專利名稱：抗體抗齲制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牙科用的制品，具體涉及口腔抗齲的生物制品。
背景技術(shù)：
長期以來，國內(nèi)外以氟化物作為主要的防齲劑，但隨著廣泛的應(yīng)用，也暴露出氟化物的一些問題。據(jù)有關(guān)部門調(diào)查表明氟化物在水中即使微量也可能與有機物結(jié)合形成三鹵甲烷。三鹵甲烷是一種具有基因毒性的致癌物；氟化物的長期應(yīng)用，會產(chǎn)生耐氟菌株，該菌株不僅抗氟，且仍然可以致齲，尤其當(dāng)它存在于混合菌斑時，致齲能力更強。
鑒于以上存在的問題，各國學(xué)者們都致力于尋找新的、更好的，從根本上消除致齲病原體的防齲制劑的研究。國外一些科學(xué)家先后發(fā)現(xiàn)和證實了變形鏈球菌是主要的致齲病原體。由此，不少學(xué)者從免疫學(xué)的角度，針對如何從根本上防齲做了大量的研究，并取得了重大的成果。研究表明，主動免疫和被動免疫防齲均是有效技術(shù)。但由于主動免疫疫苗在人體組織內(nèi)可能產(chǎn)生其它不利于人體的反應(yīng)，故主動免疫尚未在人類中開展應(yīng)用。而被動免疫是口腔內(nèi)直接輸入抗變鏈球菌抗體(免疫球蛋白)，從而達到防齲的目的，避免了主動免疫所存在的問題，因此，成為當(dāng)今防齲研究的熱點。目前，應(yīng)用于實踐中的主要是抗齲牙雞蛋黃抗體(anti-DC IgY)?？过x牙IgY可明顯地抑制變鏈菌菌體酶的活性，制備出的抗齲牙IgY效價可達320，且被證明安全無毒；還由于抗齲牙IgY接觸致齲菌后便與菌體結(jié)合而使致齲菌失活，從而可以達到標(biāo)本兼治的目的。
然而，盡管抗齲牙IgY可明顯地抑制變鏈菌菌體酶的活性，但仍難達到現(xiàn)在廣泛使用的氟化物等化學(xué)防齲制劑的直接效果。因此，如何增強應(yīng)用抗體抑制致齲菌的效果，則是重要的需要研究解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種具有非常明顯的抑制牙菌斑中的變鏈菌的生長，還能明顯抑制一些重要牙周病原菌的活性，不僅具有很好的防齲作用，而且可以防止其它口腔疾病的抗體抗齲制劑。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為抗體抗齲制劑由用口腔致齲的幾種變形鏈球菌菌株混合培養(yǎng)后經(jīng)家兔免疫制備的抗血清與水楊酸、薄荷醇、沒食子酸中的一種或一種以上的增效劑組成；四種組分組合時以抗體效價640、水楊酸0.138g/ml、薄荷醇0.01g/ml、沒食子酸0.047g/ml濃度的溶液為母液，經(jīng)稀釋X倍后混合，各組分的濃度稀釋范圍為抗血清20～80X；水楊酸10～80X；薄荷醇4～40X；沒食子酸1～8X；抗齲制劑的四種組分組合時，抗體效價提高，抗血清的稀釋倍數(shù)增加，組分的濃度范圍擴大。
下面進一步詳述本發(fā)明通過培養(yǎng)指示菌，觀察指示菌菌落狀態(tài)和生長變化，制備指示菌抗血清，測定指示菌抗血清、水楊酸、薄荷醇和沒食子酸對指示菌生長的抑制作用，測定抑菌圈大小和最低抑菌濃度。通過正交試驗設(shè)計，將指示菌抗血清、水楊酸、薄荷醇及沒食子酸按一定濃度一定比例分別進行組合后發(fā)現(xiàn)對抑制指示菌生長具有明顯的增效作用。
一、抗血清(抗體)的制備1、制備材料1.1、菌種菌種來源從四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室購得。
菌種名稱及編號變形鏈球菌(Streptococcus Porteus)S.mulans AHT，S.mulansBHT，S.mulans MT8148。菌種由試驗室凍干保存。(以下簡稱指示菌)。
1.2、培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨1％，瓊脂1.6％，pH 7.0，121℃滅菌20min。
液體培養(yǎng)基葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨1％，pH 7.0，121℃滅菌20min。
性能測定培養(yǎng)基葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨1％，pH 7.0。在培養(yǎng)液中加入數(shù)滴1.6％溴甲酚紫水溶液呈紫色。分裝試管約10ml，并將杜氏發(fā)酵管倒置于培養(yǎng)液中，121℃滅菌20min。
2、菌種的增殖培養(yǎng)和活性測定2.1、指示菌的培養(yǎng)2.1.1、增殖培養(yǎng)挑取少量凍干的混合指示菌接入液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)72小時。當(dāng)培養(yǎng)液混濁，液面無膜，而振動后有絹絲樣的波動物時，接入另一新鮮液體培養(yǎng)基中，接種量20％-30％，繼續(xù)培養(yǎng)72h。
2.1.2、稀釋培養(yǎng)吸取增殖液1ml加入9ml無菌水中，依次稀釋至10-6，分別取不同稀釋度菌液1ml于培養(yǎng)皿中，然后加入融化并冷卻至45℃左右的固體培養(yǎng)基10-15ml，搖勻，待凝固后再加入10ml培養(yǎng)基，搖勻，制成含菌的雙層平板，于37℃培養(yǎng)2-5天。
2.1.3、活性測定選擇具有透明圈的白色小型菌落，接入性能測定培養(yǎng)基內(nèi)，然后補充培養(yǎng)基距管口2cm處，密封管口，37℃培養(yǎng)2-3天，觀察培養(yǎng)液顏色的變化。當(dāng)所挑指示菌與同型乳酸發(fā)酵時，由于產(chǎn)生乳酸，培養(yǎng)基顏色由紫色變?yōu)辄S色；若所挑菌株與異型發(fā)酵時，不僅培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，而且由于產(chǎn)氣，在杜氏管內(nèi)充滿氣體。
2.1.4、菌體的保存將增殖培養(yǎng)后的菌液經(jīng)12000r/min離心4min，去上清液，0.9％生理鹽水沖洗，菌體放入4℃冰箱保存。
3、制備抗血清3.1、抗原的制備挑取培養(yǎng)好的指示菌與PBS磷酸緩沖液混勻，配制成濃度為1mg/ml的菌懸液，取菌懸液2ml與完全弗氏佐劑混合乳化(菌懸液∶完全弗氏佐劑＝1∶1)，充分混合后備用。
3.2、菌體免疫免疫前從家兔耳靜脈采集約3ul血液，作為對照血清。
用指示菌抗原做家兔免疫的注射程序如下表1

3.3、采血注射最后一次后采試血約3ml，當(dāng)試血效價達到1∶500以上，則可心臟采全血，否則要加強注射1-2次。
3.4、抗血清的分離保存從免疫家兔心臟采集的血液經(jīng)室溫或37℃靜置后置于冰箱中過夜，讓血清充分析出，必要時經(jīng)3000r/min離心10min，PBS洗滌2次，按1∶100的比例加入1％的硫柳汞，分裝入青霉素瓶，置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.5、抗血清的效價測定3.5.1、抗血清稀釋按表2兩倍稀釋法稀釋抗血清表2稀釋方法


3.5.2、抗原稀釋將保存的指示菌抗原用生理鹽水稀釋，使其相當(dāng)于麥?zhǔn)媳葷峁艿?管的濃度。
3.5.3、效價測定分別在11支血清管中加入0.5ml指示菌抗原稀釋液，抗原與等量的抗血清均勻混合，置37℃水浴鍋中孵育2～4小時，按下述判定標(biāo)準(zhǔn)測定效價++++100％凝集(完全凝集，上層變清)+++約75％凝集(絕大部分凝集，上層略渾)++約50％凝集(部分凝集，上層較渾)+約25％凝集(很少部分凝集，上層渾濁)-無凝集(液體渾濁)以出現(xiàn)“++”反應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)為抗血清的效價。經(jīng)測定，指示菌抗血清的效價為640。
3.6、抗血清抑制指示菌生長測定3.6.1、最佳菌濃度的篩選挑取指示菌菌體0.5000g，稀釋至5ml生理鹽水中，濃度為0.1g/ml，備用。取10支干凈已滅菌的試管，依次稀釋成10、20、40、80、160、320、640、1280、2560、5120倍共11個濃度梯度。培養(yǎng)基滅菌，倒平板，冷卻，每皿分別接種不同濃度的指示菌稀釋液50ul，各3個重復(fù)，37℃溫箱培養(yǎng)18h，觀察實驗結(jié)果。
通過比較，以第10管濃度菌液的指示菌菌落分布均勻，密度一致，生長狀況良好，最適合做抑菌實驗。因此，以該濃度作為抑菌實驗濃度，備用。菌濁度測定，配制真菌混懸液，以生理鹽水為空白對照，721型分光光度計測定菌濃度，波長530nm，測定第10管菌液吸光度，OD420值為0.33。
3.6.2、抑菌試驗采用牛津杯法測定抑菌圈的大小。
將抗血清依次稀釋成10、20、40、80、100、200、400、800、1000、1200倍共10個濃度梯度。培養(yǎng)基滅菌，倒平板，冷卻，每皿涂布指示菌液50ul，4個重復(fù)，吸取200ul抗血清加入至涂布指示菌液的培養(yǎng)皿中，37℃溫箱培養(yǎng)18h，結(jié)果見表4。
表4抗血清抑菌效果

效價為640的抗血清的20～80X稀釋液對指示菌有抑制作用，其中以40X的生理鹽水稀釋液的抑菌效果最佳。
二、增效劑的配制與抑菌效果測定1、水楊酸水楊酸(salicylic acid)，即鄰羥基苯甲酸，是植物的一種次生代謝產(chǎn)物，它廣泛存在于植物界，在生物體內(nèi)除以游離形式和葡萄糖苷形式存在外還可以以水楊酸甲酯的形式釋放到空氣中。水楊酸具有多種生理調(diào)節(jié)作用，最典型的生理作用是誘導(dǎo)生物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性，是生物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性的必需因子。許多實驗證明SA是重要的系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic acquired resistance，SAR)的內(nèi)源信號分子。
1.1、配制水楊酸，由北京華美生物工程公司購入。稱取水楊酸(分析純)6.9000g，充分研磨成細末，按百分比濃度溶入50％乙醇溶液中，定容至50ml，濃度為1M，作為母液備用。依次稀釋10、20、40、80、100、200、400、600、800、1000、1200共11個濃度梯度。
1.2、抑菌效果測定培養(yǎng)基滅菌，倒平板，冷卻，每皿涂布指示菌液50ul，4個重復(fù)，吸取200ul水楊酸到涂布指示菌液的培養(yǎng)皿中。以50％乙醇作空白對照，4個重復(fù)，37℃溫箱培養(yǎng)18小時。測定結(jié)果見表5。
表5抑菌效果

50％乙醇空白對照，4個重復(fù)，均不產(chǎn)生抑菌圈，說明50％乙醇不抑制指示菌的生長，沒有抑菌作用，不干擾測定水楊酸對指示菌的作用效果；從表5中可以看出水楊酸在10～80X的50％乙醇稀釋度范圍有抑菌效果，以10X的抑菌效果最佳。
2、薄荷醇薄荷醇也是植物的一種次生代謝產(chǎn)物，人工為龍腦香科常綠喬木龍腦香(Dryobalanops Arornatica Gaertnerf)樹脂的加工品，或菊科植物(Blumea Balsamifera)的提取物，或以樟腦、松節(jié)油為原料經(jīng)化學(xué)合成的加工制成品。薄荷醇屬揮發(fā)性藥物，在有機化學(xué)中稱為莰醇，難溶于水，可溶于含水乙醇中，由兩個異戊二烯單位的化合物組成，屬于多烯族化合物。薄荷醇是從含揮發(fā)油類植物中提取，亦屬于醇類。
牟氏的體外抗菌試驗表明薄荷醇可抑制或殺滅金黃色葡萄球菌、乙型溶菌性鏈球菌、綠色鏈球菌、大腸桿菌等5種常見細菌，其最低抑菌濃度(MIC)為1.0％-2.0％，最低殺菌濃度(MFC)為1.5％-2.0％，為接觸抑菌。其主要成分龍腦與異龍腦的抗菌效果一致，兩組分間既無拮抗也無協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)其最低殺菌濃度(MFC)為10％。日前薄荷醇在臨床上的應(yīng)用極為廣泛，特別是在心腦血管疾病中的應(yīng)用尤引人關(guān)注。
2.1、配制薄荷醇，(龍腦59.9％，異龍腦37.5％)，由北京華美生物工程公司購入。稱取薄荷醇(分析純)1.0000g，充分研磨成細末，按百分比濃度溶入45％乙醇溶液中，定容至100ml，作為母液備用。用45％乙醇依次稀釋成0、2、4、8、10、20、40、80、160、320、640共11個濃度梯度。
2.2、抑菌效果測定培養(yǎng)基滅菌，倒平板，冷卻，每皿涂布指示菌液50ul，4個重復(fù)，移取200ul薄荷醇液入培養(yǎng)皿中。45％乙醇作空白對照，4個重復(fù)，37℃溫箱培養(yǎng)18小時。測定結(jié)果見表6。
表6抑菌效果

45％乙醇空白對照，4個重復(fù)均不產(chǎn)生抑菌圈，說明45％乙醇不抑制指示菌的生長，沒有抑菌作用，不干擾測定薄荷醇對指示菌的作用效果。表6的測定結(jié)果說明薄荷醇在4～40X的45％乙醇稀釋度范圍有抑菌效果，以8X的抑菌效果最佳。
3、沒食子酸沒食子酸(Gallic acid)可以從五倍子、刺云實豆莢等植物中提取而得。沒食子酸對蛋白質(zhì)有沉淀作用，與皮膚、粘膜的潰瘍面接觸后，其組織蛋白質(zhì)即被凝固，造成一層被膜而呈收斂作用；腺細胞的蛋白質(zhì)被凝固引起分泌，產(chǎn)生粘膜干燥，神經(jīng)末梢蛋白質(zhì)的沉淀，可呈微弱的局部麻醉現(xiàn)象。沒食子酸可與若干金屬、生物堿甙類形成不溶解化合物，因而用作解毒劑。沒食子對小腸有收斂作用，可減輕腸道炎癥，制止腹瀉。此外，對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、傷寒、副傷寒、痢疾、炭疽、白喉、綠膿桿菌均有抑制作用。
3.1、配制沒食子酸，由北京華美生物工程公司購入。稱取沒食子酸4.7035g，按百分比濃度溶入蒸餾水中，定容至100ml，濃度為0.25M，作為母液備用。依次稀釋0、2、4、8、10、20、40、60、80、100共10個濃度梯發(fā)。
3.2、抑菌效果測定培養(yǎng)基滅菌，倒平板，冷卻，每皿涂布指示菌液50ul，3個重復(fù)，吸取200ul沒食子酸液至涂布指示菌的培養(yǎng)皿中，37℃溫箱培養(yǎng)18小時。測定結(jié)果見表7。
表7、抑菌效果

從表7的測定結(jié)果看出，母液及2～8X的稀釋液均有抑菌效果。
三、抗血清與增效劑不同組合的增效測定1、正交試驗考察的因素及水平為探討抗血清與水楊酸、薄荷醇、沒食子酸不同組合是否具有增效作用，以抑菌圈的大小為評價指標(biāo)，進行正交試驗?？疾觳煌瑵舛鹊乃畻钏帷⒈『纱?、沒食子酸和抗血清4種主要因素對抑制指示菌生長的抑菌圈大小的影響，試驗通過四因素、四水平組合正交實驗選擇抑制指示菌生長的濃度組合。
表8正交試驗考察的因素及水平

以上母液的濃度為血清效價640，水揚酸0.138g/ml，薄荷醇0.01g/ml，沒食子酸0.047g/ml?！盭”為稀釋倍數(shù)。
2、正交試驗方法與結(jié)果以血清20-80X，薄荷醇4-40X，水揚酸10-80X，沒食子酸1-8X，為區(qū)間，每個物質(zhì)分別選用四個以上濃度進行組合進行正交實驗。
按照上列的組合逐個依次配制，分別吸取每種物質(zhì)1ml混合于大試管中，充分混勻，移取混合液1ml到eppendorf管中，以測定各組合、各濃度的抑菌效果。
培養(yǎng)基滅菌，倒平板，冷卻，每皿涂乳布指示菌液50ul.依次從eppendorf管中吸取已配制好的混合液200ul放置到牛津杯中，每處理三個重復(fù)，37℃培養(yǎng)18h后，觀察不同因素水平組合的抑菌效果(見表9)。
表9.1.一種增效劑與抗血清正交試驗結(jié)果(三重復(fù)平均值)

表9.2.一種增效劑與抗血清正交試驗結(jié)果(三重復(fù)平均值)

表9.3.一種增效劑與抗血清正交試驗結(jié)果(三重復(fù)平均值)

表9.4.二種增效劑與抗血清交試驗結(jié)果(三重復(fù)平均值)


表9.5.二種增效劑與抗血清正交試驗結(jié)果(三重復(fù)平均值)

表9.6.二種增效劑與抗血清正交試驗結(jié)果(三重復(fù)平均值)

表9.7.三種增效劑與抗血清正交試驗結(jié)果(三重復(fù)平均值)

以上”X”為每種物質(zhì)的母液稀釋倍數(shù)。
3、增效結(jié)果分析從表9.1～9.7可看出3.1使用一種增效劑的抗血清其抑菌圈最高最低值的平均值分別比單一抗血清的最高值11.76高3.12和5.79[見表9.1、9.2、9.3，血清加入水揚酸(9.98+19.79)/2＝14.88；血清加入沒食子酸(11.67+23.43)/2＝17.55]；總平均值(血清加入水揚酸12.98，血清加入沒食子酸16.88，血清加入薄荷醇11.12)以及抗血清加入薄荷醇的最高最低平均值(9.95+12.51)/2＝11.23均高于抗血清的20X，40X，80X三種濃度的平均值9.74(見表6)；使用一種增效劑的抗血清的最低值9.95高于單獨使用抗血清的最低值9.34。
3.2、使用二種增效劑的抗血清其抑菌圈最高最低值的平均值比單獨使用抗血清的抑菌圈最大值11.76分別高2.30，3.24，3.51[見表9.4、9.5、9.6血清加入薄荷醇和水揚酸(8.11+20.01)/2＝14.06，血清加入沒食子酸和薄荷醇(10.11+19.89)/2＝15.00，血清加入沒食子酸和水揚酸(11.67+18.88)/2＝15.27]；總平均值比單獨使用血清的最高值11.76分別高0.53，1.87，3.96(血清加入水揚酸和薄荷醇12.29，血清加入沒食子酸和薄荷醇13.63，血清加入沒食子酸和水揚酸15.72)。
3.3、使用三種增效劑的抗血清其抑菌圈最高最低值的平均值比單獨使用血清的抑菌圈最大值11.76高5.40[見表9.7血清加水揚酸加沒食子酸加薄荷醇(10.78+23.54)/2＝17.16]；總平均值比單獨使用抗血清的最高值11.76高4.03(血清加水揚酸加沒食子酸加薄荷醇15.79)；四種物質(zhì)的最低值10.78高于單獨使用抗血清的最低值9.34。
上述結(jié)果說明一種或一種以上的增效劑加入抗血清中的增效作用明顯。當(dāng)抗體效價提高，抗血清的稀釋范圍擴大。
四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)工程教育重點實驗室對抗體抗齲制劑進行抗菌活性檢測，檢測采用NCCLs推薦的厭氧菌藥物敏感試驗肉湯稀釋法，測定抗體抗齲制劑對口腔最常見和最主要的致齲菌變形鏈球菌和粘性放線菌，以及重要牙周病原菌牙齦卟啉單細胞菌的抗菌活性，結(jié)果顯示檢品對三種實驗菌株均有明顯的抗菌活性。
表10檢品對三株實驗菌的MIC和MBC(g/L)

以上結(jié)果表明，抗體抗齲制劑具有非常明顯的抑制牙菌斑中的變鏈菌的生長，還能明顯抑制一些重要牙周病原菌的活性，不僅具有很好的防齲作用，而且可以防止其它口腔疾病。
根據(jù)湖南省疾病控制中心對“抗體抗齲制劑”產(chǎn)品進行急毒性試驗結(jié)果表明，對昆明種雌雄小鼠的急性經(jīng)口LD50大于20000mg/Kg·bw，屬實際無毒物；24小時、48小時、72小時對白色家兔的急性眼刺激性反應(yīng)結(jié)果為角膜、紅膜、結(jié)膜充血和結(jié)膜水腫積分均值均為0，屬無刺激性。
因此抗體抗齲制劑可用于生產(chǎn)防治齲齒的口腔藥物，兒童防齲的口腔疫苗，還可用于口腔保健產(chǎn)品以及添加至人們?nèi)粘Ｓ闷啡缪栏唷⑺钥谝?、口香糖等中用于防齲及防口腔疾病。
具體實施例方式用4X沒食子酸加入到80X血清中，用蒸餾水稀釋600-800倍后加入牙膏中制成牙膏，或制成漱口液等可以有效地防止齲病及牙周炎。
用10X水揚酸及20X薄荷醇混合制成增效劑加入到80X血清中，用蒸餾水稀釋500倍后可制成專用的抗齲噴劑保健用品，可專門用于兒童抗齲牙保健。
用2X沒食子酸、10X水揚酸與8X薄荷醇混合制成增效劑加入到80X血清中，用蒸餾水稀釋200倍可制成防齲口腔藥品噴劑。制成的藥品噴于口腔患處不僅能有效地防止齲病，而且還對牙周炎有較好的治療作用。
權(quán)利要求
1.一種抗體抗齲制劑，其特征在于抗齲制劑由用口腔致齲的幾種變形鏈球菌菌株混合培養(yǎng)后經(jīng)家兔免疫制備的抗血清與水楊酸、薄荷醇、沒食子酸中的一種或一種以上的增效劑組成。
2.按權(quán)利要求1所述的抗體抗齲制劑，其特征在于抗齲制劑的四種組分組合時以抗體效價640、水楊酸0.138g/ml、薄荷醇0.01g/ml、沒食子酸0.047g/ml濃度的溶液為母液，經(jīng)稀釋X倍后混合，各組分的濃度稀釋范圍為抗血清20～80X水楊酸10～80X薄荷醇4～40X沒食子酸 1～8X。
3.按權(quán)利要求2所述的抗體抗齲制劑，其特征在于抗齲制劑的四種組分組合時，抗體效價提高，抗血清的稀釋倍數(shù)增加，組分的濃度范圍擴大。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于口腔抗齲的生物制品。本發(fā)明由用口腔致齲的幾種變形鏈球菌菌株混合培養(yǎng)后經(jīng)家兔免疫制備的抗血清與水楊酸、薄荷醇、沒食子酸中的一種或一種以上增效劑組成，各組分的母液經(jīng)稀釋后組合的濃度稀釋范圍為抗血清20～80X、水楊酸10～80X、薄荷醇4～40X、沒食子酸1～8X；本發(fā)明的各種組合的抑菌效果均高于單一抗血清；經(jīng)檢測，抗體抗齲制劑對口腔最常見和最主要的致齲菌均有明顯的抗菌活性，而且無毒性，無刺激性，因而可用于生產(chǎn)防治齲齒的口腔藥物，口腔疫苗以及添加到日常生活用品如牙膏、漱口液、口香糖中防齲及預(yù)防其他口腔疾病。
文檔編號A61P1/00GK1660422SQ200410047128
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月31日
發(fā)明者邱德文, 沈建奇, 粟鑄 申請人:長沙德文生物科技開發(fā)有限公司