專(zhuān)利名稱(chēng)：用于奶牛早期妊娠診斷的試紙及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)測(cè)定配種后奶牛的乳汁孕酮含量進(jìn)行奶牛早期妊娠診斷的試紙及其檢測(cè)方法，屬于膠體金免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
提高牛奶產(chǎn)量，盡量縮短空懷期是奶牛飼養(yǎng)管理的目標(biāo)之一。因此奶牛早期妊娠診斷是促進(jìn)奶牛業(yè)發(fā)展的重要措施。簡(jiǎn)便而有效的奶牛早期妊娠診斷方法，是養(yǎng)牛生產(chǎn)者及畜牧獸醫(yī)工作者長(zhǎng)期以來(lái)亟待解決的問(wèn)題。因?yàn)槟膛Ｔ缙谌焉镌\斷是改善奶牛飼養(yǎng)管理，提高繁殖率的一項(xiàng)重要措施。如果奶牛配種后不能及時(shí)診斷是否妊娠，就可導(dǎo)致產(chǎn)犢間隔延長(zhǎng)、繁殖率降低、奶產(chǎn)量減少，飼養(yǎng)管理成本增高，大大影響經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)報(bào)道，如延誤1個(gè)情期(一般是21天)，每頭牛將減少奶產(chǎn)量168-315kg；另?yè)?jù)專(zhuān)家估計(jì)，每頭多喂1天將在飼料、人工、能源等方面多耗20-32元，多喂一個(gè)發(fā)情周期將增加成本420-672元。若利用此方法能及時(shí)對(duì)奶牛妊娠進(jìn)行診斷，則其經(jīng)濟(jì)效益十分顯著。目前我國(guó)奶牛的第一情期受孕率僅40-60％，多數(shù)奶牛需配種(授精)2-3次才能受孕，以延誤1-2個(gè)發(fā)情周期計(jì)算，減奶168-630kg。
可見(jiàn)，奶牛早期妊娠診斷技術(shù)的研究，對(duì)縮短空懷期和產(chǎn)犢間隔，提高繁殖率，進(jìn)一步促進(jìn)奶牛業(yè)的發(fā)展具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。
乳汁孕酮(MP4)濃度的變化是標(biāo)示母牛卵巢活動(dòng)的一項(xiàng)特異指征。應(yīng)用放射免疫測(cè)定法(RIA)測(cè)定MP4，證明了MP4的變化所反映的發(fā)情周期階段與直檢卵巢的評(píng)估結(jié)果相一致。因此，可以通過(guò)MP4的濃度來(lái)監(jiān)測(cè)母牛的生殖活動(dòng)。MP4濃度隨著母牛所處的生殖生理階段不同具有特征性變化，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道曾憲垠等。應(yīng)用雙抗EIA檢測(cè)奶牛發(fā)情周期中奶孕酮含量。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，14(3)453-456.其變化規(guī)律為配種后1-5天，乳汁中孕酮含量低，小于3ng/ml。隨著配種后天數(shù)的增加，孕酮含量也逐漸增加。配種后11天，孕酮含量迅速升高。配種后11-19天，孕酮含量維持在較高水平，均大于8ng/ml。配種后1-19天，孕與非孕牛奶中孕酮含量無(wú)明顯差異。20天以后，非孕牛奶中孕酮含量開(kāi)始下降，配種后21天陡降到低水平(小于1ng/ml)，而孕牛奶中孕酮含量則繼續(xù)維持在較高水平。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)T檢驗(yàn)，配種后21-24天，孕牛乳汁孕酮含量顯著高于非孕牛(p＜0.01)。孕與非孕牛配種后0-29天乳汁孕酮含量變化圖式不相同，非孕牛配種后25天起，乳中孕酮含量又逐漸上升。因此采集配種后25-30天乳樣并測(cè)定其MP4含量，對(duì)早孕診斷是切實(shí)可行的。
目前在奶牛早期妊娠診斷中常用的幾種方法有直腸診斷法，超聲波診斷法，孕酮的放射免疫法和孕酮的酶標(biāo)免疫法。其中直腸診斷法要求操作者必須具有一定的臨床經(jīng)驗(yàn)，較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，有時(shí)還會(huì)引起疾病傳染或流產(chǎn)，而且兩個(gè)半月才能檢測(cè)出懷孕的征象，做出診斷。超聲波診斷法由于儀器昂貴和專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作而使其廣泛應(yīng)用受限；孕酮的放射免疫法又具有放射性污染，需要特殊防護(hù)設(shè)備、價(jià)格昂貴的儀器和訓(xùn)練有素的人員，而且操作費(fèi)時(shí)等弊端，樣品的測(cè)試僅限于專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)室；孕酮酶標(biāo)免疫法是近年來(lái)使用較多的方法，但仍需要專(zhuān)業(yè)人員或經(jīng)培訓(xùn)的人員操作，并且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，步驟多，試劑盒也需冷藏。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的一些缺點(diǎn)，提供了一種通過(guò)膠體金免疫法來(lái)檢測(cè)配種后奶牛乳汁中的孕酮含量，現(xiàn)場(chǎng)診斷奶牛早孕的檢測(cè)試紙及其檢測(cè)方法。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的在奶牛早期妊娠診斷試紙底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗(yàn)線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水層，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水層和孕酮單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接(交疊連接部分在1-2毫米范圍)，在孕酮單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層。關(guān)于底板、硝酸纖維素膜、吸水紙、膠體金標(biāo)墊的組合方法已是公知技術(shù)。萬(wàn)華普曼生物工程有限公司于1995年已獲雙抗夾心法檢測(cè)人絨毛膜促性腺激素診斷試紙的國(guó)藥批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字S10950049號(hào)；1998年獲得競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)嗎啡試紙的國(guó)藥字批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字S19990038號(hào)，并將產(chǎn)品投放市場(chǎng)。
方案1雙抗夾心法由于孕酮分子有不同的結(jié)合位點(diǎn)，用不同的方法來(lái)合成不同結(jié)合位點(diǎn)的免疫原，將免疫原進(jìn)行免疫，篩選出兩種不同孕酮單克隆抗體，兩種不同抗體能夠識(shí)別同一抗原并以?shī)A心的方式結(jié)合于同一孕酮分子的不同位點(diǎn)，利用雙抗夾心法原理制成的試紙一種抗體稱(chēng)為I用于包被試驗(yàn)線，另一種抗體稱(chēng)為II用于膠體金標(biāo)記。
把奶牛早期妊娠診斷試紙的樣品吸液層端放入待測(cè)的奶牛乳汁中(液面不得超過(guò)MAX線圖中8)，由于毛細(xì)管作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至孕酮單克隆抗體II金標(biāo)墊時(shí)，樣品中的孕酮與孕酮單克隆抗體金標(biāo)探針發(fā)生特異結(jié)合，當(dāng)移動(dòng)至固定有孕酮單克隆抗體I試驗(yàn)線時(shí)，樣品中的孕酮另一位點(diǎn)又與試驗(yàn)線中的孕酮單克隆抗體相結(jié)合，因此其膠體金滯留于試驗(yàn)線上，試驗(yàn)線處顯示紅色，為陽(yáng)性；相反如果樣品中沒(méi)有孕酮，抗孕酮單克隆抗體金標(biāo)探針就不會(huì)與試驗(yàn)線上的孕酮單克隆抗體I發(fā)生特異結(jié)合，沒(méi)有膠體金滯留，即僅有一條紅色控制線為陰性，這就是雙抗夾心法原理。根據(jù)此原理，兩條線為陽(yáng)性，一條線為陰性得出診斷。
方案2競(jìng)爭(zhēng)法試驗(yàn)線是由孕酮-BSA包被。把奶牛早期妊娠診斷試紙的樣品吸液層端放入奶牛乳汁中，由于毛細(xì)管作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至孕酮單克隆抗體金標(biāo)墊時(shí)，樣品中的孕酮與孕酮單克隆抗體金標(biāo)探針發(fā)生特異結(jié)合，當(dāng)移動(dòng)至固定有孕酮-BSA聯(lián)結(jié)物試驗(yàn)線時(shí)，由于孕酮單克隆抗體金標(biāo)墊中的抗體與樣品中孕酮優(yōu)先結(jié)合成復(fù)合物而失去其與孕酮-BSA結(jié)合，因此其膠體金不能滯留于試驗(yàn)線上，試驗(yàn)線處沒(méi)有紅色線顯示，即只有一條紅色控制線為陽(yáng)性；相反如果樣品中沒(méi)有孕酮，孕酮單克隆抗體金標(biāo)墊中的抗體移動(dòng)到試驗(yàn)線上，孕酮單克隆抗體就會(huì)與孕酮-BSA聯(lián)結(jié)物發(fā)生特異結(jié)合，使膠體金滯留于試驗(yàn)線上，即二條紅色線為陰性，這就是免疫競(jìng)爭(zhēng)法原理。試驗(yàn)線的顏色深淺與樣品中孕酮含量高低成反比。從陽(yáng)性過(guò)渡到陰性，由于所測(cè)孕酮含量不同，試驗(yàn)線的顏色也不同，形成一個(gè)紅色顏色梯度差，以這種原理檢測(cè)出OD值，從而推斷出試驗(yàn)線所反應(yīng)的實(shí)際孕酮ng水平，從而得出診斷。
方案1或方案2中，當(dāng)移動(dòng)至羊抗鼠多克隆抗體控制線時(shí)，無(wú)論樣品中有無(wú)孕酮，標(biāo)記的金標(biāo)探針都會(huì)與已設(shè)定好的羊抗鼠多克隆抗體結(jié)合滯留，使控制線顯示紅色。因此控制線無(wú)色帶產(chǎn)生則代表操作有誤，檢測(cè)時(shí)樣品液面超過(guò)MAX線或試紙已經(jīng)過(guò)期。
由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明所提供的奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測(cè)方法具有這樣的有益效果，即特異性強(qiáng)，靈敏度高，易儲(chǔ)存，無(wú)須專(zhuān)門(mén)技術(shù)人員操作，而且結(jié)果易讀。


圖1為本發(fā)明奶牛早期妊娠診斷試紙的主視結(jié)構(gòu)圖。
圖2為發(fā)明圖1的側(cè)視結(jié)構(gòu)圖。
圖3為本發(fā)明方案1雙抗夾心法的應(yīng)用于檢測(cè)時(shí)顯示為陰性結(jié)果圖；發(fā)明方案2競(jìng)爭(zhēng)法的應(yīng)用于檢測(cè)時(shí)顯示的陽(yáng)性結(jié)果圖。
圖4為本發(fā)明方案1雙抗夾心法應(yīng)用于檢測(cè)時(shí)顯示為陽(yáng)性結(jié)果圖；發(fā)明方案2競(jìng)爭(zhēng)法的應(yīng)用于檢測(cè)時(shí)顯示的陰性結(jié)果圖。
圖5為本發(fā)明方案2競(jìng)爭(zhēng)法所制試紙比色用的檢測(cè)色標(biāo)。
圖中1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、羊抗鼠多克隆抗體控制線，4、試驗(yàn)線，5、單克隆抗體金標(biāo)墊，6、樣品吸液層，7、底板，8、MAX線。
具體實(shí)施例1.孕酮免疫原合成(1)抗原I的合成半抗原I的合成將10.45g(0.033mol)孕烯醇酮與10.45g(0.082mol)(0-羰基甲基)羥胺鹽酸鹽，溶于517ml含有46.5ml 2N KOH乙醇溶液中，將此溶液回流3小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸除溶劑，向體系中添加150ml水，用2N KOH溶液調(diào)pH值在10～10.5范圍，用乙酸乙酯萃取2次，再用濃HCl酸化水相到pH值至2左右，于冰箱中放置24h，過(guò)濾后用水洗滌沉淀，產(chǎn)物A約為13g，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，得到產(chǎn)物12g。
將0.68g A加入到50ml乙酸乙酯中，加入10ml乙醚和重氮甲烷的混合溶液，有氣泡放出，反應(yīng)體系常溫?cái)嚢柽^(guò)夜，過(guò)量的重氮甲烷用少量的冰醋酸除去，旋轉(zhuǎn)蒸除反應(yīng)體系中的溶劑，得到0.6g晶體B。
取2.57g(6.4mmol)B加入95ml無(wú)水丙酮和25ml無(wú)水苯，加熱回流，加入異丙醇鋁溶液(4.73g異丙醇鋁溶于100ml無(wú)水苯中)，反應(yīng)液回流8h后，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，并添加25ml苯。用40ml 50％羅氏鹽溶液洗滌混合液，濾出固體并分出苯層，用水洗滌三次，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾出干燥劑后，旋轉(zhuǎn)蒸除溶劑，得到1.62g粘稠狀固體，將該固體用少量苯稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)硅膠柱純化，重結(jié)晶后得到中間體C。
取2.18gC溶于78.5ml甲醇中，加入8.7ml(0.1N)NaOH，室溫下攪拌反應(yīng)，每隔1h取出少量反應(yīng)液，用水稀釋后進(jìn)行TLC檢測(cè)，3h后基本反應(yīng)完全。濃縮反應(yīng)物，用蒸餾水稀釋?zhuān)?0ml乙醚洗滌兩次。水層用1NHCl調(diào)pH值至2左右，冷藏過(guò)夜后過(guò)濾，用水洗滌濾餅，在真空干燥箱中(90～95℃)干燥2小時(shí)，得到粗品。用水和甲醇重結(jié)晶2次，得到產(chǎn)物D。
取2.33gD溶于350ml丙酮中，并冷卻到10℃，通N2，滴加瓊斯鉻酸氧化劑并將反應(yīng)溫度保持在15℃左右，直至出現(xiàn)橄欖綠色沉淀，加入2L含20ml甲醇的水溶液，使沉淀完全。過(guò)濾、水洗、風(fēng)干，得到2.28g產(chǎn)物E，將其溶于150ml甲醇中，加5滴10％KOH溶液，冷藏過(guò)夜，用HCl調(diào)pH值至2左右，添加足夠的水使沉淀完全，用乙酸乙酯萃取，用水洗滌酯層，無(wú)水Na2SO4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸除溶劑。用丙酮-石油醚重結(jié)晶得1.9g孕酮半抗原I(P4I)。P4免疫抗原I和檢測(cè)抗原I的合成1.2g的孕酮半抗原I(P4I)和0.75ml三正丁胺溶于30ml二氧六環(huán)中，冷卻至8℃，加入0.4ml氯甲酸異丁酯。這個(gè)反應(yīng)在8℃下進(jìn)行35min，而后混合溶液被添加到BSA溶液中(4.2g BSA、110ml H2O、80ml二氧六環(huán)、4.8ml 1N NaOH)，此時(shí)pH值為9，冷卻、攪拌。溶液開(kāi)始時(shí)混濁，20min后變清，測(cè)pH值降到6.8左右。用1N NaOH溶液將反應(yīng)液pH值調(diào)到7.5左右，攪拌30min，加入0.5ml此濃度NaOH溶液。反應(yīng)進(jìn)行4.5h后，用蒸餾水透析過(guò)夜，用1N HCl調(diào)pH值至4.5，過(guò)濾，沉淀冷凍24小時(shí)，將連接物(沉淀)加到200ml水中，用1N NaOH調(diào)pH值至7左右，再加300ml丙酮用1N HCl調(diào)pH值至5左右，連接物又變成沉淀。冷藏3小時(shí)后離心連接物，得到兩個(gè)相似沉淀。
用蒸餾水透析5天，每天更換透析液2次，冷凍干燥后得到P4免疫抗原I(P4I-BSA)。
同法合成P4檢測(cè)抗原I(P4I-OVA)。
(2)抗原II的合成半抗原II的合成稱(chēng)取1.0g 11α-羥基孕酮溶解于40ml無(wú)水吡啶中，加入3g琥珀酸酐，在120℃下回流24h，用簿層色譜(TLC)法檢測(cè)，反應(yīng)完全。冷卻，向反應(yīng)體系中添加200ml蒸餾水。先用乙醚萃取反應(yīng)液(100mL×2)，用水洗一次乙醚相(1/20vol)，再用飽和碳酸鈉溶液洗滌一次。分離水相，用10％的鹽酸酸化水相pH值至4左右，再用乙酸乙酯萃取3遍，無(wú)水Na2SO4干燥有機(jī)相。旋轉(zhuǎn)蒸除溶劑，得到的黃色油狀物用乙酸乙酯和石油醚重結(jié)晶，得到11α-羥基孕酮半琥珀酸，即半抗原II(P4II)。
P4免疫抗原II和檢測(cè)抗原II的合成稱(chēng)取11α-羥基孕酮半抗原(P4II)215mg溶于2ml無(wú)水二氧六環(huán)中，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)113mg溶于1ml無(wú)水二氧六環(huán)中，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)57.5mg溶于1ml無(wú)水二氧六環(huán)中。三種溶液混合，室溫?cái)嚢?h。
過(guò)濾(除尿素)，用無(wú)水二氧六環(huán)洗滌(總體積8ml)。取6.4ml濾液逐滴滴加到BSA溶液(500mg BSA溶于10ml 0.2mol/L磷酸緩沖液)中，添加水和二氧六環(huán)防止產(chǎn)成沉淀，室溫下攪拌過(guò)夜。
過(guò)濾反應(yīng)液，用蒸餾水于4℃下透析5天，每天換液2次，冷凍干燥后得到P4免疫抗原II(P4II-BSA)。
同法合成P4檢測(cè)抗原II(P4II-OVA)。
2.孕酮單克隆抗體的制備。
(1)將制備的兩種不同結(jié)合位點(diǎn)的孕酮-BSA分別免疫BALB/c小鼠。用SP20細(xì)胞融合建立瘤株進(jìn)行篩選，取瘤細(xì)胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產(chǎn)生腹水。
(2)提取小鼠腹水純化篩選，獲得與孕酮分子不同位點(diǎn)結(jié)合的兩種孕酮單克隆抗體I、II，II可用于雙抗夾心法的膠體金標(biāo)記和競(jìng)爭(zhēng)法的膠體金標(biāo)記。
3.膠體金的制備及與孕酮單克隆抗體的結(jié)合。
(1)取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到90～95℃，加入適量枸櫞酸三納繼續(xù)加熱攪拌至沸騰5分鐘，冷卻后避光保存?zhèn)溆谩?br> (2)把孕酮單克隆抗體標(biāo)記的膠體金液，吸附纖維材料上，干燥后備用。
4.制膜機(jī)制膜利用電腦控制傳動(dòng)速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。
5.試紙條組合按公知技術(shù)組合。
使用方法授精后25-30天為早孕最佳檢測(cè)時(shí)間。把奶牛早期妊娠診斷試紙的樣品吸液層端放入新采的牛奶中(液面不得超過(guò)MAX線圖中8)，1分鐘后取出試紙平放，由于毛細(xì)管和虹吸作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動(dòng)，雙抗夾心為5分鐘時(shí)觀察結(jié)果，競(jìng)爭(zhēng)法為15分鐘時(shí)觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷方案1利用雙抗夾心法制成試紙的反應(yīng)線顏色為紅色，即顯色區(qū)為兩條紅色線時(shí)為陽(yáng)性；只有一條紅色控制線時(shí)為陰性；如果顯色區(qū)有兩條線，其中試驗(yàn)線未變紅色時(shí)則判斷為可疑。
方案2利用競(jìng)爭(zhēng)法制成試紙其檢測(cè)色標(biāo)所標(biāo)定的深紅色代表的陰性值為孕酮濃度4ng/ml以下，淺紅色代表陽(yáng)性值為孕酮濃度8ng/ml以上，顏色在兩者之間為可疑。光電儀器的標(biāo)準(zhǔn)值，其中陽(yáng)性值代表孕酮濃度在8ng/ml以上，陰性值代表孕酮濃度在4ng/ml以下，在兩值之間的值判定為可疑。
權(quán)利要求
1.一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測(cè)方法，試紙是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、孕酮單克隆抗體金標(biāo)墊(5)、樣品吸液層(6)組成；底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗(yàn)線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和孕酮單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接，在孕酮單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層，其特征在于利用免疫膠體金法來(lái)進(jìn)行奶牛的早期妊娠診斷，進(jìn)而確定所測(cè)奶牛是否懷孕。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測(cè)方法，其特征在于此試紙可用兩種不同的方法制成，一種是由雙抗夾心原理制成，另一種是由競(jìng)爭(zhēng)法原理制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測(cè)方法，其特征在于控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被而成，當(dāng)樣品通過(guò)膠體金標(biāo)記的孕酮單克隆抗體移動(dòng)至羊抗鼠多克隆抗體控制線時(shí)，控制線便顯示紅色。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測(cè)方法，其特征在于由于孕酮分子有不同的結(jié)合位點(diǎn)，用不同的方法來(lái)合成不同結(jié)合位點(diǎn)的免疫原，將免疫原進(jìn)行免疫，篩選出兩種不同孕酮單克隆抗體，兩種不同抗體能夠識(shí)別同一抗原并以?shī)A心的方式結(jié)合于同一孕酮分子的不同位點(diǎn)，利用雙抗夾心法原理制成的試紙一種抗體稱(chēng)為I用于包被試驗(yàn)線，另一種抗體稱(chēng)為II用于膠體金標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測(cè)方法，其特征在于利用競(jìng)爭(zhēng)法原理所制成的試紙由孕酮-BSA包被試驗(yàn)線，篩選一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的單克隆抗體作為膠體金標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測(cè)方法，其特征在于利用雙抗夾心法制成試紙的試驗(yàn)線顏色深淺與檢測(cè)樣品中孕酮含量高低成正比。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測(cè)方法，其特征在于利用競(jìng)爭(zhēng)法制成試紙的試驗(yàn)線顏色深淺與檢測(cè)樣品中孕酮含量高低成反比。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測(cè)方法，其特征在于利用雙抗夾心法制成試紙的反應(yīng)線顏色為紅色，即顯色區(qū)為兩條線時(shí)為陽(yáng)性；只有一控制線為紅色時(shí)為陰性；如果顯色區(qū)有兩條線，其中試驗(yàn)線未變紅色時(shí)則判斷為可疑。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種用于奶牛早期妊娠診斷試紙及其檢測(cè)方法，其特征在于利用競(jìng)爭(zhēng)法制成試紙其檢測(cè)色標(biāo)所標(biāo)定的深紅色代表陰性值為孕酮濃度4ng/ml以下，淺紅色色標(biāo)代表陽(yáng)性值為孕酮濃度8ng/ml以上，顏色在深淺色標(biāo)之間為可疑；光電儀器的標(biāo)準(zhǔn)值，其中陽(yáng)性值代表孕酮濃度在8ng/ml以上，陰性值代表孕酮濃度在4ng/ml以下，在兩值之間的值判定為可疑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過(guò)測(cè)定配種后牛的乳汁孕酮含量進(jìn)行奶牛早期妊娠診斷的試紙及其檢測(cè)方法，屬于膠體金免疫檢測(cè)領(lǐng)域。試紙是由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、孕酮單克隆抗體金標(biāo)墊、樣品吸液層組成；利用雙抗夾心和競(jìng)爭(zhēng)兩種不同的方法制成試紙，檢測(cè)授精后25－30天的奶牛乳汁，根據(jù)顯色區(qū)的不同顏色變化來(lái)判斷所測(cè)奶牛是否懷孕。奶牛早期妊娠診斷試紙?zhí)禺愋詮?qiáng)，靈敏度高，易儲(chǔ)存，無(wú)須專(zhuān)門(mén)技術(shù)人員操作，而且結(jié)果易讀。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1796998SQ20051010916
公開(kāi)日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者萬(wàn)積成 申請(qǐng)人:萬(wàn)積成