專利名稱：一種牛乳中乳鐵蛋白含量的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析檢測(cè)乳中蛋白的方法，特別是一種檢測(cè)牛乳 中乳鐵蛋白含量的方法。屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳鐵蛋白是一種分子量為70 ~ 80kD的糖蛋白，廣泛存在于乳汁、 唾液、淚液等外分泌液或血漿、中性粒細(xì)胞中。牛乳中乳鐵蛋白的含 量為0.7g/L。乳鐵蛋白是一種多功能蛋白質(zhì)，具有廣鐠抗菌，抗病 毒感染作用，能調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵的平衡；調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞的生成，促進(jìn)細(xì)胞 的生長(zhǎng)；調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力；抑制人體腫瘤細(xì)胞 的作用；能同多種抗生素及抗真菌制劑協(xié)同作用，更有效地治療疾病。
目前，國(guó)內(nèi)尚未有乳鐵蛋白含量檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo) 準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有GB/T5413. 1、 2 - 1997嬰幼兒配方食品和乳粉-乳清蛋白的測(cè)定。國(guó)外，相關(guān)國(guó)標(biāo)有DIN-10466 - 2001牛奶和牛奶制 品的全部蛋白中乳清蛋白含量的測(cè)定、DIN-10470 -1999牛奶和牛奶 制品的全部蛋白質(zhì)中乳蛋白含量和酪蛋白含量測(cè)定、DIN - 10472 -1996牛奶和乳制品總蛋白量中乳蛋白和酪蛋白成分量測(cè)定.電泳法。 國(guó)內(nèi)科研院所常用乳鐵蛋白的檢測(cè)方法是分光光度計(jì)法、酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜法。免疫酶聯(lián)吸附法靈敏度高，最小檢測(cè)限低，適合
于乳鐵蛋白分離純化的全程分析；高效液相色語法快速準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn) 便，可實(shí)現(xiàn)乳鐵蛋白初步分離時(shí)的同步分析；分光光度法快速簡(jiǎn)便， 準(zhǔn)確性稍差，適合于純化后具有較高濃度的乳鐵蛋白的在線分析。鑒 于三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，本專利發(fā)明了將使用毛細(xì)管電泳儀快速檢測(cè)乳 鐵蛋白含量的方法。毛細(xì)管電泳儀是一類包括電泳、色譜及其交叉內(nèi) 容的液相微分離技術(shù)。它能快速精確檢測(cè)出牛奶中的#^支成分、抗生 素、添加的功能性因子、乳清蛋白、免疫球蛋白、酶、糖、添加劑和 其他小分子的含量。該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，檢測(cè)到出結(jié)果時(shí)間僅為 lh左右。
目前，毛細(xì)管電泳7f義的應(yīng)用前景非常廣泛。許多國(guó)際官方權(quán)威機(jī) 構(gòu)，如FDA、 U. S. P、 CBER、 CDER等均已認(rèn)可毛細(xì)管電泳方法。權(quán)威 機(jī)構(gòu)歐洲藥典中認(rèn)可勒沃卡-貝斯庭鹽酸鹽中雜質(zhì)的CE測(cè)定；歐洲藥 典中還認(rèn)可促紅細(xì)胞生成素(EP0)的毛細(xì)管電泳儀測(cè)定等。毛細(xì)管 電泳儀已成為化學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、生物工程、藥學(xué)等眾多領(lǐng)域的一個(gè) 常規(guī)科研工具。
目前，國(guó)內(nèi)毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)技術(shù)逐漸應(yīng)用到乳品領(lǐng)域里，如產(chǎn) 品開發(fā)和控制質(zhì)量問題等領(lǐng)域中。但毛細(xì)管電泳技術(shù)尚未開發(fā)檢測(cè)乳 鐵蛋白的方法。本發(fā)明成功彌補(bǔ)了乳品領(lǐng)域中的缺點(diǎn)，能準(zhǔn)確測(cè)定乳 鐵蛋白的含量，從而有利于產(chǎn)品開發(fā)和質(zhì)量控制當(dāng)中
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的 一種牛乳中乳鐵蛋白含量的檢測(cè)方法。
本發(fā)明的一種檢測(cè)乳鐵蛋白含量的檢測(cè)方法，其中，包括如下步 驟1)將乳鐵蛋白溶于樣品緩沖液，制備得到多個(gè)不同含量乳鐵蛋 白的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對(duì)多個(gè)溶液分別檢測(cè)后得到乳鐵蛋白含量與檢測(cè)結(jié) 果之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)對(duì)樣品進(jìn)行;險(xiǎn)測(cè)，并得到檢測(cè)結(jié)果；3)將所 述的檢測(cè)結(jié)果與所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，得到樣品中乳鐵蛋白的含量； 其中，檢測(cè)樣品的設(shè)備是高壓毛細(xì)管電泳分析儀。
上述步驟l)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定的方法優(yōu)選如下配制乳鐵蛋白 標(biāo)準(zhǔn)溶液，在樣品緩沖液中溶解乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成分別為 lmg/ml 、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 05mg/ml，制備得到 標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻后使用高壓毛細(xì)管電泳分析，得到檢測(cè)結(jié)果，即得到 乳鐵蛋白含量與平均校正因子的關(guān)系曲線；其中，所述的檢測(cè)結(jié)果按 照如下方法計(jì)算按峰面積計(jì)算出平均校正因子。
上述的標(biāo)準(zhǔn)溶液或祠"險(xiǎn)測(cè)樣品的處理方法為把標(biāo)準(zhǔn)溶液或待才企 測(cè)樣品裝入離心管中，在2000-6000r/min離心條件下離心5-15min, 將樣品與緩沖液按照1: 4-20的比例加入凍存管(或其他容器)，并 搖勻，精確提取10-200ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清 洗機(jī)1 ~ 10min,使用毛細(xì)管電泳儀測(cè)定。
上述的樣品緩沖液為能夠使蛋白質(zhì)分散的緩沖液，優(yōu)選如下緩 沖液
160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩沖液中加40 m mol/L 3-嗎啉代 丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，7 mol/L尿素，處理樣品時(shí)添加5ul/ml的0-巰基乙醇，曱基羥乙基纖維素0. 05%， pH值為8. 5 上述的搖勻步驟采用旋渦混合器。
上述高壓毛細(xì)管電泳分析的使用檢測(cè)參數(shù)如下毛細(xì)管電泳檢測(cè) 檢測(cè)的溫度控制在15 40。C之間，毛細(xì)管柱直徑25~75um、長(zhǎng)度 20~ 600 mm, DAD (或紫外光)檢測(cè)器，壓力進(jìn)樣(或電動(dòng)進(jìn)樣)，壓 力為0 lpsi,進(jìn)樣時(shí)間為ls 20s,分離溫度為15 ~ 40°C，工作電 壓為10~ 30 kV。
上述的毛細(xì)管柱為石英毛細(xì)管柱，包括涂層和未涂層。 上述的高壓毛細(xì)管電泳分析的4企測(cè)時(shí)電泳才莫式為區(qū)帶電泳，其電 泳緩沖液為pH2. 0~9. 0，主要成分為無機(jī)鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽、 硼酸或檸檬酸。
上述的檢測(cè)結(jié)果的處理方法如下檢測(cè)結(jié)果為樣品分離的圖譜， 運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的分析軟件，積分各峰的面積，計(jì)算出試樣濃 度，再乘稀釋倍數(shù)，即得實(shí)際濃度。
常乳里乳鐵蛋白的含量20mg 350rag/L,其分子量為12000。毛細(xì) 管電泳儀檢測(cè)最低濃度能達(dá)到1(T5 10—8mol/L。所以毛細(xì)管電泳儀能 檢測(cè)出其含量。使用毛細(xì)管電泳儀開發(fā)檢測(cè)乳鐵蛋白含量的方法包括 樣品性質(zhì)的了解、分離模式、建立緩沖體系、優(yōu)化緩沖體系和換分離 模式等步驟。開發(fā)出的方法能應(yīng)用于產(chǎn)品開發(fā)、質(zhì)量控制和分析;險(xiǎn)測(cè) 領(lǐng)域中。
本發(fā)明主要使用毛細(xì)管電泳儀能準(zhǔn)確測(cè)定乳鐵蛋白的含量，從而 應(yīng)用于產(chǎn)品開發(fā)、質(zhì)量控制和分析檢測(cè)領(lǐng)域中。本發(fā)明在在傳統(tǒng)的電泳和色譜的原理的基礎(chǔ)上，使用高壓毛細(xì)管 電泳儀檢測(cè)乳鐵蛋白的含量，達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)出乳制品中乳鐵蛋白的含
量。通過試驗(yàn)，最終確定檢測(cè)方法的最佳參數(shù)條件。具體如下
檢測(cè)乳鐵蛋白含量的檢測(cè)方法，包括樣品前處理、上樣檢測(cè)， 還包括校準(zhǔn)讀數(shù)等步驟。毛細(xì)管電泳檢測(cè)檢測(cè)的溫度控制在15 ~ 40 。C之間，毛細(xì)管柱直徑50 - 75 um、長(zhǎng)度20 600咖的石英毛細(xì)管 柱，DAD (或紫外光)檢測(cè)器，壓力進(jìn)樣，壓力為0.5psi，進(jìn)樣時(shí) 間為5s 20s,分離溫度為20~40°C,工作電壓為15-25 kV。
校準(zhǔn)曲線的制定配制乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0.25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 051mg/ml。搖勻后使用高壓毛 細(xì)管電泳分析，按峰高計(jì)算出平均校正因子。 檢測(cè)步驟為
把原料奶樣品裝入15ml的離心管中，在5000r/min離心條件下 離心5min。準(zhǔn)確提取樣品100ul置入凍存管。提取400ul樣品緩沖 液加入凍存管(或其他容器)，并使用漩渦混合器混勻。精確提取 40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機(jī)3min，使用毛細(xì) 管電泳4義測(cè)定。
樣品定量讀數(shù):根據(jù)樣品分離的圖譜，運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的 分析軟件，積分備峰高(或峰面積)，計(jì)算出試樣濃度，再乘稀釋倍 數(shù)，即得實(shí)際濃度。 有益效果
本發(fā)明方法現(xiàn)行回歸方程相關(guān)系數(shù)〉0.98，其線性范圍在0. 01mg/ml ~ 2mg/ml ,最低檢出線為0. 15ng，最低檢出濃度為 0. 005mg/ml。精確度達(dá)90%以上，柱子回收率達(dá)到90%以上，樣品回 收率達(dá)7 0%以上。能有效檢測(cè)出樣品中的乳鐵蛋白的含量。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 一種牛乳中乳鐵蛋白含量的檢測(cè)方法
毛細(xì)管電泳溫度控制在25°C，使用直徑為50ii m、長(zhǎng)度為20mm 的石英毛細(xì)管柱，DAD檢測(cè)器，進(jìn)樣壓力為0. 5psi，進(jìn)樣時(shí)間為13s, 工作電壓為15 kV。
校準(zhǔn)曲線的制定利用乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0.05 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶 液。搖勻后使用高壓毛細(xì)管電泳分析，積分后的峰面積分別為 120408、 62151、 33070、 16172、 7829，利用軟件得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，線 性回歸相關(guān)系數(shù)為0.9993，最低檢出線為0. 005ug,最低檢出含量 為O. Olmg/ml,標(biāo)準(zhǔn)樣品回收率達(dá)90%。
處理樣品緩沖液配置方法160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩沖 液中力口40 m mol/L 3-嗎啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二 鈉，6mol/L尿素，處理樣品時(shí)添加5ul/ml的P-巰基乙醇，曱基羥 乙基纖維素0. 05%,使用氫氧化鈉溶液把pH值調(diào)至8. 5。
電泳緩沖液的配置方法0. 32 mol/L檸檬酸，20 m mol/L檸檬 酸三鈉，7 mol/L尿素，羥丙基曱基纖維素0. 05%。
4企測(cè)步-驟為把奶樣品加入15ml的離心管中，在5000r/min 離心條件下離心10min。準(zhǔn)確提取樣品100ul置入凍存管(或其他容器)。提取400ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用 漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超 聲波清洗機(jī)3min,之后使用毛細(xì)管電泳儀測(cè)定。
樣品定量讀數(shù):根據(jù)樣品分離的圖譜，運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的 分析軟件，積分乳鐵蛋白的峰面積為4752，利用分析軟件自動(dòng)套入 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)計(jì)算出試樣濃度為0. 0098mg/ml，再乘稀釋倍數(shù)5， 即得實(shí)際濃度為0. 049mg/ml，所以該奶樣含有的乳鐵蛋白濃度為 0. 049g/L。
實(shí)施例2 —種牛乳中乳鐵蛋白含量的檢測(cè)方法
毛細(xì)管電泳溫度控制在3(TC,使用直徑為75um、長(zhǎng)度為600 mm 的石英毛細(xì)管柱，DAD檢測(cè)器，進(jìn)樣壓力為0. 5psi，進(jìn)樣時(shí)間為5s， 工作電壓為25 kV。
校準(zhǔn)曲線的制定利用乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0.05 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶 液。搖勻后使用高壓毛細(xì)管電泳分析，積分后的峰面積分別為， 157203、 78413、 38450、 18625、 9512利用軟件得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，線 性回歸相關(guān)系數(shù)為0.998,最低檢出線為0. Olug，最低檢出含量為 0. Olmg/ml,標(biāo)準(zhǔn)才羊品回收率達(dá)95%。
處理樣品緩沖液配置方法160 m mol/L三甲基氨基曱烷緩沖 液中加40 m mol/L 3-嗎啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6 mol/L尿素，處理樣品時(shí)添加5ul/ml的P -巰基乙醇，甲基羥乙基纖 維素0. 4%。使用0. 1M氫氧化鈉調(diào)至pH值為8, 5。電泳緩沖液的配置方法0. 32 mol/L檸檬酸，20 m mol/L檸檬 酸三鈉，6 mol/L尿素，羥丙基曱基纖維素0.4%。
才企測(cè)步驟為把奶樣品加入15ml的離心管中，在5000r/min 離心條件下離心5min。準(zhǔn)確提取樣品100ul置入凍存管(或其他容 器)。提取400ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用漩 渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲 波清洗機(jī)3min,之后使用毛細(xì)管電泳儀測(cè)定。
樣品定量讀數(shù):根據(jù)樣品分離的圖譜,運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的 分析軟件，積分乳鐵蛋白的峰面積為4856，利用分析軟件自動(dòng)套入 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)計(jì)算出試樣濃度為0. 0308mg/ml，再乘稀釋倍數(shù)5， 即得實(shí)際濃度為0. 154mg/ml,所以該奶樣含有的乳鐵蛋白濃度為 0. 154g/L。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)乳鐵蛋白含量的檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟1)將乳鐵蛋白溶于樣品緩沖液，制備得到多個(gè)不同含量乳鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對(duì)多個(gè)溶液分別檢測(cè)后得到乳鐵蛋白含量與檢測(cè)結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，并得到檢測(cè)結(jié)果；3)將所述的檢測(cè)結(jié)果與所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，得到樣品中乳鐵蛋白的含量；其中，檢測(cè)樣品的設(shè)備是高壓毛細(xì)管電泳分析儀。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟l)中 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定的方法優(yōu)選如下配制乳4失蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，在樣 品緩沖液中溶解乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成分別為lmg/ml 、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 05mg/ml,制備得到標(biāo)準(zhǔn)溶 液，搖勻后使用高壓毛細(xì)管電泳分析，得到檢測(cè)結(jié)果，即得到乳 鐵蛋白含量與平均校正因子的關(guān)系曲線；其中，所述的檢測(cè)結(jié)果 按照如下方法計(jì)算按峰面積計(jì)算出平均校正因子。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于把標(biāo)準(zhǔn)溶液或 待檢測(cè)樣品裝入離心管中，在2000-6000r/min離心條件下離心 5-15min,將樣品與緩沖液按照1: 4-20的比例加入凍存管(或 其他容器)，并搖勻，精確提取10-200ul處理樣品加入樣品管中， 放置于超聲波清洗機(jī)1 ~ 10min,使用毛細(xì)管電泳儀測(cè)定。
4. 如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的樣品緩沖液 為能夠使蛋白質(zhì)分散的緩沖液，優(yōu)選如下緩沖液160m mol/L三曱基氨基甲烷緩沖液中加40 m mol/L 3-嗎啉代 丙烷磺酸，60簡(jiǎn)ol/L乙二胺四乙酸二鈉，7mol/L尿素，處理樣 品時(shí)添加5ul/ml的p-巰基乙醇，曱基羥乙基纖維素0. 05%, pH值為8.5
5. 如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的搖勻步驟采 用旋渦混合器。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述高壓毛細(xì) 管電泳分析的使用檢測(cè)參數(shù)如下毛細(xì)管電泳檢測(cè)檢測(cè)的溫度控 制在15 ~ 40。C之間，毛細(xì)管柱直徑25 ~ 75pm、長(zhǎng)度20~ 600 mm， DAD (或紫外光)檢測(cè)器，壓力進(jìn)樣(或電動(dòng)進(jìn)樣)，壓力為0~ lpsi，進(jìn)樣時(shí)間為ls-20s，分離溫度為15~40°C，工作電壓為 7-30 kV。
7. 如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的毛細(xì)管柱為 石英毛細(xì)管柱，包括涂層和未涂層。
8. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的高壓毛 細(xì)管電泳分析的4企測(cè)時(shí)電泳模式為區(qū)帶電泳，其電泳緩沖液為 pH2. 0~9. 0，主要成分為無機(jī)鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽、硼酸或 檸檬酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2中所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的檢測(cè)結(jié) 果的處理方法如下檢測(cè)結(jié)果為樣品分離的圖譜，運(yùn)用毛細(xì)管電 泳儀所帶的分析軟件，積分各峰的面積，計(jì)算出試樣濃度，再乘稀 釋倍數(shù)，即得實(shí)際濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)乳中成分的方法，特別是一種檢測(cè)乳鐵蛋白含量的檢測(cè)方法。屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)乳鐵蛋白含量的檢測(cè)方法，包括樣品前處理、上樣檢測(cè)，還包括校準(zhǔn)讀數(shù)，編輯報(bào)告等步驟。本發(fā)明是樣品在毛細(xì)管電泳儀上跑電泳，從而毛細(xì)管色譜系統(tǒng)檢測(cè)出樣品的吸光值，以圖譜的形式表達(dá)出來，從而能準(zhǔn)確檢測(cè)出乳鐵蛋白的含量，為產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)量控制和分析成分提供技術(shù)支持。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101290322SQ20081010010
公開日2008年10月22日 申請(qǐng)日期2008年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日
發(fā)明者劉衛(wèi)星, 孫國(guó)慶, 康小紅, 胡新宇 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司