專利名稱：生長(zhǎng)因子和免疫球蛋白制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生長(zhǎng)因子和免疫球旦白制劑的制備方法及其應(yīng)用，特別涉用一種從牛初乳中制備高生物活性的生長(zhǎng)因子和免疫球旦白制劑的方法以及該制劑的應(yīng)用。
發(fā)明技術(shù)背景初乳是指分娩后72小時(shí)內(nèi)母體分泌的乳前液體。多年科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，牛初乳含有多種珍貴的生物活性物質(zhì)，具有保健、抗病、抗衰老等功效，其效用可以和人乳相媲美，某些研究人員認(rèn)為牛乳是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最有益人體健康的食品。
牛初乳的研究始于70年代，30多年來各國(guó)科學(xué)家在牛初乳成份及其對(duì)人體作用方面的研究有很大進(jìn)展，綜合目前國(guó)際上的研究成果，初乳中的活性物質(zhì)可以分為兩大類免疫因子和生長(zhǎng)因子。
牛初乳中的免疫因子可以抵抗病毒、細(xì)菌、酵母菌、真菌、過敏原和其他毒素，初乳中含有5種免疫球旦白，分別是IgG，IgD，IgM，IgA和IgE，其中IgG含量最高，在人體初乳中，IgG僅占2％左右，在牛初乳中IgG含量可達(dá)8％-25％，免疫球旦白對(duì)于病毒性感染、細(xì)菌性感染、寄生蟲和酵母菌都有良好的防御作用，高質(zhì)量牛初乳中免疫球旦白應(yīng)最低達(dá)到20％；牛初乳中至少含有19種致病菌的抗體，包括沙門氏菌、大腸桿菌和鏈球菌的抗體。研究表明，天然初乳中IgG具有較廣譜的抑菌效果，特別是對(duì)大多數(shù)導(dǎo)致腸胃道疾病的病原微生物具有良好的抑制和殺滅效果，根據(jù)《初乳功能性食品》文獻(xiàn)，牛初乳中IgG能夠抑制幽門螺旋桿菌、空腸炎彎曲桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、大腸桿菌、致腸炎沙門氏菌，可防治胃潰瘍、慢性胃炎、空腸炎、小腸結(jié)腸炎、食物中毒等。牛初乳中還含有富脯氨基酸多肽(PRP)，可以調(diào)節(jié)人體胸腺活動(dòng)而增強(qiáng)人體免疫功能；乳鐵旦白對(duì)癌癥、艾滋病、皰疹、慢性疲勞等疾病有效；乳清旦白對(duì)于癌癥和病毒有很好抵御作用；以及含有細(xì)胞活素和溶菌酶等免疫增強(qiáng)和調(diào)節(jié)物質(zhì)。
牛初乳中還含有豐富的生長(zhǎng)因子，醫(yī)學(xué)研究表明，牛初乳中的重要生長(zhǎng)因子除了有助于正常的生長(zhǎng)之外，對(duì)人體組織修復(fù)有重要的作用。牛初乳中含量最豐富的生長(zhǎng)因子是類胰島素生長(zhǎng)因子I和II(GIF-I和GIF-II)，它們幫助機(jī)體有效地進(jìn)行脂肪代謝和葡萄糖代謝，增加葡萄糖利用，增強(qiáng)糖耐量。牛初乳中還含有轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(TGFA&B)，血小板誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子(PDGF)，表皮生長(zhǎng)因子、骨髓生長(zhǎng)因子等。生長(zhǎng)因子是一類以肽為基本單位的組合物，顧名思義它可促進(jìn)體內(nèi)各種細(xì)胞群的生長(zhǎng)，細(xì)分起來，實(shí)際上其功能是多種多樣的，其組成和功效類似，往往相輔相成。血小板衍生因子(PDGF)是一種在循環(huán)血小板顆粒中發(fā)現(xiàn)的陽離子，熱穩(wěn)定物質(zhì)，具有刺激旦白質(zhì)合成和通過成纖維細(xì)胞刺激膠原旦白生成的作用，它還對(duì)成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞起促進(jìn)細(xì)胞分裂和趨化作用。類胰島素生長(zhǎng)因子I和II(GIF-I、II)對(duì)細(xì)胞增殖分化有促進(jìn)作用，對(duì)傷口愈合有明顯益處，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)能促進(jìn)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)受損害皮膚修復(fù)有促進(jìn)作用，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子A和B(TgFA&B)對(duì)粘膜生長(zhǎng)和組織創(chuàng)傷修復(fù)過程有重要意義。纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子能促進(jìn)組織正常生長(zhǎng)、再生，加快衰老受傷的肌肉、皮膚膠質(zhì)原、軟骨和神經(jīng)組織修復(fù)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子(NGF)可刺激交感神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)。
多家國(guó)外研究成果證實(shí)，免疫球旦白是一組具有高活性同時(shí)又很敏感的旦白質(zhì)，特別適合于細(xì)菌和病毒疾病的預(yù)防和治療，目前已經(jīng)有研究者應(yīng)用它們治療與細(xì)菌或病毒有關(guān)的疾病，如腹瀉，特別是與艾滋病或其他免疫缺陷有關(guān)的腹瀉、旅行者腹瀉、嬰兒中毒性腹瀉、胃和腸潰瘍、非潰瘍性胃腸炎、老年慢性支氣管炎等。
目前有多項(xiàng)技術(shù)用來提取制備牛初乳中生物活性物質(zhì)，美國(guó)專利4,526,715介紹了一種從牛初乳中通過幾種層析分離步驟制備免疫球旦白的方法。美國(guó)專利3,128,230介紹了一種從牛初乳中制備可用于治療各種細(xì)菌感染的產(chǎn)品和方法。西德專利2,813,284和歐洲專利EP-A0,046,909及EP-A0,064,103敘述了從初乳中制備含免疫球旦白產(chǎn)品的方法，該產(chǎn)品可作為抗感染產(chǎn)品。
按上述方法，開始從牛初乳或從經(jīng)過免疫接種的牛初乳中制備有效的免疫球旦白產(chǎn)品，為了達(dá)到抗致病菌或抗致病病毒的效果，必須先給動(dòng)物注射一株或多株細(xì)菌，或它的抗原，以便能夠產(chǎn)生一種抗體或一組特異性抗體，用該方法獲得的產(chǎn)物的活性與所應(yīng)用免疫的品種有關(guān)，應(yīng)用受到限制，產(chǎn)品用途單一。
中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?5100461)公布的技術(shù)中，去除酪旦白不完全，而且應(yīng)用胃旦白酶會(huì)損傷免疫球旦白活性。
而且牛初乳中還富含多種生長(zhǎng)因子和活性多肽，這些生物活性物質(zhì)能幫助局部組織修復(fù)，促進(jìn)旦白合成，減輕或恢復(fù)局部組織結(jié)構(gòu)和功能，與免疫球旦白協(xié)同，能有效促進(jìn)疾病的痊愈，目前公開的技術(shù)中尚未有看到類似報(bào)導(dǎo)。
此外，目前的技術(shù)僅將免疫球旦白應(yīng)用在胃腸道，如果制備合適的劑型也可以應(yīng)用于呼吸道、泌尿道、陰道等空腔臟器的細(xì)菌或病毒感染，由于其天然特性，無毒付作用，應(yīng)該得到良好的效果。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，通過簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)的方法從牛初乳中制備高純度和高抗體活性免疫球旦白產(chǎn)品，同時(shí)保存其中高生物活性的生長(zhǎng)因子和活性多肽，在對(duì)抗、殺滅局部致病細(xì)菌和致病病毒的同時(shí)，幫助局部組織修復(fù)，促進(jìn)旦白合成，快速恢復(fù)局部組織結(jié)構(gòu)和功能。而且使用該產(chǎn)品預(yù)先無需進(jìn)行免疫接種，可以將這個(gè)制劑制備成適合人體多個(gè)器官應(yīng)用的多種劑型，廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌和病毒相關(guān)疾病的治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，收集牛分娩后72小時(shí)內(nèi)初乳，離心脫脂，用酸劑調(diào)節(jié)PH至酸性狀態(tài)，同時(shí)，加熱凝固酪旦白，用離心方式或?yàn)V布過濾方式去除酪旦白后稀釋，收集上清液，采用低分子量超微濾膜濃縮，根據(jù)劑型的不同用途分別制備液體濃縮制劑或干粉制劑、噴霧制劑、藥物栓劑、皮膚貼劑等不同劑型。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案也可以通過下列途徑實(shí)現(xiàn)，收集的牛初乳用離心方式脫脂，脫脂牛初乳用蒸鎦水稀釋，稀釋后脫脂初乳內(nèi)加酸制劑調(diào)整PH，同時(shí)加熱，使酪旦白凝固后離心沉淀去除酪旦白，或靜置過夜后用濾布過濾去除酪旦白，收集上清液后用低分子量超微濾膜濃縮后制備上述各種劑型。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，收集牛初乳，采用離心方式去除脂肪，離心速度為2000～4000轉(zhuǎn)/分，優(yōu)選3000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間15～30分鐘，優(yōu)選20分鐘，采用冷凍離心設(shè)備在冷凍狀態(tài)下離心，離心后去除表面的脂肪，加入酸劑，例如2N HCL或其他酸性制劑，調(diào)整濃縮物PH至弱酸性，PH3.8～5.2，優(yōu)選4.5～4.8，調(diào)整濃縮物PH值后，加熱析出酪旦白，加熱溫度40℃～55℃，最好45℃～50℃，加熱時(shí)間15分鐘～90分鐘，最好30～45分鐘，最好是加熱至看到乳水明顯分離，然后用離心機(jī)離心沉淀析出的酪旦白，離心速度3000～6000轉(zhuǎn)/分，優(yōu)選5000轉(zhuǎn)/分，收集離心上清液。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，本發(fā)明的技術(shù)解決方案也可以從下列途徑實(shí)現(xiàn)，脫脂牛初乳用1倍～5倍蒸鎦水稀釋，優(yōu)選2倍～3倍，調(diào)節(jié)PH值至4.6～4.9，優(yōu)選4.7～4.8，與此同時(shí)加熱30℃～40℃，持續(xù)15～45分鐘，然后于4℃貯存過夜，用尼龍濾布或其他濾布，或用離心方式去除沉淀的酪旦白，上清液用分子量為4000～6000的超濾膜濃縮，并冷凍干燥制粉。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，本發(fā)明制劑還可以制備成注射劑，用于動(dòng)物感染性疾病的治療。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，本發(fā)明上述制備方法中最后工藝中液體濃縮物的干燥方法，既可以采用上述的冷凍干燥方法，也可以采用噴霧干燥方法，這兩種干燥方法都不會(huì)影響免疫球旦白的生物活性，但是噴霧干燥的方法，可能會(huì)影響制劑中生長(zhǎng)因子或其他活性多肽的生物活性，因此，如希望同時(shí)保存制劑中生長(zhǎng)因子和免疫球旦白生物活性時(shí)，應(yīng)采用冷凍干燥方法，如果希望降低成本，又無需保存生長(zhǎng)因子類多肽的活性時(shí)應(yīng)選擇噴霧干燥方法，噴霧干燥時(shí)溫度不能超過160°F，以免損害免疫球旦白活性。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，采用上述方法制備的富含生長(zhǎng)因子和免疫球旦白的制劑，也可以直接以液體濃縮物的形式應(yīng)用，例如制備成口服濃縮液方式應(yīng)用于治療胃腸道疾病，制備成滴液形式用于眼睛、口腔、耳朵的感染性疾病的治療。也可以制備成栓劑用于腸道感染性疾病的治療。制備成膜型劑用于皮膚外傷及皮膚感染性疾病的治療。制備成噴霧劑形式用于呼吸道感染性疾病的治療，也可以加入噴霧霧化的貯藥裝置內(nèi)，采用超聲噴霧霧化的方式治療呼吸道、口腔、咽喉的感染性疾病。上述制劑的制備采用本領(lǐng)域技術(shù)人員都能理解，并熟練掌握的成熟劑型制造技術(shù)，加入各種醫(yī)藥等級(jí)的輔料，應(yīng)用醫(yī)藥等級(jí)的設(shè)備制備。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，采用上述方法制備的富含生長(zhǎng)因子和免疫球旦白制劑，包括液體狀態(tài)濃縮物或干粉均可以用于多種胃腸道疾病的治療，這些胃腸道疾病包括但不限于腹瀉、食物中毒、嬰兒腹瀉、旅行者腹瀉、與艾滋病或其他免疫缺陷疾病相關(guān)的腹瀉、胃腸道潰瘍、慢性胃炎、空腸炎、小腸結(jié)腸炎、耶爾森氏菌感染等多種與細(xì)菌或病毒有關(guān)的胃腸道疾病。
本發(fā)明的有益效果是，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的制劑不僅含有大量的免疫球旦白，而且還含有大量生長(zhǎng)因子，在殺滅局部細(xì)菌及病毒的同時(shí)，能夠幫助修復(fù)局部組織。
實(shí)施例2收集牛初乳，離心脫脂，用雙倍量蒸鎦水稀釋，用2N HCL調(diào)PH至4.8，得到上清液，于38℃加熱40分鐘，然后于4℃靜置貯存過夜，上清液通過尼龍布濾器去除沉淀的酪旦白粗顆粒，用分子量6000的超微濾膜在板框式超濾裝置內(nèi)濃縮至原體積30％，用噴霧干燥法噴霧干燥，噴霧干燥時(shí)入口溫度160°F，出口溫度130°F，結(jié)果得到含有80％純度的免疫球旦白干粉，噴霧干燥前制劑的生物活性與噴霧干燥后制劑的生物活性一致。
實(shí)施例3收集分娩后10小時(shí)牛初乳，以3000轉(zhuǎn)/分速度離心分離脂肪，用1N HCL調(diào)節(jié)PH至4.7(每升初乳中加入約54m11N HCL)，同時(shí)加熱42℃持續(xù)35分鐘，用5000轉(zhuǎn)/分速度離心沉淀凝固的酪旦白，收集上清液，用2倍量的生理鹽水稀釋，稀釋后的上清液用中空纖維柱初濾，中空纖維平均孔徑0.4μm，表面積3m2，纖維直徑1.2mm，使用壓力超過大氣0.2-0.6巴。收集過濾液，用6倍量的生理鹽水稀釋再通過由三個(gè)中空纖維柱組成的系統(tǒng)進(jìn)行第二次過濾，每個(gè)柱的分離極限為60,000D，表面積為1.4m2，濃縮到第一次過濾前初始容量2倍。經(jīng)過測(cè)定，所得到的濃縮液中旦白質(zhì)含量為6％，用已知方法進(jìn)行過濾消毒，或采用巴氏消毒法。
實(shí)施例4按實(shí)施例3方法制備濃縮液，加入醫(yī)用等級(jí)聚二醇加熱溶液內(nèi)，混合攪拌，倒入預(yù)置栓劑模型，室溫冷卻后制備栓劑，可以應(yīng)用于婦女宮頸或陰道各類感染。
實(shí)施例5按實(shí)施例3方法制備濃縮液，與醫(yī)用等級(jí)氣溶膠溶液混合攪拌，加壓灌裝入氣瓶?jī)?nèi)，制備氣霧劑，可用于口腔、咽喉、上呼吸道感染性疾病的治療，還可以用來防治感冒和上呼吸道感染。
實(shí)施例6按實(shí)施例1方法制備的干粉，制備200m15％旦白質(zhì)無菌溶液，該溶液由15g干粉加入100ml蒸鎦水?dāng)嚢杈鶆蚺涑桑浣M成如下總旦白質(zhì)4.2g/100ml，IgG 3.0g/100ml，IgA0.35g/100ml，IgM 0.96g/100ml。
實(shí)施例7應(yīng)用含毒素的金黃色葡萄球菌上清液進(jìn)行毒素中和試驗(yàn)，采用實(shí)施例1制備的制劑與人免疫球旦白制劑相比較，對(duì)于50％溶血(毒素中和作用)所需的人免疫球旦白用量，是本發(fā)明制劑用量的三倍。
實(shí)施例8用實(shí)施例1制劑與含革蘭氏陰性細(xì)菌(綠濃桿菌)的毒素上清液進(jìn)行毒素中和試驗(yàn)，本發(fā)明方法制備的免疫球旦白在很低濃度可產(chǎn)生100％的毒素中和作用。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種從牛初乳中制備高生物活性生長(zhǎng)因子和免疫球旦白的方法以及該制劑的應(yīng)用，其特征是，收集牛分娩后72小時(shí)內(nèi)初乳，采用離心脫脂，用酸劑調(diào)節(jié)PH至酸性狀態(tài)，同時(shí)，加熱凝固酪旦白，用離心方式或?yàn)V布過濾方式去除酪旦白后稀釋，收集上清液，采用低分子量超微濾膜濃縮，根據(jù)劑型的不同用途分別制備液體濃縮制劑或干粉制劑、噴霧制劑，藥物栓劑，皮膚貼劑等不同劑型。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案也可以通過下列途徑實(shí)現(xiàn)，收集的牛初乳用離心方式脫脂，脫脂牛初乳用蒸鎦水稀釋，稀釋后脫脂初乳內(nèi)加酸制劑調(diào)整PH，同時(shí)加熱，使酪旦白凝固后離心沉淀去除酪旦白，或靜置過夜后用濾布過濾去除酪旦白，收集上清液后用低分子量超微濾膜濃縮后制備上述各種劑型。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，收集牛初乳，采用離心方式去除脂肪，離心速度為2000～4000轉(zhuǎn)/分，優(yōu)選3000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間15～30分鐘，優(yōu)選20分鐘，采用冷凍離心設(shè)備在冷凍狀態(tài)下離心，離心后去除表面的脂肪，加入酸劑，例如2N HCL或其他酸性制劑，調(diào)整濃縮物PH至弱酸性，PH3.8～5.2，優(yōu)選4.5～4.8，調(diào)整濃縮物PH值后，加熱析出酪旦白，加熱溫度40℃～55℃，最好45℃～50℃，加熱時(shí)間15分鐘～90分鐘，最好30～45分鐘，最好是加熱至看到乳水明顯分離，然后用離心機(jī)離心沉淀析出的酪旦白，離心速度3000～6000轉(zhuǎn)/分，優(yōu)選5000轉(zhuǎn)/分，收集離心上清液。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，本發(fā)明的技術(shù)解決方案也可以從下列途徑實(shí)現(xiàn)，脫脂牛初乳用1倍～5倍蒸鎦水稀釋，優(yōu)選2倍～3倍，調(diào)節(jié)PH值至4.6～4.9，優(yōu)選4.7～4.8，與此同時(shí)加熱30℃～40℃，持續(xù)15～45分鐘，然后于4℃貯存過夜，用尼龍濾布或其他濾布，或用離心方式去除沉淀的酪旦白，上清液用分子量為4000～6000的超濾膜濃縮，并冷凍干燥制粉。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，本發(fā)明上述制備方法中最后工藝中液體濃縮物的干燥方法，既可以采用上述的冷凍干燥方法，也可以采用噴霧干燥方法，這兩種干燥方法都不會(huì)影響免疫球旦白的生物活性，但是噴霧干燥的方法，可能會(huì)影響制劑中生長(zhǎng)因子或其他活性多肽的生物活性，因此，如希望同時(shí)保存制劑中生長(zhǎng)因子和免疫球旦白生物活性時(shí)，應(yīng)采用冷凍干燥方法，如果希望降低成本，又無需保存生長(zhǎng)因子類多肽的活性時(shí)應(yīng)選擇噴霧干燥方法。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，采用上述方法制備的富含生長(zhǎng)因子和免疫球旦白的制劑，也可以直接以液體濃縮物的形式應(yīng)用，例如制備成口服濃縮液方式應(yīng)用于治療胃腸道疾病，制備成滴液形式用于眼睛、口腔、耳朵的感染性疾病的治療。也可以制備成栓劑用于腸道感染性疾病的治療。制備成膜型劑用于皮膚外傷及皮膚感染性疾病的治療。制備成噴霧劑形式用于呼吸道感染性疾病的治療，也可以加入噴霧霧化的貯藥裝置內(nèi)，采用超聲噴霧霧化的方式治療呼吸道、口腔、咽喉的感染性疾病。上述制劑的制備采用本領(lǐng)域技術(shù)人員都能理解，并熟練掌握的成熟劑型制造技術(shù)，加入各種醫(yī)藥等級(jí)的輔料，應(yīng)用醫(yī)藥等級(jí)的設(shè)備制備。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，采用上述方法制備的富含生長(zhǎng)因子和免疫球旦白制劑，包括液體狀態(tài)濃縮物或干粉均可以用于多種胃腸道疾病的治療，這些胃腸道疾病包括但不限于腹瀉、食物中毒、嬰兒腹瀉、旅行者腹瀉、與艾滋病或其他免疫缺陷疾病相關(guān)的腹瀉、胃腸道潰瘍、慢性胃炎、空腸炎、小腸結(jié)腸炎、耶爾森氏菌感染等多種與細(xì)菌或病毒有關(guān)的胃腸道疾病。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法中，本發(fā)明制劑還可以制備成注射劑，用于動(dòng)物感染性疾病的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從牛初乳中制備高生物活性生長(zhǎng)因子和免疫球蛋白的方法以及該制劑的應(yīng)用，其特征是，收集牛分娩后72小時(shí)內(nèi)初乳，采用離心脫脂，用酸劑調(diào)節(jié)pH至酸性狀態(tài)，同時(shí)，加熱凝固酪蛋白，用離心方式或?yàn)V布過濾方式去除酪蛋白后稀釋，收集上清液，采用低分子量超微濾膜濃縮，根據(jù)劑型的不同用途分別制備液體濃縮制劑或干粉制劑、噴霧制劑，藥物栓劑，皮膚貼劑等不同劑型，可廣泛應(yīng)用于各類細(xì)菌和病毒相關(guān)的感染性疾病治療中。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1557340SQ20041001585
公開日2004年12月29日 申請(qǐng)日期2004年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月15日
發(fā)明者高春平 申請(qǐng)人:高春平