液后加入pH7.6-8.0的0.1-0.5％的胰酶，置37℃消化15-40分鐘，棄去胰酶液，用新鮮細胞生長液輕輕分散細胞，使之懸于含有6-8％的小牛血清MEM液的細胞生長液內，制備成細胞懸液，搖均后分裝于3立升培養(yǎng)瓶，200ml-600ml/瓶。將細胞培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫室旋轉培養(yǎng)至細胞長成均勻、致密的單層。
選擇細胞生長均勻、致密的單層細胞瓶，棄去細胞生長液后感染疫苗株病毒毒種(毒種感染劑量為感染復數為0.02-0.5，毒種稀釋液為0.5-2.0％小牛血清的MEM液)，將毒種液加入待感染的細胞瓶內，400-1000ml/瓶，置32-34℃恒溫室內旋轉培養(yǎng)18小時，棄去病毒液，加入含0.5-2.0％小牛血清MEM液，繼續(xù)置32-34℃恒溫室內旋轉培養(yǎng)至68小時，收獲病毒液，收獲的同時再加入含0.5-2.0％小牛血清的MEM液，400-1000ml/瓶，置32-34℃恒溫室內旋轉培養(yǎng)至24-48小時，再次收獲病毒液，如此連續(xù)收獲病毒培養(yǎng)液，各次收獲的病毒液均抽樣作無菌試驗和病毒滴定，并按方法一的方法滅活。滅活后的病毒液即為疫苗原液。
經無菌試驗、滅活試驗檢定合格后的疫苗原液，經連續(xù)流離心除去細胞碎片等雜質后，然后用截留分子量100kd的超濾膜超濾濃縮，并用pH7.6-7.8的0.01MPBS平衡濃縮液，濃縮50倍，收集濃縮液。然后用Sepharose 4FF介質，經pH7.6-7.8的0.01MPBS平衡后，進行柱層析，用紫外監(jiān)測儀(A280nm)檢測洗脫液，收集洗脫的第一峰為森林腦炎病毒抗原，抽樣檢測蛋白或抗原含量，稀釋后進行除菌過濾，并加入終濃度為0.1-0.2％的人白蛋白和0.45-.55mg/ml的AL(OH)3佐劑。然后作無菌試驗、熱原試驗，檢定合格后進行分裝，即為本發(fā)明的純化疫苗成品。成品檢定包括外觀檢查、無菌試驗、效力試驗、毒性試驗、細胞DNA含量測定、甲醛含量測定、硫柳汞含量測定、AL(OH)3含量測定、pH值測定等。檢定結果見表3。
附表表1 Vero細胞主代細胞庫、工作細胞庫建立及檢定結果

表2 Vero細胞森林腦炎毒種檢定結果

表3 Vero細胞森林腦炎疫苗檢定結果

權利要求
1.一種Vero細胞滅活森林腦炎疫苗，其特征在于該疫苗包含有效量的在Vero細胞上增殖的滅活森林腦炎病毒和疫苗佐劑，該滅活森林腦炎病毒來自森“張”病毒株，優(yōu)選森“張”病毒株P9-3。
2.權利要求1的Vero細胞滅活森林腦炎病毒疫苗，其特征在于該佐劑為Al(OH)3。
3.權利要求1的Vero細胞滅活森林腦炎病毒疫苗，還包含病毒穩(wěn)定劑，優(yōu)選為人血清白蛋白。
4.一種Vero細胞滅活森林腦炎疫苗的制備方法，特征在于包含下述步驟(1)培養(yǎng)來自細胞系細胞的Vero細胞；(2)在培養(yǎng)液中，用森林腦炎病毒感染Vero細胞，在感染的Vero細胞中增殖以病毒懸液形式的病毒液，該病毒優(yōu)選森“張”病毒株P9-3；(3)收獲(2)步驟中得到的病毒液，(4)通過粗提、濃縮及柱層析步驟去除該病毒液中的剩余培養(yǎng)物和/或雜蛋白，純化病毒懸液；(5)在(4)步驟之前或之后滅活得到的病毒液；(6)將(5)步驟中得到的純化滅活病毒液，用佐劑配制成疫苗。
5.權利要求4的方法，特征在于感染細胞時的病毒接種劑量，相當于感染復數(M.O.I.)0.01-1.0，優(yōu)選小于0.5。
6.權利要求4的方法，特征在于該粗提為離心或澄清膜處理，優(yōu)選連續(xù)流離心分離。
7.權利要求4的方法，特征在于該(3)步驟收獲病毒液后，還可以再加入培養(yǎng)液，以進一步收集病毒液，重復次數可為1至9之間。
8.權利要求4的方法，特征在于將收集的各次病毒液合并后，用化學試劑進行滅活。
9.權利要求4的方法，特征在于該濃縮為超濾濃縮。
10.權利要求4-9的方法，特征在于該柱層析為Sepharose 4FF柱層析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種Vero細胞滅活森林腦炎病毒疫苗以及其制備方法，特別是工業(yè)化制備方法。該疫苗包含有效量的滅活森林腦炎病毒和疫苗佐劑。本發(fā)明的制備方法是將森林腦炎病毒株如森“張”病毒接種Vero細胞，該細胞感染病毒后繼續(xù)培養(yǎng)收獲病毒培養(yǎng)液，可補充培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)，得到的病毒培養(yǎng)液經純化后，可配制成本發(fā)明的Vero細胞森林腦炎病毒疫苗。由于使用Vero細胞培養(yǎng)及Vero細胞毒種，不合有污染因子和致瘤性，具有純度高、免疫效果好的優(yōu)點，特別適合大規(guī)模工業(yè)化生產。
文檔編號A61K39/12GK1513553SQ0314095
公開日2004年7月21日 申請日期2003年6月2日 優(yōu)先權日2003年6月2日
發(fā)明者宋宗明, 韓亮, 趙紅麗, 洪成龍, 岳立廣, 劉雙軍, 趙麗紅, 錢依群, 惠連, 王曉宏, 趙建, 郝富勇, 王偉 申請人:長春生物制品研究所