專利名稱：基于表位的SARS－Cov基因疫苗及其構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基因疫苗，進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及一種采用基因工程手段構(gòu)建的基于表位的SARS-Cov基因疫苗。
背景技術(shù)：
新近分離的冠狀病毒(SARS-Cov)是目前公認(rèn)的引起非典型性肺炎爆發(fā)的致病原。它給人類健康帶來巨大威脅，使我國經(jīng)濟(jì)蒙受巨大損失，曾經(jīng)感染了五大洲8000多人，并導(dǎo)致了大于10％的死亡率。根據(jù)基因組測序分析結(jié)果，目前已知該病毒的主要的結(jié)構(gòu)蛋白包括膜表面的Spike(S)，M和E蛋白以及與RNA基因組相連的N蛋白，這都有可能成為發(fā)展疫苗的主要靶點(diǎn)。作為一種病毒引起的傳染病，疫苗被廣泛認(rèn)為是最有效的防止與控制這類疾病的最佳方法。目前我國已著重發(fā)展了滅活病毒疫苗，取得了重要進(jìn)展，而基于腺病毒載體的亞單位疫苗也完成了初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。然而，現(xiàn)有研究表明，免疫系統(tǒng)在產(chǎn)生有效控制病毒生長的中和性抗體的同時(shí)，也可能會(huì)產(chǎn)生有助于病毒感染的“惡性”抗體。此外，人們還發(fā)現(xiàn)全蛋白抗原中除了誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的功能性T、B表位外，一些無關(guān)的具有干擾甚至抑制作用的側(cè)翼序列會(huì)影響全蛋白疫苗以及全抗原基因疫苗的效果。因而，以表位為基礎(chǔ)的高特異性疫苗將為人類提供更安全有效的保護(hù)。
抗原表位(epitope)是抗原分子中誘生不同免疫應(yīng)答最基本的結(jié)構(gòu)及功能單位，結(jié)構(gòu)短小，B細(xì)胞表位長度為10～15個(gè)氨基酸，CTL表位僅有8～10個(gè)氨基酸。以精心篩選的T、B細(xì)胞抗原表位構(gòu)建免疫分子，既可有目的地誘生各類不同的免疫反應(yīng)，又避免了天然蛋白中抑制性抗原表位引起的免疫抑制現(xiàn)象，是新近預(yù)防及治療性疫苗研究的熱點(diǎn)。因此抗原表位或短肽的基因工程表達(dá)疫苗及以抗原表位為基礎(chǔ)的基因疫苗研究一直是近年分子免疫學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
在當(dāng)前疫苗的研制中，蛋白疫苗作為經(jīng)典疫苗仍在一定程度上被廣泛應(yīng)用，而基因疫苗作為第三代疫苗的新興代表，越來越受到廣大學(xué)者的重視。1990年，美國學(xué)者Wolff等首次發(fā)現(xiàn)裸露的質(zhì)粒DNA直接肌肉注射后，可高水平、持續(xù)表達(dá)外源蛋白質(zhì)，并可誘生特異性免疫反應(yīng)。此后，以此為基礎(chǔ)建立及發(fā)展的基因免疫技術(shù)(Gene Immunization)已被廣泛應(yīng)用于抗病毒、細(xì)菌、寄生蟲、腫瘤及自身抗原等的免疫應(yīng)答研究。研究證實(shí)，編碼靶抗原基因的基因疫苗(DNA疫苗)由于可較好地模擬天然病毒等的感染過程，因此可在注射局部天然地表達(dá)具有空間構(gòu)像的靶抗原，從而更有利于誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答，尤其是對(duì)清除病毒感染起決定性作用的CTL應(yīng)答。十余年來，基因免疫正逐步地由最初階段的全基因免疫系統(tǒng)的建立及廣泛應(yīng)用，發(fā)展到以抗原表位為靶抗原的精確定位階段，進(jìn)而到探討基因免疫機(jī)理、改造建立免疫系統(tǒng)階段。
目前，由于短肽表達(dá)的低效性，所有報(bào)道的SARS-Cov疫苗還沒有有效誘導(dǎo)機(jī)體針對(duì)病毒免疫應(yīng)答的基于抗原表位的基因疫苗?；谳d體蛋白的多肽疫苗也尚在嘗試尋找靶位點(diǎn)階段，本發(fā)明運(yùn)用軟件和數(shù)據(jù)庫預(yù)測的方法，結(jié)合已有的病毒與其感染靶細(xì)胞結(jié)合相關(guān)位點(diǎn)報(bào)道，選取了四個(gè)可能與病毒宿主特異性或發(fā)病相關(guān)的有較好免疫特性的靶表位，通過連接序列串聯(lián)，建立了能有效激發(fā)機(jī)體T、B淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)、并能誘導(dǎo)較長時(shí)間免疫記憶的基因疫苗，為傳統(tǒng)疫苗研究做了有益的補(bǔ)充，因此有較好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種基于表位的SARS-Cov基因疫苗，它是以一種可用于人體的質(zhì)粒為載體，以SEQ ID NO18以及SEQ IDNO19所述的氨基酸序列為目的抗原，通過基因工程方法制備獲得。所述的SEQ ID NO18和SEQ ID NO19分別為人類SARS冠狀病毒膜外S、M蛋白抗原中的T、B細(xì)胞表位SARS-s437-459aa和SARS-m1-20aa的氨基酸序列。
較佳的，本發(fā)明所述的基于表位的SARS-Cov疫苗以一種可用于人體的質(zhì)粒為載體，以SEQ ID NO20、SEQ ID NO18、SEQ ID NO21以及SEQ IDNO19所述的氨基酸序列為目的抗原，通過基因工程方法制備獲得。所述的SEQ ID NO20和SEQ ID NO21分別為人類SARS冠狀病毒膜外S蛋白抗原中的B細(xì)胞表位SARS-s174-195aa和SARS-s556-568aa的核苷酸序列。
本發(fā)明所述的可用于人體的質(zhì)粒優(yōu)選為pVAON33，它是由pVAX1質(zhì)粒改建獲得，將SEQ ID NO17的33個(gè)堿基用HindIII、EcoRI雙酶切，然后接入pVAX1質(zhì)粒，獲得pVAON33骨架質(zhì)粒。改建后的質(zhì)粒帶有有助于增強(qiáng)真核翻譯起始的KOZAK序列，pVAON33質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)見圖1。
本發(fā)明使用的載體中的真核轉(zhuǎn)錄元件組合包括人巨細(xì)胞病毒(hCMV)啟動(dòng)子序列以及牛生長因子(BGH)的polyA加尾序列。
在設(shè)計(jì)本發(fā)明的基于表位的SARS-Cov疫苗過程中，對(duì)多表位的編碼基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，使之在真核細(xì)胞中高水平表達(dá)，產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
將本發(fā)明所述的目的抗原的用特定的連接序列進(jìn)行連接后，具有SEQ IDNO23的氨基酸序列。本發(fā)明使用的連接序列優(yōu)選三氨基酸表位連接序列AAY(GCCGCCTAC)進(jìn)行連接，其在增強(qiáng)各表位抗原性的同時(shí)又保證了各表位的相對(duì)獨(dú)立性。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供一種基于表位的SARS-Cov疫苗的制備方法，該方法包括以下步驟a)運(yùn)用軟件和數(shù)據(jù)庫預(yù)測的方法，選取多個(gè)病毒宿主特異性或發(fā)病相關(guān)的有較好免疫特性的靶表位，通過連接序列進(jìn)行串聯(lián)，并對(duì)所選序列按照哺乳動(dòng)物密碼子偏好進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)出目的基因；b)選取一種可用于人體的質(zhì)粒為載體；c)將b)所述的質(zhì)粒與a)中獲得的基因片段相連接，篩選陽性克隆，得到帶有目的基因的質(zhì)粒。
d)將c)中得到的質(zhì)粒進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增，抽提和純化質(zhì)粒DNA；e)將d)中擴(kuò)增和純化得到的質(zhì)粒DNA以一定條件和濃度溶解于生物相容性介質(zhì)，獲得基于表位的SARS-Cov疫苗成品。
進(jìn)一步的，作為本發(fā)明的一個(gè)較佳的實(shí)施方式，所述的基于表位的SARS-Cov疫苗的制備方法包括以下步驟a)運(yùn)用軟件和數(shù)據(jù)庫預(yù)測的方法，選取人類SARS冠狀病毒膜外S蛋白抗原中的B細(xì)胞表位SARS-s174-195aa、SARS-s437-459aa、SARS-s556-568aa、SARS-m1-20aa作為靶表位，通過連接序列串聯(lián)構(gòu)建成多表位的SARS-Cov基因疫苗(如圖1、圖2所示)，并對(duì)所選序列按照哺乳動(dòng)物密碼子偏好進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)出目的基因；b)人工分段合成該目的基因的兩條互補(bǔ)寡核苷酸鏈，退火后其兩端為特異性無回文結(jié)構(gòu)的粘性末端，兩兩連接獲得4個(gè)較大的二體片段，回收后再兩兩連接上述4個(gè)片段，并回收獲得兩目的片段，繼續(xù)連接，體系以特異性引物擴(kuò)增獲得目的基因，目的基因片段用BglII和EcoRI酶切；c)將pVAX1質(zhì)粒插入KOZAK序列和BglII酶切位點(diǎn)，得到pVAON33質(zhì)粒，經(jīng)BglII和EcoRI酶切后，與b)得到的基因片段相連接，篩選出陽性克隆，測序鑒定與設(shè)計(jì)序列相符，即得到pVAON33-epis質(zhì)粒；d)將pVAON33-epis質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)培養(yǎng)后獲得大量菌體，大規(guī)模抽提純化pVAON33-epis質(zhì)粒DNA；e)將抽提得到的純化的pVAON33-epis質(zhì)粒DNA在無菌條件下溶解于生理鹽水中，獲得基于表位的SARS-Cov疫苗成品。
本發(fā)明所述的基于表位的SARS-Cov疫苗成品濃度優(yōu)選為1-3μg/μl。
本發(fā)明的另一目的在于提供基于表位的SARS-Cov基因疫苗在制備預(yù)防和治療SARS的藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)SARS病毒的相關(guān)序列SARS coronavirus TOR2(Genbank序列號(hào)AY274119)，本發(fā)明以SARS-Cov表面S、M膜蛋白預(yù)測有較強(qiáng)免疫原性的T、B細(xì)胞抗原表位SARS-s174-195aa、SARS-s437-459aa、SARS-s556-568aa、SARS-m1-20aa為目的靶表位，通過加入連接序列，并且進(jìn)行密碼子優(yōu)化，構(gòu)建了一種非典型性肺炎冠狀病毒的DNA疫苗。本發(fā)明的疫苗針對(duì)病毒免疫反應(yīng)特異性高，又可降低發(fā)生因非特異交叉反應(yīng)引起的自身免疫病和抗體介導(dǎo)的感染增強(qiáng)效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，克服了單表位短肽表達(dá)效率差，抗病毒突變能力弱，易產(chǎn)生耐受的缺點(diǎn)，有較好的預(yù)期臨床價(jià)值。
以下進(jìn)一步詳細(xì)敘述本發(fā)明的技術(shù)方案。
1、多表位串聯(lián)的靶基因片段獲得以軟件預(yù)測結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫預(yù)測后，首先確定如表1的四個(gè)靶表位。
表1 有較強(qiáng)免疫原性的抗原表位

以上述選定的靶表位氨基酸序列為基礎(chǔ)，根據(jù)Kotsopoulou E.(Journal ofVirology；Vol.74，No.10，4839-4852)報(bào)道的哺乳動(dòng)物密碼子偏好進(jìn)行優(yōu)化，人工合成如表2的基因片段，(表2中的序列為退火前序列，)序列寡核苷酸磷酸化后1，2相對(duì)應(yīng)退火，復(fù)性分別得到a-h片段。兩兩連接得ab、cd、ef、gh，連接片段經(jīng)回收后再次進(jìn)行兩兩連接得abcd、efgh，再次回收后連接，以1a，8b為引物擴(kuò)增，得到兩頭帶有BglII和EcoRI酶切位點(diǎn)的靶基因片段(SEQ ID NO22)如下

GAGAAGTCCGGCAACTTTAAGCACTTACGCGAGTTTGTGTTTAAGAACAAGGACGGCTTTCTGTACGCCGCCTACAACTACAAGTACAGGTACCTGAGACACGGCAAGCTGAGGCCCTTTGAGAGAGACATCTCCAACGTGCCCGCCGCCTACTCCGACTTCACTGACTCCGTTCGCGACCCCAAGACCTCCGCCGCCTACATGGCCGACAACGGCACCATCACCGTGGAGGAGCTGAAGCAGCTGCTGGAGCAGTGGAACTAATAG

其中，

為BglII酶切位點(diǎn)，

為EcoRI酶切位點(diǎn)，GCCGCCTAC為AAY連接序列。
上述序列編碼疫苗的目的氨基酸(SEQ ID NO23)EKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYAAYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPAAYSDFTDSVRDPKTSAAYMADNGTITVEELKQLLEQWN

表2 人工合成的基因片段2、基因疫苗表達(dá)載體的構(gòu)建pVAON33骨架質(zhì)粒由經(jīng)FDA認(rèn)證可用于人體的pVAX1質(zhì)粒(李忠明教授Food and Drug Administration，Bethesda，MD，USA惠增)改建獲得。人工合成的33堿基序列AGCTTGCCACCATGGGGAGATCTGGATCCTGAG，(SEQ ID NO17)，依次編碼HindIII，Kozak序列，BglII，BamHI和EcoRI序列，經(jīng)HindIII，EcoRI雙酶切后接入pVAX1質(zhì)粒，獲得pVAON33。
3、基因疫苗的鑒定多表位串聯(lián)靶基因片段經(jīng)BglII和EcoRI雙酶切后接入pVAON33質(zhì)粒，經(jīng)PCR及DNA序列測定，插入基因片段與設(shè)計(jì)相符合(圖3)。
4、基因疫苗效果驗(yàn)證在本發(fā)明的實(shí)施例中，多表位串聯(lián)的靶基因通過BamHI和EcoRI雙酶切連接克隆到pcDNA4-his/myc載體中體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)后以anti-myc抗體Western檢測可見明顯的目的蛋白表達(dá)，大小與預(yù)測相符(圖4)。可見多表位串聯(lián)的靶基因片段在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能夠高效表達(dá)。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，以基于表位的SARS-Cov基因疫苗質(zhì)粒DNA直接肌注免疫6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，結(jié)果誘生了的抗SARS-Cov膜表面S和M蛋白的特異性抗體應(yīng)答(圖5)，以大腸桿菌原核表達(dá)的多表位串聯(lián)蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)刺激，可見該基因疫苗可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)至少4個(gè)月的免疫記憶反應(yīng)，從而為該疫苗可能誘導(dǎo)抗SARS-Cov免疫保護(hù)效應(yīng)的長期性提供了佐證。
以基于表位的SARS-Cov基因疫苗質(zhì)粒DNA直接肌注免疫雌性BALB/c小鼠，經(jīng)兩次加強(qiáng)后，獲取免疫小鼠的全脾臟細(xì)胞，分別以合成的各預(yù)測表位肽和原核表達(dá)S蛋白片段進(jìn)行刺激，以3H滲入法檢測淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。結(jié)果表明該基因誘生了較強(qiáng)的表位肽特異的針對(duì)SARS-Cov膜蛋白的細(xì)胞免疫應(yīng)答(圖6)，表明該基因疫苗不僅包含了有效的B細(xì)胞表位，也提供了必要的T細(xì)胞表位，從而能在誘導(dǎo)較好的抗體免疫應(yīng)答的同時(shí)，也誘導(dǎo)了的相應(yīng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。


圖1是本發(fā)明基于表位的SARS-Cov基因疫苗質(zhì)粒模式圖。
圖2是本發(fā)明基于表位的SARS-Cov基因疫苗質(zhì)粒中插入的目的抗原的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3是本發(fā)明基于表位的SARS-Cov基因疫苗的PCR及測序鑒定，其中(A)中1為DL2000 DNA分子量Marker；2為以pVAON33-epis為模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(大小為284bp)；(B)為測序結(jié)果圖(部分)。
圖4是多表位串聯(lián)的靶基因片段在293T細(xì)胞中的表達(dá)Western檢測結(jié)果，其中1為pcDNA4-his/myc-epis轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液，2為pcDNA4-his/myc-epis轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清，3為pcDNA4空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液，4為pcDNA4空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清。
圖5是基于多表位的SARS-Cov基因疫苗免疫雌性BALB/c小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生SARS-Cov膜蛋白特異性抗體應(yīng)答(pVAON33-epis質(zhì)粒免疫組位試驗(yàn)組；pVAON33空質(zhì)粒免疫組為對(duì)照)，其中(A)為以原核表達(dá)的多表位串聯(lián)的靶基因?qū)?yīng)蛋白為抗原檢測免疫小鼠抗血清時(shí)間曲線圖，各質(zhì)粒免疫組(pVAON33-epis和pVAON33空質(zhì)粒)分別在第12、18周給予以PBS(pH＝7.2)溶解的對(duì)應(yīng)蛋白20ug/只基因免疫后的實(shí)驗(yàn)組小鼠(3只/次)刺激，檢測的抗血清對(duì)應(yīng)變化狀況。(B)為抗血清滴度峰值時(shí)對(duì)各預(yù)測表位的結(jié)合反應(yīng)特性(以合成的各表位肽作為抗原檢測血清免疫反應(yīng)性的結(jié)果)。(C)為抗血清滴度峰值時(shí)對(duì)原核表達(dá)的SARS-Cov表面膜蛋白S(部分)和M的的結(jié)合反應(yīng)特性(以原核表達(dá)的SARS-Cov表面膜蛋白S(部分)和M作為抗原檢測血清免疫反應(yīng)性的結(jié)果)。
圖6是基于多表位的SARS-Cov基因疫苗基因免疫雌性BALB/c小鼠后可誘導(dǎo)特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(pVAON33-epis質(zhì)粒免疫組位試驗(yàn)組；pVAON33空質(zhì)粒免疫組為對(duì)照)。
具體實(shí)施例方式
以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述的實(shí)施例是用于描述本發(fā)明的基因疫苗及其構(gòu)建和用途，而不是用于限制本發(fā)明。
實(shí)施例中采用的質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞、動(dòng)物及試劑如下質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞、動(dòng)物質(zhì)粒pVAX1由李忠明教授惠贈(zèng)，宿主細(xì)菌DH5α為Gibco BRL公司產(chǎn)品，293T細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞所。寡核苷酸片段均由北京三博公司合成。6-8周齡雌性BALB/c(H-2d)小鼠購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
分子生物學(xué)試劑限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI、BglII、T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)；T4多核苷酸激酶(Biolab公司)；Taq DNA多聚酶(Promega公司)；RNaseA(Ameresco公司)；dNTP(Promega和華美生物公司)；DL2000DNA Marker(TaKaRa公司)。LB培養(yǎng)基(英國OXOID公司)，瓊脂粉、瓊脂糖、SDS、EB、重蒸酚(上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站)，Tris(USB公司)，瓊脂糖膠回收試劑盒(上海華舜生物制品公司)。
多肽由吉爾生物有限公司合成。
細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化試劑細(xì)胞培養(yǎng)試劑(Gibco BRL公司)。Lipofectamin2000真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)。
免疫學(xué)試劑和材料免抗myc多克隆抗體(Santa cruz公司)，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(ELISA效價(jià)1∶1000)(華美生物工程公司)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(Southern Biotechnology Associates，Inc)。丁哌卡因(Sigma公司)，絲裂霉素C(日本Kyowa Hakko Kogyo公司)，ELISA酶標(biāo)板(Coastar公司)，ECL+plus化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pharmacia公司)。
實(shí)施例1 基于表位的SARS-Cov基因疫苗的構(gòu)建、鑒定和表達(dá)1、基于表位的SARS-Cov基因疫苗的構(gòu)建以軟件預(yù)測結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫預(yù)測后，首先確定了如表1的多肽序列為靶表位，根據(jù)Kotsopoulou E.(Journal of Virology；Vol.74，No.10，4839-4852)報(bào)道的哺乳動(dòng)物密碼子偏好進(jìn)行優(yōu)化后人工合成了如表2的基因片段。合成片段經(jīng)T4多核苷酸激酶做磷酸化處理1小時(shí)后，加熱煮沸5分鐘，保溫緩慢冷卻退火后先兩兩連接得ab、cd、ef、gh(16℃連接6小時(shí))，連接片段經(jīng)試劑盒回收后再次進(jìn)行兩兩連接得abcd、efgh，再度回收后連接，以1a，2h為引物擴(kuò)增得到兩頭帶有BglII和EcoRI酶切位點(diǎn)的靶基因片段。
pVAON33骨架質(zhì)粒是由經(jīng)FDA認(rèn)證可用于人體的pVAX1質(zhì)粒(李忠明教授Food and Drug Administration，Bethesda，MD，USA惠贈(zèng))改建獲得。人工合成的33堿基序列依次編碼HindIII，Kozak序列，BglII，BamHI和EcoRI序列并經(jīng)HindIII，EcoRI雙酶切后接入pVAX1質(zhì)粒后獲得。
載體與目的基因片段都經(jīng)BglII和EcoRI雙酶切后回收，連接后篩選陽性克隆，經(jīng)PCR及DNA序列測定，插入基因片段與設(shè)計(jì)相符合(圖3)。
2、基于表位的SARS-Cov基因疫苗的制備與純化依照QIA GEN Plasmid Mega Kit推薦程序進(jìn)行。將重組質(zhì)粒pVAON33-epis與空pVAON33質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，經(jīng)LB(Amp 100ug/ml)液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，收集菌體，按照QIAGEN Plasmid Mega Kit去雜蛋白、細(xì)菌內(nèi)毒素，最后得到純化DNA。將質(zhì)粒DNA溶解于無菌、無熱源的NS中，濃度調(diào)整為1-3μg/μl，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 3、多表位基因片段的在哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞內(nèi)的體外表達(dá)293T細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM。轉(zhuǎn)染前一天以1×105-3×105細(xì)胞數(shù)種入35mm六孔板，前4小時(shí)換液，。借助Lipofectamin2000真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑，將1-2ug純化質(zhì)粒pcDNA4-his/myc-epis或空pcDNA4-his/myc轉(zhuǎn)染該細(xì)胞株。37℃，5％CO2培養(yǎng)4小時(shí)后更換培養(yǎng)液，48小時(shí)后，收集上清，以15％的不連續(xù)變性聚丙烯酰安凝膠電泳分離蛋白組份，轉(zhuǎn)膜并經(jīng)5％脫脂奶粉封閉后，與兔抗myc多克隆抗體(1∶1000稀釋)孵育過夜。洗去一抗后，與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶200稀釋)孵育2小時(shí)。清洗去二抗后，以化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色曝光15秒獲得Western雜交結(jié)果。
Western雜交檢測多表位基因片段的在哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞內(nèi)的體外表達(dá)顯示在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，pcDNA4-his/myc-epis轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中即可檢測出該多表位基因片段表達(dá)的約近10kd的蛋白分子；而pcDNA4-his/myc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞中則無表達(dá)，表明經(jīng)密碼子修改的人工合成組裝的編碼多表位的基因片段能夠有效的在體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)(圖4)。
實(shí)施例2 基于表位的SARS-Cov基因疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6-8周齡雌性BALB/c(H-2d)小鼠，體重16-18克，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物免疫健康雌性BALB/c小鼠各12只，分為2組(1)以純化的pVAON33空質(zhì)粒載體免疫組作對(duì)照，6只；(2)以純化的pVAON33-epis質(zhì)粒免疫組，6只。肌肉免疫雌性BALB/c小鼠采用輕度麻醉后脛骨前肌肉注射法以0.75％戊巴比妥鈉100-150ul腹腔注射小鼠(按50ug/g體重)，暴露脛骨前肌肉，以1ml注射器自肌肉中部垂直入針，針尖插入深度2～3mm，緩慢進(jìn)針，停留5秒鐘。DNA免疫前24小時(shí)，注射100ul0.25％丁哌卡因，使局部肌肉壞死；24小時(shí)后再次麻醉小鼠并在同一部位注射100ug/100ul質(zhì)粒DNA溶液。于0周、3周肌注基因免疫小鼠兩次。每兩周采血一次，檢驗(yàn)產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答水平。獲得血樣4℃放置過夜后，6000rpm離心15分鐘獲得血清樣本。用大腸桿菌表達(dá)的基于表位的SARS-Cov基因疫苗對(duì)應(yīng)蛋白(10ug/ml)包被的酶標(biāo)板經(jīng)含有10％山羊血清、0.5％牛血清白蛋白、0.05％的Tween-20封閉后，以間接ELISA法檢測免疫小鼠抗血清中特異的IgG∶抗血清經(jīng)1∶200稀釋后，37℃作用2小時(shí)，與HRP-兔抗人IgG-在37℃作用1小時(shí)，以鄰苯二胺顯色，測OD490值。
分別在第12、18周以PBS(pH＝7.2)溶解的大腸桿菌表達(dá)的基于表位的SARS-Cov基因疫苗對(duì)應(yīng)蛋白20ug/只基因免疫后的實(shí)驗(yàn)組小鼠(3只/次)，隔周采血。用間接ELISA法確定抗血清對(duì)疫苗對(duì)應(yīng)蛋白、各候選表位、原核表達(dá)的SARS-Cov膜S和M蛋白的反應(yīng)特性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)顯示基因疫苗免疫兩次后可以在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，其抗血清中IgG滴度在第八周時(shí)達(dá)到最高，約1∶512左右，空質(zhì)粒注射組則無特異性抗體生成。該特異性的體液免疫反應(yīng)主要針對(duì)NP和MN表位，并且能較好的與原核表達(dá)的SARS-Cov膜S和M蛋白的反應(yīng)。免疫兩個(gè)月和四個(gè)月后，通過相應(yīng)抗原蛋白刺激，可以很快誘導(dǎo)免疫記憶反應(yīng)，短時(shí)間產(chǎn)生高達(dá)1∶2000以上的特異性IgG抗體，空白質(zhì)粒免疫組小鼠則無此記憶反應(yīng)，提示本發(fā)明可以誘導(dǎo)較長時(shí)間的免疫記憶，時(shí)間至少約4個(gè)月。
實(shí)施例3 基于表位的SARS-Cov基因疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6-8周齡雌性BALB/c(H-2d)小鼠，體重16-18克，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物免疫健康雌性BALB/c小鼠各12只，分為2組(1)以純化的pVAON33空質(zhì)粒載體免疫組作對(duì)照，6只；(2)以純化的pVAON33-epis質(zhì)粒免疫組，6只。肌肉免疫雌性BALB/c小鼠采用輕度麻醉后脛骨前肌肉注射法以0.75％戊巴比妥鈉100-150ul腹腔注射小鼠(按50ug/g體重)，暴露脛骨前肌肉，以1ml注射器自肌肉中部垂直入針，針尖插入深度2～3mm，緩慢進(jìn)針，停留5秒鐘。DNA免疫前24小時(shí)，注射100ul0.25％丁哌卡因，使局部肌肉壞死；24小時(shí)后再次麻醉小鼠并在同一部位注射100ug/100ul質(zhì)粒DNA溶液。于0周、3周肌注基因免疫小鼠兩次。二次免疫10天后，處死小鼠，無菌獲取全脾臟，三復(fù)孔分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，以終濃度為肽5ug/ml，蛋白10ug/ml的各抗原、原核表達(dá)的SARS-Cov膜S蛋白片段，多表位疫苗對(duì)應(yīng)的原核表達(dá)蛋白體外刺激56小時(shí)后加入3H標(biāo)記的胸腺嘧啶，繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)，以多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞，液閃計(jì)數(shù)儀檢測相應(yīng)的cpm值，計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。
結(jié)果(圖6)顯示NP、MN表位和多表位疫苗對(duì)應(yīng)的原核表達(dá)蛋白對(duì)pVAON33-epis免疫后小鼠的脾淋巴細(xì)胞有較強(qiáng)刺激增殖作用，對(duì)應(yīng)的空質(zhì)粒免疫組小鼠則表現(xiàn)為不反應(yīng)或低反應(yīng)性；pVAON33-epis免疫后小鼠對(duì)原核表達(dá)的SARS-Cov膜S蛋白片段有特異性的皮淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，而空質(zhì)粒免疫小鼠脾細(xì)胞則無此特性。兩組間SI值經(jīng)t檢驗(yàn)，p值都小于0.05。這提示，NP和MN表位不僅是有效的B細(xì)胞表位也是有效的T細(xì)胞表位，且NP表位有很高的免疫特異性。
序列表<110>復(fù)旦大學(xué)<120>基于表位的SARS-Cov基因疫苗及其構(gòu)建<160>23<210>1<211>30<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
GGAAGATCTGAGAAGTCCGGCAACTTTAAG30<210>2<211>40<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
CGCGTAAGTGCTTAAAGTTGCCGGACTTCTCAGATCTTCC 40<210>3<211>41<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
CACTTACGCGAGTTTGTGTTTAAGAACAAGGACGGCTTTCT 41<210>4
<211>41<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
GGCGGCGTACAGAAAGCCGTCCTTGTTCTTAAACACAAACT 41<210>5<211>39<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
GTACGCCGCCTACAACTACAAGTACAGGTACCTGAGACA 39<210>6<211>39<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
CAGCTTGCCGTGTCTCAGGTACCTGTACTTGTAGTTGTA 39<210>7<211>32<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
CGGCAAGCTGAGGCCCTTTGAGAGAGACATCT 32<210>8<211>32
<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
GGCACGTTGGAGATGTCTCTCTCAAAGGGCCT 32<210>9<211>36<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
CCAACGTGCCCGCCGCCTACTCCGACTTCACTGACT 36<210>10<211>38<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
GGTCGCGAACGGAGTCAGTGAAGTCGGAGTAGGCGGCG38<210>11<211>37<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
CCGTTCGCGACCCCAAGACCTCCGCCGCCTACATGGC 37<210>12<211>35<212>DNA
<213>合成的寡核苷酸<400>
GCCGTTGTCGGCCATGTAGGCGGCGGAGGTCTTGG 35<210>13<211>36<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
CGACAACGGCACCATCACCGTGGAGGAGCTGAAGCA 36<210>14<211>37<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
GCTCCAGCAGCTGCTTCAGCTCCTCCACGGTGATGGT 37<210>15<211>33<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
GCTGCTGGAGCAGTGGAACTAATAGGAATTCCG 33<210>16<211>22<212>DNA<213>合成的寡核苷酸
<400>
CGGAATTCCTATTAGTTCCACT22<210>17<211>33<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
AGCTTGCCACCATGGGGAGATCTGGATCCTGAG 33<210>18<211>23<212>PRT<213>人工序列<400>
Asn Tyr Lys Tyr Arg Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu 16Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro 23<210>19<211>20<212>PRT<213>人工序列<400>
Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu 16Glu Gln Trp Asn 20<210>20<211>22
<212>PRT<213>人工序列<400>
Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn16Lys Asp Gly Phe Leu Tyr22<210>21<211>13<212>PRT<213>人工序列<400>
Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser13<210>22<211>279<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>
AGATCTGAGAAGTCCGGCAACTTTAAGCACTTACGCGAGTTTGTGTTTAA050GAACAAGGACGGCTTTCTGTACGCCGCCTACAACTACAAGTACAGGTACC100TGAGACACGGCAAGCTGAGGCCCTTTGAGAGAGACATCTCCAACGTGCCC150GCCGCCTACTCCGACTTCACTGACTCCGTTCGCGACCCCAAGACCTCCGC200CGCCTACATGGCCGACAACGGCACCATCACCGTGGAGGAGCTGAAGCAGC250TGCTGGAGCAGTGGAACTAATAGGAATTC 279<210>23<211>87<212>PRT
<213>人工序列<400>
Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Va lPhe Lys Asn16Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Ala Ala Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu32Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro48Ala Ala Tyr Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser64Ala Ala Tyr Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys80Gln Leu Leu Glu Gln Trp Asn8權(quán)利要求
1.一種基于表位的SARS-Cov基因疫苗，其特征在于，以一種可用于人體的質(zhì)粒為載體，以SEQ ID NO18以及SEQ ID NO19所述的氨基酸序列為目的抗原，通過基因工程方法制備獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于表位的SARS-Cov疫苗，其特征在于，所述的SEQ ID NO18和SEQ ID NO19分別為人類SARS冠狀病毒膜外S蛋白抗原中的T、B細(xì)胞表位SARS-s437-459aa和M蛋白抗原中的T、B細(xì)胞表位SARS-m1-20aa的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于表位的SARS-Cov疫苗，其特征在于，以一種可用于人體的質(zhì)粒為載體，以SEQ ID NO20、SEQ ID NO18、SEQ IDNO21、SEQ ID NO19所述的氨基酸序列為目的抗原，通過基因工程方法制備獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于表位的SARS-Cov疫苗，其特征在于，所述的SEQ ID NO20和SEQ ID NO21分別為人類SARS冠狀病毒膜外S蛋白抗原中的B細(xì)胞表位SARS-s174-195aa和SARS-s556-568aa的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的基于表位的SARS-Cov疫苗，其特征在于，所述的載體為可用于人體的質(zhì)粒pVAON33。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于表位的SARS-Cov疫苗，其特征在于，所述的pVAON33骨架質(zhì)粒是由pVAX1質(zhì)粒改建獲得，將SEQ ID NO17的33個(gè)堿基用HindIII、EcoRI雙酶切，然后接入pVAX1質(zhì)粒，獲得pVAON33骨架質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的基于表位的SARS-Cov疫苗，其特征在于，對(duì)多表位的編碼基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，使之在真核細(xì)胞中高水平表達(dá)，產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于表位的SARS-Cov疫苗，其特征在于，所述的疫苗中具有SEQ ID NO23所示的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于表位的SARS-Cov疫苗，其特征在于，所述的疫苗中具有SEQ ID NO22所示的核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于表位的SARS-Cov疫苗，其特征在于，所述的抗原之間通過三氨基酸表位連接序列AAY進(jìn)行連接。
11.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的基于表位的SARS-Cov疫苗，其特征在于，載體中的真核轉(zhuǎn)錄元件組合包括人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子序列以及牛生長因子的polyA加尾序列。
12.一種基于表位的SARS-Cov疫苗的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a)運(yùn)用軟件和數(shù)據(jù)庫預(yù)測的方法，選取多個(gè)病毒宿主特異性或發(fā)病相關(guān)的有較好免疫特性的靶表位，通過連接序列進(jìn)行串聯(lián)，并對(duì)所選序列按照哺乳動(dòng)物密碼子偏好進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)出目的基因；b)選取一種可用于人體的質(zhì)粒為載體；c)將b)所述的質(zhì)粒與a)中獲得的基因片段相連接，篩選陽性克隆，得到帶有目的基因的質(zhì)粒；d)將c)中得到的質(zhì)粒進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增，抽提和純化質(zhì)粒DNA；e)將d)中擴(kuò)增和純化得到的質(zhì)粒DNA以一定條件和濃度溶解于生物相容性介質(zhì)，獲得基于表位的SARS-Cov疫苗成品。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的基于表位的SARS-Cov疫苗的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a)運(yùn)用軟件和數(shù)據(jù)庫預(yù)測的方法，選取人類SARS冠狀病毒膜外S蛋白抗原中的B細(xì)胞表位SARS-s174-195aa、SARS-s437-459aa、SARS-s556-568aa、SARS-m1-20aa作為靶表位，通過連接序列串聯(lián)構(gòu)建成多表位的SARS-Cov基因疫苗，并對(duì)所選序列按照哺乳動(dòng)物密碼子偏好進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)出目的基因；b)人工分段合成該目的基因的兩條互補(bǔ)寡核苷酸鏈，退火后其兩端為特異性無回文結(jié)構(gòu)的粘性末端，兩兩連接獲得4個(gè)較大的二體片段，回收后再兩兩連接上述4個(gè)片段，并回收獲得兩目的片段，繼續(xù)連接，體系以特異性引物擴(kuò)增獲得目的基因，目的基因片段用BglII和EcoRI酶切；c)將pVAX1質(zhì)粒插入KOZAK序列和BglII酶切位點(diǎn)，得到pVAON33質(zhì)粒，經(jīng)BglII和EcoRI酶切后，與b)得到的基因片段相連接，篩選出陽性克隆，測序鑒定與設(shè)計(jì)序列相符，即得到pVAON33-epis質(zhì)粒；d)將pVAON33-epis質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)培養(yǎng)后獲得大量菌體，大規(guī)模抽提純化pVAON33-epis質(zhì)粒DNA；e)將抽提得到的純化的pVAON33-epis質(zhì)粒DNA在無菌條件下溶解于生理鹽水中，獲得基于表位的SARS-Cov疫苗成品。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的基于表位的SARS-Cov疫苗的制備方法，其特征在于，所述的基于表位的SARS-Cov疫苗成品濃度為1-3μg/μl。
15.權(quán)利要求1或3所述的基于表位的SARS-Cov基因疫苗在制備預(yù)防和治療SARS的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于表位的SARS－Cov基因疫苗，所述的疫苗以一種可用于人體的質(zhì)粒為載體，以人類SARS冠狀病毒膜外S蛋白抗原中的若干B細(xì)胞表位為目的抗原，經(jīng)密碼子優(yōu)化后，通過基因工程方法制備獲得。本發(fā)明還公開了該疫苗的制備方法。該疫苗既具有特異性高的特點(diǎn)，又可降低非特異交叉反應(yīng)引起的自身免疫病和抗體介導(dǎo)的感染增強(qiáng)效應(yīng)的發(fā)生，克服了單表位短肽表達(dá)效率差，抗病毒突變能力弱，易產(chǎn)生耐受的缺點(diǎn)，有較好的預(yù)期臨床價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1657102SQ20041001645
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2004年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月20日
發(fā)明者熊思東, 汪曉華, 王纓, 儲(chǔ)以微 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)