專利名稱：牛乳孕酮含量檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種檢測試劑盒，尤其是指用于牛乳孕酮含量檢測。
背景技術(shù)：
孕酮是奶牛、黃牛在發(fā)情周期(一般為21天)中由卵巢的黃體產(chǎn)生的一種激素， 可以進(jìn)入血液、乳汁和唾液中。它的濃度在發(fā)情期中最低，到發(fā)情周期的中期因黃體成熟而 達(dá)到最高水平。臨床上，孕酮測定被主要用于確定排卵、孕激素治療監(jiān)測和早期妊娠狀態(tài)的評價。 通過孕酮檢測，區(qū)分出已孕奶牛、休情期奶?；虬l(fā)情周期不規(guī)律的奶牛，以便迅速采取適當(dāng) 的措施。奶牛早期妊娠診斷技術(shù)的研究，對縮短產(chǎn)犢間隔和減少輸精指數(shù)，減少經(jīng)濟損失， 具有明顯的經(jīng)濟意義。資料表明，奶孕酮含量幾乎接近血孕酮含量，產(chǎn)后奶牛的卵巢機能障礙和暗發(fā)情 是造成空懷期延長的主要原因，通過連續(xù)測定數(shù)次乳汁孕酮含量，就可以掌握母牛卵巢機 能的變化情況，即根據(jù)乳孕酮的消長，就可知道與此一致的卵泡發(fā)育和排卵、黃體的生長和 消失，從而識別暗發(fā)情牛和各種卵巢機能障礙牛，同時避免了采血對牛的刺激。孕酮的免疫學(xué)檢測是目前國內(nèi)外的主要檢測方法。目前用于監(jiān)測牛奶孕酮含量的 方法主要有以下幾種放射免疫測定法、乳膠凝集試驗測定法、酶免疫測定法(ELISA)。酶 聯(lián)免疫吸附測定法是將酶促反應(yīng)的放大作用與抗原一抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來的一種 酶免疫化學(xué)測定法，以酶作為孕酮的標(biāo)記物，與前兩種方法相比，酶免疫測定法具有儀器設(shè) 備相對便宜，無放射性污染，檢測靈敏度高的優(yōu)點?；趩慰寺】贵w所建立的免疫學(xué)檢測技術(shù)，用于小分子半抗原物質(zhì)的檢測分析， 已是成熟的技術(shù)，并以其快速、簡便、靈敏、特異的特點而備受推崇，這項技術(shù)的前提是利用 半抗原構(gòu)建出完全抗原。孕酮是小分子的半抗原物質(zhì)，對其完全抗原的構(gòu)建，國內(nèi)外已有成 熟的技術(shù)和方法可供借鑒。酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)與其他免疫學(xué)技術(shù)相比較，其特點是使用簡 便，不需要昂貴的儀器和設(shè)備，靈敏度高，可達(dá)到ng/ml的水平，這項技術(shù)早已在各種檢測 中廣泛應(yīng)用。萬積成在2005年申請的專利用于奶牛早期妊娠診斷的試紙及其檢測方法，測定 授精后25-30天的奶牛乳汁孕酮，根據(jù)顯色區(qū)不同顏色變化來判斷所測奶牛的是否懷孕， 但此專利沒有形成商品化的檢測試劑盒。目前市場上還沒有商品化質(zhì)量保證的奶孕酮測試 試劑盒供應(yīng)，要在國內(nèi)推廣奶孕酮試劑盒，當(dāng)前的最好辦法是從國外進(jìn)口酶免疫奶孕酮試 劑盒，但進(jìn)口費用昂貴。本發(fā)明針對以上問題，將單克隆抗體技術(shù)與酶聯(lián)免疫技術(shù)結(jié)合，研 制的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)，可商業(yè)化開發(fā)，適用于我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)實際情況的牛奶孕酮檢測 試劑盒具有重大的實用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種牛乳孕酮含量檢測試劑盒，目的是通過制備孕酮單克隆抗體，建立奶牛孕酮檢測方法，為科學(xué)開展奶牛繁殖狀態(tài)的監(jiān)控及提高奶牛繁殖效率提供簡便快速 的技術(shù)手段。本發(fā)明的技術(shù)方案是試劑盒中含有與奶牛孕酮發(fā)生特異性反應(yīng)的孕酮單克隆抗體。本發(fā)明所述的孕酮單克隆抗體是由下面的制備方法得到的1孕酮完全抗原的制備利用琥珀酸酐法使11 α -羥孕酮活化，進(jìn)一步運用碳二亞 胺法，選擇BSA作為免疫抗原載體，選擇OVA作為檢測抗原載體進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，制備出了孕 酮的完全抗原P-BSA、P-0VA。免疫抗原免疫動物后，用檢測抗原檢測到的抗體，可以和游離 的孕酮發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)。2、孕酮單克隆抗體的的制備用制備的P-BSAll α -羥孕酮完全抗原為免疫抗原免疫小鼠，采用化學(xué)融合法，以 聚乙二醇為融合劑，經(jīng)過融合、篩選、克隆、擴大培養(yǎng)和純化鑒定等步驟，從而得到抗孕酮的 單克隆抗體。3.本發(fā)明利用得到的抗孕酮單克隆抗體建立了間接競爭ELISA檢測方法，并對檢 測方法的試驗條件進(jìn)行優(yōu)化，組裝了牛奶孕酮檢測試劑盒試劑盒的組成有①酶標(biāo)板一塊(96孔/塊)，避光密封，內(nèi)放干燥劑；②標(biāo)準(zhǔn)品7瓶，每瓶容量為800 μ L。③孕酮單克隆抗體1瓶，5mL。使用時用稀釋液稀釋20倍。④HRP山羊抗小鼠酶標(biāo)二抗(市售)1瓶，5mL。使用時用稀釋液稀釋20倍。⑤底物溶液A液，一瓶，10mL。0. lmg/mL TMBB液，一瓶，lmL。30%的過氧化氫在底物溶液中的濃度為0. 1 μ L/mL。使用時A B 為 100 1。⑥終止液1瓶，5mL。2M硫酸溶液⑦稀釋液1瓶，10mL，使用時用蒸餾水進(jìn)行10倍稀釋。⑧洗滌液1瓶，30mL，使用時用蒸餾水進(jìn)行10倍稀釋。本發(fā)明以間接競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)為測定基礎(chǔ)，具有靈敏度高，特異性好，重復(fù)性高 和檢測快速準(zhǔn)確的有點。試劑盒經(jīng)過嚴(yán)格的檢驗，可用于對樣品孕酮濃度的測定。這是國 內(nèi)自行研制的首個牛乳孕酮檢測試劑盒，其精確度和最低檢出量均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)。


圖1間接競爭ELISA檢測抗血清特異性圖；圖2抗血清對孕酮殘基的特異性反應(yīng)圖；圖33株單抗的ELISA反應(yīng)曲線41F6對兩種競爭物的抑制曲線圖；圖52A11對兩種競爭物的抑制曲線圖；圖62G6對兩種競爭物的抑制曲線圖。
具體實施例方式實施例1孕酮完全抗原的制備
利用琥珀酸酐法將11 α -羥孕酮活化，進(jìn)一步運用碳二亞胺法，選擇BSA、KLH作為 免疫抗原載體，選擇OVA作為檢測抗原載體進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。進(jìn)一步用免疫抗原免疫動物制 備抗血清，確定檢測抗原P-OVA的最佳包被濃度，間接ELISA法檢測抗血清是否特異性地針 對完全抗原中的孕酮殘基部分；抗血清中針對孕酮殘基的抗體，是否可以與游離的孕酮分 子本身發(fā)生特異性的結(jié)合。對BSA與KLH兩種不同蛋白作為免疫抗原載體時的免疫效果進(jìn) 行比較，挑選出最佳的免疫抗原，為下一步制備孕酮單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1. 1 材料6-8周齡雄性BabL/C小鼠，購自長春生物制品研究所。11 α -羥孕酮(11 α -ΟΗ-Ρ)、 鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、HRP酶標(biāo)二抗、鄰苯二 氨(OPD)均為Sigma產(chǎn)品；卵清白蛋白(OVA)、明膠、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、透析 袋均為華美公司產(chǎn)品；NHS (N-羥基琥珀酸酰胺)購自Cxbio Biotechnology公司；DMF(二 甲基甲酰胺)、無水吡啶購自Genview公司。1. 2制備完全抗原有關(guān)試劑的配制①載體蛋白貯備液稱取KLH、BSA、OVA各5mg，分別用5ml重蒸水溶解，置4°C 冰箱中備用。②抗原包被液(ρΗ9· 6) =NaCO3L 59g，NaHC032. 93g，溶于1000ml蒸餾水中。 ③ PBS(pH7. 4) :NaCL8. 0g, Na2HPO4 · 12H202. 9g, KCLO. 2g，溶于 1000ml 蒸餾水。④封閉液
明膠。⑤洗滌液IOOmlPBS中加0. lmlTween-20。⑥底物溶液(OPD-H2O2溶液):4mgOPD 溶于10mlpH5.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液中，加30% Η20215 μ 1。1. 3 方法1. 3. 111 α -羥孕酮(11 α -0Η-Ρ)的活化參照Hosoda方法稱取IOOmgll α -OH-P和30mg琥珀酸酐溶于5ml無水吡啶中， 95°C水浴1. 5小時后，溶液由原先澄清液轉(zhuǎn)為淺黃色澄清液，烘干仍采用95°C烘干，最后得 黃色結(jié)晶109. 3mg。1.3.2碳二亞胺法制備免疫抗原_①稱取30mgl 1 α -OH-P的半琥珀酸酯活化物11 α -OH-P-HS,溶于0. 5mlDMF中。②稱取8. 94mgNHS 溶于 0. ImlDMF 中。③稱取16. 02mgDCC 溶于 0. ImlDMF 中。④將后兩者加入①中，室溫攪拌90min。⑤稱取BSA95. 2mg 溶于 7ml，PH7. OPB 溶液中。⑥將⑤加入上述混合液中，4°C攪拌過夜。⑦透析0. IMNaHCO3透析4. 5小時、去離子水透析5小時、PH7. OPBS液透析過夜，將 樣品4220g離心30min，取上清，真空冷凍干燥即得偶合物P-BSA的白色粉末。1. 3. 3P-KLH、 P-OVA的制備方法同上。1.3. 4抗血清的制備取10只8周齡雄性BalB/c鼠，隨機分為兩組，一組用P-BSA作免疫注射，另一組注 射P-KLH進(jìn)行免疫。以上兩組小鼠，首次免疫注射時，分別取1. 0mg/ml的免疫抗原50 μ 1， 與等量弗氏完全佐劑充分乳化，小鼠頸部皮下注射。間隔兩周后取1.0mg/ml的免疫抗原
550μ 1與弗氏不完全佐劑乳化，頸部皮下注射。再間隔兩周后，腹腔直接注射50μ 1的免疫 抗原。最后一次注射后10天挖眼采血，分離血清，進(jìn)一步對偶聯(lián)物作免疫學(xué)方面的鑒定。1. 3. 5間接ELISA的反應(yīng)程序①抗原包被用包被稀釋液對檢測抗原進(jìn)行稀釋，每孔加入100 μ 1，置4°C冰箱過 夜。②封閉封閉液每孔200 μ 1，置4 °C冰箱過夜。③洗滌洗滌液100 μ 1/孔，每次3min，洗3次。④加入待檢血清用PBS對待檢血清進(jìn)行適當(dāng)稀釋之后，100 μ 1/孔，濕盒37°C作 用Ih0⑤洗滌同步驟③。⑥加入酶標(biāo)二抗用PBS對酶標(biāo)二抗進(jìn)行1 2000稀釋，100 μ 1/孔，濕盒37°C作 用 20min。⑦洗滌同步驟③。⑧加底物100μ 1/孔，37°C避光反應(yīng)20min。⑨終止反應(yīng)加入終止液50 μ 1/孔。⑩用酶聯(lián)儀讀出0D490nm值。1.3.6檢測抗原P-OVA最佳包被濃度的確定方陣法確定檢測抗原最佳包被濃度。縱向用檢測抗原P-OVA (1. Omg/ml)，系列稀釋 度包被酶標(biāo)反應(yīng)板，橫向抗血清系列稀釋度，按照方法1.2. 5進(jìn)行操作，490nm處測定各孔 OD值。以0D490nm值接近1. O時檢測抗原的包被濃度為最佳包被濃度。從表1中可知，隨著 P-OVA包被濃度的降低，0D490nm值也降低，當(dāng)檢測抗原P-OVA的包被濃度為1 1. 6X IO2 時(3. 125μ g/ml)，血清稀釋度為1 3. 2 X IO4時的0D490nm值為1. 000，選擇此時的抗原 濃度為檢測抗原P-OVA最佳包被濃度。表1.間接ELISA法抗原最適工作濃度方陣試驗結(jié)果(0D490nm值)
權(quán)利要求
一種牛乳孕酮含量檢測試劑盒，其特征在于包括試劑盒中含有與奶牛孕酮發(fā)生特異性反應(yīng)的孕酮單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛乳孕酮含量檢測試劑盒，其特征在于孕酮單克隆抗體是由 下面的制備方法得到的(1)孕酮完全抗原的制備利用琥珀酸酐法可以使11α -羥孕酮活化，活化的11 α -羥 孕酮可以與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，制備出了孕酮的完全抗原。免疫抗原免疫動物后，用檢測抗原 檢測到的抗體，可以和游離的孕酮發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)。(2)孕酮單克隆抗體的的制備用制備的P-BSAll α -羥孕酮完全抗原為免疫抗原免疫小鼠，采用化學(xué)融合法，以聚乙 二醇為融合劑，經(jīng)過融合、篩選、克隆、擴大培養(yǎng)和純化鑒定等步驟，從而得到抗孕酮的單克 隆抗體。
3.—種如權(quán)利要求1所述的牛乳孕酮含量檢測試劑盒，其特征在于具體包括①酶標(biāo)板一塊，避光密封，內(nèi)放干燥劑；酶標(biāo)板的制備將檢測抗原用包被稀釋液0. 05mol/L, pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液，稀 釋至3. 125ug/mL，每孔IOOul加入酶標(biāo)板，置4°C冰箱過夜后37°C孵育2h，甩干；再用封閉 液2%的山羊血清200μ 1/孔，37°C封閉2h，用洗滌液PBS洗3次，3min/次，甩干，吹干；②標(biāo)準(zhǔn)品7瓶，每瓶容量為SOOuL；③孕酮抗體1瓶，5mL，使用時用稀釋液稀釋20倍；④HRP山羊抗小鼠酶標(biāo)二抗1瓶，5mL，使用時用稀釋液稀釋20倍。⑤底物溶液A液，一瓶，10mL。0.lmg/mL TMB ；B液，一瓶，lmL，30%的過氧化氫在底物 溶液中的濃度為0. lyL/mL，使用時A B為100 1 ；⑥終止液1瓶，5mL,2M硫酸溶液；⑦稀釋液1瓶，10mL，使用時用蒸餾水進(jìn)行10倍稀釋；⑧洗滌液1瓶，30mL，使用時用蒸餾水進(jìn)行10倍稀釋，磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牛乳孕酮含量檢測試劑盒，屬于一種檢測試劑盒。試劑盒中含有與奶牛孕酮發(fā)生特異性反應(yīng)的孕酮單克隆抗體。試劑盒經(jīng)過嚴(yán)格的檢驗，可用于對樣品孕酮濃度的測定。這是國內(nèi)自行研制的首個牛乳孕酮檢測試劑盒，其精確度和最低檢出量均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號C07K16/26GK101949940SQ20101025014
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月11日
發(fā)明者馮曉聲, 周曉菲, 張乃生, 楊正濤 申請人:吉林大學(xué)