專利名稱：豬白細(xì)胞介素－2基因抗感染制劑的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
1.生物技術(shù) 2.分子免疫學(xué)具體包括豬白細(xì)胞介素-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、殼聚糖納米顆粒對(duì)藏豬白細(xì)胞介素-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的分子包裝及其增強(qiáng)動(dòng)物免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)力的應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素-2(IL-2)是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵性的細(xì)胞因子，主要由輔助T細(xì)胞、NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞分泌；它能激活并促進(jìn)T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞的分化成熟，誘導(dǎo)淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)活性，還能促進(jìn)許多淋巴因子如干擾素，腫瘤壞死因子等的合成與釋放以及抗體生成，顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。IL-2已用于預(yù)防和治療一些常規(guī)方法難以治療的，如腫瘤、病毒感染等免疫抑制、免疫機(jī)能低下的疾病，如惡性黑色素瘤及腎細(xì)胞癌，其他腫瘤有神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱、卵巢腫瘤，視神經(jīng)細(xì)胞癌、肺、頭頸部、乳腺腫瘤、淋巴瘤、結(jié)腸癌及內(nèi)皮癌等(Baigrie RJ，1992)。在獸醫(yī)方面因其能提高疫苗的免疫效果，尤其是在基因工程亞單位苗的免疫效果而倍受重視，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。
IL-2跟IL-2R結(jié)合后才發(fā)揮作用，它與活化T細(xì)胞表面的IL-2Rα鏈、β鏈和γ鏈結(jié)合。首先β鏈和γ鏈結(jié)合成中等親和力受體，再與低親和力的α鏈?zhǔn)荏w結(jié)合，成為高親和力受體。IL-2與三聚體結(jié)合后，發(fā)生信號(hào)傳導(dǎo)，引起NK細(xì)胞與單核細(xì)胞的增殖反應(yīng)及活化CTL。其中的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚不清楚，可能與一種酪氨酸激酶的激活相關(guān)。另外，IL-2Rα鏈易從細(xì)胞上脫落成可溶性IL-2Rα，可與細(xì)胞表面IL-2受體競(jìng)爭(zhēng)型IL-2，對(duì)IL-2的生物學(xué)活性發(fā)揮起抑制作用。
IL-2的主要生物學(xué)活性包括1刺激T細(xì)胞生長(zhǎng)IL-2最重要的作用是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖(從G0期進(jìn)入S期)和分化。IL-2對(duì)T細(xì)胞的作用還包括增強(qiáng)CTL的細(xì)胞毒活性，增加細(xì)胞內(nèi)pH，促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)，增強(qiáng)細(xì)胞間的接觸和誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(IFN-γ、IL4、TNF和CSF等)。
2誘導(dǎo)細(xì)胞毒作用(1)接受了抗原預(yù)刺激信號(hào)的CD8+T細(xì)胞可以受IL-2的作用活化CTL，發(fā)揮細(xì)胞毒作用；在一定條件下，CD4+T細(xì)胞也可受IL-2的誘導(dǎo)而具有殺傷作用。
(2)NK細(xì)胞是唯一正常情況下表達(dá)IL-2R的淋巴細(xì)胞，因此始終對(duì)IL-2保持反應(yīng)性。然而靜止NK細(xì)胞上只表達(dá)IL-2R的β鏈和γ鏈，對(duì)IL-2的親和力低，只能對(duì)高濃度的IL-2發(fā)生反應(yīng)。一旦NK細(xì)胞活化，就表達(dá)IL-2R的α鏈，成為高親和力的受體；大劑量IL-2誘導(dǎo)的LAK活性主要來(lái)源于NK細(xì)胞。
(3)使T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ、TNFβ和TGFβ等因子，促進(jìn)非特異性細(xì)胞毒性；還可誘導(dǎo)產(chǎn)生某些B細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及造血因子等，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。
3對(duì)B細(xì)胞的作用IL-2對(duì)B細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化均有一定的促進(jìn)作用。較高濃度的IL-2可誘導(dǎo)B細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，促使抗體分泌，并誘使B細(xì)胞由分泌IgM向著分泌IgG2轉(zhuǎn)換。
IL-2除了支持B細(xì)胞生長(zhǎng)外，還能促進(jìn)免疫球蛋白(IgM和IgG)的分泌，誘導(dǎo)J鏈合成從而加速IgM的裝配和分泌。
4對(duì)巨噬細(xì)胞的作用高劑量的IL-2能激活單核巨噬細(xì)胞增殖和分化，并增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。單核-巨噬細(xì)胞受到IL-2的持續(xù)作用后，其抗原遞呈能力、殺菌力、細(xì)胞毒性均明顯增強(qiáng)，分泌某些細(xì)胞因子的能力也得到加強(qiáng)。
IL-2還能誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)LAK細(xì)胞和TIL，并刺激它們產(chǎn)生細(xì)胞因子。
現(xiàn)在IL-2重組蛋白是應(yīng)用較廣泛的細(xì)胞因子免疫增強(qiáng)劑。重組人IL-2能提高傷寒桿菌活苗和莢膜多糖亞單位苗的免疫效果；重組牛IL-2與牛皰疹病毒I型活苗一起使用，血清中中和抗體滴度比單獨(dú)使用疫苗組提高6倍；用牛皰疹病毒糖蛋白亞單位苗免疫牛，并注射IL-2，可顯著提高特異性抗體滴度，特異性細(xì)胞毒反應(yīng)和特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)；重組牛IL-1、IL-2能促進(jìn)牛病毒性腹瀉死苗的免疫效果；IL-2分別于狂犬病疫苗或瘧疾疫苗聯(lián)合使用，對(duì)相應(yīng)抗原的攻擊有保護(hù)作用。Ramshaw等(1981)、Flexner等(1987)先后報(bào)道將小鼠或人IL-2cDNA與含禽流感血凝素(HA)基因的痘病毒重組，獲得表達(dá)IL-2的重組病毒。將這種重組病毒與不含IL-2基因的痘病毒同時(shí)接種裸鼠，結(jié)果顯示，IL-2的插入并不影響HA的表達(dá)水平及免疫原性，但可以提高裸鼠的抗病力。Hazama等(Hazama et al.，1993)將IL-2基因與牛單純性皰疹病毒糖蛋白D基因融合，真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)融合蛋白，免疫小鼠后攻毒。結(jié)果該融合蛋白可以完全保護(hù)小鼠免疫病毒攻擊，而以氫氧化鋁為佐劑但不含IL-2的重組糖蛋白只產(chǎn)生部分保護(hù)，IL-2在體內(nèi)的半衰期也因此延長(zhǎng)大約4倍。這些結(jié)果表明采用此種方式獲得，是研制新一代基因工程苗的另一途徑。
rIL-2能顯著增強(qiáng)人體免疫功能，只要每天注射10μg-100μg的rIL-2，四周后，NK細(xì)胞的高親和受體即可從10％升至60-80％，能大大增強(qiáng)其免疫功能(Akuffo H，Kaplan G，etal.1990)，說(shuō)明rIL-2是良好的免疫治療因子，對(duì)維持人體正常健康以及防病治病有重要的作用。用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體插入IL-2基因，再轉(zhuǎn)化肝癌細(xì)胞株HAC，從而使之能持續(xù)分泌IL-2。將此IL-2基因轉(zhuǎn)化了的HAC去接種大鼠腹腔或皮下，結(jié)果使動(dòng)物生存期延長(zhǎng)，田體積縮小，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明IL-2的基因治療在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中取得了明顯的效果(王立群，鄭仲承，1996)。
rIL-2對(duì)感染性疾病有較好的治療作用。rIL-2對(duì)麻瘋病的治療有很好的療效，每天注射兩次，每次10μg，經(jīng)8天的療效，可相當(dāng)于WHO使用MDT一年的療效；有人發(fā)現(xiàn)，rIL-2對(duì)結(jié)核桿菌(TB)有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)小鼠接種TB5或15天后，每天肌肉注射0.5-1.0萬(wàn)IU的rIL-2共10天，然后觀察脾臟中TB細(xì)菌數(shù)目，結(jié)果rIL-2對(duì)TB的抑制作用能達(dá)到99％(Flexner C，Hugin A，et al，1987)；近年來(lái)性病有蔓延趨勢(shì)，尖銳濕疣過(guò)去在性病中居第4位，現(xiàn)在上海的統(tǒng)計(jì)上升到第二位，它是由乳頭狀瘤病毒感染所致，可用激光治療，但復(fù)發(fā)率高達(dá)30-60％，用rIL-2合劑肌肉注射與激光治療相結(jié)合，可完全防止復(fù)發(fā)，療效幾乎100％。對(duì)AIDS病患者，使用低劑量rIL-2(10萬(wàn)IU/天)，治療一個(gè)月，也獲得一定的效果。rIL-2對(duì)嚴(yán)重結(jié)合免疫缺陷癥(SCID)也有一定療效(McElrach MJ，et al，1990)。
以上rIL-2的治療作用，均由于rIL-2增強(qiáng)免疫功能所致，也證明用小劑量rIL-2能增強(qiáng)免疫功能，可產(chǎn)生良好的療效。
rIL-2對(duì)腫瘤有較強(qiáng)的治療作用。肌注rIL-2能增強(qiáng)癌癥患者的免疫功能。在rIL-2的臨床癌癥患者中，大部份患者的免疫功能經(jīng)rIL-2治療而增強(qiáng)，rIL-2的這種免疫功能對(duì)防止癌癥患者在手術(shù)、放化療后的復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移而延長(zhǎng)病人生命，有一定的作用。rIL-2與LAK合用治療癌癥，兩者療效均達(dá)50％，采用局部動(dòng)脈灌注rIL-2及異體LAK，治療肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、腎癌共268人，灌注682例次，總有效率36.5％(肝癌38％)，癥狀改善率68.3％(肝癌70％以上)。
此外，IL-2有明顯的鎮(zhèn)痛作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明結(jié)果IL-2的鎮(zhèn)痛作用非常明顯(Li JZ，ZhouDH，et al.1993)，用電生理方法也得到證實(shí)(Zhao ZQ，Yang XY.1994)。故IL-2的鎮(zhèn)痛現(xiàn)象，已明確無(wú)誤，在臨床應(yīng)用IL-2時(shí)，它一般能使病人疼痛癥狀減輕，生活指標(biāo)提高，可能與IL-2的這一鎮(zhèn)痛作用有關(guān)。
總之，白細(xì)胞介素-2(interleukin 2，IL2)具有廣泛的生物學(xué)活性，對(duì)免疫系統(tǒng)和免疫應(yīng)答具有十分重要的調(diào)節(jié)效應(yīng)，已在抗腫瘤與病毒病方面顯示較好的療效。在動(dòng)物醫(yī)學(xué)上因其能提高疫苗的免疫效果，尤其是在基因工程亞單位苗的免疫應(yīng)答而倍受重視，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。但直接注射IL2時(shí)，因其體內(nèi)的存留時(shí)間較短，大劑量重復(fù)給藥不僅費(fèi)用高，而且常伴有較重的毒副作用，因而尋找高效安全、效應(yīng)持久和經(jīng)濟(jì)價(jià)廉的新型實(shí)用制劑，一直是研究IL2等細(xì)胞因子提高機(jī)體免疫應(yīng)答的熱點(diǎn)應(yīng)用研究領(lǐng)域。
殼聚糖是天然生物多糖甲殼質(zhì)的脫乙酰基衍生物，具有很好的生物相容性、可被體內(nèi)多種酶類降解、降解產(chǎn)物安全無(wú)毒，并能被生物體完全吸收；而且由于其具有獨(dú)特的聚陽(yáng)離子特性，已有的研究結(jié)果顯示它是一種具有很大潛力的緩釋材料。近年來(lái)，在基因轉(zhuǎn)染表達(dá)研究領(lǐng)域已出現(xiàn)了基于殼聚糖的納米顆粒系統(tǒng)。大量研究表明，殼聚糖可包裹濃縮DNA，形成小的分散顆粒，將殼聚糖DNA復(fù)合物用于基因運(yùn)載和轉(zhuǎn)染表達(dá)時(shí)，能有效攜帶目的基因進(jìn)入靶細(xì)胞中。包封于殼聚糖顆粒中的物質(zhì)，其釋放率主要決定于殼聚糖的生物降解和溶蝕，因此物質(zhì)釋放明顯延長(zhǎng)。初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于殼聚糖的顆粒系統(tǒng)在生物醫(yī)學(xué)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，殼聚糖還具有多種生物學(xué)功能，尤其是可作為藥物增效劑。
由于殼聚糖納米顆粒良好的生物相容性使其在DNA制劑的包裹應(yīng)用中顯示了廣闊的前景，因此利用殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2制備DNA制劑，并將其應(yīng)用于提高機(jī)體細(xì)胞和體液免疫水平、增強(qiáng)抗感染能力的應(yīng)用技術(shù)，在科研，醫(yī)療，動(dòng)物保健，和產(chǎn)業(yè)化方面具有潛在的巨大價(jià)值。
本發(fā)明首次制備了包裹豬IL2基因(VPIL2)的殼聚糖納米顆粒分子，以其分子包裝豬IL2基因真核表達(dá)質(zhì)粒VPIL2，發(fā)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物免疫機(jī)能和免疫保護(hù)效應(yīng)有顯著的增強(qiáng)作用，可用作高效安全和效應(yīng)持久的新型動(dòng)物免疫增強(qiáng)劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題具體包括豬白細(xì)胞介素-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、殼聚糖納米顆粒對(duì)豬白細(xì)胞介素-2基因真核質(zhì)粒的分子包裝及其增強(qiáng)動(dòng)物免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)力的應(yīng)用技術(shù)。主要包括下列步驟1、豬白細(xì)胞介素2基因的克隆應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離技術(shù)，分離了藏豬外周血液淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，在Con A的刺激下培養(yǎng)24-72h后，提取培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增出藏豬淋巴細(xì)胞白細(xì)胞介素-2基因的cDNA，克隆到pMD18-T載體上，并進(jìn)行了序列分析；將得到的序列在GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了同源比較，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)克隆到了藏豬白細(xì)胞介素-2的cDNA。
2、藏豬白細(xì)胞介素2基因的真核表達(dá)與活性檢測(cè)將豬白細(xì)胞介素2基因亞克隆到真核分泌型表達(dá)載體VR1020上，命名為VRIL-2；豬淋巴母細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明VRIL-2在轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞株后，能夠表達(dá)出有生物活性的IL-2，可刺激豬淋巴母細(xì)胞顯著增殖；此結(jié)果表明已成功構(gòu)建了能正確表達(dá)TPIL-2的真核表達(dá)質(zhì)粒，其表達(dá)產(chǎn)物具有正常的生物學(xué)活性，為研究其體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)作用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
3、殼聚糖納米顆粒的制備和分子包裝將殼聚糖溶液(pH5.5)和VRIL2質(zhì)粒(含適當(dāng)濃度三聚磷酸鹽)溶液分別50℃水浴恒溫20min，均勻混合質(zhì)粒溶液和殼聚糖溶液5min，即得VRIL2質(zhì)粒殼聚糖納米顆粒樣品液。取少量質(zhì)粒殼聚糖納米樣品液于透射電子顯微鏡下觀察納米顆粒形態(tài)并拍照。另取納米顆粒樣品液適量，加雙蒸水稀釋后用Zetasizer 3000HS/IHPL納米粒度分析儀測(cè)定粒徑、分散度及Zeta電位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本法獲得的顆粒直徑主要在40-60nm之間，顆粒的zeta電位達(dá)到+25.6mV，表明所制備的CNP成功完成了VRIL2的分子包裝。
4、藏豬白細(xì)胞介素-2基因抗感染制劑的應(yīng)用試驗(yàn)動(dòng)物用昆明鼠120只，隨機(jī)分為8組，每組15只。采用肌肉注射法，通過(guò)注射小鼠兩側(cè)股四頭肌免疫小鼠。注射裸質(zhì)粒免疫組每只小鼠接種相應(yīng)質(zhì)粒30pmol；注射殼聚糖包裝質(zhì)粒的免疫組每只小鼠接種相應(yīng)包裝的質(zhì)粒6pmol。5周后每只小鼠口服大腸桿菌K88和K99 0.4ml進(jìn)行攻毒(3×109/ml)。大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和豬藍(lán)耳病疫苗特異性小鼠分組見(jiàn)表1，每組小鼠均按豬免疫劑量1/50股外側(cè)肌肉注射免疫。非特異免疫小鼠分組除不注射疫苗外，其它均以特異疫苗免疫組相同。
小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，分離血清，用以檢測(cè)體液免疫應(yīng)答(IgG、IgA及IgM的含量、特異性抗體的測(cè)定)、細(xì)胞免疫反應(yīng)(細(xì)胞因子和外周血免疫細(xì)胞數(shù)量)的動(dòng)態(tài)變化；并在小鼠免疫35天后，以大腸桿菌K88/K99口服攻毒實(shí)驗(yàn)小鼠，觀察發(fā)病情況；49天時(shí)對(duì)所有小鼠進(jìn)行解剖，觀察各種器官的生理病變情況，檢測(cè)免疫保護(hù)效應(yīng)。
本研究首次將豬白細(xì)胞介素-2基因用殼聚糖納米顆粒包裝后通過(guò)肌肉注射的方式免疫小鼠，檢測(cè)了殼聚糖包裝豬白細(xì)胞介素-2基因及未包裝豬白細(xì)胞介素-2基因?qū)π∈蟮捏w液免疫和細(xì)胞免疫水平的影響情況，并對(duì)常規(guī)疫苗在不同的形式的豬白細(xì)胞介素-2基因分子免疫佐劑協(xié)同作用下細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答的變化，進(jìn)行了較為系統(tǒng)的分析。結(jié)果顯示豬白細(xì)胞介素-2基因能顯著提高小鼠的免疫應(yīng)答水平，以殼聚糖納米顆粒作為免疫基因包裝分子，具有減少質(zhì)粒用量、增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫的優(yōu)點(diǎn)。
在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，豬白細(xì)胞介素-2基因裸質(zhì)粒和殼聚糖包裝豬白細(xì)胞介素-2基因質(zhì)粒肌肉注射的方式都能有效提高免疫小鼠對(duì)常規(guī)疫苗的免疫應(yīng)答水平，兩種方式的作用效果差異不大。CNP包裹組的質(zhì)粒用量?jī)H為未包裹組的1/5，但獲得了與VRIL2直接免疫組相似或較強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，其原因可能是殼聚糖納米顆粒包裹質(zhì)粒DNA后，有效地防止了VRIL2被體內(nèi)其它組織蛋白的吸附和體液核酸酶對(duì)DNA的降解，同時(shí)又促進(jìn)VRIL2進(jìn)入細(xì)胞，使質(zhì)粒DNA緩慢釋放，將目的基因DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞中，發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，分泌更多的細(xì)胞因子，增強(qiáng)對(duì)免疫應(yīng)答的上調(diào)效應(yīng)，提高體液和細(xì)胞免疫水平。這在將來(lái)的實(shí)際應(yīng)用上有較大的價(jià)值，意味著較少的質(zhì)粒用CNP包裹后也可刺激較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，減少質(zhì)粒用量，降低成本。這些結(jié)果提示殼聚糖納米顆粒包裹豬白細(xì)胞介素-2基因接種可提高機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫水平，增強(qiáng)免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)力，可望作為豬的新型高效抗感染免疫調(diào)節(jié)劑，具有潛在的廣泛應(yīng)用前景。


圖1a 殼聚糖納米顆粒透射電鏡圖(×50000)圖1b 殼聚糖納米顆粒粒徑分布圖2a TPIL-2 RT-PCR電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)1DL2,000 MTPIL-2cDNA圖2b pMTPIL-2酶切電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)Lane1DL2000marker Lane2BamHI/EcoRI消化 Lane3BamHI消化Lane4EcoRI消化 Lane5空質(zhì)粒圖2.c 真核表達(dá)RT-PCR電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)1DL2,000marker 2VR1020對(duì)照 324h 448h 572h表達(dá)產(chǎn)物圖3a 疫苗免疫組小鼠血清中沙門(mén)氏菌特異性抗體含量圖3b 疫苗免疫組小鼠血清中大腸桿菌特異性抗體含量圖3c 疫苗免疫組小鼠血清中藍(lán)耳病特異性抗體含量圖4a 疫苗免疫組小鼠血清中IgG含量圖4b 疫苗免疫組小鼠血清中IgM含量圖4c 疫苗免疫組小鼠血清中IgA含量圖5a 疫苗免疫組小鼠血清中IL-2含量圖5b 疫苗免疫組小鼠血清中IL-4含量圖5c 疫苗免疫組小鼠血清中IL-6含量圖6a 疫苗免疫組小鼠白細(xì)胞數(shù)量變化圖6b 疫苗免疫組小鼠單核細(xì)胞數(shù)量變化圖6c 疫苗免疫組小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)量變化圖6d 疫苗免疫組小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)量變化圖7a 非特異免疫組小鼠血清中IgA含量圖7b 非特異免疫組小鼠血清中IgG含量圖7c 非特異免疫組小鼠血清中IgM含量圖7d 非特異免疫組小鼠血清中大腸桿菌特異性抗體含量圖8a 非特異免疫組小鼠血清中IL-2含量圖8b 非特異免疫組小鼠血清中IL-4含量圖8c 非特異免疫組小鼠血清中IL-6含量圖9a 非特異免疫組小鼠白細(xì)胞數(shù)量變化圖9b 非特異免疫組小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)量變化圖9c非特異性免疫組小鼠單核細(xì)胞數(shù)量變化圖9d 非特異免疫組小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)量變化
具體實(shí)施例方式
1、藏豬IL2基因(TPIL-2基因)的克隆從健康藏豬耳靜脈無(wú)菌采血10mL，分離藏豬外周血淋巴細(xì)胞，加入10ug/ml Con A刺激，在CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72h，分時(shí)段(24、48、70h)提取藏豬總RNA，設(shè)計(jì)一對(duì)藏豬IL-2基因cDNA擴(kuò)增引物。引物序列如下引物1CGGGATCCCAG TAA CCT CAA CTC CTG CCA CAAT，引物2GCCAA TTCCAA GTC AGT GTT GAG TAG ATG CTTT。
以總RNA為模板，在50μl反應(yīng)體系中加10×RT-PCR反應(yīng)緩沖液5μl，25mM MgCl210μl，10mM dNTP5μl，RNase Inhibitor(40units/μl)1μl，AMV RNase XL(5units/uL)1μl，AMV-Optimized Taq(5units/uL)1μl，5′和3′引物各20uM，總RNA1~2μl，補(bǔ)水至50μl。RT-PCR循環(huán)參數(shù)為50℃，30min；94℃，2min，然后進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)(94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s)后繼續(xù)在72℃延伸10min，4℃保存。
回收cDNA片段，克隆到pMD-T18載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選和鑒定含重組質(zhì)粒的菌落，小規(guī)模提取質(zhì)粒DNA，酶切及電泳觀察質(zhì)粒DNA，確定重組質(zhì)粒中的插入片段的大小同目的片段的大小一樣后(附圖2a.b)，進(jìn)行序列測(cè)定。序列測(cè)定結(jié)果采用DNAtools 5.1進(jìn)行分析。
用M13通用引物對(duì)含有目的基因片斷的pMTPIL-2質(zhì)粒進(jìn)行正反向測(cè)序，通過(guò)重疊序列的拼接，得到了完整的TPIL-2基因的cDNA序列，并用DNAtools 5.1對(duì)其編碼氨基酸進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其ORF為465個(gè)堿基，編碼154個(gè)氨基酸，分子量為17.4kD。
2、藏豬IL2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)活性檢測(cè)提取VR1020質(zhì)粒，經(jīng)BamHI/BglII酶切后，加入回收的BamHI/BglII酶切的TPIL-2cDNA片段2μl，1μl T4DNA連接酶16℃水浴過(guò)夜連接。轉(zhuǎn)化的菌落與含50μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。然后通過(guò)重組子的快速鑒定，經(jīng)過(guò)質(zhì)粒大小的比較，選取有插入片斷的菌落，提取質(zhì)粒，用BamHI/BglII分別做雙酶切篩選鑒定重組子，證實(shí)獲得TPIL2的真核表達(dá)質(zhì)粒-VRIL2(見(jiàn)附圖2c)。
使用法國(guó)PT公司的JetPEITM細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。培養(yǎng)48小時(shí)，檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物活性。以RT-PCR檢測(cè)基因在真核細(xì)胞中表達(dá)；制備豬淋巴母細(xì)胞，MTT比色法檢測(cè)TPIL-2生物學(xué)活性，分別使用轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、36小時(shí)和72小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VTPIL-2重組質(zhì)粒真核表達(dá)產(chǎn)物對(duì)豬淋巴細(xì)胞均有顯著的增殖刺激活性，24h表達(dá)樣品(OD5700.284)、36h表達(dá)樣品(OD5700.431)和72h表達(dá)樣品(OD5700.496)均明顯高于VR1020對(duì)照孔的OD5700.067(P＜0.01)；這些證明，VTPIL-2能在真核細(xì)胞正確轉(zhuǎn)染表達(dá)具有生物學(xué)活性的TPIL-2，對(duì)豬淋巴細(xì)胞具有增殖免疫激活作用。
3、殼聚糖納米顆粒的制備和包裝VRIL2質(zhì)粒分子用離子交聯(lián)法制備質(zhì)粒殼聚糖納米顆粒。將殼聚糖溶液(pH5.5)和VRIL2質(zhì)粒(含適當(dāng)濃度三聚磷酸鹽)溶液50℃水浴分別恒溫20min，然后均勻混合質(zhì)粒溶液和殼聚糖溶液5min，即得VRIL2質(zhì)粒殼聚糖納米顆粒樣品液。取少量質(zhì)粒殼聚糖納米樣品液于透射電子顯微鏡下觀察納米顆粒形態(tài)并拍照。另取納米顆粒樣品液適量，加雙蒸水稀釋后用Zetasizer 3000HS/IHPL納米粒度分析儀測(cè)定粒徑、分散度及Zeta電位。
透射電鏡觀察結(jié)果表明殼聚糖納米顆粒多呈球形(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附1)。納米粒度分析儀測(cè)定結(jié)果為平均粒徑為45nm；多分散度為0.190，表明納米顆粒直徑較均勻(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附2)；顆粒的zeta電位達(dá)到+25.6mV，說(shuō)明這種納米顆粒比較穩(wěn)定，能有效地包裹帶大量負(fù)電荷的質(zhì)粒分子，有利于顆粒分子進(jìn)入細(xì)胞。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)VRIL2幾乎全部被CNP所包裹。這些表明本實(shí)驗(yàn)成功地制備了CNP，完成了VRIL2的分子包裝。
4、殼聚糖納米顆粒包裝豬白細(xì)胞介素-2基因?qū)σ呙缣禺愋悦庖邞?yīng)答的調(diào)節(jié)試驗(yàn)動(dòng)物分組昆明鼠60只，隨機(jī)分為4組，每組15只。采用肌肉注射法，通過(guò)注射小鼠兩側(cè)股四頭肌免疫小鼠。
注射裸質(zhì)粒免疫組每只小鼠接種相應(yīng)質(zhì)粒30pmol注射殼聚糖包裝質(zhì)粒的免疫組每只小鼠接種相應(yīng)包裝的質(zhì)粒6pmol。5周后每只小鼠口服大腸桿菌K88和K99 0.4ml進(jìn)行攻毒(3×109/ml)。大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和豬藍(lán)耳病疫苗特異性小鼠分組見(jiàn)表1，每組小鼠均按豬免疫劑量1/50股外側(cè)肌肉注射免疫。
表1 疫苗免疫小鼠分組組別 免疫程序A1裸VRIL2肌注接種小鼠+疫苗A2CNP包裹VRIL2肌注接種小鼠+疫苗C1CNP包裹VR1020肌注接種組小鼠+疫苗C2裸VR1020肌注接種組小鼠+疫苗注CNP殼聚糖納米顆粒體液免疫反應(yīng)的檢測(cè)小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，分離血清，用以檢測(cè)體液免疫反應(yīng)。
IgG、IgA及IgM的含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)鼠血清分別作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀釋包被Costar酶標(biāo)板，用特異性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重鏈抗體(美國(guó)Bethyl公司生產(chǎn))作一抗，酶標(biāo)羊抗兔IgG為二抗(華美生物工程公司)，TMB(四甲基聯(lián)苯胺)為底物，測(cè)定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。
特異性抗體的測(cè)定制備K88和K99大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和藍(lán)耳病病毒抗原，分別用折3種抗原包被Costar酶標(biāo)板，實(shí)驗(yàn)鼠血清100倍稀釋為一抗，TMB(四甲基聯(lián)苯胺)為底物，SABC法(武漢博士德公司生產(chǎn))測(cè)定小鼠免疫5周攻毒后血清中抗大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和藍(lán)耳病病毒特異性抗體含量。
細(xì)胞因子的檢測(cè)小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，實(shí)驗(yàn)鼠血清100倍稀釋包被Costar酶標(biāo)板，兔抗鼠IL2、IL4、IL6 IgG抗體(武漢博士德生物工程公司提供)為一抗，TMB(四甲基聯(lián)苯胺)為底物，SABC法檢測(cè)血清中IL2、IL4及IL6含量，觀測(cè)小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答情況。
免疫小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，常規(guī)法計(jì)白細(xì)胞總數(shù)；血涂片Giemsa染色，鏡檢分類計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞。
免疫保護(hù)效應(yīng)的檢測(cè)小鼠免疫35天后，以大腸桿菌K88/K99口服攻毒實(shí)驗(yàn)小鼠，觀察生長(zhǎng)情況；49天時(shí)用常規(guī)方法對(duì)所有小鼠進(jìn)行解剖，觀察各種器官的生理病變情況。
數(shù)據(jù)分析上述各種數(shù)據(jù)均用方差分析進(jìn)行差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)小鼠血清中特異性抗體含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附3。圖3(a)(b)(c)顯示了傷寒疫苗、大腸桿菌和藍(lán)耳病疫苗、與相應(yīng)VRIL2聯(lián)合免疫后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物特異性抗體變化情況。結(jié)果顯示小鼠在免疫一周后，就檢測(cè)到特異性抗體的產(chǎn)生；在同時(shí)免疫VRIL2后，實(shí)驗(yàn)小鼠的上述特異性抗體比對(duì)照組顯著提高(P＜0.05)。用殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2后與疫苗聯(lián)合注射免疫小鼠，在核酸用量?jī)H為未包裝組1/5的情況下，VRIL2對(duì)提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)疫苗特異性免疫應(yīng)答效果同樣顯著；其中肌肉注射對(duì)藍(lán)耳病疫苗、大腸桿菌、傷寒疫苗特異性抗體水平的明顯提高。
(2)小鼠血清IgG、IgM、IgA含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附4。圖4(a)(b)(c)顯示了VRIL2與藍(lán)耳病疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗免疫小鼠后血清中免疫球蛋白的變化情況。結(jié)果表明在同時(shí)免疫了VRIL2后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的IgG、IgA與IgM含量均比對(duì)照組顯著增多(P＜0.05)。其中殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2后，再與藍(lán)耳病疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯(lián)合注射小鼠，雖然在DNA的使用量上只有未包裝組的1/5，但其IgG、IgA、IgM含量較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，與未包裝免疫鼠差異不顯著(P＞0.05)。
(3)血清中細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附5。圖5(a)(b)(c)結(jié)果表明VRIL2與藍(lán)耳病疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯(lián)合免疫小鼠后，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量較對(duì)照組高。用殼聚糖納米顆粒包裹VRIL2組與未包裝組相比較，包裝的DNA只有未包裹組1/5的用量，但是對(duì)免疫小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提升作用較明顯。
(4)免疫小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附6。用藍(lán)耳病疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯(lián)合VRIL2免疫小鼠，小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的變化情況(見(jiàn)圖6(a)(b)(c))。結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)肌肉注射VRIL2均對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠外周血免疫細(xì)胞有較好的提升能力；只是攻毒后小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組稍低。用殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2，不僅可以將DNA用量減少至未包裝用量的1/5，還有效增加了小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量。
6、殼聚糖納米顆粒包裝豬白細(xì)胞介素-2基因?qū)π∈蠓翘禺愋悦庖邞?yīng)答的影響試驗(yàn)動(dòng)物分組昆明鼠60只，隨機(jī)分為4組，每組15只，非特異免疫小鼠分組見(jiàn)表2。采用肌肉注射法，通過(guò)注射小鼠兩側(cè)股四頭肌免疫小鼠；注射裸質(zhì)粒免疫組每只小鼠接種相應(yīng)質(zhì)粒30pmol；注射殼聚糖包裝質(zhì)粒的免疫組每只小鼠接種相應(yīng)包裝的質(zhì)粒6pmol。5周后每只小鼠口服大腸桿菌K88和K99 0.4ml進(jìn)行攻毒(3×109/ml)，觀察各試驗(yàn)動(dòng)物的免疫抗病力變化。
表2 非特異免疫小鼠分組組別免疫程序A1 裸VRIL2肌注接種小鼠B1 CNP包裹VRIL2肌注接種小鼠C1 CNP包裹VR1020肌注接種組小鼠C2 裸VR1020肌注接種組小鼠注CNP殼聚糖納米顆粒動(dòng)物接種包裝質(zhì)粒制劑后免疫機(jī)能的變化檢測(cè)免疫小鼠體液免疫反應(yīng)的檢測(cè)(IgG、IgA及IgM的含量、特異性抗體的測(cè)定)細(xì)胞因子的檢測(cè)和外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化均與上述特異性免疫應(yīng)答試驗(yàn)相同。
免疫保護(hù)效應(yīng)的檢測(cè)小鼠免疫35天后，以大腸桿菌K88/K99口服攻毒實(shí)驗(yàn)小鼠，觀察生長(zhǎng)情況；49天時(shí)用常規(guī)方法對(duì)所有小鼠進(jìn)行解剖，觀察各種器官的生理病變情況。
數(shù)據(jù)分析上述各種數(shù)據(jù)均用方差分析進(jìn)行差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)小鼠血清IgG、IgM、IgA含量和攻毒后特異性抗體的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附7。從圖7(a)(b)(c)(d)可見(jiàn)，小鼠在注射VRIL2后，其血清中IgG、IgA、IgM含量比對(duì)照組顯著增高；其中殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2注射組血清中IgG、IgA、IgM含量的增加尤為顯著；與對(duì)照組相比，肌注未包裝VRIL2組IgG、IgA、IgM含量也有提高。殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2后，雖然DNA用量?jī)H為未包裝組的1/5，但免疫組血清中的IgG、IgA、IgM含量仍顯著提高，與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)。第6周大腸桿菌攻毒后，免疫組小鼠IgG、IgA、IgM較對(duì)照組血清中IgG、IgA、IgM含量顯著增加(P＜0.05)；大腸桿菌特異性抗體水平也明顯高于空白質(zhì)粒對(duì)照組小鼠(P＜0.05)。
(2)血清中細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附8。由圖8(a)(b)(c)可知，VRIL2免疫組小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量均較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2組與未包裹組相比，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提高幅度差異不顯著(P＞0.05)。
(3)免疫小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附9。免疫小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化是考察小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答的一個(gè)重要指標(biāo)。圖9結(jié)果顯示VRIL2免疫小鼠后，免疫小鼠外周血白細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組都有顯著增加，中性粒細(xì)胞在攻毒前也較對(duì)照組明顯升高，但攻毒后中性粒細(xì)胞數(shù)量則較對(duì)照組低(P＜0.05)；用殼聚糖納米微粒包裝VRIL2后免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)在使用DNA量減少5倍的情況下，可以達(dá)到同樣的提高免疫細(xì)胞數(shù)量的效果。
攻毒小鼠免疫保護(hù)率的觀察免疫后35天以致病性大腸桿菌口服攻擊實(shí)驗(yàn)小鼠，攻毒3周后剖解實(shí)驗(yàn)小鼠和檢測(cè)免疫學(xué)變化；結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNP包裹VRIL2組小鼠的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答均顯著強(qiáng)于對(duì)照小鼠，VRIL2接種小鼠活動(dòng)如常，均健康存活，3周后剖解消化道和呼吸道均未見(jiàn)明顯的眼觀病變。而對(duì)照小鼠均發(fā)病，精神委頓，行動(dòng)遲緩、被毛聳立；剖解后發(fā)現(xiàn)胃、十二指腸、空腸粘膜等處出血、肝脾腫大等病變。這些結(jié)果顯示殼聚糖納米顆粒包裹VRIL2接種能顯著增強(qiáng)小鼠對(duì)大腸桿菌感染的免疫抵抗力，提高其免疫保護(hù)率。
<110>四川今朝生物科技有限責(zé)任公司<120>藏豬白細(xì)胞介素-2抗感染DNA制劑的制備及應(yīng)用<160>1<210>1<211>465<212>DNA<213>藏豬(Tibet Sus scrofa)<220>
<400>1atgtataaga tgcagctctt gtgttgcatt gcactaaccc ttgcactcat ggcaaacggt 60gcacctactt caagctctac aaagaacaca aagaaacaac tggagccatt gctgctggat 120ttacagttgc ttttgaagga agttaagaat tacgagaatg ctgatctctc caggatgctc 180acatttaaat tttacatgcc caagcaggct acagaattga aacaccttca gtgtttagta 240gaagaactca aagctctgga gggagtgcta aatttaggtc aaagcaaaaa ctctgactca 300gcaaatatca aggaatcaat gaacaatatc aacgtaacag ttttggaact aaagggatct 360gaaacaagtt tcaaatgtga atatgatgat gagacagtaa ctgctgttga atttctgaac 420aaatggatta ccttttgtca aagcatctac tcaacactga cttga 46權(quán)利要求
1.豬白細(xì)胞介素-2基因抗感染制劑的制備及應(yīng)用，其特點(diǎn)為包括豬白細(xì)胞介素-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、殼聚糖納米顆粒對(duì)豬白細(xì)胞介素-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的分子包裝、此DNA制劑應(yīng)用于豬增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答及抗感染免疫力的應(yīng)用技術(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬白細(xì)胞介素-2基因抗感染制劑的制備，其特征在于所述的豬白細(xì)胞介素-2基因構(gòu)建入VR1020真核表達(dá)質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬白細(xì)胞介素-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的制備，其特征在于所述的DNA制劑的包裹材料是分子量為150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖，用離子交聯(lián)法制備質(zhì)粒殼聚糖納米顆粒分子。
4.使用權(quán)利要求1要求的殼聚糖納米分子包裝豬白細(xì)胞介素-2基因表達(dá)質(zhì)粒作為新型動(dòng)物抗感染基因分子免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用技術(shù)，其特征在于以下幾方面a)將制備的豬白細(xì)胞介素-2基因表達(dá)質(zhì)粒納米顆粒以肌注方式免疫動(dòng)物，比較了對(duì)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答水平的影響；b)以制備的殼聚糖納米顆粒豬白細(xì)胞介素-2基因表達(dá)質(zhì)粒接種動(dòng)物，結(jié)果表明該納米顆粒基因制劑能有效提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物非特異性細(xì)胞和體液免疫水平，增強(qiáng)其非特異性免疫力；c)以制備的豬白細(xì)胞介素-2基因表達(dá)質(zhì)粒納米顆粒聯(lián)合疫苗(豬藍(lán)耳病疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗)共免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，結(jié)果表明殼聚糖納米顆粒豬白細(xì)胞介素-2基因表達(dá)質(zhì)?？娠@著促進(jìn)動(dòng)物對(duì)疫苗的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫抗病能力。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)豬白細(xì)胞介素－2基因抗感染DNA制劑的制備及應(yīng)用技術(shù)。用離子交聯(lián)法制備質(zhì)粒殼聚糖納米顆粒，將豬白細(xì)胞介素－2基因真核質(zhì)粒(VPIL2)溶解于三聚磷酸鹽溶液與分子量150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖醋酸溶液50℃水浴分別恒溫20min，然后按適當(dāng)比例均勻混合質(zhì)粒溶液和殼聚糖溶液5min，得到VPIL2質(zhì)粒殼聚糖納米顆粒液，粒徑40－60nm，Zeta電位+25.6mv，無(wú)細(xì)胞毒性，能抵抗核酸酶對(duì)DNA的降解。以殼聚糖納米顆粒包裝VPIL2質(zhì)粒，將此DNA納米顆粒制劑以肌肉注射的方式單獨(dú)或協(xié)同疫苗免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可顯著提高試驗(yàn)動(dòng)物的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答水平，明顯增強(qiáng)試驗(yàn)動(dòng)物的抗感染免疫保護(hù)力，提供了殼聚糖納米顆粒包裝VPIL2質(zhì)粒作為新型動(dòng)物抗感染分子免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用技術(shù)。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1720998SQ200410040210
公開(kāi)日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2004年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月14日
發(fā)明者高榮, 武梅, 李惠, 王澤洲, 李江凌, 呂學(xué)斌, 吳凱源, 付滿良, 楊毅, 王麗煥 申請(qǐng)人:四川今朝生物科技有限公司