專利名稱：高濃度抗體和蛋白制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特別適合于皮下施用的高度濃縮的抗體制劑。本發(fā)明進一步的提供穩(wěn)定的、高度濃縮的(例如≥100mg/ml蛋白質(zhì))液體制劑。
相關(guān)技術(shù)的說明對高度濃縮的液體抗體制劑存在著顯著的需求。然而，高度濃縮的蛋白制劑遇到了幾個難題。一個難題是由于形成微粒(particulate)而導致的不穩(wěn)定性。用重構(gòu)(reconstituted)的凍干制品來生產(chǎn)液體制劑，已經(jīng)通過使用表面活性劑(例如，聚山梨醇酯)解決了這個難題，但是表面活性劑不適于液體制劑，因為表面活性劑為進一步的處理帶來了困難。此外，表面活性劑也不能減少增加了的粘性，增加的粘性是抗體的高分子性質(zhì)帶來的大量分子間相互作用導致的結(jié)果。
盡管已經(jīng)顯示出表面活性劑能顯著地減少蛋白微粒形成的程度，但它們不能解決增加了的粘性的難題，增加的粘性給濃縮的抗體制劑的操作和施用造成了困難。由于抗體的高分子性質(zhì)和潛在的分子間相互作用，抗體在高濃度時傾向于形成粘性溶液。此外，藥學上可接受的糖常常作為穩(wěn)定劑大量使用。這樣的糖可以增強分子間相互作用，從而增加制劑的粘性。高粘性制劑很難制造、難以吸入到注射器中并且難以皮下地注射。在操作粘性制劑中使用壓力引起過多的泡沫，泡沫會導致活性生物產(chǎn)品的變性和失活。這個難題還缺乏令人滿意的解決方案。
雖然現(xiàn)有技術(shù)指出了能適當?shù)貞?yīng)用于制造藥物制劑的賦形劑的大量實例，但幾乎沒有蛋白質(zhì)被成功地配制成超過100mg/ml的濃度，也幾乎沒有人描述過將蛋白質(zhì)配制成超過100mg/ml的濃度的技術(shù)。
申請人發(fā)現(xiàn)精氨酸，特別是精氨酸-HCl特別適合于高度濃縮的液體蛋白或抗體制劑。
在1997年2月13日公開的PCT出版物WO97/04801中公開了穩(wěn)定的等滲凍干蛋白制劑，其全部公開的內(nèi)容在此引入本文作參考。該公開的凍干制劑可以被重構(gòu)產(chǎn)生高蛋白濃度的液體制劑而沒有穩(wěn)定性的明顯損失。然而，與重構(gòu)的制劑的高粘度有關(guān)的潛在問題沒有被解決。已經(jīng)預(yù)先通過添加糖降低了蛋白質(zhì)聚集，但是這樣做會顯著地增加粘性和滲透壓，從而導致不能實施加工和使用。
申請人的PCT申請、2002年4月18日公開的WO02/30463公開了高蛋白濃度但低粘度的制劑，是通過(1)低pH值(約4.0到5.3)；(2)高pH值(約6.5到12.0)或(3)通過添加鹽或緩沖液來增加制劑的總離子強度而取得的。然而，當增加的離子強度降低制劑的粘性時(例如用NaCl)，其也可導致溶液混濁度增加，這常與蛋白粒子的形成(例如，聚集)有關(guān)。因此最佳的高濃度蛋白制劑必須克服穩(wěn)定性、粘性、滲透壓和混濁性的難題。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及穩(wěn)定的并且是低粘度和低混濁度的高度濃縮的蛋白或抗體制劑。
特別地，本發(fā)明涉及低混濁度的高度濃縮的抗體制劑，包含蛋白質(zhì)或抗體(100-260mg/ml)、組氨酸(10-100mM)、精氨酸-HCl(50-200mM)和聚山梨醇酯(0.01％-0.1％)，具有5.5-7.0的pH值、50cs或更低的粘度和200mOsm/kg-450mOsm/kg的滲透壓。做為選擇，在制劑中的蛋白或抗體可以在120-260mg/ml、做為選擇150-260mg/ml、做為選擇180-260mg/ml、做為選擇200-260mg/ml的范圍中?；蛘咚鰸B透壓在250mOsm/kg-350mOsm/kg的范圍中。做為選擇，精氨酸-HCl的濃度在100-200mM、或者150-200mM、或者180-200mM的范圍中。
做為選擇，本發(fā)明涉及低混濁度的高度濃縮的抗體制劑，包含抗體(40-150mg/ml)、組氨酸(10-100mM)、糖(例如海藻糖或蔗糖，20-350mM)和聚山梨醇酯(0.01％-0.1％)。
在一個特定的實施方式中，本發(fā)明提供包含高濃度的大分子量蛋白，例如抗體或免疫球蛋白的制劑。抗體可以是，例如，針對特定的預(yù)定抗原的抗體。在一個特定的方面，抗原是IgE(例如，在美國專利6,329,509和WO99/01556中描述的rhuMAbE-25和rhuMAbE-26)。做為選擇，抗IgE抗體可以是在Corne等，J.Clin.Invest.99(5)879-887(1997)、WO92/17207中描述的CGP-5101(Hu-901)，和ATTC保藏號No.BRL-10706和11130、11131、11132、11133。做為選擇，抗原可包括CD蛋白CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34和CD40；HER受體家族的成員例如EGF受體，HER2、HER3或HER4受體；2C4、4D5、PSCA、LDP-2、細胞粘附分子例如LFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和包括其α-和β-亞基的αv/β3整聯(lián)蛋白(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗體)；生長因子例如VEGF；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體、CTLA-4和蛋白C。
本發(fā)明的制劑可以是藥物制劑。在一個特定的方面，所述制劑是皮下給藥的。
在又一個實施方式中，本發(fā)明提供對可用配制的蛋白或抗體醫(yī)治的疾病的醫(yī)治、預(yù)防或治療方法，包括施用此處公開的包含治療有效量的蛋白或抗體的制劑。這種制劑對皮下施用是特別有用的。一方面，所述疾病是IgE介導的疾病。更進一步地，所述IgE介導的疾病是過敏性鼻炎、哮喘(例如，過敏性哮喘和非過敏性哮喘)、特應(yīng)性皮炎、過敏性胃腸病、超敏反應(yīng)(例如，過敏反應(yīng)、蕁麻疹、食物過敏等)、過敏性支氣管肺曲霉病、寄生蟲疾病、間質(zhì)性膀胱炎、高IgE綜合征、共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥、Wiskott-Aldrich綜合征、胸腺淋巴發(fā)育不全、IgE骨髓瘤和移植物抗宿主反應(yīng)(graft-versus-hostreaction)。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種制品，包括裝有此處公開的制劑的容器。一方面，所述制品是預(yù)填充的注射器。另一方面，所述預(yù)填充的注射器進一步包含在注射裝置中。另一方面，所述注射裝置是自動注射器(auto-injector)。


附圖1.胃蛋白酶消化的抗IgE單克隆抗體的疏水作用層析。在不同的pH值和緩沖液中配制樣品(●)20mM醋酸鹽，(△)20mM琥珀酸鹽，(▲)20mM Na2HPO4，(Λ)20mM K2PO4和(*)20mM Tris緩沖液。樣品在30℃保存6個月。
附圖2.在40℃保存6個月的抗IgE單克隆抗體的大小排阻層析。在不同的pH值和緩沖液中配制樣品(■)20mM谷氨酸鹽，(●)20mM醋酸鹽，(△)20mM琥珀酸鹽，(□)20mM組氨酸，(▲)20mM Na2HPO4，()20mMK2PO4和(*)20mM Tris緩沖液。
附圖3.在30℃保存6個月的抗IgE單克隆抗體的活性。在不同的pH值和緩沖液中配制樣品(●)20mM醋酸鹽，(△)20mM琥珀酸鹽，(□)20mM組氨酸，(▲)20mM Na2HPO4，()20mM K2PO4和(*)20mM Tris緩沖液。
附圖4.聚山梨醇酯20對受壓的(stressed)抗IgE單克隆抗體的混濁度的影響。樣品包含100mg/ml抗體、20mM琥珀酸鹽、192mM海藻糖和各個量的聚山梨醇酯20，pH6.0。聚山梨醇酯濃度是(■)0，(▲)0.01％，(●)0.02％和(△)0.05％。
附圖5.抗IgE單克隆抗體在～150mg/ml與不同的賦形劑(▲)CaCl2，())MgCl2和(△)精氨酸-HCl的混濁度。
附圖6.抗IgE單克隆抗體在～150mg/ml與各種賦形劑的混濁度。樣品保存在(▲)-70℃，(■)2-8℃，(△)15℃，(□)30℃和())40℃。
附圖7.木瓜蛋白酶消化的抗IgE單克隆抗體的疏水作用層析分析。樣品以～150mg/ml與各種賦形劑配制，保存在()-70℃，(■)2-8℃，(▲)15℃，(△)30℃和(□)40℃。
附圖8.抗IgE單克隆抗體以～150mg/ml在(■)200mM精氨酸-HCl、23mM組氨酸、pH6.0，(▲)182mM精氨酸-HCl、20mM組氨酸、pH6.0，(●)182mM精氨酸-HCl、20mM組氨酸、91mM蔗糖、pH6.0，(□)50mM MgCl2、27mg/ml海藻糖、0.01％醋酸鹽，(△)50mM MgCl2、30mM MgAc2、0.01％醋酸鹽，和(○)50mM MgCl2、45mM MgAc2、0.01％醋酸鹽中的大小排阻層祈。樣品在30℃保存6個月。
附圖9.木瓜蛋白酶消化的抗IgE單克隆抗體的疏水作用層析分析。顯示的樣品配制在(■)200mM精氨酸-HCl、23mM組氨酸，(▲)182mM精氨酸-HCl、20mM組氨酸，(●)182mM精氨酸-HCl、20mM組氨酸、91mM蔗糖，(□)50mM MgCl2、27mg/ml海藻糖、0.01％醋酸鹽，(△)50mM MgCl2、30mM MgAc2、0.01％醋酸鹽，和(○)50mM MgCl2、45mM MgAc2、0.01％醋酸鹽之中。樣品在30℃保存6個月。
附圖10.顯示了抗IgE抗體E25、E26和Hu-901的可變鏈和恒定鏈的全長序列的比較。Hu-901的CDR區(qū)用下劃線表示。對于E25和E26，Chotbia定義的CDR區(qū)用黑體字表示，而Kabat定義的CDR區(qū)用方框畫出。附圖10A顯示了E25、E26和Hu-901的輕鏈序列(SEQ ID NO1-3)，而附圖10B顯示了E25、E26和Hu-901的重鏈序列(SEQ ID NO4-6)。
優(yōu)選實施方式的詳細說明I.定義“蛋白質(zhì)”是指氨基酸序列，鏈長度足以產(chǎn)生高水平的三級結(jié)構(gòu)和/或四級結(jié)構(gòu)。這是與“多肽”或其它沒有這種結(jié)構(gòu)的小分子量藥物的區(qū)別。通常，這里的蛋白質(zhì)的分子量至少約為15-20kD，最好至少約為20kD。
這里定義所包括的蛋白質(zhì)的例子有哺乳動物蛋白質(zhì)，例如，生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促濾泡激素；降鈣素；促黃體素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、組織型因子和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白質(zhì)C；心鈉素；肺表面活性劑；纖維蛋白溶解酶原激酶，如尿激酶或組織型纖溶酶原激酶(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；趨化因子RANTES(活化后可調(diào)節(jié)的通常由T細胞表達和分泌)；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；穆勒氏抑制物；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原；鼠促性腺素伴隨肽；脫氧核糖核酸酶；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；整聯(lián)蛋白；蛋白質(zhì)A或D；類風濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)性因子如骨衍神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神經(jīng)生長因子如NGN-β；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子如aFGF和bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白質(zhì)；CD蛋白質(zhì)，如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促紅細胞生長素(EPO)；血小板生長素(TPO)；成骨誘導因子(osteoinductive factors)；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素，如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細胞介素(IL)，如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T細胞受體；膜表面蛋白質(zhì)；衰變加速因子(DAF)；病毒性抗原，例如AIDS的部分包被；轉(zhuǎn)運蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；免疫粘附素；抗體；和任何上述多肽的生物活性片段或變異體。
制劑的蛋白質(zhì)最好是基本上純凈，最好基本上是均相的(即沒有雜蛋白等)?！盎旧霞儍簟钡牡鞍踪|(zhì)指的是組分包含至少約90％(重量)(以組分的總重量計)的蛋白質(zhì)，較佳的為至少約95％(重量)。“基本上均相”的蛋白質(zhì)指的是以組分的總重量計，組分包含至少99％(重量)的蛋白質(zhì)。
在一些例子中，蛋白質(zhì)是抗體。例如抗體可與上述的任一分子結(jié)合。本發(fā)明中抗體典型的靶分子包括CD蛋白質(zhì)，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20，CD34和CD40；HER受體家族的成員，例如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；2c4、4D5、PSCA、LDP-2；細胞粘附分子，如LFA-1、Mol、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整聯(lián)蛋白，包括它的α或β亞單元(如，抗-CD11a、抗-CD18或抗CD11b抗體)；生長因子如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受體；多脂性(OB)受體；mpl受體；CTLA-4和蛋白C等。
其中使用的術(shù)語“抗體”包括單克隆抗體(包括具有免疫球蛋白Fc區(qū)的全長抗體)、具有多表位特異性的抗體組合物、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體、雙功能抗體(diabody)，和單鏈分子，以及抗體片段(例如，F(xiàn)ab、F(ab′)2和Fv)。術(shù)語“免疫球蛋白”(Ig)在此與“抗體”可互換地使用。
基本的4鏈抗體單位是由兩個同一的輕(L)鏈和兩個同一的重(H)鏈組成的異四聚體糖蛋白。IgM抗體由5個基本的異四聚體單位與額外的稱為J鏈的多肽組成，包含10個抗原結(jié)合位點，而IgA抗體包含2-5個基本的4鏈單位，基本的4鏈單位能與J鏈共同聚合形成多價的集聚物。對于IgG來說，4鏈單元一般約150,000道爾頓。每個L鏈通過一個共價二硫鍵與H鏈相連，而兩個H鏈取決于H鏈同種型通過一個或多個二硫鍵相互連接。每個H和L鏈也具有有規(guī)則地間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每個H鏈在N-末端具有可變區(qū)(VH)，對于每個α和γ鏈繼之以三個恒定區(qū)(CH)、對于μ和ε同種型繼之以四個CH區(qū)。每個L鏈在N-末端具有可變區(qū)(VL)，在另一個末端繼之以恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)相對應(yīng)(align)，而輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)相對應(yīng)。特殊的氨基酸殘基被認為在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成界面。VH和VL的配對一同形成了單一抗原結(jié)合位點。對于不同種類的抗體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，參見例如，Basic and Clinical Immunology，8th Edition，Daniel P.Sties，Abba I.Terr and Tristram G Parsolw(eds)，Appleton & Lange，Norwalk，CT，1994，第71頁和第6章。
來自任何脊椎動物物種的L鏈可以根據(jù)它們恒定區(qū)的氨基酸序列被分派為兩個明顯不同類型中的一種，稱為kappa和lambda。取決于它們的重鏈(CH)恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被分派為不同的種類或同種型。有五類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分別具有被命名為α、δ、ε、γ和μ的重鏈。根據(jù)CH的序列和功能方面的相對小的差異，γ和μ類被進一步分成亞類，例如，人類表達以下的亞類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
術(shù)語“可變”是指在抗體之間可變區(qū)的某些片段在序列上有很大差異的事實。V區(qū)介導抗原結(jié)合并確定了特定抗體對其特定抗原的特異性。然而，可變性在整個可變區(qū)上不是均勻分布的。而是，V區(qū)由被幾個較短區(qū)域分隔的相對不變的區(qū)域組成，相對不變的區(qū)域被稱為骨架區(qū)(FR)、約15-30個氨基酸殘基，較短區(qū)域被稱為“高變區(qū)”或有時稱為“互補決定區(qū)”(CDR)，有極度的可變性、每個長度約9-12個氨基酸殘基。每個天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)都包含四個FR，大多采取β-折疊結(jié)構(gòu)，通過三個高變區(qū)連接，高變區(qū)形成環(huán)形連接，有些情況下形成部分β-折疊結(jié)構(gòu)。每個鏈中的高變區(qū)通過FR緊密鄰近地結(jié)合在一起，與來自另一個鏈的高變區(qū)一同，形成抗體的抗原結(jié)合位點(見Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。恒定區(qū)沒有直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是顯示出各種效應(yīng)物功能，例如參與對抗體依賴細胞細胞毒性(ADCC)。
在此使用術(shù)語“超變區(qū)”(也稱為“互補決定區(qū)”或CDR)時，是指位于免疫球蛋白V區(qū)結(jié)構(gòu)域內(nèi)部的抗體氨基酸殘基(通常為三個或四個極度序列可變性的短區(qū)域)，其形成抗原結(jié)合位點，并且是抗原特異性主要決定基。有至少兩種方法來鑒定CDR殘基(1)根據(jù)跨種(cross-species)序列可變性的方法(即，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Instituteof Health，Bethesda，MS 1991))；和(2)根據(jù)抗原抗體復(fù)合物的結(jié)晶研究的方法(Chothia，C.等，J.Mol.Biol.196901-917(1987))。然而，在這個意義上，兩種殘基鑒定技術(shù)判定重疊的區(qū)域，而不是同一的區(qū)域，可以組合它們來判定雜交CDR。
這里所用的術(shù)語“單克隆抗體”指的是從基本上均一的抗體種群中獲得的抗體，即單個抗體包括的種群是相同的，除了少量可能發(fā)生天然的突變。單克隆抗體對單一的抗原位點有高度的特異性。而且，與常規(guī)的(多克隆)抗體制備物，即通常有不同抗體針對不同的決定簇(表位)不同，每個單克隆抗體只針對抗原單一的決定簇。除了特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點是它們是用雜交瘤培育來合成的，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾詞“單克隆”指從基本上均一的抗體種群中獲得的抗體的特征，不應(yīng)被理解為需要任何特殊的方法來生產(chǎn)抗體。例如，本發(fā)明所用的單克隆抗體可用Kohler等人描述的雜交瘤方法(Nature，256495(1975))來制備，或用重組DNA技術(shù)來制備(見美國專利No.4,816,567)?！皢慰寺】贵w”也可用如Clackson等人(Nature，352624-628(1991))和Marks等人(J.Mol.Biol.222581-597(1991))描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離獲得。
在此單克隆抗體特別地包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，在“嵌合”抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分與來源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列同一或同源，而鏈的其余部分與來源于另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列同一或同源，還包括這種抗體的片段，只要它們顯示出期望的生物學活性(美國專利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。在此感興趣的嵌合抗體包括“靈長類化(primitized)”的抗體，其包含來源于非人靈長類動物(例如，Old World Monkey，Ape等)的可變區(qū)抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。
“完整的”抗體是包含抗原結(jié)合位點以及CL和至少重鏈區(qū)CH1、CH2和CH3的抗體。恒定區(qū)可以是天然的序列恒定區(qū)(例如，人類天然序列恒定區(qū))或其氨基酸序列變體。優(yōu)選的，完整的抗體具有一種或多種效應(yīng)器功能。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選的包括完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)和/或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙功能抗體；線性抗體(參見美國專利5,641,870，實施例2；Zapata等，Protein Eng.8(10)1057-1062 )；單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體。
抗體的木瓜蛋白酶消化生產(chǎn)兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，以及殘余的“Fc”片段，其是反映易于結(jié)晶能力的命名。Fab片段由完整的L鏈以及H鏈的可變區(qū)(VH)和一條重鏈的第一個恒定區(qū)(CH1)組成。每個Fab片段對于抗原結(jié)合是單價的，即，它具有單個抗原結(jié)合位點。對抗體進行胃蛋白酶處理產(chǎn)生單個大的F(ab′)2片段，其大略地相應(yīng)于具有不同抗原結(jié)合活性的兩個二硫化物連接的Fab片段，并仍具有交聯(lián)抗原的能力。Fab′片段不同于Fab片段，F(xiàn)ab′在CH1區(qū)的羧基末端具有幾個額外的殘基，包括一個或多個來自抗體絞鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab′-SH在此是指在恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶有游離硫醇基的Fab′。F(ab′)2抗體片段最初作為Fab′片段的成對物而產(chǎn)生，其具有Fab′片段之間的鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學偶聯(lián)也是已知的。
Fc片段包含由二硫化鍵連接的兩個H鏈的羧基末端部分?？贵w的效應(yīng)器功能由Fc區(qū)的序列決定，該區(qū)也是在某些種類的細胞上發(fā)現(xiàn)的Fc受體(FcR)識別的區(qū)域。
“Fv”是含有完整的抗原識別和抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。此片段由緊密地非共價連接的一個重鏈可變區(qū)與一個輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。在這個構(gòu)象中每個可變區(qū)的三個超變區(qū)相互作用，在VH-VL二聚體表面限定一個抗原結(jié)合位點。這六個超變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變區(qū)(或FV上僅含有二個抗原特異性高變區(qū)的那一半)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，但與完整的結(jié)合位點相比其親和力較低。
“單鏈Fv”也可簡寫成“sFv”或“scFv”抗體片段，包括抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域存在于單個多肽鏈上。優(yōu)選Fv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含一個多肽接頭，它能使sFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述見Pluckthun在《單克隆抗體的藥理學》，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，第269-315頁(1994)。
術(shù)語“雙功能抗體”是指小的抗體片段，通過用VH和VL區(qū)之間的短接頭(約5-10殘基)構(gòu)建sFv片段(參見前段)，因而取得鏈間、而不是鏈內(nèi)的V區(qū)對而制得，從而產(chǎn)生二價的片段，即，具有兩個抗原結(jié)合位點的片段。雙特異性雙功能抗體是兩個“交叉”sFv片段的異二聚物，在其中兩個抗體的VH和VL區(qū)存在于不同的多肽鏈上。雙功能抗體在例如EP404,097；WO93/11161；Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448(1993)中有更詳細的描述。
“特異性結(jié)合”或“特異于”特定多肽或特定多肽上的表位的抗體，是與該特定多肽或特定多肽上的表位結(jié)合、基本上不與任何其它多肽或多肽表位結(jié)合的那種抗體。
術(shù)語“固相”描述了無水的基質(zhì)，本發(fā)明的抗體可以附著在上面。此處包括的固相的實例包括那些部分地或全部由玻璃(例如，控制孔隙大小的玻璃)、多糖(例如，瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅樹脂形成的那些固相。在某些實施方式中，取決于具體情況，固相可以包括分析平板的孔；在其它實施方式中，其是純化柱(例如，親和層析柱)。這個術(shù)語還包括完整物品的分開的固相，例如那些在美國專利No.4,275,149中描述的。
非人體來源(如鼠源型)的“人源化”抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或包含從非人源型免疫球蛋白中獲得的最小序列的片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其它與抗原結(jié)合的抗體序列)。人源化抗體的大部分是人源型免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的互補決定區(qū)(CDR)的殘基被非人源型的有所需特異性、親和性和容量的抗體如鼠、大鼠或兔子抗體(供體抗體)的CDR殘基替代。在一些例子中，人源型免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人源型殘基取代。而且，人源化抗體可包括在受體抗體和輸入的CDR或構(gòu)架序列中均沒有的殘基。這些修飾可進一步精修并優(yōu)化抗體的性能。人源化抗體最理想地還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，一般地是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的一部分。有關(guān)詳細情形，參見Jones等，Nature，321522-525(1986)；Reichmann等，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)。
“物種依賴性抗體(species-dependent antibody)”，例如哺乳動物抗人IgE抗體，是對來自第一哺乳動物物種的抗原、與對來自第二哺乳動物物種的該抗原的同系物相比，具有更強的結(jié)合親合性的抗體。通常，物種依賴性抗體“特異性地結(jié)合”人類抗原(即，具有不超過約1×10-7M的結(jié)合親合性(Kd)值，或者不超過1×10-8M，或者不超過1×10-9M)，但對來自第二非人哺乳動物物種的該抗原的同系物的結(jié)合親和性、與其對所述非人抗原的親和性相比，弱至少約50倍、至少約500倍，或至少約1000倍。物種依賴性抗體可以是如上述定義的各種類型的抗體中的任何一種，但優(yōu)選的是人源化或人類抗體。
抗體“效應(yīng)物(器)功能”是指歸因于抗體的Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))、隨抗體同種型變化的那些生物學的活性。抗體效應(yīng)物功能的實例包括C1q結(jié)合和補體依賴性細胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體)的下調(diào)；和B細胞活化。
“抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用”和“ADCC”是指由細胞介導的反應(yīng)，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒細胞(例如自然殺傷(NK)細胞，中性粒細胞和巨噬細胞)識別結(jié)合在靶細胞上的抗體，隨后引起該靶細胞裂解。介導ADCC作用的主要細胞NK細胞僅表達FcγRIII，而單核細胞則表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。關(guān)于造血細胞上FcR表達的總結(jié)見Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9457-92(1991)的464頁上的表三。為了評價目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC檢測，例如美國專利5500362或5821337中所述。用于這類檢測的有效效應(yīng)細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞?；蛘?或另外)，可在體內(nèi)，例如在Clynes等(PNAS(USA)，95652-656(1998))所述的動物模型中，評估目的分子的ADCC活性。
術(shù)語“Fc受體”或“FcR”用來描述與抗體Fc段結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的受體(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類(包括這些受體的等位基因變體和選擇性剪接型)。FcγRII受體包括具有相似的氨基酸序列的FcγRIIA(“活化受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，其主要區(qū)別在于其細胞漿結(jié)構(gòu)域?；罨荏wFcγRIIA在其細胞漿結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的活化基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞漿結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的抑制基序(ITIM)。(見綜述M.in Daeron，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997))。FcR的綜述見Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)；Capel等，免疫學方法425-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126330-41(1995)。本文中術(shù)語“FcR”函蓋其它FcR，包括那些在將來將被鑒定的FcR。該術(shù)語還包括負責將母體IgG轉(zhuǎn)移到胎兒的新生期受體FcRn(Guyer等，免疫學雜志117587(1976)和Kim等，免疫學雜志24249(1994))。
“人類效應(yīng)物(器)細胞”是表達一或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)功能的白細胞。優(yōu)選所述細胞至少表達FcγRIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)功能。介導ADCC作用的人類白細胞的實例包括外周血單核細胞(PBMC)，自然殺傷(NK)細胞，單核細胞，細胞毒T細胞和中性粒細胞；優(yōu)選PBMC和NK細胞。所述效應(yīng)細胞可從其天然來源中分離，例如從本文所述血液或PBMC中分離。
“補體依賴性細胞毒作用”或“CDC”是指在補體存在的條件下分子裂解靶的能力。補體系統(tǒng)的第一個組分(C1q)與結(jié)合相關(guān)(cognate)抗原的分子(例如抗體)的結(jié)合可起始補體激活途徑。為了評價補體活化作用，可進行CDC檢測，如Gazzano-Santoro等(免疫學方法雜志202163(1996))所述。
″分離的″多肽，是指已從其天然環(huán)境組分中鑒定和分離和/或收獲的多肽。肽的天然環(huán)境中的污染成分是那些將干擾使用多肽進行診斷和治療的物質(zhì)，可包括酶、激素和其它蛋白性或非-蛋白性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，多肽被純化為(1)用轉(zhuǎn)杯式蛋白測序儀，達到足以獲得N-末端或內(nèi)部氨基酸序列至少15個殘基的程度，或者(2)使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染色，達到在非-還原或還原條件下SDS-PAGE電泳同質(zhì)性的程度。分離的多肽包括在重組細胞內(nèi)的原位多肽，因為多肽天然環(huán)境中的至少一個組分是不存在的。然而，通常用至少一個純化步驟來制備分離的多肽。
編碼此處的多肽和抗體的“分離的”核酸分子是鑒定和分離自至少一個污染物核酸分子的核酸分子，所述核酸分子通常在其產(chǎn)生的環(huán)境中與污染物核酸分子締合。優(yōu)選的，所述分離的核酸免于與其產(chǎn)生環(huán)境相關(guān)的所有組分締合。編碼此處的多肽和抗體的分離的核酸分子處于與其在自然狀態(tài)中被發(fā)現(xiàn)的形式或環(huán)境不同的形式。因此分離的核酸分子不同于自然存在于細胞中的編碼此處的多肽或抗體的核酸。
術(shù)語“控制序列”是指在特定的宿主生物中表達可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適合于原核生物的控制序列包括啟動子、選擇性地包括操縱子序列和核糖體結(jié)合位點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號和增強子。
當一種核酸與另一種核酸序列處于功能相關(guān)的位置時，該核酸與該另一種核酸“可操作相連”。例如如果一種多肽表達為參與該多肽的分泌的前體蛋白，則將前序列或分泌前導序列的DNA與該多肽的DNA可操作相連；啟動子或增強子當能影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄時可與該編碼序列可操作相連；或核糖體結(jié)合位點當其位置能促進翻譯時可與編碼序列可操作相連。通常“可操作相連”指被連接的DNA序列是相鄰的，而且，如果是分泌前導序列，則相鄰且為閱讀狀態(tài)。然而，增強子不必是相鄰的。連接可通過在方便的限制性位點相連而實現(xiàn)。如果不存在這樣的位點，可根據(jù)常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
在此處使用術(shù)語“標記的表位(epitope tagged)”時，是指包含與“標記物多肽”融合的此處描述的多肽或抗體的嵌合多肽。標記物多肽具有足夠的殘基以提供表位，針對該表位可以產(chǎn)生抗體，而該標記物多肽又足夠短從而不干擾與其融合的多肽的活性。標記物多肽優(yōu)選還是十分獨特的，以致所述抗體基本上不與其它表位交叉反應(yīng)。適合的標記物多肽一般地具有至少六個氨基酸殘基，通常在約8到50個氨基酸殘基之間(優(yōu)選的，在約10到20個氨基酸殘基之間)。
在本文中術(shù)語“免疫粘附素”定義為抗體樣分子，其將異源“粘附素”蛋白(例如受體、配體或酶)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白恒定區(qū)組合。結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括具有所需結(jié)合特異性之粘附素氨基酸殘基與免疫球蛋白恒定區(qū)序列的融合，所述粘附素氨基酸不同于抗體的抗原識別和結(jié)合位點(抗原結(jié)合位點)(即為“異源性”)。免疫粘附分子的粘附素部分通常是包括受體或配體的至少一個結(jié)合位點的鄰接氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定區(qū)序列，可以得自任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。Ig融合物優(yōu)選的包括在Ig分子內(nèi)的至少一個可變區(qū)的位置用此處描述的多肽或抗體的區(qū)域替代。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，免疫球蛋白融合物包括IgG1分子的鉸鏈、CH2和CH3，或鉸鏈、CH1、CH2和CH3區(qū)域。關(guān)于免疫球蛋白融合物的生產(chǎn)也參見1995年6月27日授權(quán)的美國專利5,428,130。
“穩(wěn)定的”制劑是一種制劑，在該制劑中、在保存期間其中的蛋白質(zhì)基本上保持它的物理和化學穩(wěn)定性和完整性。本領(lǐng)域現(xiàn)有各種測量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分析技術(shù)，在Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent LeeEd.，Marcel Dekker，Inc.New York，New York，Pubs.(1991)和Jones A.Adv.Drug Delivery Rev.1029-90(1993)中有綜述?？梢栽谶x定的溫度測量在一選定的時段的穩(wěn)定性。對于快速篩選，制劑可以被保持在40℃ 2周到1個月，在這個時間測量穩(wěn)定性。當制劑將被保存在2-8℃時，一般地該制劑應(yīng)當在30℃或40℃穩(wěn)定至少1個月和/或在2-8℃穩(wěn)定至少2年。當制劑將被保存在30℃時，一般地該制劑應(yīng)當在30℃穩(wěn)定至少2年和/或在40℃穩(wěn)定至少6個月。例如，在保存期間的聚集程度可以被用作蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的指標。因而，“穩(wěn)定的”制劑可以是一種制劑，在其中少于約10％、和優(yōu)選的少于約5％的蛋白在該制劑中以聚合體存在。在另一個實施方式中，可以確定在制劑的保存期間在聚合體形成方面的任何增加。
“重構(gòu)的(reconstituted)”制劑是一種已經(jīng)通過將凍干的蛋白或抗體制劑溶解在稀釋劑中以使蛋白遍及其中而制備的制劑。重構(gòu)的制劑適合于向需要用感興趣的蛋白治療的病人施用(例如，腸胃外施用)，在本發(fā)明的某些實施方式中，可以是適合于皮下施用的制劑。
“等滲的”制劑是一種基本上具有與人類血液相同的滲透壓的制劑。等滲的制劑一般地具有從約250到350mOsm的滲透壓。術(shù)語“低滲的”描述了滲透壓低于人類血液滲透壓的制劑。相應(yīng)地，術(shù)語“高滲的”被用于描述滲透壓高于人類血液滲透壓的制劑。例如，可以利用蒸氣壓或冰凍型滲透壓計來測量等滲性。作為添加鹽和/或緩沖液的結(jié)果，本發(fā)明的制劑是高滲的。
“藥學上可接受的酸”包括無機酸和有機酸，在它們被配制的濃度和方式下是無毒的。例如，適合的無機酸包括鹽酸、高氯酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫磺酸、磺酸、亞磺酸、硫酸、磷酸、碳酸，等等。適合的有機酸包括直鏈和支鏈的烴基的、芳族的、環(huán)狀的、環(huán)脂肪族的、芳脂肪族的、雜環(huán)的、飽和的、不飽和的、單羧基、雙羧基、三羧基的酸，包括例如、蟻酸、乙酸、2-羥基乙酸、三氟乙酸、苯乙酸、三甲基乙酸、t-丁基乙酸、鄰氨基苯甲酸、丙酸、2-羥基丙酸、2-羰基丙酸、丙二酸、環(huán)戊烷丙酸(cyclopentanepropionic)、環(huán)戊烷丙酸(cyclopentane propionic)、3-苯基丙酸、丁酸、丁二酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲基)苯甲酸、2-乙酸基-苯甲酸、抗壞血酸、肉桂酸、十二烷基硫磺酸、硬脂酸、粘康酸、扁桃酸、琥珀酸、恩貝酸、反丁烯二酸、蘋果酸、馬來酸、羥基馬來酸、丙二酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、乙二醇酸、糖酸、葡糖酸、丙酮酸、乙醛酸、草酸、甲磺酸、琥珀酸、水楊酸、鄰苯二甲酸、棕櫚酸(palmoic acid)、palmeic acid、硫氰酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-chorobenzenesulfonicacid、萘-2-磺酸、p-甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基二環(huán)(2，2，2)-辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸、4，4′-甲撐雙-3-(羥基-2-烯-1-羧酸)、羥基萘甲酸。
“藥學上可接受的堿“包括無機堿和有機堿，在它們被配制的濃度和方式下是無毒的。例如，適合的堿包括那些由成無機堿金屬，例如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、銨、鐵、鋅、銅、錳、鋁，N-甲基葡糖胺，嗎啉，哌啶形成的堿，和有機無毒堿，包括伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺、環(huán)胺和堿離子交換樹脂，[例如，N(R′)4+(其中R′獨立的是H或C1-4烴基，例如，銨，Tris)]，例如，異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙氨基乙醇、trimethamine、二環(huán)己基胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、海巴明、膽堿、甜菜堿、乙撐二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹脂等。特別優(yōu)選的有機無毒堿是異丙胺、二乙胺、乙醇胺、trimethamine、二環(huán)己基胺、膽堿和咖啡因。
本發(fā)明可用的另外的藥學上可接受的酸和堿包括那些來源于氨基酸的酸和堿，所述氨基酸例如，組氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸和天冬酰胺。
“藥學上可接受的”緩沖液和鹽包括那些來源于上述指明的酸和堿的加成鹽的緩沖液和鹽。特定的緩沖液和/或鹽包括組氨酸、琥珀酸鹽和醋酸鹽。
“溶解保護劑(1yoprotectant)”是一種分子，當其與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合時，在凍干和隨后的保存中有效地防止或減少蛋白質(zhì)的化學的和/或物理的不穩(wěn)定性。舉例性的溶解保護劑包括糖和它們相應(yīng)的糖醇；氨基酸，例如谷氨酸單鈉或組氨酸；甲胺，例如甜菜堿；易溶鹽，例如硫酸鎂；多元醇，例如三元的或更高分子量的糖醇，例如甘油(glycerin)、葡聚糖、赤蘚醇、甘油(glycerol)、阿拉伯醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；Pluronics；和其組合。另外的示范性溶解保護劑包括甘油和明膠，和蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水蘇四糖。還原糖的實例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖和乳果糖。非還原糖的實例包括非還原的多羥基化合物的糖苷，多羥基化合物選自糖醇及其它直鏈多元醇。優(yōu)選的糖醇是單糖苷，特別是那些通過將二糖，例如乳糖、麥芽糖、乳果糖和麥芽酮糖還原而獲得的化合物。糖苷的側(cè)基可以是葡糖苷的或半乳糖苷的。糖醇的另外的實例是葡糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。優(yōu)選的溶解保護劑是非還原糖海藻糖或蔗糖。
以“溶解保護量”將溶解保護劑添加到凍干前的制劑意思指，在存在溶解保護量的溶解保護劑的情況下對蛋白質(zhì)凍干之后，在凍干和保存期間蛋白質(zhì)基本上保持它的物理的和化學的穩(wěn)定性以及完整性。
在制備本發(fā)明的降低的粘度的制劑時，需要小心利用上述枚舉的賦形劑以及其它添加劑，特別是以高濃度添加時，以使得不增加制劑的粘度。
“藥學上可接受的糖”是一種分子，當其與感興趣的蛋白質(zhì)組合時，在保存中有效地防止或減少蛋白的化學的和/或物理的不穩(wěn)定性。當制劑將要被凍干然后被重構(gòu)時，“藥學上可接受的糖”也可作為“溶解保護劑”。舉例性的糖和它們相應(yīng)的糖醇包括氨基酸，例如谷氨酸單鈉或組氨酸；甲胺，例如甜菜堿；易溶鹽，例如硫酸鎂；多元醇，例如三元的或更高分子量的糖醇，例如甘油(glycerin)、葡聚糖、赤蘚醇、甘油(glycerol)、阿拉伯醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；Pluronics；和其組合。另外的示范性溶解保護劑包括甘油和明膠，和蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水蘇四糖。還原糖的實例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖和乳果糖。非還原糖的實例包括非還原的多羥基化合物的糖苷，多羥基化合物選自糖醇及其它直鏈多元醇。優(yōu)選的糖醇是單糖苷，特別時那些通過將二糖，例如乳糖、麥芽糖、乳果糖和麥芽酮糖還原而獲得的化合物。糖苷的側(cè)基可以是葡糖苷的或半乳糖苷的。糖醇的另外的實例是葡糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。優(yōu)選的藥學上可接受的糖是非還原糖海藻糖或蔗糖。
以“保護量”將藥學上可接受的糖添加到制劑(例如，凍干前)是指，在保存期間(例如，在重構(gòu)和保存之后)蛋白質(zhì)基本上保持它的物理的和化學的穩(wěn)定性以及完整性。
此處感興趣的“稀釋劑”是一種藥學上可接受的(對于向人類施用是安全的和無毒的)、對于配制液體制劑有用的試劑，液體制劑例如在凍干之后重構(gòu)的制劑。舉例性的稀釋劑包括無菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩沖溶液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水)、無菌鹽水、Ringer’s溶液或葡萄糖溶液。在替換性的實施方式中，稀釋劑可以包括鹽和/或緩沖液的水溶液。
“防腐劑”是一種可被添加到此處的制劑中以降低細菌活性的化合物。添加防腐劑可以，例如便于生產(chǎn)多次使用(多劑量)的制劑?？赡艿姆栏瘎┑膶嵗ㄊ送槎谆交然@、氯化六烴季銨、氯化苯甲烴銨(烷基苯基二甲基氯化銨的混合物，其中烴基基團是長鏈化合物)和氯化芐乙氧銨。其它類型的防腐劑包括芳香醇類，例如苯酚、丁基和苯甲基醇、烴基對羥苯甲酸，例如甲基或丙基對羥苯甲酸、鄰苯二酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇、和m-甲酚。在此最優(yōu)選的防腐劑是苯甲醇。
“治療”是指治療處理以及預(yù)防或防范措施。需要醫(yī)冶的對象包括那些已經(jīng)發(fā)生疾病以及那些需要防止疾病的對象。
對于醫(yī)治來說“哺乳動物”是指任何被分類為哺乳動物的動物，包括人類、家畜和農(nóng)畜、和動物園、競技或玩賞動物，例如狗、馬、兔、牛、豬、倉鼠、沙鼠、小鼠、白鼬、家鼠、貓，等等。優(yōu)選的，哺乳動物是人。
“疾病”是將受益于用蛋白質(zhì)醫(yī)治的任何狀況。這包括慢性的和急性的疾病或病癥，包括那些使得哺乳動物傾向于所患疾病的病理學狀況。此處需醫(yī)治的疾病的非限制性實例包括癌和過敏。
“治療有效量”至少是對于特定的疾病引起可測量的改善或預(yù)防所需的最小濃度。已知蛋白的治療有效量是本領(lǐng)域公知的，在下文中揭示的蛋白質(zhì)的有效量可以通過熟練技術(shù)人員，例如普通醫(yī)師的能力范圍內(nèi)的標準技術(shù)來確定。
此處使用的“粘度”可以是“運動粘度(kinematic viscosity)”或“絕對粘度(absolute viscosity)”?！斑\動粘度”是測量在重力的影響下抵抗液體流動的尺度。當將兩個等體積的流體置于同一的毛細管粘度計并允許重力自流時，粘性流體比較低粘性流體花費更長的時間流過該毛細管。如果一個流體花費200秒完成其流動，而另一個花費400秒，在運動粘度的尺度上第二個流體的粘度是第一個的兩倍?！敖^對粘度”，有時稱為動態(tài)粘度或簡單粘度，是運動粘度和流體密度的積絕對粘度＝運動粘度×密度運動粘度的單位是L2/T，其中L是長度、T是時間。通常，運動粘度用厘司(cSt)表示。運動粘度的國際標準單位是mm2/s，是1cSt。絕對粘度用單位厘泊(cP)表示。絕對粘度的國際標準單位是毫帕-秒(mPa-s)，1cP＝1mPa-s。
此處使用的“抗組胺劑”是對抗組胺的生理效應(yīng)的藥劑。組胺與其受體，H1和H2結(jié)合產(chǎn)生特有的過敏性癥狀和影響，或搔癢、發(fā)紅、腫脹等。許多抗組胺劑通過阻斷組胺與其受體H1、H2的結(jié)合來起作用；而其它的抗組胺劑被認為通過抑制組胺的釋放來起作用。抗組胺劑的實例是氯芬胺、苯海拉明、普魯米近、色甘酸鈉、阿司咪唑、馬來酸哌吡庚啶、bropheniramine maleate、馬來酸氯苯吡醇胺、鹽酸西替利嗪、延胡索酸氯馬斯汀、鹽酸二苯環(huán)庚啶、馬來酸右溴苯那敏、馬來酸右旋氯苯吡胺、氯茶堿苯海拉明、鹽酸苯海拉明、琥珀酸杜克西拉明、fexofendadine hydrochloride、terphenadine hydrochloride、鹽酸羥嗪、loratidine、鹽酸敏克靜、檸檬酸曲吡那敏、鹽酸曲吡那敏、鹽酸丙吡咯啶。
此處使用的“支氣管擴張劑”描述了對抗或逆轉(zhuǎn)支氣管收縮的藥劑，支氣管收縮通常是在早期階段哮喘反應(yīng)中發(fā)生的、并導致肺活量降低和喘氣的生理學事件。支氣管擴張劑的實例包括廣泛作用的α和β腎上腺素能的腎上腺素，β腎上腺素能的舒喘寧，吡布特羅，間羥異丙腎上腺，沙美特羅和新異丙腎上腺素。支氣管擴張也可以通過施用黃嘌呤，包括氨茶堿和茶堿來實現(xiàn)。
此處使用的“糖皮質(zhì)激素”描述了具有抗炎活性的基于甾族的藥劑。糖皮質(zhì)激素通常用于減弱晚期階段哮喘反應(yīng)。糖皮質(zhì)激素的實例包括，脫氫可的松、二丙酸氯地米松、丙酮氟羥脫氫皮醇、氟尼縮松、倍他米松、布地縮松、地塞米松、醋酸氟氫可的松、氟尼縮松、丙酸氟替卡松、氫化可的松、甲基強的松龍、氫化潑尼松、脫氫可的松和氟羥脫氫皮質(zhì)醇。
此處使用的“非甾族抗炎藥”或“NSAID”描述了具有抗炎活性的、不基于甾族的藥劑。NSAID的實例包括醋氨酚、乙酰水楊酸、溴芬酸鈉、二氯苯胺苯乙酸鈉、二氟苯水楊酸、依托度酸、苯氧基氫化阿托酸鈣、氟比洛芬、布洛芬、吲哚氯甲酰、酮洛芬、meclofenamate sodium、甲滅酸、萘丁美酮、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸鈉、羥保泰松、phenylbutzone、吡羅昔康、舒林酸、甲苯酰吡酸鈉。
II.實施本發(fā)明的方法A.多肽和抗體制備以下說明主要涉及此處描述的多肽或抗體的產(chǎn)生，通過培養(yǎng)用包含編碼相同多肽或抗體的核酸的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞，和純化所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或抗體來實現(xiàn)。當然，可以預(yù)期的是，本領(lǐng)域公知的替換方法也可被用來制備這種多肽或抗體。舉例來說，這樣的序列或其部分，可以通過利用固相技術(shù)進行直接的肽合成來生產(chǎn)[參見，例如，Stewart等，Solid-Phase PeptideSynthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149-2154(1963)]?？梢岳萌斯ぜ夹g(shù)或通過自動裝置進行體外蛋白質(zhì)合成。舉例來說，可以利用Applied Biosystems肽合成儀(FosterCity，CA)利用廠商的說明實現(xiàn)自動化合成?？梢苑謩e化學合成此處描述的蛋白質(zhì)或抗體的各個部分，利用化學的或酶促的方法組合。
1.分離編碼此處描述的蛋白質(zhì)的DNA編碼此處描述的蛋白質(zhì)的DNA可以從cDNA文庫中獲得，cDNA文庫從被認為擁有相應(yīng)的mRNA并以可檢測的水平表達該mRNA的組織中制備得來。因此，這種人類蛋白質(zhì)編碼DNA可以方便地從由人類組織制備的cDNA文庫中獲得，如在實施例中所描述的。蛋白質(zhì)編碼基因也可以從基因組文庫或通過已知的合成步驟(例如，自動化核酸合成)獲得。
可以用設(shè)計用來鑒定感興趣基因的探針(例如至少約20-80個堿基的寡核苷酸)來篩選文庫?？梢岳脴藴食绦颍缭赟ambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中描述的程序，用選定的探針篩選cDNA或基因組文庫。分離編碼所期望的基因的基因的替代方法是PCR方法[Sambrook等，同上；Dieffenbach等，PCR PrimerA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)]。
以下的實例描述篩選cDNA文庫的技術(shù)。選擇作為探針的寡核苷酸應(yīng)當足夠長，和足夠明確，從而使假陽性最小化。寡核苷酸優(yōu)選的是標記了的，從而在與需篩選的文庫中的DNA雜交時能被檢測到。標記的方法是本領(lǐng)域公知的，包括用象32P標記的ATP這樣的放射性標記、生物素化或酶標記。在Sambrook等，同上，中提供了雜交條件，包括中度嚴緊和高度嚴緊的雜交條件。
在這種文庫篩選方法中鑒定的序列可以與其它已知的序列比較和序列對比，其它已知的序列被保存在公眾的數(shù)據(jù)庫，例如Genbank或其它私有的序列數(shù)據(jù)庫中，并可從中獲得。處于分子的確定區(qū)域中、或跨越全長序列的序列的身份(氨基酸水平或核苷酸水平)可以利用本領(lǐng)域已知的方法和如在此描述的方法來確定。
可以首先利用在此公開的推導的氨基酸序列通過篩選選定的cDNA或基因組文庫來獲得具有蛋白質(zhì)編碼序列的核酸，如有必要，利用如Sambrook等，同上，中描述的常規(guī)的引物延伸步驟來檢測可能未被反轉(zhuǎn)錄成cDNA的mRNA的前體和加工中間物。
2.宿主細胞的選擇和轉(zhuǎn)化用包含此處描述的要生產(chǎn)的蛋白質(zhì)或抗體的表達載體或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞，在視誘導啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體、或擴增編碼期望的序列的基因的情況而修改了的常規(guī)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。由熟練技術(shù)人員無需過度實驗就可以選擇培養(yǎng)條件，例如培養(yǎng)基、溫度、pH值，等。一般而言，可以在Mammalian Cell BiotechonolgyA Practical Approach，M.Butler，ed.(IRLPress，1991)和Sambrook等，同上，中找到最大化細胞培養(yǎng)物的生產(chǎn)能力的原則、方案和實用技術(shù)。
真核細胞轉(zhuǎn)染和原核細胞轉(zhuǎn)化的方法對于普通熟練技術(shù)人員是已知的，例如，CaCl2、CaPO4、脂質(zhì)體介導的方法和電穿孔的方法。取決于使用的宿主細胞，利用適合于這種細胞的標準技術(shù)進行轉(zhuǎn)化。如Sambrook等，同上，中描述的應(yīng)用氯化鈣的鈣處理，或電穿孔一般用于原核生物。如Shaw等，Gene，23315(1983)和1989年6月29日公開的WO89/05859中描述的，使用根瘤土壤桿菌的感染被用于轉(zhuǎn)化某些植物細胞。對于沒有細胞壁的哺乳動物細胞，可以使用Graham和van der Eb，Virology，52456-457(1978)的磷酸鈣沉淀法。哺乳動物細胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)染的一般情況已經(jīng)在美國專利No.4,399,216中描述了。一般根據(jù)Van Solingen等，J.Bact.，130946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)763829(1979)的方法向酵母進行轉(zhuǎn)化。然而，也可以使用其它用于將DNA導入細胞中的方法，例如核顯微注射、電穿孔、與完整細胞的細菌原生質(zhì)體融合、或聚陽離子，例如Polybrene、聚鳥氨酸的方法。轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞的各種技術(shù)參見Keown等，Methods inEnzymology，185527-537(1990)和Mansour等，Nature，336348-352(1988)。
用于克隆或表達此處的在載體中的DNA的適合的宿主細胞包括原核生物、酵母或高等真核生物細胞。適合的原核生物包括但不限于真細菌，例如革蘭氏陰性或格蘭氏陽性生物，例如，腸桿菌族，例如大腸埃希氏菌。各種大腸埃希氏菌菌株都是公眾可獲得的，例如大腸埃希氏菌K12菌株MM294(ATCC 31，446)；大腸埃希氏菌X1776(ATCC 31，537)；大腸埃希氏菌菌株W3110(ATCC 27，325)和K5772(ATCC 53，635)。其它適合的原核宿主細胞包括腸細菌族，例如埃希氏桿菌屬，例如，大腸埃希氏菌、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)，例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌屬(Serratia)，例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志賀氏菌屬(Shigella)，以及芽孢桿菌屬，例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如，1989年4月12日公開的DD 266，710中公開的地衣芽孢桿菌41P)，假單胞菌屬，例如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、和鏈霉菌屬。這些實例是說明性的而不是限制性的。菌株W3110是特別優(yōu)選的宿主或親本宿主，因為它是重組DNA產(chǎn)物發(fā)酵的通用宿主菌株。優(yōu)選的，宿主細胞分泌最小數(shù)量的蛋白水解酶。例如，可以修改菌株W3110以引起對編碼宿主內(nèi)源蛋白質(zhì)的基因的遺傳突變，這種宿主的實例包括大腸埃希氏菌W3110菌株1A2，其具有完整的基因型tonA；大腸埃希氏菌W3110菌株9E4，其具有完整的基因型tonA ptr3；大腸埃希氏菌W3110菌株27C7(ATCC 55，244)，其具有完整的基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169degP ompT kanr；大腸埃希氏菌W3110菌株37D6，其具有完整的基因型tonAptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr；大腸埃希氏菌W3110菌株40B4，其是具有非卡那霉素抗性degP刪除突變的菌株37D6；和在1990年8月7日出版的美國專利No.4,946,783中公開的具有特別的周質(zhì)蛋白酶的大腸埃希氏菌菌株。做為選擇，體外克隆方法，例如，PCR或其它核酸聚合酶反應(yīng)，是適合的。
除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適于使編碼FGF-19的載體克隆或表達的宿主。釀酒酵母，或常用的面包酵母，在低等真核宿主微生物中最為常用。其它真核微生物包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，Nature，290140 ；1985年5月2日公布的EP 139383)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主(美國專利4943529；Fleer等，Bio/Technologv，9968-975(1991))，例如乳酸克魯維酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.，154(2)737-742 )、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、成克曼氏克魯維酵母(K.wickeraml])(ATCC24178)、K.waltii(ATCC 56500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC36906；Van den Berg等，Bio/Technology，8135(1990))、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和克魯維氏酵母屬(K.marxianus)等；yarrowia(EP 402226)；巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)(EP 183070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28265-278 )；念珠菌屬；Trichoderma reesia(EP 244234)；粗糙鏈孢霉(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，765259-5263 )；許旺氏酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公布的EP 394538)等；和絲狀真菌，例如鏈孢霉屬、青霉屬、Tolypocladium(1991年1月10日公布的WO 91/00357)以及曲霉屬宿主如構(gòu)巢曲霉(Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112284289 ；Tilburn等，Gene，26205-221 ；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，811470-1474 )和黑曲霉等(Kelly和Hynes，EMBO J.，4475-479 )。在本文中嗜甲基(Methylotropic)酵母是適宜的，包括但不限于選自下述屬的能夠在甲醇中生長的酵母漢遜氏酵母屬(Hansenula)，念珠菌屬(Candida)，克勒克酵母屬(Kloeckera)，畢赤酵母屬(Pichia)，酵母屬，球擬酵母屬和紅酵母屬。此類酵母的例證性特定酵母屬的清單見C.Anthony，The Biochemistrvof Methylotrophs，269(1982)。
表達此處描述的多肽和抗體的糖基化形式的適合的宿主細胞來自于多細胞有機體。無脊椎動物細胞的實例包括昆蟲細胞(例如果蠅屬S2和草地夜蛾Sf9)和植物細胞。有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和COS細胞。更特異的實例包括轉(zhuǎn)化了SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)的猴腎CV1細胞系；人胚腎細胞系(293細胞或亞克隆培養(yǎng)成在懸浮培養(yǎng)液中生長的293細胞，Graham等，J.Gen Virol.3659(1977))；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；鼠賽爾托利細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251(1980))；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝臟細胞(Hep G2，HB 8065)；和鼠乳腺癌細胞(MMT 060562，ATCC CCL51)。選擇合適宿主細胞是本領(lǐng)域常識。
3.復(fù)制型載體的選擇和應(yīng)用可以將編碼此處描述的多肽或抗體的核酸(例如，cDNA或基因組DNA)插入到可復(fù)制載體中用于克隆(DNA擴增)或表達。各種載體是公眾可以獲得的。載體可以是例如質(zhì)粒、粘粒、病毒顆?；蚴删w的形式。使用各種方法可將合適的核酸序列插入載體。通常，利用本領(lǐng)域已知技術(shù)將DNA插入到合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點。載體組成部分一般包括但不限于一個或多個信號序列、復(fù)制起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。使用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的標準連接技術(shù)，構(gòu)建包括這些組成部分中一個或多個元件的適宜載體。
多肽或抗體的重組產(chǎn)物不僅可直接重組制備，而且還可制備成與異源多肽的融合多肽，所述異源多肽為信號序列或在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特異性裂解位點的其它多肽。通常，信號序列可以是載體的一個組分，或者可以是被插入載體中編碼多肽或抗體的DNA的一部分。信號序列可以是選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、1pp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導區(qū)的原核信號序列。對于酵母分泌，可以是例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導區(qū)、α因子前導區(qū)(包括糖酵母屬和克魯維酵母屬的α因子前導區(qū)，后者在美國專利5010182中有述)，或酸性磷酸酶前導區(qū)、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前導區(qū)(1990年4月4日公布的EP 362179)，或者1990年11月15日公布的WO90/13646中所述信號序列。在哺乳動物細胞表達時，可使用哺乳動物信號序列以直接分泌蛋白，如得自相同物種或相關(guān)物種分泌型多肽的信號序列以及病毒分泌前導區(qū)。
表達載體和克隆載體均含有使載體在一個或多個選定宿主細胞中復(fù)制的核酸序列。在多種細菌、酵母和病毒中，這樣的序列眾所周知。來自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點適宜于大多數(shù)革蘭氏陰性細菌，2μ質(zhì)粒復(fù)制起始點適于酵母，各種病毒復(fù)制起始點(SV40，多瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)適宜于哺乳動物細胞中的克隆載體。
表達載體和克隆載體通常包含篩選基因，也稱為可篩選標記。典型的篩選基因編碼蛋白，該蛋白(a)提供對抗生素或其它毒素，如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素等的抗性，(b)彌補營養(yǎng)缺陷，或(c)提供從復(fù)合培養(yǎng)基中不能得到的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，例如編碼芽孢桿菌屬D-丙氨酸消旋酶的基因。
適于哺乳動物細胞的篩選標記實例是那些允許鑒定細胞的可選擇標記物，例如DHFR或胸苷激酶。當使用野生型DHFR時，適當?shù)乃拗骷毎前凑誙rlaub等在Pric.Natl.Acad.Sci.USA 774216(1980)中描述的方法制備和繁殖的DHFR活性缺陷型中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。適用于酵母的合適篩選基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trp1基因[Stinchcomb等，Nature，28239(1979)；Kingsman等，Gene，7141(1979)；Tschemper等，Gene，10157(1980)]。trp1基因為不能在色氨酸中生長的酵母突變株(例如ATCC44076或PEP4-1)提供了篩選標記[Jones，Genetics，8512(1977)]。
表達和克隆載體通常含有可操作地連接于所述DNA序列的啟動子，以指導mRNA合成。被各種潛在宿主細胞識別的啟動子是眾所周知的。適用于原核宿主的啟動子，包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)[Chang等，Nature，275615(1978)；Goeddel等，Nature，281544(1979)]，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)[Goeddel，Nucleic acids Res.，84057(1980)；EP 36776]，和雜化啟動子如tac啟動子[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983)]。適用于細菌系統(tǒng)的啟動子，也含有可操作地連接于所述DNA序列的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
適用于酵母宿主的啟動序列的實例包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman等，J.Biol.Chem.，2552073(1980)]或其它糖酵解酶[Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7149(1968)；Holl和Biochemistrv，174900(1978)]的啟動子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶。
其它的酵母啟動子，即那些具有由生長條件控制轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點的誘導型啟動子，是下述基因的啟動子區(qū)，即乙醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73657中進一步描述了用于酵母表達系統(tǒng)的適當載體和啟動子。
在哺乳動物宿主細胞中，對載體的轉(zhuǎn)錄可受下述啟動子調(diào)控，所述啟動子來自病毒基因組如多瘤病毒(polyoma virus)、鳥痘病毒(fowlpox virus)(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的啟動子，或者來自異源哺乳動物的啟動子，如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子等，和來自熱休克啟動子，前提是這些啟動子與宿主細胞系統(tǒng)相容。
高等真核生物對編碼此處的多肽或抗體的核酸的轉(zhuǎn)錄可以通過將增強子序列插入到載體中來增加。增強子是作用于啟動子以增加轉(zhuǎn)錄的DNA的順式作用元件，一般約10～300bp。目前已經(jīng)知道了很多哺乳動物基因(珠蛋白，彈性蛋白酶、白蛋白、α胎蛋白和胰島素)的增強子序列。然而，人們通常使用真核細胞病毒的增強子。實例包括在其復(fù)制起始點晚期側(cè)的SV40增強子(bp 100-270)，巨細胞病毒早期啟動子增強子，在其復(fù)制起始點晚期側(cè)的多形瘤增強子，和腺病毒增強子。所述增強子可以被剪接到載體中編碼序列的5’或3’端，但優(yōu)選位于啟動子的5’端。
用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物的有核細胞)的表達載體，還包括對轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)所必須的序列。這些序列通常來自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶爾為3’)非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含核苷酸片段，所述核苷酸片段在編碼此處描述的多肽或抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中被轉(zhuǎn)錄為多聚腺苷酸化片段。
適合在重組脊椎動物細胞培養(yǎng)中合成此處描述的多肽或抗體的其它適宜方法、載體和宿主細胞，見Gething等，Nature，293620-625(1981)；Mantei等，Nature，28140-46(1979)；EP 117060和EP 117058中的描述。
4.檢測基因擴增/表達基因的擴增和/或表達可以在樣品中直接測定，例如，根據(jù)此處提供的序列并利用適當?shù)臉擞浱结?，通過常規(guī)技術(shù)如Southern印跡、測定mRNA轉(zhuǎn)錄量的Northern印跡[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980)]、點印跡(DNA分析)或原位雜交，可以直接在樣品中測定基因擴增和/或表達?；蛘撸褂媚軌蜃R別特異雙鏈體的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜化雙鏈體或者DNA-蛋白雙鏈體。依次標記抗體，對雙鏈體與表面哪個部位結(jié)合進行分析，從而基于雙鏈體在表面的形成，探測到與雙鏈體結(jié)合的抗體。
或者，為直接定量測定表達的基因產(chǎn)物，用免疫學方法測定基因表達，所述方法如細胞或組織切片的免疫組化染色和細胞培養(yǎng)物或體液分析。適用于免疫組化染色和/或樣品液分析的抗體，可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且可以在任何哺乳動物中制備抗體。方便地，可以針對此處描述的多肽，或針對根據(jù)此處提供的DNA序列合成的肽，或針對與編碼這種多肽和抗體的DNA融合的外源序列，和與編碼特異性抗體表位的DNA融合的外源序列，來制備抗體。
5.多肽純化可從培養(yǎng)基或宿主細胞裂解物中回收多肽。如果所述多肽與膜結(jié)合，那么使用適宜去垢劑溶液(例如Triton-X 100)或通過酶裂解使之自細胞膜釋放。使用各種物理或化學手段，如凍融循環(huán)、超聲、機械破裂或細胞溶解劑，使表達此處描述的多肽或抗體所用的細胞破裂。
可以期望從重組細胞蛋白或其它多肽中純化此處描述的多肽或抗體。下述程序是例證性適宜的純化步驟在離子-交換柱上分級分離；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅石或陽離子-交換樹脂如DEAE上層析；聚焦層析；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；使用例如交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)G-75進行凝膠過濾；過蛋白A瓊脂糖柱以除去污染物如IgG；和結(jié)合表位-標記形式FGF-19的金屬螯合劑柱。可以使用蛋白純化的各種方法，這些方法是本領(lǐng)域熟知的，并在例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein PurificationPrincipes and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)中作了描述。純化步驟的選擇，取決于例如，生產(chǎn)方法的性質(zhì)和所產(chǎn)生的特定多肽或抗體。
B.抗體制備在本發(fā)明的某些實施方式中，選擇的蛋白質(zhì)是抗體。以下是生產(chǎn)抗體的技術(shù)，包括多克隆的、單克隆的、人源化的、雙特異性的和異源偶聯(lián)物抗體。
(1)多克隆抗體。
一般通過多次皮下的(sc)或腹膜內(nèi)的(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑，在動物中引發(fā)出多克隆抗體。利用雙功能或衍生化試劑，例如馬來酰亞胺苯甲酰硫酸琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基結(jié)合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1獨立的是低級烴基基團，將相關(guān)的抗原結(jié)合到在被免疫的物種中是免疫原性的蛋白質(zhì)上，是有用的，所述蛋白質(zhì)例如，匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制物?？梢允褂玫淖魟┑膶嵗ǜナ喜煌耆魟┖蚆PL-TDM佐劑(單磷?；|(zhì)A、合成的雙白喉菌酸酯(dicorynomycolate))。本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過度的實驗就可以選擇免疫方案。
用所述抗原、免疫原性偶聯(lián)物，或衍生物免疫動物，通過使例如100μg或5μg所述蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別對于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑組合，皮內(nèi)在多個位置注射所述溶液來實現(xiàn)。一個月后，用1/5到1/10初始量的肽或偶聯(lián)物在弗氏完全佐劑中通過在多個位置皮下注射來對動物進行強化免疫。七到十四天后，對動物抽血，血清用于分析抗體滴度。對動物進行強化免疫，直到滴度達高峰水平。偶聯(lián)物也可作為蛋白質(zhì)融合物在重組細胞培養(yǎng)物中制備。此外，聚集劑例如明礬(alum)適合于增強免疫反應(yīng)。
(2)單克隆抗體。
單克隆抗體是從基本上同質(zhì)的抗體群體中獲得的抗體，即，除了可能以少量存在的可能自然發(fā)生的突變和/或翻譯后修飾(例如，異構(gòu)化、酰胺化)之外，包含所述群體的每個抗體都是相同的。因而，修飾語“單克隆”表明抗體的特征不是不同抗體的混合物。
例如，單克隆抗體可以通過由Kohler等，Nature，256495(1975)首先描述的雜交瘤方法制備，或可以通過重組DNA方法制備(美國專利No.4,816,567)。
在雜交瘤方法中，按上文中描述的免疫小鼠或其它適當?shù)乃拗鲃游?，例如倉鼠，引發(fā)出淋巴細胞，所述淋巴細胞產(chǎn)生或能產(chǎn)生與用于免疫的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體。做為選擇，可以體外致敏淋巴細胞。然后利用適合的的融合劑，例如聚乙二醇，將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103(AcademicPress，1986)。
所述免疫劑一般地包括抗原性蛋白質(zhì)或其融合變體。一般而言，如果需要來源于人的細胞，則使用外周血淋巴細胞(“PBLs”)，如果需要非人哺乳動物來源的細胞，那么就使用脾細胞或淋巴結(jié)細胞。然后，使用適宜的融合試劑如聚乙二醇，將淋巴細胞與無限增殖細胞系融合，從而形成雜交瘤細胞[Goding，單克隆抗體Principles和Practice，Academic Press，(1986)59-103頁]。
無限增殖細胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞，特別是嚙齒類、牛和人類起源的骨髓瘤細胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系?？稍谶m宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細胞，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的無限增殖細胞生長或生存的物質(zhì)。例如，親代細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤的培養(yǎng)基通常包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(″HAT培養(yǎng)基″)，這些物質(zhì)抑制HGPRT-缺陷細胞生長。
優(yōu)選的永生骨髓瘤細胞是那些有效地融合、支持選定的抗體生產(chǎn)細胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體、和對培養(yǎng)基，例如HAT培養(yǎng)基敏感的細胞。在這些之中，優(yōu)選的是鼠骨髓瘤細胞系，例如來源于MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤、可以從Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California USA獲得的那些，和可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassus，Virginia USA獲得的SP-2細胞(和其衍生物，例如，X63-Ag8-653)。也已經(jīng)描述了將人骨髓瘤和小鼠-人異骨髓瘤細胞系用于人單克隆抗體的生產(chǎn)((Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker Inc.，New York，1987))。
分析雜交瘤細胞生長的培養(yǎng)基生產(chǎn)針對所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)量。優(yōu)選的，雜交瘤細胞生產(chǎn)的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀法或通過體外結(jié)合分析，例如放射性免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)來確定。
可以分析培養(yǎng)雜交瘤細胞的培養(yǎng)基，分析其中是否存在針對期望的抗原的單克隆抗體。優(yōu)選的，所述單克隆抗體的結(jié)合親合性和特異性可以通過免疫沉淀法或通過體外結(jié)合分析，例如放射性免疫測定(RIA)或酶聯(lián)分析(ELISA)來確定。這種技術(shù)和分析方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可以通過Munson等，Anal.Biochem.，107220(1980)的Scatchard分析來確定結(jié)合親合性。
在鑒定了產(chǎn)生期望特異性、親合性和/或活性的抗體的雜交瘤細胞之后，通過限制性稀釋步驟和通過標準方法(Goding，同上)培養(yǎng)來對所述克隆進行亞克隆。用于這個目的的適合的培養(yǎng)基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細胞可以在體內(nèi)，如哺乳動物的腹水瘤中生長。
通過常規(guī)的免疫球蛋白純化步驟，例如蛋白質(zhì)A瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，適當?shù)貙⑺鰜喛寺》置诘膯慰寺】贵w與培養(yǎng)基、腹腔積液或血清分離。
也可通過重組DNA方法，例如在美國專利No.4,816,567和如上述描述的方法，來制造單克隆抗體。利用常規(guī)程序容易地分離編碼單克隆抗體的DNA并測序(例如，利用能與編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞充當了這種DNA的優(yōu)選的來源。一旦被分離出來，DNA可以被置入表達載體中，然后用該載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，所述宿主細胞如猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞，以便在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。關(guān)于編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.130151-188(1992)。
在進一步的實施方式中，可以從利用McCafferty等，Nature，348552-554(1990)中描述的技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫中分離抗體。Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)分別描述了利用噬菌體文庫分離鼠的和人類的抗體。隨后的出版物描述了通過鏈改組(strain shuffle)(Marks等，Biol/Technology，10779-783(1992))以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建龐大噬菌體文庫的策略(Waterhouse等，Nucl.acids Res.，212265-2266(1993))，來生產(chǎn)高親合力(nM范圍)的人類抗體。因而，這些技術(shù)是對分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行性替換。
例如，也可以通過用人類重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列代替同源的鼠序列(美國專利No.4,816,567；Morrison，等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，816851(1984))，或通過將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽編碼序列的全部或部分共價連接，來修改DNA。一般地這種非免疫球蛋白多肽代替抗體的恒定區(qū)，或可以取代抗體的一個抗原結(jié)合位點的可變區(qū)，以產(chǎn)生嵌合的二價抗體，所述二價抗體包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結(jié)合位點和對不同的抗原具有特異性的另一個抗原結(jié)合位點。
此處描述的單克隆抗體可以是單價的，其制備方法是本領(lǐng)域公知的。例如，一種方法包括免疫球蛋白輕鏈和修飾后的重鏈的重組表達。一般地重鏈在Fc區(qū)域的任一點被截斷以阻止重鏈交聯(lián)。做為選擇，相關(guān)的半胱氨酸殘基可以被另一個氨基酸殘基代替，或被刪除，以阻止交聯(lián)。體外方法也適用于制備單價的抗體?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)來實現(xiàn)對抗體的消化，以產(chǎn)生其片段，特別是Fab片段。
也可以在體外利用已知的合成蛋白化學方法，包括那些利用交聯(lián)劑的方法來制備嵌合的或雜交抗體。例如，可以利用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。用于這個目的的適合的試劑的實例包括亞氨基硫醇化物(iminothiolate)和甲基-4-巰基丁亞氨酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
(3)人源化抗體。
本發(fā)明的抗體可進一步包括人源化抗體或人抗體。非-人(例如，鼠)的人源化抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2或抗體的其它抗原結(jié)合亞序列)，它們包含極少的非人免疫球蛋白序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受者抗體)中受者互補決定區(qū)(CDR)殘基被具有所需特異性、親和力和性能的小鼠、大鼠、家兔等非人源物種抗體(供體抗體)的CDR殘基所取代。在一些實例中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)殘基由相應(yīng)的非人類殘基所取代。人源化抗體也可包含受者抗體或供體CDR或框架序列中均不存在的殘基。通常，人源化抗體基本上包括至少一個、通常兩個可變區(qū)的全部，其中CDR的全部或基本上全部對應(yīng)于非人免疫球蛋白的相應(yīng)部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白共有序列。人源化抗體還任選包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。詳見Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
人源化非-人抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。通常，人源化抗體中已導入一或多個源自非人類的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常稱為“引進的”殘基，它們通常來自“引進的”可變區(qū)。人源化過程基本如Winter及其同事(Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988))所述，用一個或多個CDR序列取代人類抗體的相應(yīng)序列來進行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4816567)，其中完整人類可變區(qū)的很大一部分被非人類物種的相應(yīng)序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中一些CDR殘基且可能有一些FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點的殘基取代。
在制造人源化抗體中人類可變區(qū)，包括輕鏈和重鏈可變區(qū)的選擇，對減少抗原性是非常重要的。根據(jù)所謂的“best-fit”方法，相對于已知的人類可變區(qū)序列的完整文庫篩選嚙齒動物抗體的可變區(qū)序列。然后將與嚙齒動物的序列最接近的人類序列作為人源化抗體的人類骨架(FR)。Sims等，J.Immunol.1512296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196901(1987)。另一種方法使用了特定的骨架，所述骨架來源于特定輕鏈或重鏈亞群的人類抗體的共有序列。相同的骨架可被用于幾個不同的人源化抗體。Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等，J.Immnol.，1512623(1993).。
更重要的是，抗體被人源化后仍保持著對抗原的高親合性及其它有利的生物學性質(zhì)。為了實現(xiàn)這個目標，根據(jù)優(yōu)選的方法，通過利用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念上的人源化產(chǎn)物的過程，來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。圖解和顯示選定的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序是可獲得的。對這些顯示結(jié)果的檢查，可以分析在候選免疫球蛋白序列的功能中殘基可能起的作用，即，分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。這樣，可以從接受者和輸入序列中選擇和組合FR殘基，從而獲得期望的抗體特性，例如對目標抗原的增加的親合性。一般地，CDR殘基直接并且極其充分地(most substantially)影響抗原結(jié)合。
各種形式的人源化抗體都是本發(fā)明所涉及的。例如，人源化抗體可以是抗體片段，例如Fab，其選擇性地與一個或多個細胞毒性藥劑結(jié)合以產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物。做為選擇，人源化抗體可以是完整的抗體，例如完整的IgG1抗體。
(4)人類抗體作為對人源化的替代，可以產(chǎn)生人類抗體。例如，可以制備轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)，所述轉(zhuǎn)基因動物可以通過免疫，在沒有內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生全套人抗體。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突變小鼠中，抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合性缺失導致內(nèi)源性抗體產(chǎn)生的完全抑制。將人胚系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到此胚系突變小鼠，將導致產(chǎn)生針對抗原攻擊的人抗體。例如，見Jakobovits等，美國國家科學院院刊，902551(1993)；Jakobovits等，自然，362255-258(1993)；；美國專利No.5,591,669和WO97/17852。
或者，噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)可被用于從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因所有組成部分體外生產(chǎn)人類抗體或抗體片段。McCafferty等，Nature348552-553(1990)；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227381(1991)。依據(jù)這種技術(shù)，抗體V區(qū)基因被克隆到絲狀噬菌體的主要和次要外殼蛋白基因讀框中，所述絲狀噬菌體例如M13或fd，在噬菌體粒子的表面上被呈現(xiàn)為功能性抗體片段。由于絲狀粒子包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體功能性質(zhì)的選擇，也產(chǎn)生了對編碼顯示出那些性質(zhì)的抗體的基因的選擇。因而，噬菌體模擬了B細胞的一些性質(zhì)?？梢杂酶鞣N形式進行噬菌體展示，例如這在Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Curr.Opin Struct.Biol.3564-571(1993)中有綜述。數(shù)種來源的V基因片段可被用于噬菌體展示。Clackson等，Nature352624-628(1991)從來源于免疫小鼠的脾的V基因的小隨機組合文庫中分離了多種抗唑酮抗體的陣列(array)。遵循Marks等，J.Mol.Biol.222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)中描述的技術(shù)，可以構(gòu)建來自未免疫人類供體的V基因的所有組成部分，可以基本上分離出針對各種抗原(包括自體抗體)的抗體。參見，美國專利No.5,565,332和5,573,905。
也可獲得Cole等人和Boerner等人的技術(shù)用于制備人類單克隆抗體(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)和Boerner等，J.Immunol.147(1)86-95(1991)。類似地，可以通過將人免疫球蛋白基因座導入轉(zhuǎn)基因動物，例如小鼠來制造人類抗體，在所述轉(zhuǎn)基因的動物中內(nèi)源性免疫球蛋白基因已經(jīng)被部分地或完全地失活了。在攻擊時，觀察人類抗體產(chǎn)物，在各個方面其都與在人類中所見的類似，包括基因重排，裝配和抗體所有組成部分(antibody repertoire)。例如，這個方法在美國專利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016中，和在以下科學出版物Marks等，Bio/Technology10779-783(1992)；Lonberg等Nature368856-859(1994)；Morrison，Nature368812-13(1994)，F(xiàn)ishwild等，Nature Biotechnology14845-51(1996)，Neuberger，Nature Biotechnology14826(1996)和Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)中有描述。
最后，也可在體外通過活化的B細胞來產(chǎn)生人類抗體(參見美國專利No.5,567,610和5,229,275)。
(5)抗體片段在某些情形下，使用抗體片段比使用整個抗體有好處。較小的片段大小允許被快速的清除，可產(chǎn)生對實體腫瘤的增加的接觸機會。
已經(jīng)開發(fā)出各種技術(shù)用于產(chǎn)生抗體片段。傳統(tǒng)上，通過對完整抗體進行蛋白水解消化來派生出這些片段(參見，例如Morimoto等，J.Biochem Biophys.Method.24107-117(1992)；和Brennan等，Science22981(1985))。然而，現(xiàn)在可以直接通過重組宿主細胞生產(chǎn)這些片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都能夠在大腸埃希氏菌中表達和從大腸埃希氏菌分泌，因而容許容易的產(chǎn)生大量的這些片段。可以從如上所述的抗體噬菌體文庫從分離抗體片段。做為選擇，可以直接從大腸埃希氏菌回收Fab′-SH片段，化學地連接形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology10163-167(1992))。根據(jù)另一個方法，可以直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物中分離F(ab′)2片段。在美國專利No.5,869,046中描述了具有增加的體內(nèi)半衰期的Fab和F(ab′)2。在其它實施方式中，可選的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利No.5,571,894和美國專利No.5,587,458?？贵w片段也可以是“線性抗體”，例如，如在美國專利5,641,870中描述的。這種線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
(6)抗體依賴的酶介導的前體藥物治療(ADEPT)通過將抗體與前體藥物激活酶結(jié)合，本發(fā)明的抗體也可被用于ADEPT，所述前體藥物激活酶將前體藥物(例如肽基化學治療劑，參見WO 81/01145)轉(zhuǎn)換成活性的抗癌藥物。參見，例如，WO 88/07378和美國專利No.4,975,278。
對于ADEPT有用的免疫偶聯(lián)物的酶組分包括能以一定方式作用于前體藥物以將其轉(zhuǎn)變成其更具活性、細胞毒性的形式的任何酶。
對本發(fā)明的方法有用的酶包括但不限于，糖苷酶、葡萄糖氧化酶、人溶菌酶、人葡糖醛酸酶、對于將包含磷酸鹽的前體藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物有用的堿性磷酸酶；對于將包含硫酸鹽的前體藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物有用的芳基硫酸酯酶；對于將無毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變成抗癌藥物5-氟尿嘧啶有用的胞嘧啶脫氨基酶；蛋白酶，例如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶(例如，羧肽酶G2和羧基肽酶A)和組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B和L)，對于將包含肽的前體藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物是有用的；D-丙氨?；入拿福瑢τ谵D(zhuǎn)化包含D-氨基酸取代基的前體藥物是有用的；碳水化合物裂解酶，例如將糖基化的前體藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物有用的β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸苷酶；對于將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物有用的β-內(nèi)酰胺酶；和青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，對于在胺氮上用苯氧乙?；虮揭阴；苌乃幬锓謩e轉(zhuǎn)變成游離藥物是有用的。做為選擇，具有酶活性的抗體，本領(lǐng)域也稱為“抗體酶”，可被用于將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)變成游離的活性藥物(參見，例如Massey，Nature328457-458(1987))。可以如在此描述的來制備抗體-抗體酶偶聯(lián)物，用于將抗體酶遞送到腫瘤細胞群體中。
可以通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)，例如使用上述的異雙功能交聯(lián)劑，將上述酶共價連接到此處描述的多肽或抗體上。做為選擇，至少包含本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合區(qū)的、與本發(fā)明的酶的至少一個功能活性部分連接的融合蛋白質(zhì)，可以利用本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)來制備(參見，例如，Neuberger等，Nature312604-608(1984))。
7)雙特異性和多特異性抗體雙特異性抗體(BsAb)是那些具有與至少兩個不同表位的結(jié)合特異性的抗體，包括那些在同一個或另一個蛋白質(zhì)上的表位。做為選擇，可以裝備一條臂以與目標抗原結(jié)合，另一條臂可以與一種與白細胞上的觸發(fā)分子結(jié)合的臂化合，所述觸發(fā)分子例如T細胞受體分子(例如，CD3)或IgG的Fc受體(FcγR)，例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，以將細胞防衛(wèi)機制聚焦和定位到表達目標抗原的細胞上。這種抗體可以來源于全長抗體或抗體片段(例如，F(xiàn)(ab′)2雙特異性抗體)。
雙特異性抗體也可以被用于將細胞毒性藥劑定位到表達目標抗原的細胞。這種抗體擁有與期望的抗原結(jié)合的一條臂和與細胞毒性藥劑結(jié)合的另一條臂(例如，saporin、抗干擾素-a、vinca alkoloid、篦麻毒素A鏈、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)。已知的雙特異性抗體的實例包括抗ErbB2/抗FcgIII(WO 96/16673)、抗ErbB2/抗FcgRI(美國專利5,837,234)、抗ErbB2/抗-CD3(美國專利5,821,337)。
制造雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)是根據(jù)共表達兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中兩個鏈具有不同的特異性。Millstein等，Nature，305537-539(1983)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(quadromas)產(chǎn)生10個不同抗體分子的潛在混合物，在其中僅有一個具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化，是相當繁瑣的，產(chǎn)物產(chǎn)率很低。在WO 93/08829和在Traunecker等，EMBO J.，103655-3659(1991)中公開了類似的步驟。
根據(jù)不同的方法，將具有期望的結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。所述融合優(yōu)選的是與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合，至少包含鉸鏈、CH2和CH3區(qū)域的部分。具有包含為輕鏈結(jié)合所必需的位點的第一個重鏈恒定區(qū)(CH1)是優(yōu)選的，存在于至少一個所述融合物中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物的DNA、和如果需要將編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA，插入到獨立的表達載體中，共轉(zhuǎn)染到適合的宿主生物中。當用于構(gòu)建時三個多肽鏈的不等比例提供了最適的產(chǎn)量時，在實施方式中這為調(diào)整所述三個多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，當至少兩個多肽鏈以相等的比例表達導致高產(chǎn)量時，或當所述比例沒有特別的意義時，有可能將兩個或全部三個多肽鏈編碼序列插入到一個表達載體中。
在這個方法的優(yōu)選實施方式中，所述雙特異性抗體由在一條臂上具有第一結(jié)合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈、和在另一條臂上的雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)組成。據(jù)發(fā)現(xiàn)，這個不對稱的結(jié)構(gòu)便于從不需要的免疫球蛋白鏈結(jié)合物中離期望的雙特異性化合物，在僅半個所述雙特異性分子中存在免疫球蛋白輕鏈提供了容易的分離路線。在WO 94/04690中公開了這個方法。產(chǎn)生雙特異性抗體的進一步細節(jié)，參見，例如，Suresh等，Methods in Enzymology121210(1986)。
根據(jù)在WO 96/27011或美國專利5,731,168中描述的另一個方法，可以設(shè)計在抗體分子對之間的接觸面來最大化從重組細胞培養(yǎng)物中回收雜二聚物的百分比。優(yōu)選的接觸面至少包含抗體恒定區(qū)的CH3區(qū)的一部分。在這個方法中，來自第一抗體分子的接觸面的一個或多個小的氨基酸側(cè)鏈被大的側(cè)鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)替換。通過用小的氨基酸側(cè)鏈(例如，丙氨酸或蘇氨酸)替換大的氨基酸側(cè)鏈，在第二抗體分子的接觸面上產(chǎn)生與大的側(cè)鏈相同或類似大小的補償“腔”。這提供了一種相對其它不需要的終產(chǎn)物，例如同型二聚體、用于增加雜二聚體的產(chǎn)量的機制。
已經(jīng)在文獻中描述了從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的方法。例如，可以利用化學連接來制備雙特異性抗體。Brennan等，Science22981(1985)描述了一種步驟，其中完整的抗體被蛋白水解化地剪切以產(chǎn)生F(ab′)2片段。在存在二巰基化物絡(luò)合劑亞砷酸鈉以穩(wěn)定鄰近的二巰基化物和阻止分子間的二硫化物形成的情況下，這些片段被減少了。然后將產(chǎn)生的Fab′片段轉(zhuǎn)變成三硝基苯(TNB)衍生物。然后將Fab′-TNB衍生物中的其中一個再轉(zhuǎn)變成Fab′-TNB衍生物，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可被用作用于酶的選擇性固定化的藥劑。
可以直接從大腸埃希氏菌中回收Fab′片段，并化學地聯(lián)結(jié)以形成雙特異性抗體。Shalaby等，J.Exp.Med.175217-225(1992)描述了完全人源化的雙特異性抗體F(ab′)2分子的生產(chǎn)。分別地從大腸埃希氏菌分泌每個Fab′片段，在體外進行直接的化學偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。這樣形成的雙特異性抗體能夠與過量表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞結(jié)合，并且能觸發(fā)人細胞毒淋巴細胞對人乳腺腫瘤靶點的溶解活性。
也已經(jīng)描述了直接從重組細胞培養(yǎng)物中制造和分離二價抗體片段的各種技術(shù)。例如，已經(jīng)利用亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了二價的雜二聚物。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)1547-1553(1992)。來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)肽通過基因融合被連接到兩個不同抗體的Fab′部分。在絞鏈區(qū)還原抗體同二聚體以形成單體，然后重氧化以形成抗體異二聚物。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)描述的“雙功能抗體”技術(shù)提供了制造雙特異性/二價抗體片段的可選擇的機制。所述片段包括通過接頭連接到輕鏈可變區(qū)(VL)的重鏈可變區(qū)(VH)，所述接頭非常短從而不容許在相同鏈的兩個區(qū)域間的配對。因此，一個片段的VH和VL區(qū)不得不與另一個片段的互補VL和VH區(qū)配對，從而形成兩個抗原結(jié)合位點。已經(jīng)報道了利用單鏈Fv(sFv)二聚體制造雙特異性/二價抗體片段的另一個策略。參見Gruber等，J.Immunol.，1525368(1994)。
具有超過兩個化合價的抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可以制備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.14760(1991)。
舉例性的雙特異性抗體可以與給定分子上的兩個不同表位結(jié)合。做為選擇，可以將抗蛋白質(zhì)臂與結(jié)合白細胞上的觸發(fā)分子的臂化合，所述觸發(fā)分子例如T細胞受體分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)，或IgG的Fc受體(FcγR)，例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，以將細胞的防衛(wèi)機制聚焦到表達特定蛋白質(zhì)的細胞上。雙特異性抗體也可以被用于將細胞毒性藥劑定位到表達特定蛋白質(zhì)的細胞。這種抗體擁有蛋白結(jié)合臂和與細胞毒性藥劑或放射性核素螯合劑，例如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA結(jié)合的臂。另一種感興趣的雙特異性抗體與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合，并進一步結(jié)合組織因子(TF)。
6)異偶聯(lián)物抗體異偶聯(lián)物抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。異偶聯(lián)物抗體由兩個共價連接的抗體組成。例如，在異偶聯(lián)物中的一個抗體可以與抗生物素蛋白聯(lián)結(jié)，另一個與生物素聯(lián)結(jié)。例如，這種抗體已經(jīng)被計劃用來將免疫系統(tǒng)細胞靶向不需要的細胞，美國專利4,676,980，和用來醫(yī)治HIV感染。WO 91/00360，WO92/200373和EP 0308936。預(yù)期的是，也可以在體外利用已知的合成蛋白化學方法，包括那些利用交聯(lián)劑的方法來制備所述抗體。例如，可以利用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。用于這個目的的適合的試劑的實例包括亞氨基硫醇化物和甲基-4-巰基丁亞氨酸酯，和那些例如在美國專利No.4,676,980中公開的試劑?？梢岳萌魏畏奖愕慕宦?lián)方法來制造異偶聯(lián)物抗體。適合的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域公知的，在美國專利No.4,676,980中隨同許多交聯(lián)技術(shù)一起被公開。
(7)效應(yīng)物功能改造根據(jù)效應(yīng)物功能修飾本發(fā)明的抗體是可取的，以便增強抗體在治療癌癥中的有效性。例如，可將半胱氨酸殘基導入Fc區(qū)中，從而容許在該區(qū)中形成鏈間的二硫鍵。這樣產(chǎn)生的同型二聚化抗體具有增加的內(nèi)化能力和/或增加的補體介導的細胞殺傷和抗體依賴的細胞毒性(ADCC)。參見Caron等，J.Exp.Med，.1761191-1195(1992)和Shopes，J.Immunol.1482918-2922(1992)。也可以利用如Wolff等，Cancer Research532560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯(lián)接頭來制備具有增強的抗腫瘤活性的同型二聚化抗體。做為選擇，可以設(shè)計抗體具有雙Fc區(qū)，從而抗體具有增強的補體溶解和ADCC能力。參見Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design3219-230(1989)。
(8)免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還涉及免疫偶聯(lián)物，所述免疫偶聯(lián)物包含與細胞毒性藥劑結(jié)合的抗體，細胞毒性藥劑例如化學治療劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射偶聯(lián)物)。
對產(chǎn)生這種免疫偶聯(lián)物有用的化學治療劑包括BCNU、streptozoicin、長春新堿、長春花堿、阿霉素和5-氟尿嘧啶。
可以應(yīng)用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑，白樹毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。
抗體與細胞毒制劑的偶聯(lián)物可通過多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(如亞氨基己二酸二甲酯鹽酸鹽)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯甲?；?己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科學2381098(1987)所述制備。C14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯(lián)至抗體的偶聯(lián)劑之一。見WO94/11026。這種接頭可能是有利于細胞毒藥物在細胞內(nèi)釋放的“可斷開的接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定型接頭，肽酶敏感型接頭，二甲基接頭或含二硫鍵的接頭(Chari等，癌癥研究52127-131(1992))。
另外，小分子毒素例如卡奇霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(美國專利5,208,020)、trichothene和CC1065也可望作為可結(jié)合的毒素用于本發(fā)明的制劑。在一個實施方式中，全長抗體或其抗原結(jié)合片段可以與一個或多個美登木素生物堿(maytansinoid)分子結(jié)合(例如，每個抗體分子與約1-10個美登木素生物堿分子結(jié)合)。美登木素生物堿是通過抑制微管蛋白聚合來起作用的有絲分裂抑制劑。已經(jīng)描述了從天然來源分離的、或合成制備的美登木素生物堿，包括美登素、maytansinal和其衍生物和類似物，參見美國專利No.5,208,020和其中引用的參考文獻(見第2欄第53行至第3欄第10行)和美國專利3,896,111和4,151,042。在美國專利No.5,208,020中也描述了制備抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物的方法。在優(yōu)選的實施方式中，美登木素生物堿通過二硫化物或其它含硫的接頭基團與抗體連接。例如，可以將美登素轉(zhuǎn)變成May-SS-Me，其可以被還原為May-SH3并與修飾的抗體反應(yīng)產(chǎn)生美登木素生物堿-抗體免疫偶聯(lián)物。Chari等，Cancer Res.52127-131(1992)?？梢酝ㄟ^已知的方法修飾抗體，包含游離或保護的硫醇基的抗體然后與包含二硫化物的美登木素生物堿反應(yīng)產(chǎn)生所述偶聯(lián)物。所述抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物的細胞毒性可以在體外或體內(nèi)通過已知的方法來測定并可用IC50確定。
加利車霉素(calicheamicin)是另一個感興趣的免疫偶聯(lián)物。加利車霉素家族的抗生素能在亞-皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA中斷?？梢允褂玫募永嚸顾氐慕Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于γ11、α21、α31、N-乙酰-γ11、PSAG和θ11(Hinman等，Cancer Res.533336-3342(1993)和Lode等，Cancer Res.582925-2928(1998))?？梢赃B結(jié)抗體的其它抗腫瘤藥物包括QFA，其是一種抗葉酸物。加利車霉素和QFA都具有細胞內(nèi)的作用位點，不容易穿越質(zhì)膜。因此，通過抗體介導的內(nèi)在化作用對這些藥劑的細胞攝取大大地增強了它們的細胞毒性效果。
在抗體和具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內(nèi)切酶，例如脫氧核糖核酸酶，DNase))之間形成的免疫偶聯(lián)物也是預(yù)期的。
抗體也可以與高放射性原子結(jié)合。用于產(chǎn)生放射性共軛抗體的各種放射性核素是可獲得的。實例包括At211、Bi212、I131、In131、Y90、Re186、Re188、Sm153、P32和Pb212和Lu的放射性同位素。當所述偶聯(lián)物是用于診斷時，其可以包含用于閃爍成像研究的放射性原子，例如Tc99或I123、或用于核磁共振(nmr)成像(也稱為磁共振成像，mri)的自旋標記物，例如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可以用已知的方法將放射標記物或其它標記物摻入到所述偶聯(lián)物中。例如，可以利用包含，例如適當位置的氟-19或氫的適合的氨基酸前體，通過化學的氨基酸合成來生物合成或化學合成所述肽。Tc99或I123、Re186、Re188和In111標記物可以通過肽中的半胱氨酸殘基附著上。釔-90可以通過賴氨酸殘基附著。IODOGEN法可用于摻入碘-123，F(xiàn)raker等，Biohem.Biophys.Res.Commun.8049-57(1978)。在″Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy″(Chatal，CRC Press1989)中描述了結(jié)合放射性核素的其它方法。
做為選擇，可以通過重組技術(shù)或肽合成來制造包含抗體和細胞毒性藥劑的融合蛋白。DNA的長度可包含編碼所述偶聯(lián)物的兩個部分的各自的區(qū)域，所述區(qū)域可以是相互鄰近的，或由編碼接頭肽的區(qū)域分隔開來，所述接頭肽不破壞所述偶聯(lián)物的期望的性質(zhì)。
在另一個實施方式中，抗體可以與“受體”(如鏈霉抗生物素蛋白)結(jié)合用于在腫瘤的預(yù)靶向中使用，其中向病人施用抗體-受體偶聯(lián)物，然后用清除劑從循環(huán)中除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，再施用與細胞毒性藥劑(例如，放射性核苷酸)結(jié)合的“配體”(例如，抗生物素蛋白)。
(9)免疫脂質(zhì)體此處公開的抗體也可被配制為免疫脂質(zhì)體?！爸|(zhì)體”是由各種類型的類脂、磷脂和/或表面活性物質(zhì)組成的小的泡囊，對于向哺乳動物投送藥物是有用的。脂質(zhì)體的組分通常排列成雙分子層形式，類似于生物膜的脂質(zhì)分布。
通過本領(lǐng)域已知的方法制備包含抗體的脂質(zhì)體，例如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，774030(1980)；和美國專利No.4,485,045和4,544,545中描述的方法。在美國專利No.5,013,556中公開了具有增強的循環(huán)時間的脂質(zhì)體。
可以通過反相蒸發(fā)法，用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的類脂組合物來產(chǎn)生特別有用的脂質(zhì)體。通過規(guī)定孔徑大小的過濾材料擠出脂質(zhì)體來產(chǎn)生具有期望直徑的脂質(zhì)體。可以如Martin等，J.Biol.Chem.，257286-288(1982)中描述的，通過二硫化物交換反應(yīng)將本發(fā)明的抗體的Fab′片段結(jié)合到脂質(zhì)體上。選擇性地將化學治療劑(例如阿霉素)包含在脂質(zhì)體內(nèi)。參見Gabizon等，J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
(10)其它抗體修飾在此對抗體的其它修飾是預(yù)期的。例如，抗體可以與各種非蛋白的多聚體連接，非蛋白多聚體例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。也可以將抗體包裹在處于膠體藥物給藥系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳劑、納粒子和毫微囊劑)或大乳劑中的微囊中，所述微囊通過，例如，凝聚技術(shù)或界面聚合作用(例如，分別是羥甲基纖維素或明膠微囊，和聚-(甲基丙烯酸甲脂)微囊)來制備。在RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy，20th Ed.，Alfonso Gennaro，Ed.，PhiladelphiaCollege of Pharmacy and Science 2000)中公開了這種技術(shù)和適合的制劑。
C.凍干制劑此處描述的制劑也可以被制備為重構(gòu)的凍干制劑。凍干此處描述的蛋白或抗體，然后重構(gòu)以產(chǎn)生本發(fā)明的降低了粘度的穩(wěn)定的液體制劑。在這個特定的實施方式中，在如上所述制備了感興趣的蛋白之后，生產(chǎn)“預(yù)凍干制劑”。存在于所述預(yù)凍干制劑中的蛋白的量考慮到期望的劑量、施用的方式等來確定。例如，完整抗體的起始濃度可以從約2mg/ml到約50mg/ml，優(yōu)選的從約5mg/ml到約40mg/ml和最優(yōu)選的約20-30mg/ml。
(1)凍干制劑的制備需配制的蛋白一般存在于溶液中。例如，在本發(fā)明的增加了離子強度降低了粘度的制劑中，蛋白可以存在于pH值約4-8，優(yōu)選的約5-7的pH緩沖溶液中。取決于，例如，緩沖液和期望的制劑張力(例如重構(gòu)的制劑的張力)，緩沖液濃度可以從約1mM到約20mM，做為選擇從約3mM到約15mM。舉例性的緩沖液和/或鹽是那些藥學上可接受的、并可以從適合的酸、堿和它們的鹽產(chǎn)生的緩沖液或鹽，例如那些用“藥學上可接受的”定義的酸、堿或緩沖液。
在一個實施方式中，向預(yù)凍干制劑中添加溶解保護劑。在預(yù)凍干制劑中溶解保護劑的量一般地要使得在重構(gòu)時產(chǎn)生的制劑是等滲的。然而，高滲的重構(gòu)制劑也可能是適合的。此外，溶解保護劑的量不能太低，以致在凍干時發(fā)生無法接受量的蛋白質(zhì)降解/聚集。然而，在預(yù)凍干制劑中舉例性的溶解保護劑濃度是從約10mM到約400mM，做為選擇從約30mM到約300mM，做為選擇從約50mM到約100mM。舉例性的溶解保護劑包括糖和糖醇，例如蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。然而，在特定的環(huán)境下，某些溶解保護劑也可增加制劑的粘度。同樣地，應(yīng)當小心地選擇能最小化和中和這些影響的特定的溶解保護劑。在“溶解保護劑”的定義下，以上描述了額外的溶解保護劑，在此也稱為“藥學上可接受的糖”。
對于每個特定的蛋白或抗體與溶解保護劑的組合，蛋白與溶解保護劑的比例可以變化。對于抗體作為備選蛋白和糖(例如，蔗糖或海藻糖)作為溶解保護劑、用來產(chǎn)生高蛋白濃度的等滲重構(gòu)制劑的情況，溶解保護劑對抗體的摩爾比例可以是從約100到約1500摩爾溶解保護劑比1摩爾抗體，和優(yōu)選的從約200到約1000摩爾溶解保護劑比1摩爾抗體，例如從約200到約600摩爾溶解保護劑比1摩爾抗體。
在優(yōu)選的實施方式中，向預(yù)凍干制劑(pre-lyophilized formulation)添加表面活性劑是可取的。做為選擇，或此外，可以向凍干制劑和/或重構(gòu)制劑中添加表面活性劑。舉例性的表面活性劑包括非離子型表面活性劑例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；polyoxamers(例如poloxamer 188)；Triton；辛基糖苷鈉；十二烷基-、十四烷基-、亞麻油基(linoleyl)-、或硬脂酰-硫代甜菜堿(sulfobetaine)；十二烷基-、十四烷基-、亞麻油基-或硬脂酰-肌氨酸；亞麻油基-、十四烷基-、或十六烷基-甜菜堿；月桂酰胺丙基(lauroamidopropyl)-、椰油酰胺丙基(cocamidopropyl)-、亞油酰胺丙基(linoleamidopropyl)-、肉豆蔻酰胺丙基(myristamidopropyl)-、棕櫚酰胺丙基(palmidopropyl)-、或異硬脂酰胺丙基(isostearamidopropyl)-甜菜堿(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕櫚酰胺丙基-、或異硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油基?；撬徕c(sodiummethyl cocoyl-taurate)或甲基油烯基牛磺酸二鈉(disodium methyloleyl-taurate)；和MONAQUATM系列(Mona Industries，Inc.，Paterson，NewJersey)，聚乙二醇、聚丙二醇和乙烯和丙二醇的共聚物(例如Pluronics、PF68等等)。添加的表面活性劑的量使得其能降低重構(gòu)蛋白的微粒形成，并最小化重構(gòu)之后的微粒形成。例如，存在于預(yù)凍干制劑中的表面活性劑的量約0.001-0.5％，做為選擇約0.005-0.05％。
可以在所述預(yù)凍干制劑的制備中使用溶解保護劑(例如蔗糖或海藻糖)和填充劑(bulking agent)(例如甘露醇或甘氨酸)的混合物。填充劑可以容許產(chǎn)生沒有過多空穴在其中的均勻的凍干塊。其它藥學上可接受的運載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，例如那些在Remington′s Phannaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)中描述的，可以被包括在預(yù)凍干制劑(和/或凍干制劑和/或重構(gòu)制劑)中，只要它們不會對制劑的期望特性有不利的影響。可接受的運載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在應(yīng)用的劑量和濃度下對于接受者是無毒的，包括另外的緩沖劑；防腐劑；輔助溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；螯合劑，例如EDTA；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；可生物降解的聚合物，例如聚酯；和/或成鹽反離子，例如鈉。
只要是對需醫(yī)治的特定癥狀是必需的，此處的制劑也可包含超過一個蛋白，優(yōu)選的包含那些具有不給另一種蛋白帶來不利影響的互補活性的蛋白。例如，在單個制劑中提供與期望的靶點(例如，受體或抗原)結(jié)合的兩種或更多種抗體是可取的。這樣的蛋白以對預(yù)定目標有效的數(shù)量適當?shù)卮嬖谟诮M合物中。
體內(nèi)施用的制劑必須是無菌的。在凍干和重構(gòu)之前，或在之后，這可以用過濾除菌膜來過濾很容易的實現(xiàn)。做為選擇，例如，可以通過對除蛋白以外的成分，在約120℃高壓滅菌30分鐘來實現(xiàn)完整混合物的無菌化。
在蛋白、可選的溶解保護劑及其它可選的組分混合在一起之后，將制劑凍干。為此，許多不同的冷凍干燥器是可用的，例如Hull50TM(Hull，USA)或GT20TM(Leybold-Heraeus，Germany)冷凍干燥器。通過冷凍制劑，隨后在適合于初次干燥的溫度下從冷凍的內(nèi)容物中將冰升華來實現(xiàn)凍干。在這個條件下，產(chǎn)品溫度低于制劑的共熔點或坍縮溫度(collapse temperature)。一般地，用于初次干燥的保存溫度(shelf temperature)范圍從約-30℃到25℃(假如初次干燥期間產(chǎn)物保持冷凍)，處于適當?shù)膲毫ο?，范圍一般從約50到250mTorr。制劑、容納樣品的容器的大小和類型(例如，玻璃小瓶)和液體的體積將主要決定干燥所需的時間，其可以在幾小時到幾天的范圍內(nèi)變動(例如，40-60小時)。任選地，取決于產(chǎn)品中期望的殘留水分水平，也可以進行第二次干燥。進行第二次干燥的溫度范圍從約0到40℃，主要取決于容器的類型和大小以及使用的蛋白的種類。例如，在凍干的整個除水階段中保存溫度可以是約15-30℃(例如，約20℃)。第二次干燥所需的時間和壓力是能產(chǎn)生適合的凍干塊的時間和壓力，取決于，例如溫度及其它參數(shù)。第二次干燥時間由在產(chǎn)物中期望的殘留水分水平來決定，一般地需要至少約5小時(例如，10-15小時)。壓力可以是與初次干燥步驟期間使用的相同。取決于制劑和小瓶的大小，凍干條件可以變化。
2.凍干制劑的重構(gòu)在向病人施用之前，用藥學上可接受的稀釋劑重構(gòu)凍干制劑，從而使在重構(gòu)制劑中的蛋白濃度為至少約50mg/ml，例如約50mg/ml到約400mg/ml，做為選擇約80mg/ml到約300mg/ml，做為選擇約90mg/ml到約150mg/ml。當希望在皮下投遞重構(gòu)制劑時，在重構(gòu)制劑中的這種高蛋白濃度被認為是特別有用的。然而，對于其它給藥途徑，例如靜脈內(nèi)施用，重構(gòu)制劑中較低的蛋白濃度可能是所期望的(例如，在重構(gòu)制劑中的蛋白為約5-50mg/ml，或約10-40mg/ml)。在某些實施方式中，重構(gòu)制劑中的蛋白濃度比預(yù)凍干制劑中的濃度顯著的高。例如，重構(gòu)制劑中的蛋白濃度可以是預(yù)凍干制劑中的蛋白濃度的約2-40倍、做為選擇3-10倍、做為選擇3-6倍(例如至少三倍或至少四倍)。
盡管也可以自由地使用其它溫度，一般地在約25℃發(fā)生重構(gòu)以確保完全的水化。重構(gòu)所需的時間取決于，例如，稀釋劑的類型、賦形劑的數(shù)量和蛋白。舉例性的稀釋劑包括無菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩沖溶液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水)、無菌鹽水、Ringer溶液或葡萄糖溶液。稀釋劑選擇性地包含防腐劑。舉例性的防腐劑已經(jīng)在上文中描述了，芳香醇類例如苯甲醇或酚醇是優(yōu)選的防腐劑。使用的防腐劑的數(shù)量通過評定不同的防腐劑濃度對蛋白的兼容性和防腐效率試驗來確定。例如，如果防腐劑是芳香醇類(例如苯甲醇)，其數(shù)量可以是約0.1-2.0％和優(yōu)選的約0.5-1.5％，但最優(yōu)選的約1.0-1.2％。
優(yōu)選的，重構(gòu)制劑少于每瓶6000個粒子，粒子大小≥10μm。
D.液體制劑通過將具有期望的純度的活性成分與可選的藥學上可接受的運載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，制備保存所用的治療制劑(Remington′s PharmaceuticalSciences 18th edition，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.18042 )?？山邮艿倪\載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用的劑量和濃度下對接受者是無毒的，包括緩沖液，抗氧化劑，包括抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素E、焦亞硫酸鈉；防腐劑，等滲劑，穩(wěn)定劑，金屬復(fù)合物(例如Zn蛋白質(zhì)復(fù)合物)；螯合劑例如EDTA和/或非離子型表面活性劑。
當治療劑是抗體片段時，特異地與目標蛋白的結(jié)合區(qū)結(jié)合的最小的抑制片段是優(yōu)選的。例如，根據(jù)抗體的可變區(qū)序列，抗體片段乃至肽分子可以被設(shè)計為保持了與目標蛋白序列結(jié)合的能力。這種肽可以化學合成和/或通過DNA重組技術(shù)生產(chǎn)(參見，例如，Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA907889-7893 )。
使用緩沖液來將pH值控制在一定范圍，該pH值能使療效最優(yōu)化，特別是穩(wěn)定性依賴于pH值時。緩沖液優(yōu)選的濃度范圍從約50mM到約250mM。本發(fā)明使用的適合的緩沖劑包括有機的和無機的酸，和它們的鹽。例如，檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、葡糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、醋酸鹽。另外，緩沖液可以由組氨酸和三甲胺鹽組成，例如Tris。
添加防腐劑以抑制微生物生長，一般地范圍為0.2％-1.0％(w/v)。本發(fā)明使用的適合的防腐劑包括，例如十八烷二甲基苯基氯化銨；氯化六烴季銨；苯甲烴銨鹵化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)，氯化芐乙氧銨；硫柳汞，苯酚，丁基甲醇或苯甲醇；烴基對羥苯甲酸，例如甲基對羥苯甲酸或丙基對羥苯甲酸；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇，3-戊醇，和m-甲酚。.
含有張力劑(tonicity agent)，有時被稱為“穩(wěn)定劑”，來調(diào)整或維持組合物的液體張力。當使用大的、帶電生物分子例如蛋白和抗體時，它們通常稱為“穩(wěn)定劑”，因為它們能與氨基酸側(cè)鏈的帶電基團作用，從而減少分子內(nèi)和分子間相互作用的可能性。考慮到其它成分的相對數(shù)量，張力劑可以以重量計在0.1％到25％之間，優(yōu)選的1到5％之間的任何量存在。張力劑包括多羥基糖醇，優(yōu)選的三羥基或更高級的糖醇，例如甘油、赤蘚醇、阿拉伯醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。
另外的賦形劑包括可以充當一個或多個以下試劑的試劑(1)填充劑，(2)溶解增強劑，(3)穩(wěn)定劑和(4)抑制變性或?qū)θ萜鞅诘母街乃巹?。穩(wěn)定劑的范圍可以是從0.1到10,000重量份的活性蛋白或抗體。典型的穩(wěn)定劑包括多羥基糖醇(在上文中列舉了)；氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、等等；有機糖或糖醇，例如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇四糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、myoinisitol、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環(huán)多醇(例如，環(huán)己六醇)、聚乙二醇；含硫還原劑，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量蛋白，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其它免疫球蛋白；親水多聚體，例如聚乙烯吡咯烷酮；單糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖(例如，乳糖、麥芽糖、蔗糖)；三糖，例如棉子糖；和多聚糖例如糊精或葡聚糖。
含有非離子型表面活性劑或洗滌劑(也稱為“潤濕劑”)以幫助治療劑溶解，以及保護治療蛋白對抗攪動引起的聚集，其也容許制劑遭受剪切表面應(yīng)力而不導致活性治療蛋白或抗體的變性。非離子型表面活性劑的范圍約0.05mg/ml到約1.0mg/ml，優(yōu)選的約0.07mg/ml到約0.2mg/ml。
適合的非離子型表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80，等等)，polyoxamers(184、188等)，Pluronicpolyols，Triton，聚氧化乙烯山梨聚糖單醚(polyoxyethylene sorbitan monoether)(Tween-20，Tween-80，等等)，lauromacrogol 400，聚氧40硬脂酸鹽(酯)，聚氧乙烯氫化蓖麻油(polyoxyethylene hydrogenated castor oil)10、50和60，單硬脂酸甘油酯，脂肪酸糖酯，甲基纖維素和羧甲基纖維素?？梢允褂玫年庪x子洗滌劑包括十二烷基硫酸鈉，磺基丁二酸二辛基鈉(dioctyle sodum sulfosuccinate)和二辛基磺酸鈉(dioctyl sodium sulfonate)。陽離子洗滌劑包括氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)或氯化芐乙氧銨(benzethonium chloride)。
為了將制劑用于體內(nèi)施用，它們必須是無菌的?？梢杂眠^濾除菌膜過濾來使制劑無菌化。此處的治療組合物一般地被放入到具有無菌的進人孔的容器中，例如，靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶。
施用途徑是按照已知的和公認的方法，例如通過單個或多個大丸劑給藥(bolus)，或以合適的方式在一段長時間內(nèi)輸注，例如，通過皮下的、靜脈的、腹膜內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、動脈內(nèi)的、病灶內(nèi)的或關(guān)節(jié)內(nèi)的途徑，局部施用，吸入或通過持續(xù)釋放或延時釋放的方法。
只要是對需醫(yī)治的特定癥狀是必需的，此處的制劑也可包含超過一個活性化合物，優(yōu)選的包含那些具有不會相互帶來不利影響的互補活性的活性化合物。做為選擇，或此外，所述組合物可包括細胞毒性藥劑、細胞因子或生長抑制劑。這樣的分子以對預(yù)定目標有效的數(shù)量適當?shù)卮嬖谟诮M合物中。
也可以將活性成分包裹在處于膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳劑、納粒子和毫微囊劑)或大乳劑中的微囊中，所述微囊通過，例如，凝聚技術(shù)或界面聚合作用(例如，分別是羥甲基纖維素或明膠微囊，和聚-(甲基丙烯酸甲脂)微囊)來制備。在Remington′s PharmaceuticalSciences 18th edition，同上，中公開了這種技術(shù)。
可以制備持續(xù)釋放制備物。持續(xù)釋放制備物的適合的實例包括，包含抗體的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)處于有形物的形式，例如薄膜，或微囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-異丁烯酸)，或聚(乙烯基乙醇))、聚交酯(美國專利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物，例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。已經(jīng)用人生長激素(rhGH)、干擾素-(rhIFN-)、白細胞介素-2和MN rpg 120成功地進行了用于持續(xù)釋放的重組蛋白微囊化。Johnson等，Nat.Med.2795-799(1996)；Yasuda等，Biomed.Ther.271221-1223(1993)；Hora等，Bio/Technology8755-758(1990)；Cleland，″Design and Production of Single Immunization Vaccines Using PolylactidePolyglycolide Microsphere Systems，″in Vaccine DesignThe Subunit andAdjuvant Approach，Powell和Newman，eds.，(Plenum PressNew York，1995)，pp.439-462；WO 97/03692；WO 96/40072；WO 96/07399；and美國專利No.5,654,010.
這些蛋白的持續(xù)釋放制劑可以利用聚乳酸-羥基乙酸(polylactic-coglycolic acid)(PLGA)聚合物來開發(fā)，因為PLGA具有生物適應(yīng)性和廣泛的生物可降解性質(zhì)。PLGA的降解產(chǎn)物，乳酸和羥基乙酸可以很快地從人體中清除。此外，取決于其分子量和組成，這個聚合物的降解性可以從數(shù)月到數(shù)年間調(diào)整。Lewis，″Controlled release of bioactive agents fromlactide/glycolide polymer″，in Biodegradable Polymers as Drug DeliverySystems(Marcel Dekker；New York，1990)，M.Chasin and R.Langer(Eds.)pp.1-41。
聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸允許釋放分子超過100天，某些水凝膠在較短的時期內(nèi)釋放蛋白。當封裝的抗體在體內(nèi)保持很長時間時，作為暴露在37℃的潮濕環(huán)境的結(jié)果，它們可能變性或聚集，導致生物學活性的喪失和可能在免疫原性方面產(chǎn)生變化。取決于其中包含的機制，為了穩(wěn)定性可以設(shè)計出合理的策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機制是通過硫代-二硫化物互換的分子間S-S鍵形成，可以通過修飾巰基殘基、從酸性溶液凍干、控制含水量、利用適當?shù)奶砑觿?、和開發(fā)特別的聚合物基質(zhì)組合物來實現(xiàn)穩(wěn)定。
脂質(zhì)體或類蛋白組合物也可被用于配制此處公開的蛋白或抗體。參見美國專利No.4,925,673和5,013,556。
此處描述的蛋白和抗體的穩(wěn)定性可以通過使用無毒的“水溶性多價金屬鹽”來增強。實例包括Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Sn2+、Sn4+、Al2+、和Al3+?？梢耘c上述多價金屬陽離子形成水溶性的鹽類的陰離子的實例包括那些由無機酸和/或有機酸形成的陰離子。這種水溶鹽在水中的溶解度(20℃)至少約20mg/ml，做為選擇至少約100mg/ml，做為選擇至少約200mg/ml。
可用于形成所述“水溶性多價金屬鹽”的適合的無機酸包括鹽酸、乙酸、硫磺酸、硝酸、硫氰酸和磷酸?？梢允褂玫倪m合的有機酸包括脂肪族羧酸和芳香酸。在這個定義下的脂肪族酸可被定義為飽和的或不飽和的C2-9羧酸(例如，脂肪族的單、二和三羧酸)。例如，在這個定義下舉例性的一元羧酸包括飽和的C2-9一元羧酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、capryonic酸，和不飽和的C2-9一元羧酸，丙烯酸、propriolic甲基丙烯酸、巴豆酸和異巴豆酸。舉例性的二羧酸包括飽和的C2-9二羧酸，丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸和庚二酸，而不飽和C2-9二羧酸包括順丁烯二酸、反丁烯二酸、檸康酸和甲基延胡索酸。舉例性的三羧酸包括飽和的C2-9三羧酸，丙三羧酸和1，2，3-丁烷三羧酸。另外，這個定義的羧酸類還包含一個或兩個羥基形成羥基羧酸。舉例性的羥基羧酸類包括乙二醇酸、乳酸、甘油酸、羥基戊二酸、蘋果酸、酒石酸和檸檬酸。這個定義下的芳香酸包括苯甲酸和水楊酸。
通常使用的能用來幫助穩(wěn)定本發(fā)明的封裝的多肽的水溶性多價金屬鹽包括，例如(1)鹵族的無機酸金屬鹽(例如，氯化鋅、氯化鈣)、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽和硫氰酸鹽；(2)脂肪族羧酸金屬鹽(例如，乙酸鈣、醋酸鋅、calcium proprionate、羥乙酸鋅、乳酸鈣、乳酸鋅和酒石酸鋅)；和(3)芳香族羧酸金屬鹽，苯甲酸鹽(例如，苯甲酸鋅)和水楊酸鹽。
E.醫(yī)冶方法為了預(yù)防或醫(yī)冶疾病，活性藥劑的合適劑量將取決于需醫(yī)治的如上文定義的疾病類型、疾病的嚴重度和進程、施用藥劑是為了預(yù)防目的還是治療目的、先前的治療、病人的病史和對藥劑的反應(yīng)，和主治醫(yī)師的判斷。一次性或在醫(yī)治的系列過程中將藥劑適當?shù)厥┯媒o病人。
優(yōu)選的醫(yī)冶方法是醫(yī)治IgE介導的疾病。IgE介導的疾病包括特應(yīng)性疾病(atopic disorder)，其特征在于對許多普通的自然發(fā)生吸入和攝取的抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答、和持續(xù)不斷的產(chǎn)生IgE抗體的這樣一種遺傳的傾向。特定的特應(yīng)性疾病包括過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎和過敏性胃腸病。特應(yīng)性病人常常具有多發(fā)的過敏，意思是他們有針對許多環(huán)境過敏原，包括花粉、真菌(例如，霉菌)、動物和昆蟲碎屑和某些食物的IgE抗體，和由之產(chǎn)生的癥狀。
然而與增加的IgE水平有關(guān)的疾病并不局限于那些具有遺傳的(特應(yīng)性)病因的疾病?？磥硎荌gE介導的、并可以用本發(fā)明的制劑醫(yī)治的、與增加的IgE水平有關(guān)的其它疾病包括，超敏反應(yīng)(例如，過敏性超敏反應(yīng))、濕疹、蕁麻疹、過敏性支氣管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis)、寄生蟲病、間質(zhì)性膀胱炎(interstitial cystitis)、高IgE綜合征、共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥(ataxia-telangiectasia)、Wiskott-Aldrich綜合征、胸腺淋巴發(fā)育不全(thymic alymphoplasia)、IgE骨髓瘤和移植物抗宿主反應(yīng)。
過敏性鼻炎，也稱為過敏性鼻結(jié)膜炎或枯草熱，是對吸入的過敏原的特應(yīng)性反應(yīng)的最常見的表現(xiàn)形式，其嚴重程度和持續(xù)時間常常與暴露于過敏原的強度和時間有關(guān)。這是一種慢性病，可以在任何年齡首次出現(xiàn)，但通常在兒童期或青春期發(fā)作。典型的發(fā)作包括大量的水樣鼻溢液，陣發(fā)性的噴嚏、鼻塞和鼻、腭瘁、。鼻后的粘液引流還導致咽喉炎、throat clearing和咳嗽。也可以有過敏性瞼緣結(jié)膜炎的癥狀，伴有結(jié)膜和眼瞼的強烈搔癢、發(fā)紅、流淚和畏光。嚴重的發(fā)作常常伴有全身性的不適、虛弱、疲勞，和有時候在劇烈的噴嚏期間伴有肌肉疼痛。
哮喘，也稱為可逆的阻塞性氣道疾病，特征在于氣管支氣管樹對呼吸刺激物和支氣管收縮化學物質(zhì)的超反應(yīng)性，產(chǎn)生喘氣、呼吸困難、胸悶和咳嗽的發(fā)作，這種發(fā)作是自然可逆的、或由醫(yī)治而可逆的。這是涉及整個氣道的慢性病，嚴重程度從偶然的輕微瞬時反應(yīng)到嚴重的、慢性的、危急生命的支氣管阻塞。哮喘和特應(yīng)性反應(yīng)(atopy)可以共存，但僅約一半的哮喘患者也是特應(yīng)性的，更小比例的特應(yīng)性反應(yīng)的病人同時具有哮喘。然而，特應(yīng)性和哮喘不是完全獨立的，因為哮喘在特應(yīng)性的個體中比在無特應(yīng)性的個體中發(fā)生得更頻繁，特別是在兒童期。哮喘在歷史上已經(jīng)被進一步分解為兩個亞群，外因性哮喘和內(nèi)因性哮喘。
外因性哮喘，也稱為過敏性、特應(yīng)性、或免疫性哮喘，是對那些一般在年輕時、通常在幼兒期或兒童期出現(xiàn)哮喘的病人的描述。常常同時產(chǎn)生特應(yīng)性反應(yīng)的其它表現(xiàn)形式，包括濕疹或過敏性鼻炎。在花粉季節(jié)、存在動物時、或暴露于室內(nèi)塵埃、羽毛枕或其它過敏原中時，可以發(fā)生哮喘發(fā)作。皮膚試驗顯示出對病因過敏原的陽性疹塊和紅斑反應(yīng)。令人感興趣的是，總血清IgE濃度經(jīng)常增加，但有時是正常的。
內(nèi)因性哮喘，也稱為非過敏性或特發(fā)性哮喘(idiopathic asthma)，一般地在成年期首次發(fā)生，之后有明顯的呼吸道感染。癥狀包括與花粉季節(jié)或與暴露于其它過敏原無關(guān)的慢性的或復(fù)發(fā)性的支氣管阻塞。對常見的特應(yīng)性過敏原皮膚試驗是陰性的，血清IgE濃度正常。額外的癥狀包括痰血和嗜曙紅細胞增多。將哮喘分類為亞群的其它的方案，象阿斯匹林敏感的、運動誘導的、傳染性的和不過是心理上的，定義了與其它人相比對某些病人影響更大的外觸發(fā)因子。
最后，重點要注意的是，雖然一些分類方法以前僅將過敏性哮喘與IgE依賴性聯(lián)系起來，但現(xiàn)在有有力的統(tǒng)計學上顯著的數(shù)據(jù)顯示了IgE和哮喘(過敏性的和非過敏性的)之間的相關(guān)性。Chapter 27，“The Atopic Diseases”，A.I.Terr in Medical Immunology，9th Ed.，Simon and Schuster，Stites等，Ed.(1997)。因此，術(shù)語“IgE介導的疾病”對于本申請而言，包括過敏性的和非過敏性的哮喘。
哮喘發(fā)作的體征包括呼吸急促、可聽到的喘氣聲、和輔助呼吸肌的使用。一般也存在快速的脈搏和升高的血壓，也有外周血中嗜曙紅細胞水平升高和鼻分泌物增多。肺機能顯示出在肺通量和第1秒用力呼氣量方面的下降?？偡位盍亢凸δ苄詺垰饬恳话闶钦５幕蛏杂性黾?，但在極度的支氣管痙攣時會減少。
哮喘的病狀可以被區(qū)分為早期階段和晚期階段反應(yīng)。早期階段的特點在于平滑肌收縮、浮腫和分泌過多，而晚期反應(yīng)的特點在于細胞炎癥。哮喘可以被各種非特定的觸發(fā)物誘導，包括感染(例如，病毒性呼吸道感染)、生理因素(例如，運動、換氣過度、深呼吸、心理因素)、大氣的因素(例如，二氧化硫、氨、冷空氣、臭氧、蒸餾水蒸汽)，食入物(例如，普萘洛爾(propranolol)、阿斯匹林、非甾類抗炎藥物)、試驗性吸入物(例如，高滲溶液、檸檬酸、組胺、乙酰甲膽堿、前列腺素F2α)和職業(yè)性的吸入物(例如，isocyantes)。引起過敏性哮喘的各種其它職業(yè)性或環(huán)境過敏原包括，動物產(chǎn)品、昆蟲塵屑、海洋生物、植物產(chǎn)品、水果、種子、葉子和花粉、有機染料和墨水、微生物藥劑、酶、治療劑、殺菌劑、無機的和有機的化學藥品。
特應(yīng)性皮炎，也稱為濕疹、神經(jīng)性皮膚炎、特應(yīng)性濕疹或Besnier′s癢疹，是常見的皮膚疾病，是具有家族性和特應(yīng)性免疫學特征的病人群體特有的?；咎卣魇丘岬钠つw炎癥性反應(yīng)，其誘導了偏愛某些部位的特征性對稱分布的皮疹。B淋巴細胞過量產(chǎn)生IgE也是常見的。雖然特應(yīng)性皮炎由于其與過敏性鼻炎和哮喘和高IgE水平的相關(guān)性被分類為特異反應(yīng)的皮膚表現(xiàn)形式，然而，皮炎的嚴重程度不一定與皮膚試驗上暴露于過敏原相關(guān)，脫敏療法不能有效的治療(不同于其它過敏性疾病)。雖然高量血清IgE是診斷過敏性哮喘的確證，但正常的水平不能排除其可能性。疾病的發(fā)作可以發(fā)生在任何年齡，病變急性地開始，具有紅斑狀的水腫丘疹或帶鱗屑的斑塊。搔癢導致滲液和結(jié)痂，然后導致慢性的苔癬樣硬化。在細胞水平上，急性病變是水腫性的，真皮被單核細胞、CD4淋巴細胞浸潤。嗜中性粒細胞、嗜曙紅細胞、漿細胞和嗜堿性細胞很少，但是存在脫粒化的肥大細胞。慢性病變的特征是表皮增生、皮膚角化過度和角化不全，真皮被單核細胞、郎格漢斯細胞和肥大細胞浸潤。也可以有病灶區(qū)域的纖維化，包括累及小神經(jīng)的神經(jīng)束膜。
過敏性胃腸病也稱為嗜酸性胃腸病(eosinophilic gastroenteropathy)，是少見的特應(yīng)性表現(xiàn)形式，其中多種IgE食物敏感性與局部的胃腸道粘膜反應(yīng)相關(guān)。在成年人中是少見的，但是更常見的，但為瞬時性的，在嬰兒中存在。當攝取的食物過敏原與空腸粘膜上的局部IgE抗體反應(yīng)釋放肥大細胞調(diào)節(jié)物時產(chǎn)生這種情況，導致進餐后不久的消化系統(tǒng)癥狀。持續(xù)性暴露產(chǎn)生的慢性炎癥，導致胃腸蛋白喪失和低蛋白性水腫?？梢杂凶銐蛎黠@的經(jīng)由發(fā)炎的腸粘膜的失血從而導致缺鐵性貧血。在暴露于過敏原之后在上部胃腸道粘膜局部地發(fā)生過敏反應(yīng)，但可以通過避開過敏原而解除。
過敏反應(yīng)和蕁麻疹明顯的是IgE介導的，但是沒有遺傳決定性，對于特應(yīng)性的個體沒有偏愛。過敏反應(yīng)是急性的、同時涉及幾個器官系統(tǒng)的全身性過敏反應(yīng)，涉及的器官系統(tǒng)通常為心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)。所述反應(yīng)是免疫介導的，當暴露于患者先前已被其致敏的過敏原時發(fā)生反應(yīng)。蕁麻疹和血管性水腫是指物理的腫脹、紅斑和搔癢，由表皮血管上的受組胺刺激的受體引起，是全身過敏的標志性皮膚特征。全身過敏是由藥物、昆蟲毒液或食物引起的同時在多個器官中發(fā)生的IgE介導的反應(yīng)。其是由過敏原誘導的、負載在肥大細胞上的IgE突然引起，導致在各種重要器官的功能方面影響深遠的和危急生命的變化。幾乎同時地發(fā)生血管坍縮(collapse)、急性氣道阻塞、皮膚血管舒張和水腫、和胃腸的和泌尿生殖器的肌肉痙攣，盡管不一定達到相同的程度。
過敏反應(yīng)的病狀包括血管性水腫和肺過度膨脹，具有氣道的粘液栓和局限性肺膨脹不全。在細胞水平上，肺部與急性哮喘發(fā)作期間的表現(xiàn)類似，出現(xiàn)支氣管粘膜下腺分泌過多、粘膜和粘膜下層水腫、支氣管周的血管充血和支氣管壁中的嗜曙紅細胞增多?？赡艽嬖诜嗡[和出血。也可能存在支氣管肌肉痙攣、過度膨脹、甚至肺泡破裂。人過敏反應(yīng)的重要的特征包括水腫、血管充血，和喉、氣管、會厭和舌的固有層中嗜曙紅細胞增多。
暴露于過敏原可以是經(jīng)由攝食、注射、吸入或與皮膚或粘膜的接觸。在暴露于過敏原后數(shù)秒或數(shù)分鐘內(nèi)開始反應(yīng)?？赡艽嬖谧畛醯臑l死恐懼或感覺，隨后很快出現(xiàn)一個或多個靶器官系統(tǒng)中的癥狀，靶器官系統(tǒng)是心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)。
導致過敏反應(yīng)的過敏原與那些通常和特應(yīng)性相關(guān)的過敏原不同。食物、藥物、昆蟲毒液或膠乳(latex)是常見的來源。食物過敏原包括那些在甲殼動物、軟體動物(例如，龍蝦、蝦、蟹)、魚、豆類(legume)(例如，花生、豌豆、蠶豆、甘草)、種子(例如，芝麻、棉籽、葛縷子、介子、亞麻子、葵花子)、堅果、漿果、蛋白、蕎麥和牛奶中的過敏原。藥物過敏原包括那些在異源蛋白質(zhì)和多肽、多聚糖和半抗原藥物中存在的過敏原。昆蟲過敏原包括膜翅目昆蟲，包括蜜蜂、小黃蜂、大黃蜂、胡蜂和火蟻。
腎上腺素是用于過敏反應(yīng)的典型的醫(yī)冶手段，對于不太嚴重的蕁麻疹或血管性水腫反應(yīng)一般開出抗組胺劑或其它組胺阻斷劑的處方。
F.組合治療可以將本發(fā)明的方法與已知的醫(yī)治IgE介導的疾病的方法組合，既可以作為組合的或附加的醫(yī)治步驟，也可以作為治療制劑的額外組分。
例如，可以在本發(fā)明的抗IgE抗體之前，或與之成比例地施用抗組胺劑，特別是非鎮(zhèn)靜性抗組胺劑。適合的抗組胺劑包括屬于烷基胺(例如，氯芬胺)、乙醇胺(例如，苯海拉明)和吩噻嗪(例如，普魯米近)的那些抗組胺劑。許多抗組胺劑通過阻斷效應(yīng)細胞上的組胺受體位點來對拮抗組胺的藥理學效應(yīng)，其它常見的抗組胺劑通過阻斷組胺從肥大細胞釋放來起作用，所述肥大細胞已經(jīng)被過敏原-特異性的IgE致敏或裝備(例如，色甘酸鈉)。抗組胺劑的實例包括阿司咪唑、馬來酸哌吡庚啶、馬來酸bropheniramine、馬來酸氯苯吡醇胺、鹽酸西替利嗪、延胡索酸氯馬斯汀、鹽酸二苯環(huán)庚啶、馬來酸右溴苯那敏、馬來酸右旋氯苯吡胺、氯茶堿苯海拉明、鹽酸苯海拉明、琥珀酸杜克西拉明、鹽酸fexofendadine、鹽酸t(yī)erphenadine、鹽酸羥嗪、loratidine、鹽酸敏克靜、檸檬酸曲吡那敏、鹽酸曲吡那敏、鹽酸丙吡咯啶。
IgE介導的疾病(例如，早期階段反應(yīng))的特定癥狀可以用擬交感神經(jīng)藥或具有支氣管舒張效應(yīng)的藥物來改善。腎上腺素是有廣泛作用的阿爾法和貝塔腎上腺素能藥物，常常以0.2-0.5mL的1∶100水溶液皮下施用。當期望有更長持續(xù)時間的影響時，也可以以1∶200懸浮液使用腎上腺素的長久作用形式(例如，間羥叔丁腎上腺素)。適合的其它貝塔腎上腺素能藥物包括鼻部施用(例如，手持噴霧器、間歇性正壓呼吸裝置或計量加壓吸入器)或口服的舒喘寧、吡布特羅、間羥異丙腎上腺、salmeterol、新異丙腎上腺素和formoterol。
也可以通過施用黃嘌呤來實現(xiàn)支氣管擴張，特別是通過與上述擬交感神經(jīng)藥物共同施用來實現(xiàn)。黃嘌呤的實例包括氨茶堿(靜脈注射，250-500mg)和茶堿(口服，10-20μg/ml血清濃度)。
其它來自各種IgE介導的疾病(例如，晚期階段反應(yīng))的癥狀可以通過用糖皮質(zhì)激素或其它具有抗炎效果的藥物的治療來減弱。對于嚴重的發(fā)作全身地施用脫氫可的松(30-60mg每天)，而對于長期的維持治療，以氣霧劑形式施用二丙酸氯地米、氟羥脫氫皮質(zhì)醇丙酮化物和氟尼縮松。具有抗炎效應(yīng)的其它類固醇包括倍他米松、布地縮松、地塞米松、醋酸氟氫可的松、氟尼縮松、丙酸氟替卡松、氫化可的松、甲基強的松龍、氫化潑尼松、脫氫可的松、氟羥脫氫皮質(zhì)醇。
也可用于與本發(fā)明的治療方法相聯(lián)合的非甾族抗炎藥物包括醋氨酚、乙酰水楊酸、溴芬酸鈉、二氯苯胺苯乙酸鈉、二氟苯水楊酸、etodolac、苯氧基氫化阿托酸鈣、氟比洛芬、布洛芬、吲哚氯甲酰、酮洛芬、甲氯胺苯酸鈉、甲滅酸、萘丁美酮、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸鈉、羥保泰松、phenylbutzone、吡羅昔康、舒林酸、甲苯酰吡酸鈉。
此外，也可以施用減充血劑(例如，苯腎上腺素、苯丙醇胺、pseudoephadrin)、咳嗽抑制劑(例如，美沙芬、可待因或氫可酮)或鎮(zhèn)痛藥(例如，醋氨酚、阿斯匹林)來實現(xiàn)治療效益的最大化。
過敏原脫敏感作用是一種治療形式，其中將過敏原注入到病人體內(nèi)來達到降低或消除過敏反應(yīng)的目的。這也稱為過敏原免疫療法、脫敏作用或過敏癥注射治療。通常與其它過敏癥治療方法組合使用，但常不會作為主要醫(yī)治方法。其已經(jīng)成功地應(yīng)用在不可能回避過敏原的情況。典型的過敏原脫敏治療包括以不斷增加的劑量每周一次或兩次皮下注射無菌過敏原，直到能夠在注射部位生產(chǎn)瞬時的微小局部炎癥的劑量為止。然后按照維持時間表每2-4周給予這個劑量。過敏性脫敏感作用最常用于過敏性哮喘和過敏性鼻炎的醫(yī)治，盡管其在醫(yī)治過敏反應(yīng)中也已經(jīng)獲得了成功。通過使用佐劑也有效地進行了脫敏感作用，佐劑例如弗氏不完全佐劑，其是一種在礦物油中含水性抗原的乳劑。其生理效應(yīng)產(chǎn)生了一種不溶解的液體保存庫，從其中可以逐漸地釋放過敏原的微滴。過敏原脫敏感作用的另一個形式是將單體的過敏原與戊二醛聚合以產(chǎn)生相對低的過敏原性(例如，導致過敏反應(yīng))的分子，而保持免疫原性的有效水平。
G.藥物劑量本發(fā)明的藥物組合物的劑量和期望的藥物濃度可取決于預(yù)想的特定用途而變化。確定合適劑量或給藥途徑完全在普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。動物試驗為確定用于人類治療的有效劑量提供了可靠的指導?？梢愿鶕?jù)Mordenti，J.和Chappell，W.″The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics，″In Toxicokinetics and New Drug Development，Yacobi等，Eds，Pergamon Press，New York 1989，pp.42-46中提出的原則進行有效劑量的種間換算。
當進行此處描述的多肽或抗體的體內(nèi)施用時，正常的劑量數(shù)取決于給藥途徑可以從每天約10ng/kg直到約100mg/kg哺乳動物體重或更多，優(yōu)選的約1mg/kg/天到10mg/kg/天。已經(jīng)在文獻中提供了對給藥的特別劑量和方法的指導，參見，例如美國專利No.4,657,760；5,206,344或5,225,212。包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的是，不同的制劑對于不同的醫(yī)冶和不同的疾病是有效的，以及意圖醫(yī)治特定器官或組織的施用可能必需以不同于醫(yī)治另一個器官或組織的方式來給藥。此外，可以通過一次或多次獨立的的施用，或通過連續(xù)的輸注來按劑量給藥。對于持續(xù)幾天或更長時間的重復(fù)施用，取決于其條件，持續(xù)進行醫(yī)冶直到產(chǎn)生期望的對疾病癥狀的抑制。然而，其它給藥方案也是有用的?？梢酝ㄟ^傳統(tǒng)的技術(shù)和分析來容易地監(jiān)測治療的進展。
H.制劑的施用本發(fā)明的制劑，包括但不限于重構(gòu)制劑，根據(jù)已知的方法，例如以大丸劑形式(bolus)靜脈施用，或通過肌肉內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、腦脊髓內(nèi)的、皮下的、關(guān)節(jié)內(nèi)的、滑液內(nèi)的、鞘膜內(nèi)的、口服的、局部的或吸入的途徑，在一段時間內(nèi)的連續(xù)輸注，來向需要用蛋白醫(yī)治的哺乳動物施用，所述哺乳動物優(yōu)選的是人。
在優(yōu)選的實施方式中，通過皮下施用(例如，在皮膚之下)將所述制劑施予哺乳動物。為此，可以利用注射器注射所述制劑。然而，用于施用所述制劑的其它裝置是可用的，例如注入裝置(例如，Inject-easeTM和GenjectTM裝置)；注射筆(例如GenPenTM)；自動注射裝置、無針的裝置(例如，MediJectorTM和BioJectorTM)和皮下小片給藥系統(tǒng)(subcutaneous patch delivery systems)。
在特定的實施方式中，本發(fā)明涉及用于單劑量給藥單位的試劑盒。這種試劑盒包括治療蛋白或抗體的水性制劑的容器，包括單腔的或多腔的預(yù)填充注射器。舉例性的預(yù)填充注射器可從Vetter GmbH，Ravensburg，Germany獲得。
所述蛋白的合適劑量(“治療有效量”)將取決于，例如，需醫(yī)治病情、病情的嚴重度和進程、施用蛋白是為了預(yù)防目的還是治療目的、先前的治療、病人的病史和對蛋白的反應(yīng)，使用的蛋白種類、和主治醫(yī)師的判斷。一次性或在一系列醫(yī)冶過程中向病人施用蛋白，也可自診斷后任何時候向病人施用。所述蛋白可以作為唯一的醫(yī)冶方法來施用，或與在醫(yī)治當前病情中有用的其它藥物或治療方法組合施用。
備選的蛋白是抗體，約0.1-20mg/kg是向病人施用的最初候選劑量，例如，不論是一次還是多次的獨立施用。然而，其它給藥方案也是有用的?？梢酝ㄟ^傳統(tǒng)的技術(shù)來容易地監(jiān)測治療的進展。
抗IgE制劑(例如，rhuMAbE-25、rhMAbE-26、Hu-901)的用途包括醫(yī)治或預(yù)防例如IgE介導的過敏性疾病、寄生蟲感染、間質(zhì)性膀胱炎(interstitialcystitis)和哮喘。取決于需醫(yī)治的疾病或病癥，向病人施用治療有效量(例如，約1-15mg/kg)的抗IgE抗體。
I.制品在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供包含所述制劑的制品，優(yōu)選提供它的使用說明。所述制品包括容器。適合的容器包括，例如，瓶子、小瓶(例如，雙腔小瓶)、注射器(例如，單腔或雙腔注射器)和試管。所述容器可以由各種材料例如玻璃或塑料制成。裝有所述制劑的容器和位于容器上，或與之關(guān)聯(lián)的標簽，可以標明重構(gòu)和/或使用的指示。標簽可進一步說明所述制劑對皮下施用有用或是供皮下施用的。帶有所述制劑的容器可以是多次使用的小瓶，其容許重復(fù)施用(例如，2-6次施用)重構(gòu)制劑。所述制品可進一步包括包含適合的稀釋劑(例如，BWFI)的第二容器。在混合所述稀釋劑和凍干制劑時，在重構(gòu)制劑中的最終蛋白濃度一般地是至少50mg/ml。所述制品可進一步包括從商業(yè)和用戶立場出發(fā)的其它所需的材料，包括其它的緩沖液、稀釋劑、過濾器、針、注射器和帶使用說明的包裝插頁。
通過參考以下實施例將能更充分地理解本發(fā)明。然而，這些實施例不能被看作是對本發(fā)明的范圍的限制。在此引用的所有內(nèi)容全文納入本文作參考。
在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包含此處描述的制劑用于在自動注射器裝置中施用的制品。自動注射器可被描述為一種在啟動時無需病人或施用者的額外的必要動作而投送其內(nèi)容物的注射裝置。當給藥速率必需恒定和給藥時間比較長時，它們特別適合于治療制劑的自我藥療。
實施例1抗IgE rhuMAbE25(“E25”)制劑的制備從E25散裝物(bulk residual)Lot K9094A(40mg/ml rhuMAb E25，85mM海藻糖，5mM組氨酸，pH6，0.01％吐溫20)或rhuMAbE25Q-Pool(5mg/mlrhuMAb E25，25mM Tris，200mM NaCl)制備單克隆抗IgE抗體rhuMAbE25的制劑。
通過利用Slide-A-Lyzer透析盒(Pierce)在2-8℃透析到不同的緩沖液(20mM His-HCl和200mM Arg-HCl，pH6.0)中來制備rhuMAbE25的水溶液。然后將樣品轉(zhuǎn)移到Centricon-30離心微型濃縮器(Amicon)的樣品儲存器中。通過在4000-5000g旋轉(zhuǎn)Centricon-3濃縮器濃縮所述蛋白，直到達到期望的蛋白濃度。
然后利用超濾作用將樣品濃縮到～150mg/ml rhuMAb E25。向每個制備物添加吐溫20到0.02％的終濃度。過濾所有制劑，在Class 100房間中無菌地填入3cc FormaVitrum小瓶中，用13-mM Diakyo塞子塞住。
實施例2方法和材料穩(wěn)定性研究在Class 100無菌灌裝房間內(nèi)將所有制劑1ml填入3ccFormaVitrum玻璃小瓶中，用13-mm Diakyo塞子塞住。將小瓶置于-70℃、2-8℃、15℃和30℃的不透光容器中。
攪動研究將每個制劑的等分量置于玻璃小瓶中。在Glas-Col Bench Top搖動器上在室溫水平地攪動小瓶。將搖動器設(shè)定為70，具有30cm臂長(最大的)。在攪動以后，根據(jù)以下方案檢查和分析樣品。
凍融研究使E25的樣品經(jīng)歷三個凍融循環(huán)。每個循環(huán)包括在-70℃冷凍過夜，和隨后在室溫解凍約一小時。在每個循環(huán)之后，利用光箱(light box)視覺上檢查樣品以評定液體的顏色和透明度。遵循如下所述的方案測量混濁度和可溶解的聚集體。
分析方法通過表1中列出的方法分析樣品穩(wěn)定性表1分析方法

a顏色、外觀和透明度的檢查相對于檢查用的白色和黑色背景視覺上評定樣品的顏色、外觀和透明度，與等體積的陰性對照相對比。應(yīng)對樣品小心地打旋以確保同質(zhì)的混合，但不應(yīng)太大力以致產(chǎn)生氣泡。
b大小排阻層析將TSK SUPER SW3000(4.6×300mm)柱用于HP 1100層析系統(tǒng)中。柱用20μg蛋白質(zhì)上樣，在0.1M磷酸鉀中洗脫，pH6.8。用UV檢測器在280nm檢測樣品。
c疏水性相互作用層析(HIC)利用TSK Phenyl-5PW(7.5×75mm)柱(TosoHaas)在HP 1100液相色譜系統(tǒng)上進行HIC實驗。柱用28μg木瓜蛋白酶消化的Fab片段上樣，用20mMTris緩沖液中的硫酸銨濃度梯度從2M到0M洗脫。通過UV檢測器在210nm監(jiān)視波峰。
d混濁度在1cm通光長度的比色杯中利用HP分光光度計確定樣品的混濁度。按照340-360nm的平均吸光率計算混濁度。
e抗IgE單克隆抗體的活性通過受體結(jié)合抑制分析來確定。在包含磷酸緩沖液、0.5％BSA、0.05％聚山梨醇酯20、0.01％Thimerosol的分析稀釋劑中將樣品稀釋到100和1.56μg/ml的標準曲線范圍內(nèi)。用IgE受體包被微量滴定板，然后用IgE-生物素和稀釋的抗IgE樣品溫育。利用鏈霉抗生物素蛋白-HRP測定與抗IgE單克隆抗體的活性相關(guān)的、與受體結(jié)合的IgE-生物素的量。利用4參數(shù)邏輯曲線擬合程序分析數(shù)據(jù)。
f在Hewlett Packard 8453雙列分光光度計上用1cm石英比色杯得到抗體的濃度。用1.5cm-1(mg/ml)-1的吸光率計算濃度。
液體制劑的概要

150mg/ml E25在組氨酸和ArgHCl制劑中的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

80mg/ml E25在組氨酸和海藻糖制劑中的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

a.測量可溶性的聚集體和片段的大小排阻層析b.對木瓜蛋白酶消化的E25的疏水性相互作用層析c.IgE受體結(jié)合抑制分析d.平均OD值(340-360nm)攪動研究

制劑1156mg/ml E25、200mMArgCl、23mM His、0.02％T20制劑2150mg/ml E25、182mMArgCl、20mM His、0.02％T20
凍融研究

制劑1156mg/ml E25、200mMArgCl、23mM His、0.02％T20制劑2150mg/ml E25、182mMArgCl、20mM His、0.02％T20實施例3在20mM緩沖液中制備抗IgE單克隆抗體(E26)液體制劑的樣品，然后保存在30℃和40℃。E26的穩(wěn)定性通過層析和活性測量來確定。用大小排阻層析測定可溶性的聚集體，用對胃蛋白酶消化的樣品進行疏水性相互作用層析測量異構(gòu)化。利用IgE受體結(jié)合抑制分析監(jiān)視樣品的活性。如圖1、2和3所示，E26的降解高度依賴于緩沖液的pH值。E26在pH6.0左右顯得最穩(wěn)定。
實施例4微粒制劑是制造高濃度液體制劑的主要挑戰(zhàn)，因為在應(yīng)力狀態(tài)下它通常隨著蛋白濃度的增加而增加。圖4顯示了對濃縮的E26液體制劑的攪動研究的結(jié)果。在20mM琥珀酸鹽、192mM海藻糖，pH6.0，和不同濃度的聚山梨醇酯20中制備制劑。用渾濁度測定監(jiān)視微粒制劑。結(jié)果顯示隨著攪動時間E26溶液的混濁度增加。在應(yīng)力狀態(tài)下添加至少0.01％的聚山梨醇酯對于降低微粒形成是必不可少的。對于濃縮的E25液體制劑也觀察到了類似的結(jié)果。
實施例5圖5顯示了通過重構(gòu)凍干的E25來制備的150mg/ml E25的液體制劑。鹽濃度的增加抑制了可逆的微粒形成并導致混濁度讀數(shù)的降低。在所有測試的鹽之中，含有Arg-HCl的制劑看來具有最小的混濁度。對于用TFF方法制備的E25也觀察到了鹽濃度對于降低混濁度讀數(shù)的效果。
實施例6存在ArgHCl的E25液體制劑看來也比其它液體制劑有更好的穩(wěn)定性。圖6和7顯示了在包含ArgHCl、CaCl2和MgCl2的液體制劑中150mg/ml的E25的穩(wěn)定性研究結(jié)果。對于包含ArgHCl、有或者沒有蔗糖的液體制劑，就混濁度、異構(gòu)化和片段化而言在它們的穩(wěn)定性方面有少許的差異。包含ArgHCl的液體制劑比包含MgCl2和CaCl2的液體制劑更穩(wěn)定。
實施例7圖8顯示了對含有醋酸鹽的E25液體制劑和組氨酸制劑的穩(wěn)定性研究的結(jié)果。含有組氨酸的制劑比醋酸鹽制劑有更高的pH值。結(jié)果清楚地表明在組氨酸、ArgHCl液體制劑中E25比在其它條件下更穩(wěn)定。
實施例8在存在某些離子，例如檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和硫酸鹽(表1)，特別是在2-8℃的貯存溫度的情況下高濃度的E25可以形成固體凝膠。利用精氨酸-HCl作為賦形劑允許我們配制E25達到超過200mg/ml而不形成凝膠或沉淀。
表1各種賦形劑對125mg/ml，pH～6.0的E25凝膠化的影響

實施例9在大腸埃希氏菌中表達蛋白或抗體這個實施例說明了通過在大腸埃希氏菌中重組表達制備期望的蛋白或抗體的非糖基化形式。
最開始利用選定的PCR引物擴增編碼期望的蛋白或抗體的DNA序列。引物應(yīng)包含相應(yīng)于選定的表達載體上的限制性內(nèi)切酶位點的限制性內(nèi)切酶位點?？梢允褂酶鞣N表達載體。適合的載體的一個實例是包含氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因的pBR322(來源于大腸埃希氏菌；參見Bolivar等，Gene，295(1977))。用限制性內(nèi)切酶消化載體并脫去磷酸。然后將PCR擴增的序列連接到載體中。載體優(yōu)選的包括編碼抗生素抗性基因的序列、trp啟動子、polyhis前導區(qū)(包括開始的六個STII密碼子、polyhis序列和腸激酶裂解位點)、期望的蛋白或抗體的編碼區(qū)、λ轉(zhuǎn)錄終止子和argU基因。另外，載體可至少包括編碼期望的蛋白或抗體的天然核酸序列的非翻譯的5′和3′片斷的無意義的部分。
然后利用在Sambrook等，同上，中描述的方法用連接混合物轉(zhuǎn)化選定的大腸埃希氏菌菌株。通過能在LB平板上生長的能力鑒定出轉(zhuǎn)化體，然后選出抗生素抗性菌落。可以分離質(zhì)粒DNA，通過限制性分析和DNA測序來確認。
選出的克隆可以在液體培養(yǎng)基中，例如在補充有抗生素的LB肉湯中生長過夜。過夜的培養(yǎng)物隨后可用于接種更大規(guī)模的培養(yǎng)物。然后使細胞生長到期望的光密度，在這時開放表達啟動子。
對細胞再培養(yǎng)幾個小時之后，可通過離心作用收獲細胞。通過離心作用獲得的細胞團用本領(lǐng)域已知的各種試劑溶解，然后可以利用金屬螯合柱在容許緊密結(jié)合蛋白或抗體的條件下純化溶解了的期望的蛋白或抗體。
利用以下步驟可以在大腸埃希氏菌中以聚-His標記的形式表達期望的蛋白或抗體。最開始利用選定的PCR引物擴增編碼期望的蛋白或抗體的DNA序列。引物包含相應(yīng)于選定表達載體上的限制性內(nèi)切酶位點的限制性內(nèi)切酶位點，以及其它為有效和可靠的翻譯起始、在金屬螯合柱上快速純化、用腸激酶蛋白水解去除所提供的有用序列。然后將PCR擴增的、聚-His標記的序列連接到表達載體中，用于轉(zhuǎn)化基于菌株52的大腸埃希氏菌宿主(W3110 fuhA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts)clpP(lacIq)。首先將轉(zhuǎn)化體在包含50mg/ml羧芐青霉素的LB中在30℃搖動培養(yǎng)，直到達到3-5的O.D.600。然后將培養(yǎng)物稀釋50-100倍到CRAP培養(yǎng)基(通過在500mL水中混合3.57g(NH4)2SO4、0.71g檸檬酸鈉$2H2O、1.07g KCl、5.36g Difco酵母提取物，5.36g Sheffield hycase SF，以及110mM MPOS、pH7.3、0.55％(w/v)葡萄糖和7mM MgSO4來制得)，在30℃搖動生長約20-30小時。采取樣品通過SDS-PAGE分析來證實表達，大批量培養(yǎng)物進行離心以團?；毎?。將細胞團冷凍，直到進行開始純化和重折疊。
將從0.5到1L發(fā)酵液中取得的大腸埃希氏菌(6-10g細胞團)重懸浮于10倍量(w/v)的7M胍、20mM Tris，pH8緩沖液中。添加固體亞硫酸鈉和連四硫酸鈉使終濃度分別達到0.1M和0.02M，將溶液在4℃攪拌過夜。這個步驟產(chǎn)生了所有半胱氨酸殘基都亞硫酸化阻斷的變性蛋白。在BeckmanUltracentifuge中以40,000rpm將溶液離心30分鐘。用3-5倍體積的金屬螯合柱緩沖液(6M胍、20mM Tris、pH7.4)稀釋上清液，通過0.22微米過濾器過濾澄清。將澄清的提取物加載到在金屬螯合柱緩沖液平衡過的5ml QiagenNi-NTA金屬螯合柱上。柱用包含50mM咪唑(Calbiochem，Utrol grade)pH7.4的另外的緩沖液洗滌。用包含250mM咪唑的緩沖液洗脫蛋白。收集包含期望的蛋白的級分，保存在4℃。通過在280nm的吸光率利用根據(jù)其氨基酸序列計算的消光系數(shù)來估計蛋白濃度。
通過將樣品慢慢地稀釋到新鮮制備的重折疊緩沖液來使蛋白重折疊，所述重折疊緩沖液由20mM Tris，pH8.6、0.3M NaCl、2.5M尿素、5mM半胱氨酸、20mM甘氨酸和1mM EDTA組成。選擇重折疊體積使得最終蛋白濃度在50-100微克/ml之間。在4℃輕微地攪拌正在重折疊的溶液12-36小時。通過添加TFA到0.4％的終濃度(pH約3)來結(jié)束重折疊反應(yīng)。在進一步的蛋白純化之前，通過0.22微米過濾器過濾溶液，添加乙腈到終濃度2-10％。在Poros R1/H反相柱上對重折疊的蛋白進行層析，利用0.1％TFA的流動緩沖液，用從10％到80％的乙腈梯度洗脫。具有A280吸光率的級分的等分量在SDS聚丙烯酰胺凝膠上分析，收集包含均質(zhì)的重折疊蛋白的級分。一般地，大多數(shù)蛋白的適當重折疊的種類是在最低的乙腈濃度下洗脫的，因為這些折疊的蛋白種類是最緊湊的，它們的疏水內(nèi)部被遮蔽而不與反相樹脂相互作用。聚集的種類通常在較高乙腈濃度下洗脫。除了從期望形式的蛋白中除去了錯誤折疊形式的蛋白之外，反相步驟還從樣品中除去了內(nèi)毒素。
收集包含折疊的期望蛋白或抗體的級分，利用在溶液中溫和的氮氣流除去乙腈。通過透析或通過利用在制劑緩沖液中平衡的G25Superfine(Pharmacia)樹脂進行凝膠過濾，將蛋白配制為20mM Hepes，pH6.8，含有0.14M氯化鈉和4％甘露醇的溶液，并進行無菌過濾。
實施例10
在哺乳動物細胞中表達蛋白或抗體這個實施例說明了通過在哺乳動物細胞中重組表達制備期望的蛋白或抗體的潛在糖基化形式。
使用載體pRK5(參見1989年3月15日公開的EP 307,247)作為表達載體。選擇性地，用選定的限制性內(nèi)切酶以容許利用例如在Sambrook等，同上，中描述的連接方法插入這種DNA，將編碼期望的蛋白或抗體的DNA連接到pRK5中。
在一個實施方式中，選擇的宿主細胞可以是293細胞。人293細胞(ATCCCCL 1573)在組織培養(yǎng)平板上在培養(yǎng)基中，例如補充有胎牛血清和選擇性地補充了營養(yǎng)成分和/或抗生素的DMEM中，生長至匯合。約10μg連接到pRK5中的、編碼期望的蛋白或抗體的DNA與約1μg編碼VA RNA基因[Thimmappaya等，Cell，31543(1982)]的DNA混合，并溶于500μl的1mMTris-HCl，0.1mM EDTA，0.227M CaCl2中。向這個混合物中滴加500μl的50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCl、1.5mM NaPO4，在25℃容許形成沉淀10分鐘。懸浮沉淀，添加到293細胞，在37℃容許沉積約四小時。吸凈培養(yǎng)基，添加2ml含20％甘油的PBS中30秒。然后用無血清培養(yǎng)基洗滌293細胞，添加新鮮培養(yǎng)基，溫育細胞約5天。
在轉(zhuǎn)染后約24小時，移除培養(yǎng)基，替換為培養(yǎng)基(單獨地)或包含200μCi/ml35S-半胱氨酸和200μCi/ml35S-甲硫氨酸的培養(yǎng)基。在溫育12小時之后，收集條件培養(yǎng)基，在旋轉(zhuǎn)過濾機上濃縮，加載到15％SDS凝膠上。可以干燥加工后的凝膠，在膠片上暴露選定的時段來顯示期望的蛋白或抗體的存在。包含轉(zhuǎn)染的細胞的培養(yǎng)物可以經(jīng)歷進一步的溫育(在無血清培養(yǎng)基中)，在選定的生物檢測方法中測試培養(yǎng)基。
在替換性的技術(shù)中，利用Somparyrac等，Proc.Natl.Acad.Sci.127575(1981)描述的硫酸葡聚糖方法，可以將期望的蛋白或抗體瞬時地導入293細胞。在旋轉(zhuǎn)燒瓶中使293細胞生長到最大密度，添加700μg連接到pRK5中、編碼期望的蛋白或抗體的DNA。通過離心從旋轉(zhuǎn)燒瓶中第一次濃縮細胞，用PBS洗滌。DNA-葡聚糖沉淀物在細胞團上溫育四小時。用20％甘油處理細胞90秒，用組織培養(yǎng)基洗滌，重新加入到包含組織培養(yǎng)基、5μg/ml牛胰島素和0.1μg/ml牛轉(zhuǎn)鐵蛋白的旋轉(zhuǎn)燒瓶中。約四天后，離心和過濾條件培養(yǎng)基以除去細胞和碎屑。然后可以通過任何選擇的方法，例如透析和/或柱層析來濃縮和純化包含表達的期望蛋白或抗體的樣品。
在另一個實施方式中，可以在CHO細胞中表達期望的蛋白或抗體?？梢岳靡阎脑噭?，例如CaPO4或DEAE-葡聚糖將連接到pRK5中編碼期望的蛋白或抗體的DNA轉(zhuǎn)染到CHO細胞中。如上所述，可以溫育細胞培養(yǎng)物，將培養(yǎng)基替換為培養(yǎng)基(單獨)或包含放射性標記例如35S-甲硫氨酸的培養(yǎng)基。在確定了期望的蛋白或抗體的存在之后，培養(yǎng)基可以被替換為無血清培養(yǎng)基。優(yōu)選的，培養(yǎng)物溫育約6天，然后收獲條件培養(yǎng)基。然后可以通過任何選擇的方法來濃縮和純化包含表達的期望蛋白或抗體的培養(yǎng)基。
也可以在宿主CHO細胞中表達期望的蛋白或抗體的表位標記的變體。可以從pRK5載體中亞克隆出連接到pRK5中的編碼期望的蛋白或抗體的DNA。亞克隆插入物可以進行PCR，在閱讀框中與選定的表位標記物，例如聚-his標記物融合到桿狀病毒表達載體中。然后可以將聚-his標記的、編碼期望的蛋白或抗體插入物的DNA亞克隆到包含用于選擇穩(wěn)定克隆的選擇標記物例如DHFR的SV40驅(qū)動的載體中。最后，可以用所述SV40驅(qū)動的載體轉(zhuǎn)染(如上所述)CHO細胞?？梢匀缟纤鲞M行標記來證實表達。然后可以通過任何選擇的方法，例如Ni2+螯合物親和層析來濃縮和純化包含表達的聚-His標記的期望蛋白或抗體的培養(yǎng)基。
也可以通過瞬時的表達步驟在CHO和/或COS細胞中，或通過另一個穩(wěn)定的表達步驟在CHO細胞中表達期望的蛋白或抗體。
利用以下步驟進行CHO細胞中的穩(wěn)定表達。蛋白被表達為IgG結(jié)構(gòu)(免疫粘附素)，在其中各個蛋白質(zhì)的可溶形式(例如，細胞外區(qū)域)的編碼序列與包含鉸鏈區(qū)、CH2和CH2區(qū)的IgG1恒定區(qū)序列融合，和/或是聚-His標記的形式。
在PCR擴增后，利用如Ausubel等，Current Protocols of Molecular Biology，Unit 3.16，John Wiley and Sons(1997)中描述的標準技術(shù)，將各個DNA亞克隆到CHO表達載體中。構(gòu)建CHO表達載體，使之具有與感興趣的DNA兼容的限制性位點5＝和3＝以允許方便地移動cDNA。在CHO細胞表達中使用的載體如Lucas等，Nucl.Acids Res.249(1774-1779(1996)中所述，使用SV40早期啟動子/增強子來驅(qū)動感興趣的cDNA和二氫葉酸還原酶(DHFR)的表達。DHFR表達允許在轉(zhuǎn)染后選擇穩(wěn)定地維持了質(zhì)粒的細胞。
利用商售的轉(zhuǎn)染試劑SuperfectTM(Quiagen)、DosperTM或FugeneTM(Boehringer Mannheim)將十二微克期望的質(zhì)粒DNA導入到約1000萬個CHO細胞中。如Lucas等，同上，中描述的使細胞生長。將約3×10-7細胞冷凍在安瓿瓶中，用于如下所述的進一步生長和生產(chǎn)。
包含質(zhì)粒DNA的安瓿瓶通過放入水浴中來解凍，并通過渦流混合。將內(nèi)容物移液到包含10mL培養(yǎng)基的離心管中，在1000rpm離心5分鐘。吸出上清液，將細胞重懸浮于10mL選擇培養(yǎng)基(含有5％0.2m過濾的胎兒牛血清的0.2m過濾的PS20)中。然后將細胞等分到包含90mL選擇培養(yǎng)基的100mL旋轉(zhuǎn)器中。1-2天后，將細胞轉(zhuǎn)移到加注了150mL選擇性生長培養(yǎng)基的250mL旋轉(zhuǎn)器中，在37℃溫育。再經(jīng)過2-3天后，按3×105細胞/mL接種250mL、500mL和2000mL旋轉(zhuǎn)器。通過離心作用和重懸浮于生產(chǎn)培養(yǎng)基來用新鮮的培養(yǎng)基替換細胞培養(yǎng)基。盡管可以使用任何適合的CHO培養(yǎng)基，實際上可以使用在1992年6月16日出版的美國專利No.5,122,469中描述的生產(chǎn)培養(yǎng)基。以1.2×106個細胞/mL接種3L生產(chǎn)旋轉(zhuǎn)器。在0天，確定細胞數(shù)和pH。在第1天，對旋轉(zhuǎn)器取樣，開始用過濾的空氣進行通氣。在第2天，對旋轉(zhuǎn)器取樣，溫度變化到33℃，加30mL 500g/L葡萄糖和0.6mL 10％防沫劑(例如，35％聚二甲硅氧烷乳劑、Dow Coming 365醫(yī)學級乳劑)。在整個生產(chǎn)過程中，根據(jù)需要調(diào)整pH，保持在7.2附近。10天后，或直到存活率降低到低于70％，通過離心和經(jīng)0.22m過濾器過濾收獲細胞培養(yǎng)物。濾液可以保存在4℃，或緊接著加載到用于純化的柱上。
對于聚-His標記的結(jié)構(gòu)，利用Ni-NTA柱(Qiagen)純化蛋白。在純化之前，向條件培養(yǎng)基中添加咪唑到5mM的濃度。將條件培養(yǎng)基以4-5ml/min的流速泵到在20mM Hepes，pH7.4包含0.3M NaCl和5mM咪唑的緩沖液中平衡了的6ml Ni-NTA柱上。在加載之后，所述柱用另外的平衡緩沖液洗滌，用包含0.25M咪唑的平衡緩沖液洗脫蛋白。然后用25ml G25Superfine(Pharmacia)柱將高度純化的蛋白脫鹽，置入包含10Hepes、0.14MNaCl和4％甘露醇，pH6.8的存儲緩沖液中，保存在-80℃。
如下述從條件培養(yǎng)基中純化免疫粘附素(包含F(xiàn)c)結(jié)構(gòu)。將條件培養(yǎng)基泵到5ml蛋白A柱(Pharmacia)上，蛋白A柱已經(jīng)過20mM Na磷酸鹽緩沖液，pH6.8平衡。在加載之后，用平衡緩沖液仔細地洗滌所述柱，然后用100mM檸檬酸，pH3.5洗脫。通過收集1ml的級分到包含275L 1M Tris緩沖液，pH9的試管中，立即將洗脫的蛋白中和。隨后將高度純化的蛋白脫鹽，置入如上所述用于聚-His蛋白的存儲緩沖液中。通過SDS聚丙烯酰胺凝膠和通過Edman降解的N-末端氨基酸測序來評定同質(zhì)性(homogeneity)。
實施例11在酵母中表達抗體或蛋白以下方法描述了在酵母中重組表達期望的蛋白或抗體。
首先，構(gòu)建酵母表達載體以從ADH2/GAPDH啟動子對期望的蛋白或抗體進行細胞內(nèi)生產(chǎn)或分泌。將編碼期望的蛋白或抗體的DNA和啟動子插入到選定的質(zhì)粒中適合的限制性內(nèi)切酶位點來直接進行細胞內(nèi)表達。為了分泌，同編碼ADH2/GAPDH啟動子、天然信號肽或其它哺乳動物信號肽，或，例如酵母α因子或轉(zhuǎn)化酶分泌信號/前導序列，和接頭序列(如果需要的話)的DNA一起，將編碼期望的蛋白或抗體的DNA克隆到選定的質(zhì)粒中，用于表達期望的蛋白或抗體。
然后可用如上所述的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細胞，例如酵母菌株AB110，并在選定的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)?？梢酝ㄟ^對轉(zhuǎn)化的酵母上清液用10％三氯乙酸沉淀、通過SDS-PAGE分離、用考馬斯藍對凝膠著色來進行分析。
隨后通過離心從發(fā)酵培養(yǎng)基中除去酵母細胞，然后用選定的筒式過濾器濃縮培養(yǎng)基，分離和純化重組蛋白或抗體?？梢赃M一步利用選定的柱層析樹脂純化包含重組蛋白或抗體的濃縮物。
實施例12在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中表達蛋白或抗體以下方法描述了在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中重組表達期望的蛋白或抗體。
將編碼期望的蛋白或抗體的序列融合到包含在桿狀病毒表達載體中的表位標記的上游。這種表位標記包括聚-his標記和免疫球蛋白標記(象IgG的Fc區(qū))?？梢允褂酶鞣N質(zhì)粒，包括衍生自商售的質(zhì)粒，例如pVL1393(Novagen)。簡要地，通過PCR利用與5′和3′區(qū)互補的引物來擴增編碼蛋白或抗體的期望部分的序列，例如，編碼跨膜蛋白的細胞外區(qū)的序列，或如果蛋白是細胞外蛋白，編碼成熟蛋白的序列。5′引物可包括側(cè)翼的(選定的)限制性內(nèi)切酶位點。然后用那些選定的限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)物，亞克隆入表達載體。
通過利用lipofectin(可從GIBCO-BRL購得)將上述質(zhì)粒和BaculoGoldTM病毒DNA(Pharmingen)共轉(zhuǎn)染入Spodoptera frugiperda(“Sf9”)細胞(ATCCCRL 1711)來產(chǎn)生重組桿狀病毒。在28℃溫育4-5天后，收獲釋放的病毒用于進一步的擴增。如O′Reilley等，Baculovirus expression vectorsA LaboratoryManual，OxfordOxford University Press(1994)描述的進行病毒感染和蛋白表達。
然后可以通過例如如下的Ni2+螯合親和層析純化表達的聚-his標記的蛋白或抗體。如Rupert等，Nature，362175-179(1993)描述的從重組病毒感染的Sf9細胞制備提取物。簡要地，洗滌Sf9細胞，重懸浮在超聲處理緩沖液(25mL Hepes，pH7.9；12.5mM MgCl2；0.1mM EDTA；10％甘油；0.1％NP-40；0.4M KCl)中，在冰上超聲降解兩次20秒。離心澄清超聲降解物，在加載緩沖液(50mM磷酸鹽，300mM NaCl，10％甘油，pH7.8)中將上清液稀釋50倍，經(jīng)由0.45m過濾器過濾。用5mL的柱床體積制備Ni2+-NTA瓊脂糖柱(可從Qiagen購得)，用25mL水洗滌，用25mL加載緩沖液平衡。以0.5mL每分鐘將過濾的細胞提取物加載到所述柱上。用加載緩沖液將柱洗滌到基線A280，在這個點上開始級分收集。然后，所述柱用第二洗滌緩沖液(50mM磷酸鹽；300mMNaCI，10％甘油，pH6.0)洗滌，洗脫非特異性結(jié)合的蛋白。在再次到達A280基線后，用在第二洗滌緩沖液中0到500mM咪唑梯度對柱進行操作。收集一毫升級分，通過SDS-PAGE和銀染色或Western印跡，用與堿性磷酸酶結(jié)合的Ni2+-NTA(Qiagen)進行分析。收集包含洗脫的His10標記的蛋白或抗體的級分，用加載緩沖液透析。
做為選擇，可以利用已知的層析技術(shù)，包括例如蛋白A或蛋白G柱層析來進行IgG標記的(或Fc標記的)蛋白或抗體的純化。
實施例13抗體的制備這個實施例說明了制備能與感興趣的蛋白或期望的抗原結(jié)合的單克隆抗體。
生產(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如，在Goding，同上，中有描述?？梢允褂玫拿庖咴兓钠谕牡鞍谆蚰繕丝贵w，包含期望的蛋白或目標抗原的融合蛋白，和在細胞表面表達這種重組蛋白或抗原的細胞。熟練技術(shù)人員無需過度的實驗就可以選擇免疫原。
用在完全弗氏佐劑中乳化的所述期望的蛋白或目標免疫原，以1-100微克的數(shù)量皮下或腹膜內(nèi)注射來免疫小鼠，例如Balb/c。做為選擇，在MPL-TDM佐劑(Ribi Immunochemical Research，Hamilton，MT)中乳化免疫原，注入到動物的后足墊中。然后在10到12天后用在選定的佐劑中乳化的額外(additional)免疫原對免疫的小鼠進行強化。此后幾個星期，也可用額外的免疫注射來強化小鼠。通過后眼窩采血來周期性地從小鼠獲取血清樣品，用于在ELISA分析中檢測針對期望的蛋白或抗原的抗體。
在檢測到適合的的抗體滴度之后，可以用期望的蛋白或目標抗原對對于抗體而言是“陽性”的動物進行最后的靜脈注射。三到四天后，處死小鼠，收獲脾細胞。然后使脾細胞與選定的鼠骨髓瘤細胞系，例如可從ATCC，No.CRL 1597獲得的P3X63AgU.1融合(利用35％聚乙二醇)。融合產(chǎn)生雜交瘤細胞，然后可將雜交瘤細胞置于包含HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷)培養(yǎng)基的96孔組織培養(yǎng)平板中，以抑制非融合細胞、骨髓瘤雜交體和脾細胞雜交體的增值。
用ELISA來篩選雜交瘤細胞對期望的蛋白或目標抗原的反應(yīng)性。確定分泌這種單克隆抗體的“陽性”雜交瘤細胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。
可以將所述陽性雜交瘤細胞腹膜內(nèi)注射到同基因的Balb/c小鼠中以產(chǎn)生包含這種單克隆抗體的腹腔積液。做為選擇，可以使雜交瘤細胞在組織培養(yǎng)燒瓶或滾瓶中生長。可以利用硫酸銨沉淀、繼之以凝膠排阻層析法來純化腹腔積液中產(chǎn)生的單克隆抗體。做為選擇，可以使用基于抗體對蛋白A或蛋白G的結(jié)合的親和層析。
實施例14利用特定的抗體純化期望的蛋白可以通過蛋白純化領(lǐng)域中的各種標準技術(shù)來純化天然形式或重組形式的期望的蛋白。例如，可以利用特異于期望的蛋白的抗體通過免疫親和層析來純化期望的蛋白的前體多肽、成熟多肽、或前多肽形式。一般地，通過將特異性結(jié)合所述期望的蛋白的抗體共價連結(jié)到活化的層析樹脂上來構(gòu)建免疫親和層析柱。
通過用硫酸銨沉淀或通過在固定化的蛋白A(Pharmacia LKBBiotechnology，Piscataway，N.J.)上純化來從免疫血清中制備多克隆的免疫球蛋白。同樣地，通過硫酸銨沉淀或在固定化的蛋白A上層析來從小鼠腹腔積液中制備單克隆抗體。將部分純化的免疫球蛋白共價附著到層析樹脂上，例如CnBr-活化的SEPHAROSETM(Pharmacia LKB Biotechnology)。根據(jù)廠家的說明將抗體偶聯(lián)到樹脂上，封閉樹脂，和洗滌衍生的樹脂。
通過從以可溶形式表達蛋白的細胞中制備級分，利用這種免疫親和柱來純化期望的蛋白。通過添加洗滌劑或本領(lǐng)域公知的其它方法，將通過差速離心獲得的整個細胞或亞細胞部分溶解，來取得這種制備物。做為選擇，可以以有效量將包含信號序列的可溶性蛋白分泌到細胞生長的培養(yǎng)基中。
使包含期望的蛋白的溶解的制備物通過免疫親和柱，在容許優(yōu)先吸收所述期望的蛋白的情況下(例如存在洗滌劑的高離子強度緩沖液)洗滌柱。然后在破壞抗體與蛋白的結(jié)合的情況下(例如，低pH緩沖液，例如約pH 2-3，或高濃度的促溶劑(chaotrope)，例如尿素或硫氰酸根離子)沖洗柱，收集期望的蛋白。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的、低混濁度的液體制劑，包含(a)100到260mg/ml量的蛋白或抗體，(b)50到200mM量的精氨酸-HCl，(c)10到100mM量的組氨酸，(d)0.01到0.1％量的聚山梨醇酯，其中所述制劑進一步具有從5.5到7.0的pH值、約50cs或更小的運動粘度和從200mOsm/kg到450mOsm/kg的滲透壓。
2.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述蛋白或抗體的濃度范圍從120mg/ml到260mg/ml。
3.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述蛋白或抗體的濃度范圍從150mg/ml到260mg/ml。
4.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述蛋白或抗體的濃度范圍從180mg/ml到260mg/ml。
5.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述蛋白或抗體的濃度范圍從200mg/ml到260mg/ml。
6.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述蛋白或抗體的濃度約150mg/ml。
7.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述滲透壓范圍從250mOsm/kg到350mOsm/kg。
8.權(quán)利要求1所述的制劑，其中精氨酸-HCl的濃度范圍從100mg/ml到200mg/ml。
9.一種穩(wěn)定的、低混濁度的液體制劑，包含(a)100到260mg/ml量的抗IgE單克隆抗體，(b)50到200mM量的精氨酸-HCl，(c)10到100mM量的組氨酸，(d)0.01到0.1％量的聚山梨醇酯，其中所述制劑進一步具有從5.5到7.0的pH值、約50cs或更小的運動粘度和從200mOsm/kg到450mOsm/kg的滲透壓。
10.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述蛋白或抗體的濃度范圍從120mg/ml到260mg/ml。
11.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述蛋白或抗體的濃度范圍從150mg/ml到260mg/ml。
12.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述蛋白或抗體的濃度范圍從180mg/ml到260mg/ml。
13.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述蛋白或抗體的濃度范圍從200mg/ml到260mg/ml。
14.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述蛋白或抗體的濃度約150mg/ml。
15.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述滲透壓的范圍從250mOsm/kg到350mOsm/kg。
16.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述抗IgE抗體選自rhuMAbE25、rhuMAbE26或Hu-901。
17.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述抗IgE抗體是rhuMAbE25。
18.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述抗IgE抗體是rhuMAbE26。
19.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述抗IgE抗體是Hu-901。
20.一種穩(wěn)定的、低混濁度的液體制劑，包含(a)量約150mg/ml的抗IgE抗體，(b)量為200mM的精氨酸-HCl，(c)量為20mM的組氨酸，(d)量為0.02％的聚山梨醇酯，其中所述制劑更進一步具有6.0的pH值。
21.權(quán)利要求20所述的制劑，其中所述抗IgE抗體是E25。
22.一種制品，包含裝有權(quán)利要求1所述的制劑的容器。
23.權(quán)利要求22所述的制品，其中所述容器是注射器。
24.權(quán)利要求23所述的制品，其中所述注射器進一步被包含在一注射裝置中。
25.權(quán)利要求24所述的制品，其中所述注射裝置是自動注射器。
26.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述制劑是重構(gòu)的。
27.權(quán)利要求26所述的制劑，其中在所述重構(gòu)的制劑中所述蛋白或抗體的濃度比在凍干前的濃度大約高2-40倍。
28.醫(yī)治IgE介導的疾病的方法，包括向需要醫(yī)治的病人施用治療有效量的權(quán)利要求20的制劑。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述IgE介導的疾病選自過敏性鼻炎、哮喘、過敏性哮喘、非過敏性哮喘、特應(yīng)性皮炎或胃腸病。
30.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述IgE-介導的疾病是過敏性鼻炎。
31.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述IgE-介導的疾病是過敏性哮喘。
32.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述IgE-介導的疾病是哮喘。
33.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述IgE-介導的疾病是特應(yīng)性皮炎。
34.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述IgE介導的疾病選自超敏反應(yīng)、過敏性支氣管肺曲霉病、寄生蟲疾病、間質(zhì)性膀胱炎、高IgE綜合征、共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥、Wiskott-Akdrich綜合征、胸腺淋巴發(fā)育不全、IgE骨髓瘤或移植物抗宿主反應(yīng)。
35.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述IgE介導的疾病是超敏反應(yīng)。
36.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述超敏反應(yīng)疾病選自過敏反應(yīng)、蕁麻疹或食物過敏。
37.權(quán)利要求36所述的方法，其中超敏反應(yīng)疾病是食物過敏。
38.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述食物過敏是由對豆類的暴露而引起。
39.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述豆類是花生。
40.醫(yī)治IgE介導的疾病的方法，包括向需要醫(yī)治的病人給藥有效量的與抗組胺劑組合的權(quán)利要求20的制劑。
41.醫(yī)治IgE介導的疾病的方法，包括聯(lián)合抗組胺劑的施用，向需要醫(yī)治的病人給藥治療有效量的權(quán)利要求20的制劑。
42.醫(yī)治IgE介導的疾病的方法，包括向需要醫(yī)治的病人給藥治療有效量的與支氣管舒張劑組合的權(quán)利要求20的制劑。
43.醫(yī)治IgE介導的疾病的方法，包括聯(lián)合支氣管舒張劑的施用，向需要醫(yī)治的病人給藥治療有效量的權(quán)利要求20的制劑。
44.醫(yī)治IgE介導的疾病的方法，包括向需要醫(yī)治的病人給藥治療有效量的與糖皮質(zhì)激素組合的權(quán)利要求20的制劑。
45.醫(yī)治IgE介導的疾病的方法，包括聯(lián)合糖皮質(zhì)激素的施用，向需要醫(yī)治的病人給藥治療有效量的權(quán)利要求20的制劑。
46.醫(yī)治IgE介導的疾病的方法，包括向需要醫(yī)治的病人給藥與糖皮質(zhì)激素組合的治療有效量的權(quán)利要求20的制劑。
47.醫(yī)治IgE介導的疾病的方法，包括聯(lián)合糖皮質(zhì)激素的施用，向需要醫(yī)治的病人給藥治療有效量的權(quán)利要求20的制劑。
48.醫(yī)治IgE介導的疾病的方法，包括聯(lián)合過敏原脫敏療法的施用，向需要醫(yī)治的病人給藥治療有效量的權(quán)利要求20的制劑。
49.醫(yī)治IgE介導的疾病的方法，包括向需要醫(yī)治的病人給藥治療有效量的與NSAID組合的權(quán)利要求20的制劑。
50.醫(yī)治IgE介導的疾病的方法，包括聯(lián)合NSAID的施用，向需要醫(yī)治的病人施用治療有效量的權(quán)利要求20的制劑。
全文摘要
本申請涉及具有降低的粘度的、穩(wěn)定的、相對等滲的和低混濁度的高度濃縮抗體和蛋白制劑。所述制劑特別適合于皮下施用。本申請進一步描述了包含這種制劑的制品，和利用它們來治療可用所述配制的抗體或蛋白醫(yī)治的疾病的方法。所述制劑包含精氨酸－HCl，組氨酸和聚山梨醇酯。
文檔編號A61K47/06GK1798575SQ200480015556
公開日2006年7月5日 申請日期2004年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月4日
發(fā)明者劉駿, 史蒂文·希雷 申請人:健泰科生物技術(shù)公司, 諾瓦蒂斯公司