專利名稱：一種新型抗生物細胞自由基氧化損傷合劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是生物技術領域中一種新型抗生物細胞自由基氧化損傷合劑。
背景技術：
隨著現代醫(yī)學科學技術的進展，人們已經認識到細胞的自由基氧化損傷與健康之間的關系。越來越多的證據顯示，許多的疾病都是由于機體的氧化與抗氧化的失衡所致。當機體的抗氧化功能低下時，過量的自由基會攻擊細胞，造成細胞的氧化損傷；當細胞的氧化損傷達到一定的程度時，人體將會產各種各樣的疾病。目前已經證實的與自由基氧化損傷有關的病理變化和疾病包括衰老、神經系統(tǒng)退行性病變(早老性癡呆、帕金森性病、腦硬化)、中風、心血管疾病(心絞痛、心肌缺血、冠狀動脈粥樣硬化)、腫瘤、白內障及皮膚的彈性下降、皮膚皺紋等等。除此之外，某些疾病的治療過程中，也可產生大量的自由基。如心臟手術時必須暫時阻斷局部的血流供應，或在溶血栓的治療時，重開血流供應，又如在人體器官移植時，供體器官在被貯存和運輸過程中，也會造成細胞的缺氧與缺血，這些治療過程往往會導致缺血與再灌注，造成缺血與再灌注損傷，影響治療效果，缺血與再灌注損傷的主要病理的基礎就是器官的自由基氧化損傷。再如在腫瘤的放療與化療過程中，也會產生大量的自由基，引起機體廣泛的氧化損傷，導致其他的副作用，因此，這些氧化損傷極大的降低和限制了手術、放療，化療的臨床效果，甚至有時加重了患者的癥狀，針對細胞自由基氧化損傷，及其在疾病發(fā)生過程中的危害性，抗氧化劑已被廣泛用于臨床，并在預防與治療上述疾病過程中出現的副作用，取得了一定的效果。
目前抗生物細胞氧化損傷的抗氧化劑，多達數十種，而最常用的，包括小分子量的維生素C、維生素E、輔酶Q、褪黑素、谷胱苷肽等等，大分子的抗氧化劑有超氧化歧化酶、過氧化酶等。大部分抗氧劑的作用都有相似之處，這些抗氧化劑都能提供電子中和有害的自由基。但是，由于分子結構的差別，不同的抗氧化劑在細胞中的分布不同，因此，它們的抗氧化作用就存在很大的差別。經典的抗氧化劑有維生素C，維生素C的英文拼寫(Ascorbic acid 或Vitamin C)，許多動植物食品中都有不同含量維生素C，維生素C于1933年由英國化學家Walter Haworth首先合成，被作為抗氧化劑廣泛應用，屬于水溶性物質，在機體內主要分布在細胞漿，很少存在于細胞膜，所以對細胞膜的抗氧化作用有限。另一種經典的抗氧化劑維生素E，維生素E的英文拼寫為(α-Tocopherol或Vitamin E)，許多動植物食品中也含有不同量的維生素E，維生素E于1922年由美國科學家Herbert M Evans所發(fā)現，同樣作為抗氧化劑而被廣泛應用，維生素E屬脂溶性物質，分布在細胞膜中，在胞漿中的含量低，主要為保護生物細胞膜的氧化，而對細胞水溶性成份保護效果欠佳。維生素C與維生素E作為抗氧化劑都存在一個明顯的缺陷，即在一定的條件下，例如細胞內有游離鐵離子時，維生素C還可以導致過氧化作用，可能會進一步損傷那些需要保護的細胞結構。新型的抗氧化劑有褪黑素，褪黑素的英文拼寫為(Melatonin)于1958年由美國科學家Aaron B Lerner所發(fā)現，在人體中主要由大腦中的松果體腺分泌，某些植物中也有一定的含量，首先被用于改善睡眠，1993年后國內外廣泛用于抗氧化健康食品領域，褪黑素具有水脂兼溶性，按一定的比例分布于細胞結構中，能夠有效的保護細胞的各種結構，使其免受自由基的損傷，同時褪黑素不會引起過氧化作用。維素生C和維生素E與褪黑素是目前最為常用的抗氧化劑。
發(fā)明內容
不同的抗氧劑之間存在著一種內在的互動關系，同時不同的抗氧化劑在細胞中的分布不同，基于抗氧化劑的這兩大特點，申請人通過理論的分析與實驗檢驗上，發(fā)明了一種全新的抗生物細胞自由基氧化損傷合劑，本發(fā)明的創(chuàng)造性就在于抓住了新型抗氧化劑褪黑素能與經典抗氧化劑維生素C、維生素E之間產生一種細胞內的互動的代謝聯系，這種代謝聯系一方面能有效抑制維生素的過氧化作用，另一方面，又能相互間增強各自的抗氧能力，形成一種高效的抗氧化合劑。這種高效抗氧化合劑中的褪黑素與維生素的內部代謝機理如下當維生素E清除掉細胞膜上的自由基后，使形成維生素E自由基，此時，維生素C可提供一個電子使維生素E自由基再一次還原成有抗氧化作用的維生素E，而失去一個電子的維生素C毒細胞漿內接受谷胱苷肽提供的一個電子，又還原成有抗氧化功能的維生素C；褪黑素在細胞膜及細胞漿內都能清除其中的自由基，然后失去一個電子形成褪黑素自由基，維生素C可提供一個電子給褪黑素自由基，使還原成有抗氧化功能的褪黑素，而失去一個電子的維生素C自由基又在細胞漿內接受谷胱苷肽提供的一個電子，還原成有抗氧化功能的維生素C，所以，維生素C、維生素E和褪黑素實際上在機體內形成了一個共同的抗氧化網絡，極大的提高了各自的抗氧化能力。在抗氧化網絡中，由于褪黑素能在細胞漿內和細胞膜上均勻分布，起到了聯系細胞漿中的維生素C與細胞膜中維生素E的橋梁作用。根據以上理論分析，申請人產生了一個創(chuàng)造性思維，首次明確提出，維生素C、維生素E、和褪黑素按一定的比例組合，能形成一種新型的高效的抗生物細胞自由基氧化損傷合劑，至目前止，經檢索，國內外尚無用維生素C、維生素E、褪黑素三種抗氧化劑組成一種新型抗生物細胞自由基氧化損傷合劑，并將其作為一種新型抗生物細胞自由基氧化損傷合劑應用于與生物細胞自由基氧化損傷有關領域的報道與專利。
發(fā)明目的該新型抗生物細胞自由基氧化損傷合劑的各組成份均為天然物質，它們分別作為抗生物細胞自由基氧化損傷的保健食品在市場上被廣泛使用，所以，這種合劑能夠安全高效的用于防治前文所述的與細胞自由基氧化損傷有關的疾病，如神經系統(tǒng)退行性病變(早老性癡呆、帕金森性病、腦硬化)、中風、心血管疾病(心絞痛、心肌缺血、冠狀動脈粥樣硬化)、腫瘤、白內障及皮膚的彈性下降、皮膚皺紋，和用于心臟手術、溶血栓治療、器官移植領域、皮膚的護理以及腫瘤的放療、化療的支持輔助用藥，而其效果比單獨使用合劑中的任一成份要高得多，并可以從下面的實施實驗中顯示出來，同時又克服了單獨使用某一成份的缺陷。
具體實施例方式自由基氧化損傷對細胞的破壞是多方面的，醫(yī)學理論認為如上所述的諸多疾病與自由基對細胞的破壞有關，并從理論上以及致病機理上都有了明確的解釋，同時就自由基對細胞的氧化損傷程度的測定技術也有了成熟的方案，換而言之，本發(fā)明的這種新型抗生物細胞自由基氧化損傷合劑對人體細胞的抗氧化保護程度也能科學的、可靠的測定出來。目前就自由基對人體的細胞氧化損傷程度的測定技術有多種、如人體氧合血紅蛋白A自氧化的測定，β-淀粉樣多肽引發(fā)神經細胞的死亡率的測定，脂質過氧化測定，自由基測定等等，本發(fā)明選擇了前兩種最具代表性的測定技術來完成本發(fā)明的實施方案。
人體氧合血紅蛋白A是機體輸送氧的主要載體，通過分光光度計檢測，人體氧合血紅蛋白A在575納米區(qū)有一個主要吸收峰，人體氧合血紅蛋A中所含的鐵離子為正2價，所以，氧合血紅蛋白A很容易和環(huán)境中的氧化物，包括過氧化氫(H2O2)，超氧化陰離子(O2-)發(fā)生反應，產生自氧化，原來正2價的鐵離子被氧化成正3價或正4價，因此，人體氧合血紅蛋白A失去了攜帶氧的功能，自氧化后的人氧合血紅蛋白A在575納米區(qū)的光密度下降，即人體氧合血紅蛋白A自氧化程度越高，該被氧化過的人體氧合血紅蛋白A在575納米區(qū)的光密度下降得越多，正是基于此原理，本發(fā)明不斷調整這種合劑中維生素C、維生素E及褪黑素三者之間的比例，經過反復實驗與測試，以期求得最佳組合，和應用的最佳濃度，實驗證明該合劑中維生素C、維生素E及褪黑素的比例在1∶1∶0.01至1∶1∶1范圍內，其在人體氧合血紅蛋白A中的濃度在1-500個微摩的范圍內都具有一定的抗氧化能力。
為了對本發(fā)明的合劑的功能進一步證實，該發(fā)明還選用了另一個施實方案，即β-淀粉樣多肽-25-35(Aβ25-35)導致的神經細胞死亡檢測。醫(yī)學上常用MTT[3-(4，5-dimethylthiazol-2yl)-2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide]的方法測定培養(yǎng)神經細胞的死亡率，可以用來判斷抗氧化劑及其組合的抗氧化能力，加入了抗氧化劑或其組合后使β25-35引起的神經細胞死亡率越低，該抗氧化劑或其組合的抗氧化能力越強，本發(fā)明選用了小鼠海馬蛔神經細胞(HT22)進行常規(guī)神經細胞培養(yǎng)，而小鼠海馬蛔神經細胞與記憶有關，對自由基損失很敏感。經過多次反復實驗，本發(fā)明同樣得出該合劑中維生素C、維生素E與褪黑素三者的比例在1∶1∶0.01至1∶1∶1的范圍內，該抗氧化合劑在細胞培養(yǎng)液中的濃在1-500個微摩的范圍內都具有一定的抗生物細胞自由基氧化損傷的能力。
實施方案一用維生素C、維生素E、褪黑素組成的新型抗生物細胞自由基氧化損傷合劑，來保護人體氧合血紅蛋白A自氧化實驗，維生素C、維生素E、褪黑素、人體氧合血紅蛋白A及其它化學物品均購自美國Sigma化學試劑公司(Sigma Chemicals，St.Louis，MO，USA)。
實驗步驟一、將人體氧合血紅蛋白A、溶于TRS-鹽酸緩沖液，緩沖液的克分子濃度為20毫摩爾，含乙二胺四乙酸0.1毫摩爾，酸堿度7.4(pH 7.4)。人氧合血紅蛋白A的濃度為0.3毫克/毫升，然后置于30℃恒溫水浴箱中溫浴，隨著時間的延長，人氧合血紅蛋白A將會不斷的自氧化，其自氧化的程度可以通過分光光度計測定其在575納米的光密度來判斷。此實驗共分為8組；組1為正常對照組，此組為未加任何試劑的人氧合血紅蛋白A；組2為維生素C處理組，此組在經過上述的處理的1毫升人氧合血紅蛋白A緩沖液中加入維生素C 500微摩爾；組3為維生素E處理組，此組為在經過上述處理的1毫升人氧合血紅蛋白A緩沖液中加入維生素E 500微摩爾；組4為褪黑素處理組，在經過上述處理的1毫升人氧合血紅蛋白A緩沖液中加入褪黑素500微摩爾；組5為維生素C與維生素E處理組，在經過上述處理的1毫升人氧合血紅蛋白A緩沖液中加維生素C、維生素E各500微摩爾；組6為維生素C與褪黑素處理組，在經過上述處理的1毫升人氧合血紅蛋白A緩沖液中加入維生素C、褪黑素各500微摩爾；組7為維生素E與褪黑素處理組，在經過上述處理的1毫升人氧合血紅蛋白A緩沖溶液中加入維生素E、褪黑素各500微摩爾；組8為維生素C、維生素E、褪黑素處理組，該組為在經過上述處理的1毫升人氧合血紅蛋白A緩沖液中加入維生素C、維生素E、黑素各500微摩爾。用一毫升的聚乙烯比色管在575納米區(qū)測定8組樣本的人氧合血紅蛋白A的光吸收密度，其值將作為8組樣本進行溫浴后的相應組的對照標準；然后將各種組合的8組人氧合血紅蛋白A緩沖液溫浴20小時后，用一毫升的聚乙烯比色管在575納米區(qū)，測定各組的人氧合血紅蛋白A的光吸收密度，以溫浴前的各相應組的光密度值為100％，用這種方法重復6次獨立的試驗，再將每次結果的數據進行平均值加減標準誤的統(tǒng)計處理，統(tǒng)計處理的方法為方差分析(ANOVA)與t-檢驗，p＜0.05被認為統(tǒng)計學上存在著顯著的差異。統(tǒng)計處理的結果如表一所示，表一是抗氧化劑及其組合對人體氧合血紅蛋自A氧化的影響統(tǒng)計表，表中的數為平均值±標準誤；N＝6；*為與對照組相比P＜0.05；**為與對照組相比P＜0.01；**為與其它實驗組相比P＜0.01.人體氧合血紅蛋A自氧化的程度表示為光密度在575納米區(qū)的衰減百分率％。從表一可以看出，第一組標本的人氧合血紅蛋白A在575納米光區(qū)的光密度下降了大約14％，分別加入了維生素C、維生素E、和加入了維生素C與維生素E混合體的標本中的人自氧化血紅蛋白A在575納米區(qū)的光密度各自下降了17％～24％之間，顯示了維生素C維生素E可能產生了過氧化作用，因為可能有游離的鐵離子自人氧合血紅蛋白A中釋出，而加入了褪黑素處理過的標本在575納米光區(qū)的光密度僅下降了13％，與第一組的結果相比，無統(tǒng)計差異。在維生素C、維生素E及褪黑素三者混合的標本中的人氧合血紅蛋白A在575納米光區(qū)的光密度僅下降了5％左右，與第一組及其它各組的實驗結果相比，統(tǒng)計學上存在著顯著的差異，實驗結果證明，由維生素C、維生素E及褪黑素三者組合的合劑具有強大的抗氧化作用，不但能顯著降低人氧合血紅蛋白A的自氧化作用，還能抑制維生素C、維生素E的過氧化作用，保護人氧合血紅蛋白A結構的完整，實驗結果與理論指導預期十分吻合。
實施方案2維生素C、維生素E和褪黑素組合對β淀粉樣多肽導致的神經細胞死亡的保護作用的實驗。
1、細胞培養(yǎng)和處理小鼠海馬神經細胞(HT22細胞株)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中，此培養(yǎng)液中含有10％的小牛血清，2毫摩爾的谷胺，每毫升100單位的連酶素，0.2毫克的頭孢酶素和25毫摩爾的HEPEBS。細胞種殖到96孔的培養(yǎng)板，細胞密度為10,000/平方厘米，放入5％的二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中(37℃)培養(yǎng)12小時；當細胞貼壁后再加入不同的試劑，實驗共分為9個組，組一為正常對照組，未加入任何試劑，組2至組9為試驗組，首先在組3中加入維生素C50微摩爾；組4加入維生素E50微摩爾；組5褪黑素50微摩爾；組6加入維生素C和維生素E各50微摩爾；組7加入維生素C和褪黑素各50微摩爾；組8加入維生素E及褪黑素各50微摩爾；組9加入維生素C、維生素E及褪黑素各50微摩爾，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時后，從組2至組9各自加入神經毒性的β-淀粉樣多肽-25-35(Aβ25-35)30微摩爾，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。
2、細胞成活率的分析MTT[3-(4，5-dimethylthiazol-2yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide]方法用于細胞成活率的分析，MTT 0.5毫克/毫升(終濃度)，加到處理后的細胞，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，然后加入溶解液(20％ sodium dodecyl sulfate，50％N，N-DIMETHYLFORMAMIDE，Ph 4.7)，放入37℃度恒溫水浴箱中溫浴18小時，然后將96孔的培養(yǎng)板置于培養(yǎng)板閱讀儀(μQuant，Bio-Tek Instruments Inc.Winooski，VT，USA)在570納米區(qū)閱讀計數，對照細胞的計數值為100％(細胞成活率)。
3、結果Aβ25-35為神經毒素，是形成老年性癡呆大腦特征性病變老年斑的主要成份；Aβ25-35在大腦中的沉積產生大量自由基，造成細胞結構的氧化損傷，最終導致神經細胞的死亡。從本實驗中的結果可以看出，30微摩爾的淀粉樣多肽造成了培養(yǎng)的神經細胞氧化損傷，在24小時之內，有60％的神經細胞死亡(成活率為40％)，實驗中，選用了臨界有效濃度的3種抗氧化劑，包括經典的抗氧化劑維生素C、維生素E和新型的抗氧化劑褪黑素。單一的抗氧化劑和兩種抗氧化劑合用，與組2相比，能夠輕微提高細胞的成活率(成活率為45％-55％)。而用維生素C、維生素E和褪黑素3種物質的組合，完全防止了Aβ25-35導致的神經細胞毒性。使培養(yǎng)的神經細胞成活率與對照組一樣，達到了100％。其結果如表二，表二是抗氧化劑及其組合對β-淀粉樣多肽-25-35(Aβ25-35)導致的神經細胞死亡的保護作用效果的統(tǒng)計表，表中的數值為平均值±標準誤；N＝6；統(tǒng)計處理的方法為方差分析(ANOVA)與t-檢驗，p＜0.05被認為統(tǒng)計學上存在著顯著的差異，*為與對照組相比P＜0.05；**為與對照組相比P＜0.01；**為與其它實驗組相比P＜0.01。除對照組外，其它實驗組均加有Aβ25-35試劑30毫摩爾；抗氧化劑均為50毫摩爾，表二中顯示，維生素C、維生素E、褪黑素三種物質的組合，在培養(yǎng)的神經細胞中能發(fā)揮高效的抗氧化作用。三者的組合發(fā)生了協同作用，使其抗氧化的效果倍增。
本發(fā)明的這種新型抗生物細胞自由基氧化損傷合劑作為一種健康食品對人類的健康是有益的，特別是對上述的某些疾病的治療與防治，對某些手術的術后治療以及延長離體移植器官貯存與運輸時間都有廣泛的應用前景。高效氧化合劑中各成份目前在國內外作為一種健康食品都有成熟的用量，根據這些用量，再根據本發(fā)明中三種成份的比例，本發(fā)明推薦該合劑作為健康食品的用量是需用者每次用603毫克，而603毫克中含維生素C有300毫克、維生素E 300毫克和褪黑素3毫克，每日一次，需用者可用口服，口服可用片劑，也可用膠囊或口服液，還可肌肉注射，靜脈注射等多種方法，同時也可以膏脂等形式直接涂敷在皮膚上使用，作為皮膚的護理和化妝用品，同時，該合劑可進一步開發(fā)成藥品，用于與生物細胞自由基氧化損傷有關的領域，該發(fā)明將對促進人類的健康起到積極的作用。
表一抗氧化劑及其組合對人體氧合血紅蛋白A氧化的影響統(tǒng)計表
表中的數為平均值±標準誤；N＝6；*為與對照相比P＜0.05；**為與對照相比P＜0.01；##為與其它實驗組相比P＜0.01.人體氧合血紅蛋A白氧化的程度表示為光密度在575納米區(qū)的衰減％，抗氧化劑均為500毫摩爾。
表二抗氧化劑及其組合對β-淀粉樣多肽-25-35(Aβ25-35)導致的神經細胞死亡的保護作用效果的統(tǒng)計表
表中的數值為平均值±標準誤；N＝6；*為與對照組相比P＜0.05；**為與對照組相比P＜0.01；##為與其它實驗組相比P＜0.01.除對照組外，其它實驗組均加有Aβ25-35試劑30毫摩爾；抗氧化劑均為50毫摩爾。
權利要求
1.本發(fā)明所述的一種新型抗生物細胞自由基氧化損傷合劑，其特征是該合劑由褪黑素與維生素類物質組成。
2.根據權利要求1所述的一種新型抗生物細胞自由基氧化損傷合劑，其特征是該合劑由褪黑素與維生素類物質中的維生素C、維生素E組成。
3.根據權利要求1所述一種新型抗生物細胞自由基氧化損傷合劑，其特征是該合劑中維生素C、維生素E、褪黑素三者的組成比例在1∶1∶0.001至1∶1∶1的范圍內都具有抗生物細胞自由基氧化損傷作用。
4.根據權利要求1所述一種新型抗生物細胞自由基氧化損傷合劑其特征是該合劑中維生素C、維生素E、褪黑素的組成按1∶1∶0.01的比例具有很強的抗生物細胞自由基氧化損傷作用。
5.根據權利要求1所述一種新型抗生物細胞自由基氧化損傷合劑，其特征是該合劑可用于與生物細胞自由基氧化損傷有關的藥品，醫(yī)療，保健食品，化妝品等領域。
全文摘要
該合劑用維生素C、維生素E、褪黑素三種抗氧化劑組成，此組成構成了一種新型抗生物細胞自由基氧化損傷合劑，可將其作為一種新型高效抗生物細胞自由基氧化損傷物質應用于與生物細胞自由基氧化損傷有關的各領域。這些領域是防治與細胞自由基氧化損傷有關的疾病，如神經系統(tǒng)退行性病變(早老性癡呆、帕金森性病、腦硬化)、中風、心血管疾病(心絞痛、心肌缺血、冠狀動脈粥樣硬化)、腫瘤、白內障及皮膚的彈性下降、皮膚皺紋，又如用于心臟手術、溶血栓治療、器官移植領域、皮膚的護理以及腫瘤的放療、化療的支持輔助用藥，而其效果比單獨使用合劑中的任一成分要高得多，同時又克服了單獨使用某一抗氧化劑引起的過氧化現象等缺陷。
文檔編號A61K31/403GK1562002SQ20041002299
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月19日 優(yōu)先權日2004年3月19日
發(fā)明者譚敦寧, 譚敦憲 申請人:譚敦寧