專利名稱：用于檢測生物體內(nèi)一氧化氮濃度的微型光纖生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測及臨床醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測生物體內(nèi)NO 濃度的微型光纖生物傳感器。
背景技術(shù)：
—氧化氮(NO)是一種極不穩(wěn)定的生物自由基，分子小，結(jié)構(gòu)簡單，生物半衰期只 有3 5秒?，F(xiàn)已查明NO是生物體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子，對心腦血管系統(tǒng)、消化 系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等均具有重要的調(diào)節(jié)作用，對其檢測在生命學(xué)科、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng) 域中都非常重要。 目前，檢測NO的方法主要有電化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、儀器分析法，同位素放射強度 法、間接檢測法等，這些方法各有其特點，但在靈敏度、特異度和檢測速度等方面不能非常 好地滿足臨床醫(yī)學(xué)上實時在體檢測的需要。如電化學(xué)法是目前報道檢測NO最為廣泛的一 類檢測方法，但其響應(yīng)慢、易受干擾、檢測精度低；化學(xué)發(fā)光法中臭氧氧化法需要NO和臭氧 氣相反應(yīng)且同儀器分析法一樣過程復(fù)雜、耗時長；LUminOl-H202化學(xué)發(fā)光體系易受生物體 中多巴胺、尿酸、抗壞血酸維生素C、金屬離子等的干擾；同位素放射強度法則會造成放射 性污染并給人體帶來危害。由于N0是由一氧化氮合酶(N0S)催化L-精氨酸(LA)脫去胍基 而產(chǎn)生，人們也嘗試用間接測量的方法，通過測定N0S (半衰期為l-2min)的含量或N0代謝 產(chǎn)物亞硝酸鹽(N02—)、硝酸鹽(N03—)等的含量來間接測定NO的濃度，但這種方法誤差很大， 難以得到準(zhǔn)確的結(jié)果。近年來，熒光光度法檢測NO的研究成為熱點，它是一種靈敏的化學(xué) 檢測手段，其檢測下限一般可以達到納摩爾(10—9摩爾)甚至皮摩爾(10—12摩爾)級，而且 熒光型探針可以實現(xiàn)對N0的選擇性、實時檢測，并獲得更高的敏感性。國內(nèi)外已經(jīng)研究出 一些與N0反應(yīng)產(chǎn)生熒光強度變化的鄰二氨基共軛苯環(huán)敏感材料的熒光型探針，如2， 3- 二 氨基萘(DAN)及其衍射物；二氨基熒光素(DAF) ;二氨基羅丹明(DARs)等。但是熒光光度 檢測方法無法實現(xiàn)對生物體內(nèi)NO濃度的在體檢測，因而無法獲得人體的準(zhǔn)確生理信息。
光纖生物傳感器是光纖傳感器中的一大類，其探頭可以感知待測生物物質(zhì)，并產(chǎn) 生相應(yīng)的光信號，再經(jīng)過光電轉(zhuǎn)換裝置轉(zhuǎn)化成電信號輸出。由于光纖生物傳感器具有探頭 直徑小、信息傳輸容量大、能量損耗低、抗干擾能力強、響應(yīng)快、成本低、使用方便，可實時在 體檢測等優(yōu)點，近年來一直是國內(nèi)外的研究熱點。光纖微型生物傳感器在檢測生物體中待 測物質(zhì)時，探頭具有特殊的要求，必須具有微小的尺寸，能無創(chuàng)插入人體的合適深度，并具 有生物相容性。同時，為了提高在其探頭上固定生物敏感材料的效率和光信號傳輸效率， 需要在光纖上刻制精巧結(jié)構(gòu)。由于光纖十分纖細(芯徑一般為5 9ym，包層直徑一般為 125 i！ m)，而且組成光纖的二氧化硅材料硬且脆，采用傳統(tǒng)的研磨、腐蝕、火焰等方法很難在 光纖上加工精巧結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的針對目前檢測生物體內(nèi)一氧化氮濃度方面存在的問題，本發(fā)明提供一種新型的一氧化氮(NO)微型光纖生物傳感器。該生物傳感器具有探頭直徑小、信息傳輸 容量大、能量損耗低、抗干擾能力強、響應(yīng)快、成本低、使用方便、可實時在體檢測且檢測靈 敏度高等優(yōu)點，可對生物體內(nèi)NO濃度的實時在體檢測。 該NO光纖微型生物傳感器工作原理為檢測時取被測物放入含有緩沖液的微量 檢測池4中(見附圖1)，從光源1發(fā)射出的光通過輸入光纖2照射在光纖微槽中的敏感膜 上，敏感材料與環(huán)境中的NO反應(yīng)后自身熒光強度發(fā)生變化，變化的熒光經(jīng)由輸出光纖5傳 至信息采集與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)6進行處理，通過熒光強度變化的大小可以得到NO的濃度。其 中該NO微型光纖生物傳感器采用560nm的激光光源，光纖微探頭包括NO熒光敏感膜7，反 射面Ag膜8和半透膜9， NO敏感薄膜由含NO熒光指示劑的高分子膜組成。用激光微加工 技術(shù)制作的NO傳感器具有微小光纖探頭，能無創(chuàng)檢測，極大地減輕使用過程中病人痛苦。
實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案 —種NO光纖生物微型傳感器，其特征是，光纖微探頭采用紫外短脈沖激光加工技 術(shù)刻蝕成微槽，該探頭中NO敏感薄膜由NO熒光指示劑和具有生物相容性的高分子膜組成， 采用物理吸附方法將所述敏感膜固定在光纖微槽中。光纖探頭用金屬套封裝，NO敏感膜微 槽結(jié)構(gòu)處用半透膜封裝，在光纖探頭端面用真空蒸鍍法鍍Ag膜成反射膜。所述熒光指示劑 為二氨基熒光素(DAFs)和二氨基羅丹明(DARs)，所述高分子膜材料為醋酸纖維素。該NO 微型光纖生物傳感器包括光源、輸入光纖、NO微型熒光探頭、輸出光纖、信息采集與數(shù)據(jù)處 理系統(tǒng)。所述的傳感器結(jié)構(gòu)模式為反射式。 本發(fā)明的NO微型光纖生物傳感器制作方法，包含如下步驟
1)光纖微型探頭的加工 本發(fā)明所用光纖為多模石英光纖，采用英國Exitech公司生產(chǎn)的輸出波長為 157nm的F2激光加工系統(tǒng)，通過振幅模板和微動平臺控制技術(shù)，對傳感器探頭進行微加工。 利用157nm深紫外激光直刻工藝在多模石英光纖刻蝕微槽，所述微槽用來固定NO敏感材 料。在光纖探頭端面采用真空蒸鍍法鍍Ag膜成反射膜。
2)N0敏感膜的制備 本發(fā)明光纖微型探頭中NO敏感膜由NO熒光指示劑和具有生物相容性的高分子膜 組成，高分子膜材料為醋酸纖維素。NO熒光指示劑采用目前應(yīng)用的最為成功的二氨基熒光 素(DAFs)和二氨基羅丹明(DARs)。稱取0. lg醋酸纖維素溶于3. 5mL丙酮，密閉攪拌2h，再 向混合液中加入O. 25mL—定濃度的N0熒光指示劑和0. 5ml雙蒸水，再密閉攪拌6h ;將攪拌 均勻的混合液傾倒入直徑①60mm的玻璃生化培養(yǎng)皿中，用保鮮膜將皿封好，在保鮮膜上扎 適當(dāng)大小及數(shù)量的孔，室溫下置于水平平臺上直至丙酮完全揮發(fā)成膜即可，膜厚約20 ii m。 或者吸取攪拌均勻的混合液直接滴入所述光纖探頭微槽中，用保鮮膜將探頭封好，室溫下 置于水平平臺上直至丙酮完全揮發(fā)成膜。
3) NO微型光纖生物傳感器的制作 采用物理吸附法將步驟2)中制備的NO敏感膜固定于步驟1)加工后的光纖微槽 中。光纖探頭用金屬套封裝，NO敏感膜微槽結(jié)構(gòu)處用半透膜封裝以便于敏感材料和待檢測 NO反應(yīng)。連接激光光源(560nm)、輸入光纖、光纖熒光微探頭、輸出光纖、信息采集與數(shù)據(jù)處 理系統(tǒng)等制作成NO微型光纖生物傳感器。 本發(fā)明中所采用的激光微加工是一種無接觸加工，紫外短脈沖激光照在光纖材料上，作用時間短、熱擴散度低，產(chǎn)生的熱熔化區(qū)小，燒蝕深度、形狀能夠精確控制，可以制作 較好的表面形貌。由于激光加工不受熔化作用、表面膨脹或震動導(dǎo)致的微裂紋等的限制，比 較適合加工光纖這樣易碎的硬性材料，可以在光纖上制作各種微小、精致的結(jié)構(gòu)，精度達到 微米量級。 本發(fā)明中所述的室溫系指25t:。 下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做出進一步的說明。


圖1是用于檢測生物體內(nèi)一氧化氮濃度的微型光纖生物傳感器原理圖。
圖2是光纖微型探頭的結(jié)構(gòu)示意圖。 其中l(wèi)-激光光源，2-輸入光纖，3-光纖微探頭，4-微量檢測池，5-輸出光纖， 6_信息采集與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，7-N0熒光敏感膜，8-反射面Ag膜，9-半透膜。
具體實施方法
實施例1 1)利用157nm深紫外激光直刻工藝在多模石英光纖上刻蝕微槽，刻蝕微槽槽寬
20-40 ym，槽長約100-120 ym。在光纖探頭端面用真空蒸鍍法鍍Ag膜成反射膜。 2)稱取O. lg醋酸纖維素溶于3. 5mL丙酮，密閉攪拌2h，再向混合液中加入0. 25mL
濃度為0. 5mmol/ml的二氨基熒光素(DAFs)和0. 5ml雙蒸水，再密閉攪拌6h ;將攪拌均勻
的混合液傾倒入直徑①60mm的玻璃生化培養(yǎng)皿中，用保鮮膜將皿封好，在保鮮膜上扎適當(dāng)
大小及數(shù)量的孔，室溫下置于水平平臺上直至丙酮完全揮發(fā)成膜即可。 3)采用物理吸附法將步驟2)中制備的NO敏感膜固定于步驟1)加工后的光纖微
槽中。用金屬套封裝光纖探頭，NO敏感膜微槽結(jié)構(gòu)處用半透膜封裝。參照圖1和圖2，采用
560nm的激光光源，從光源1發(fā)射出的激光通過耦合器進入輸入光纖2照射在NO敏感膜7
上，待測物質(zhì)中NO通過半透膜9與NO敏感膜7發(fā)生反應(yīng)，所激發(fā)的熒光被光纖端面Ag膜
8反射經(jīng)光纖分路器由輸出光纖5傳至信息采集與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)6進行處理。 檢測過程將N0光纖微探頭與輸出光纖固定好，取被測物放入微量檢測池4中，整
個系統(tǒng)處于密閉狀態(tài)。通過自動數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)讀取熒光強度值，根據(jù)熒光強度的變
化來計算被測物NO的濃度，待測物濃度單位為P mol/L。 實施例2 除更換NO熒光指示劑外，其他實施方法同實施例1 。 NO敏感薄膜的制備稱取0. lg醋酸纖維素溶于3. 5mL丙酮，密閉攪拌2h，再向混 合液中加入0. 25mL濃度為0. 5mmol/ml的二氨基羅丹明(DARs)和0. 5ml雙蒸水，再密閉攪 拌6h ;將攪拌均勻的混合液傾倒入直徑①60mm的玻璃生化培養(yǎng)皿中，用保鮮膜將皿封好， 在保鮮膜上扎適當(dāng)大小及數(shù)量的孔，室溫下置于水平平臺上直至丙酮完全揮發(fā)成膜即可。
實施例3 1)利用157nm深紫外激光直刻工藝在多模石英光纖上刻蝕微槽，刻蝕微槽槽寬約 20-40 ym，槽長約100-120 ym。在光纖探頭端面用真空蒸度法鍍Ag膜成反射膜。
2)稱取O. lg醋酸纖維素溶于3. 5mL丙酮，密閉攪拌2h，再向混合液中加入0. 25mL 濃度為0. 5mmol/ml的二氨基熒光素(DAFs)和0. 5ml雙蒸水，再密閉攪拌6h ;吸取攪拌均勻的混合液直接滴入1)中所述光纖探頭微槽中，用保鮮膜將探頭封好，室溫下置于水平平 臺上直至丙酮完全揮發(fā)成膜即可。 3)用金屬套封裝光纖探頭，NO敏感膜微槽結(jié)構(gòu)處用半透膜封裝。參照圖1和圖2， 采用560nm的激光光源，從光源1發(fā)射出的光線通過輸入光纖2照射在NO敏感膜7上，待 測物質(zhì)中NO通過半透膜9與NO敏感膜7發(fā)生反應(yīng)，所激發(fā)的熒光被光纖端面Ag膜8反射 經(jīng)光纖分路器由輸出光纖5傳至信息采集與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)6進行處理。
檢測過程將N0光纖微探頭與輸出光纖固定好，取被測物放入微量檢測池4中，整 個系統(tǒng)處于密閉狀態(tài)。通過自動數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)讀取熒光強度值，根據(jù)熒光強度的變 化來計算被測物NO的濃度，待測物濃度單位為P mol/L。
實施例4 除更換NO熒光指示劑外，其他實施方法同實施例3。 NO敏感薄膜的制備稱取0. lg醋酸纖維素溶于3. 5mL丙酮，密閉攪拌2h，再向混 合液中加入0. 25mL濃度為0. 5mmol/ml的二氨基羅丹明(DARs)和0. 5ml雙蒸水，再密閉攪 拌6h ;吸取攪拌均勻的混合液直接滴入1)中所述光纖探頭微槽中，用保鮮膜將探頭封好， 室溫下置于水平平臺上直至丙酮完全揮發(fā)成膜即可。
權(quán)利要求
用于檢測生物體內(nèi)一氧化氮濃度的微型光纖生物傳感器；其特征在于微型光纖生物傳感器包括，激光光源、輸入光纖、光纖微探頭、微量檢測池、輸出光纖和信息采集與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；微型光纖生物傳感器采用560nm的激光光源，光纖微探頭由一氧化氮熒光敏感膜(7)，反射面Ag膜(8)和半透膜(9)組成，光纖微探頭采用紫外短脈沖激光加工技術(shù)刻蝕成微槽，采用物理吸附方法將一氧化氮熒光敏感膜固定在光纖微槽中，微槽端口處用半透膜封裝，在光纖探頭端面用真空蒸鍍法鍍成反射面Ag膜8，整個光纖微探頭用金屬套封裝。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測生物體內(nèi)一氧化氮濃度的微型光纖生物傳感器，其 特征是，光纖微探頭加工包含如下工藝?yán)?57nm深紫外激光直刻工藝在多模石英光纖刻蝕微槽，給定的激光加工參數(shù)為觸 發(fā)電壓3000V，激光重復(fù)率15HZ，氮氣流量4. 01/min。采用30 y mX 20 y m的初始光斑沿光 纖軸向慢速掃描，掃描速度0. 15mm/min，左右掃描4個來回，刻蝕微槽槽寬約30 y m，槽長約 120iim。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測生物體內(nèi)一氧化氮濃度的微型光纖生物傳感器，其 特征是，一氧化氮熒光敏感膜7由熒光指示劑和具有生物相容性的高分子膜組成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一氧化氮敏感膜制備方法特征是，一氧化氮熒光指示劑分別 采用二氨基熒光素和二氨基羅丹明，高分子基體采用醋酸纖維素。包含如下步驟稱取O. lg醋酸纖維素溶于3. 5mL丙酮，密閉攪拌2h，再向混合液中加入0. 25mL0. 25mL 濃度為0. 5mmol/ml的二氨基熒光素或二氨基羅丹明和0. 5ml雙蒸水，再密閉攪拌6h ;將攪 拌均勻的混合液傾倒入直徑①60mm的玻璃生化培養(yǎng)皿中，用保鮮膜將皿封好，在保鮮膜上 扎適當(dāng)大小及數(shù)量的孔，室溫下置于水平平臺上直至丙酮完全揮發(fā)成膜即可。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一氧化氮敏感膜制備方法，其特征是， 一氧化氮熒光指示劑 分別采用二氨基熒光素和二氨基羅丹明，高分子基體采用醋酸纖維素。包含如下步驟稱取O. lg醋酸纖維素溶于3. 5mL丙酮，密閉攪拌2h，再向混合液中加入0. 25mL濃度為 0. 5mmol/ml的二氨基熒光素或二氨基羅丹明和0. 5ml雙蒸水，再密閉攪拌6h ;吸取攪拌均 勻的混合液直接滴入所述光纖探頭微槽中，用保鮮膜將探頭封好，室溫下置于水平平臺上 直至丙酮完全揮發(fā)成膜即可。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測生物體內(nèi)NO濃度的微型光纖生物傳感器。該傳感器由光源、輸入光纖、NO光纖熒光微型探頭、輸出光纖、信息采集與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。所述傳感器微型探頭采用157nm紫外短脈沖激光技術(shù)加工多模石英光纖制成。NO敏感膜由NO熒光指示劑和高分子基體材料構(gòu)成，通過物理吸附的方法固定在光纖微探頭上，敏感材料可與環(huán)境中的NO反應(yīng)導(dǎo)致熒光強度信號顯著變化，從而進行NO濃度的檢測。傳感器檢測系統(tǒng)采用反射式光路設(shè)計，使用快捷，具有較高的靈敏度和精確度，抗干擾性和穩(wěn)定性好。
文檔編號G03F7/00GK101710074SQ200910273390
公開日2010年5月19日 申請日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者丁莉蕓, 戴玉堂, 王海, 鐘韻鳴, 黃 俊, 黃蘭芬 申請人:武漢理工大學(xué)