專利名稱：能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的rna適配子及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬微生物感染免疫和檢驗領域。涉及利用分子生物學技術SELEX技術設計和制備一種能與感染人的傷寒桿菌(Salmonella Typhi)特有的病原性毒力島上IVB型纖毛結構蛋白高親和的RNA適配子(Aptamer)。
背景技術：
近2300種相關的沙門氏菌中，傷寒桿菌是最重要的致病菌，而且是唯一只對人致病并導致傷寒腸熱癥的細菌。傷寒桿菌可通過污染的食物和水而流行和傳染。每年全世界感染傷寒桿菌的人數達16.6億，我國傷寒也長期流行。最近我國將傷寒桿菌對人感染劃定為10種法定的傳染病之一。大多數沙門氏菌只引起腸炎，但傷寒桿菌可侵入人體血管導致高燒及更嚴重的腸熱癥和敗血癥，是臨床治療中頗為棘手的問題。遺憾的是至今為止全世界還沒有完善的傷寒疫苗；而近十幾年來，傷寒桿菌出現對多種抗菌素耐藥(如抗氯霉素抗性等)的趨勢，這也成為非常嚴重的問題。
我們近年克隆和發(fā)現傷寒桿菌IVB型纖毛操縱子，該操縱子含有11個基因，其中pilS基因是負責編碼傷寒桿菌IVB型纖毛的結構蛋白PilS，并已構建好了高水平表達谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白(GST-PilS融合蛋白)的重組質粒菌株，見參考文獻Zhang X-L，Tsui I.S.M.，Yip C.M.C.，FungA.W.Y.，Wong D.K.-H.，Dai X-Y，Yang Y-H，Hackett J，and Morris C.，Salmonella enterica serovar typhi uses type IVB pili to enter humanintestinal epithelial cells.Infect Immun 2000；Vol.68.No.6.3067-3073。該文獻還介紹了谷胱甘肽硫轉移酶-瓊脂糖4B(GST-Sepharose 4B)和谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白-瓊脂糖4B(GST-PilS-Sepharose4B)。傷寒桿菌IVB型纖毛缺失突變株(Typhi J341pilS-)侵入人小腸細胞只有表達IVB型纖毛的傷寒桿菌(Serovar Typhi A21-6)侵入小腸細胞的5％-25％，加入可溶性的PilS蛋白可抑制傷寒桿菌對細胞的侵入。此外，PilS蛋白介導了傷寒桿菌之間的聚集，這種聚集可能與它的致病性毒性關系密切。種種證據均表明，IVB型纖毛尤其是PilS結構蛋白和傷寒桿菌對人體細胞的侵入性密切相關。
SELEX技術(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment系統(tǒng)進化指數富集技術)是20世紀90年代初研制的一種新的組合化學技術，它運用大容量的隨機寡核苷酸文庫，并結合體外PCR擴增技術，以指數富集與靶分子特異結合的寡核苷酸，經過多輪篩選，獲得高親和力、特異性強的寡核苷酸適配子(aptamers)，具有庫容量大、靶分子范圍廣、親和力高等優(yōu)點，已成功運用于許多靶分子的篩選，包括金屬離子、有機染料、蛋白質、藥物、氨基酸以及各種細胞因子等。這種方法具有簡便、快速、經濟等特點，與其他組合化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適配子具有更高的親和性和特異性，具有良好的應用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是，提供一種能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子，該RNA適配子為預防和治療傷寒桿菌腸熱癥提供了新型的拮抗劑，為克服臨床上傷寒治療出現的日益嚴重的耐藥問題，提供了新的解決途徑。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞RNA適配子的方法，該方法通過制備和純化IVB型纖毛結構融合蛋白-瓊脂糖4B、隨機單鏈DNA文庫和引物的構建、合成雙鏈DNA文庫、PCR擴增、RNA文庫制備、SELEX篩選、熒光定量PCR選取，得到能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子，并檢測其效果。
為了實現上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案一種能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子，該RNA適配子的RNA序列為5’-GGGAACAGUCCGAGCCUCACUGUUAUCCGAUAGCAGCGCGGGAUGAGGGUCAAUGCGUCAUAGGA-3’。
一種能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子的制備方法按下列步驟順序進行1、制備和純化谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白-瓊脂糖4B復合體(GST-PilS-Sepharose 4B)。將谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白重組質粒菌株(見參考文獻Zhang X-L，Tsui I.S.M.，Yip C.M.C.，Fung A.W.Y.，Wong D.K.-H.，Dai X-Y，Yang Y-H，Hackett J，and Morris C.，Salmonella enterica serovar typhi uses type IVB pili to enter humanintestinal epithelial cells.Infect Immun 2000；Vol.68.No.6.3067-3073。)接種于濃度為50μg/ml的氨芐抗菌素的2×TY液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至600nm吸光度值為1～2，加入異丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)使其濃度為0.1mmol/L誘導，30℃振蕩培養(yǎng)4～6小時，濃縮菌株，超聲破碎，加入三硝基甲苯-100(TritonX-100)使其濃度為1％，輕混30～40分鐘，5000轉/分鐘離心5分鐘，取上清，加入谷胱甘肽瓊脂糖4B(Gluthathion-Sepharose 4B)，室溫混合20～30分鐘，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2～4次，即得到純化的谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白-瓊脂糖4B復合體(GST-PilS-Sepharose 4B)。
上述2×TY液體培養(yǎng)基為1升水中溶解蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaCl5g。
2、構建隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫和引物。構建長度為88個堿基的單鏈DNA(ssDNA)文庫5’-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3’，其中N代表堿基A，G，T，C中的任意一個，該文庫的容量約為1014～1015；構建上游引物5’-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3’，其中畫線部分為T7啟動子的序列，該引物含有DNA限制性內切酶EcoRI的酶切位點；構建下游引物5’GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3’，該引物中含有DNA限制性內切酶BamHI的酶切位點。隨機單鏈DNA文庫和引物可由引物合成公司合成。
3、單鏈DNA文庫合成雙鏈DNA文庫。將單鏈DNA文庫0.1μg、下游引物0.3nmol、由立陶宛MBI公司生產的10倍的大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(KlenowFragment)反應緩沖液5μl、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段5個活性單位和1nmol脫氧核糖核酸(dNTP)加入雙蒸水中，使總體積為50μl；然后放入PCR儀中，55℃反應10分鐘，37℃15反應分鐘，70℃10分鐘滅活Klenow Fragment，得到雙鏈DNA文庫。
4、雙鏈DNA文庫的PCR擴增。將步驟3中的雙鏈DNA文庫10μl、上游引物0.1nmol、下游引物0.1nmol、25mmol/L MgCl210μl、2mmol/LdNTP10μl，由立陶宛MBI公司生產的10倍DNA聚合酶反應緩沖液10μl和DNA聚合酶2.5個活性單位，加入雙蒸水中，使總體積為100μl；然后放入PCR儀中，先進行94℃反應2分鐘預變性，按以下條件循環(huán)8次94℃反應30秒、60℃反應1分鐘、72℃反應2分鐘，再72℃反應3分鐘，便得到雙鏈DNA文庫PCR擴增的產物。
5、PCR擴增產物的純化。用含0.5μg/ml溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠，對步驟4中PCR擴增產物進行電泳，然后將其放在260nm熒光透視板上，把呈橘紅色條帶的PCR擴增產物切下，用德國Qiagen公司提供的DNA純化回收試劑盒純化；6、RNA文庫的制備。將α-P32(P的同位素)標記的尿嘧啶(UTP)50μCi(微居)或UTP 0.5mmol/L、2μg～5μg雙鏈DNA文庫、T7RNA聚合酶(美國Promega公司提供)40個活性單位、5倍T7RNA聚合酶反應緩沖液(美國Promega公司提供)20μl、100mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)10μl，100mmol/L核糖核酸ATP、GTP、UTP和CTP各0.5μl加入雙蒸水中，使總體積為100μl；將其放入PCR儀中，在37℃條件下反應2小時，得到RNA文庫。
7、RNA文庫的純化。將步驟6獲得的RNA隨機文庫加入5個活性單位的無RNA酶的DNA酶(美國Promega公司提供)，將其放入PCR儀中，在37℃條件下反應15分鐘，然后用美國Qbiogene公司提供的RNA純化回收試劑盒純化。
8、SELEX篩選。取0.2mg的谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白-瓊脂糖4B(GST-PilS-Sepharose 4B)，每次用1ml的SELEX篩選緩沖液洗滌3～5次。將步驟7的純化RNA文庫200-500pmol加入到50μl的SELEX篩選緩沖液中，再加入到GST-PilS-Sepharose 4B中，室溫下輕輕振動15～20分鐘，用5000轉/分鐘離心5分鐘，去上清，以棄去未與GST-PilS-Sepharose 4B結合的RNA，用3～6ml的SELEX篩選緩沖液洗滌3～6次，然后加入SELEX篩選洗脫液100μl，4℃靜置1小時，用5000轉/分鐘離心5分鐘，取上清，然后用美國Qbiogene公司提供的RNA純化回收試劑盒純化，得到純化的RNA。
上述SELEX篩選緩沖液為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液(Tris-Cl)，50mmol/LKCl，200mmol/LNaCl，0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5％甘油(Glycerol)，0.5mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)。
上述SELEX篩選洗脫液為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液(Tris-Cl)，50mmol/LKCl，1mol/L NaCl，0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5％甘油(Glycerol)，0.5mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)。
9、RNA逆轉錄PCR擴增(RT-PCR)。將上游引物0.1nmol、下游引物0.1nmol、10mmol/L MgSO42μl、10mmol/L dNTP2μl、由美國Promega公司提供的5倍RT-PCR反應緩沖液10μl、DNA聚合酶2個活性單位、逆轉錄酶2個活性單位和步驟8中純化的RNA 25μl加入到雙蒸水中，使總體積為50μl，將其放入PCR儀中，48℃反應45分鐘，94℃反應2分鐘預變性，然后按下列條件循環(huán)20次94℃反應30秒、60℃反應1分鐘、72℃反應2分鐘，再72℃反應3分鐘，得到RT-PCR擴增產物。
10、重復步驟5～9，并將步驟5中的“步驟4中的PCR擴增產物”用步驟9得到的RT-PCR擴增產物替代，得到RT-PCR擴增產物；11、將步驟5～9重復6輪，把步驟5中的“步驟4中的PCR擴增產物”用每次新得到的RT-PCR擴增產物替代，并將其中的步驟8改為將步驟7得到的RNA文庫溶于50μl的SELEX篩選緩沖液，將其加入到0.5mg的谷胱甘肽硫轉移酶-瓊脂糖4B中，室溫下輕輕振動15分鐘，以吸附與谷胱甘肽硫轉移酶-瓊脂糖4B結合的RNA，離心，取上清，再將上清加入到0.2mg的谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白-瓊脂糖4B中，室溫下輕輕振動15～20分鐘，離心，去上清，用SELEX篩選緩沖液洗滌3～6次，再加入SELEX篩選洗脫液100μl，4℃靜置1小時，離心，取上清，用RNA純化回收試劑盒純化，得到純化的RNA；12、重復步驟5～7，將步驟5中的“步驟4中的PCR擴增產物”用步驟11最后一輪得到的RT-PCR擴增產物替代，得到可與傷寒桿菌IVB纖毛結構蛋白高度親和的RNA適配子庫；13、將步驟11最后一輪得到的RT-PCR擴增產物，經DNA限制性內切酶EcoRI和BamHI消化，連于質粒pUC19上，轉化到大腸桿菌DH5α，氨芐抗性篩選，挑取單個生長菌落進行測序；14、將各單個生長菌落所對應的RNA適配子3μg分別加入含有3.0×106個野生型傷寒桿菌的50μl菌液中，15～20℃靜置15分鐘后，將處理過的傷寒桿菌加入到500μl含有2.5×105個人白血病單核細胞(THP-1)的1640細胞培養(yǎng)液中，在5％二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃反應2小時，隨后加入1mlPBS，2000轉/分鐘離心10分鐘，去上清，如此洗滌3～5次，洗滌后加入慶大霉素使其濃度為100μg/ml，在5％二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃反應1小時，再用PBS洗滌3～5次后，加入500μl的細胞裂解液，在55℃的烤箱內裂解細胞1小時，然后迅速放于94℃的烤箱內反應10分鐘，隨后在其中加入酚、氯仿抽提液1ml，上下顛倒振蕩5分鐘使液體充分混合，然后12000轉/分鐘離心5分鐘，取400μl上層水相，在該水相中加入0.8ml乙醇，再將其靜置于-80℃冰箱中12小時沉淀DNA，最后20000轉/分鐘離心15分鐘，去上清，15～20℃自然風干殘余水分后，加入15～20μl雙蒸水溶解沉淀的DNA，取34.4ngDNA作為模板，用熒光定量PCR試劑盒(QuantiTectTMSYBR Green PCR kit由德國Qiagen公司提供)進行定量PCR反應，擴增所用的上游引物為5’GCTTCTATAACTAGCAACGT 3’；下游引物為5’CTTCTGGCAAGATATTCTGA 3’，反應條件為95℃，15分鐘預變性，然后按下列條件循環(huán)40次95℃反應45秒、50℃反應45秒、72℃反應30秒，再進行72℃反應3分鐘，在進行反應的同時，運用定量PCR儀檢測細胞內傷寒桿菌基因組DNA的含量，選取細胞內傷寒桿菌基因組DNA含量較少的一組，該組即為能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子。
本發(fā)明的優(yōu)點是能特異性的結合在傷寒桿菌致病過程中發(fā)揮關鍵作用的IVB型纖毛上，可顯著抑制傷寒桿菌侵入人體細胞，RNA適配子可直接作為傷寒桿菌的拮抗劑使用，可預防和治療傷寒桿菌腸熱癥。因為采用了新的組合化學技術-SELEX技術進行傷寒桿菌IVB纖毛結構蛋白的RNA適配子的篩選，確保了獲得的RNA適配子可特異性結合在傷寒桿菌IVB型纖毛上，從而封閉了傷寒桿菌的致病位點，使其不能進入人體細胞。
其二，為克服臨床上傷寒治療出現的日益嚴重的耐藥問題，提供了新的解決途徑。目前治療傷寒感染多采用廣譜抗菌素，如氯霉素(chloramphenicol)，氨芐青霉素(ampicillin)，和三甲氧芐氨嘧啶(黃胺增效劑)/黃胺甲異惡唑(trimethoprim/sulfamethoxazole)，這些藥物不僅殺傷傷寒桿菌也殺傷寄生在人體內的多種有益菌群，同時傷寒桿菌的對這些藥物產生的耐藥問題也日益嚴重。本發(fā)明制備的RNA適配子為小分子核酸，其分子結構不同與任何廣譜抗生素，因而無耐藥性之憂；同時RNA適配子只針對傷寒桿菌發(fā)揮作用，對人體內的多種有益菌群并無危害。RNA適配子也別于傳統(tǒng)的蛋白質抗體，其分子量小，可快速滲入細胞，無抗原性，不引起副作用。
其三，由下表可知，用RNA適配子處理野生型傷寒桿菌Serovar Typhi J341后，傷寒桿菌侵入人白血病單核細胞(THP-1)的數目明顯減少，用熒光定量PCR檢測細胞內的傷寒桿菌DNA含量由未加RNA適配子時的0.000163ng/μl下降到0.000024ng/μl，抑制率為85.28％，說明本發(fā)明的適配子能有效地抑制傷寒桿菌侵入人體細胞，可以直接作為傷寒桿菌的拮抗劑使用。此外，該RNA適配子已克隆到DNA質粒上，并且該質粒已轉化到大腸桿菌DH5α中，可直接用該菌株進行大規(guī)模生產制備。

具體實施例方式一種能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子，該RNA適配子的RNA序列為5’-GGGAACAGUCCGAGCCUCACUGUUAUCCGAUAGCAGCGCGGGAUGAGGGUCAAUGCGUCAUAGGA-3’。
一種能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子的制備方法按下列步驟順序進行1、制備和純化谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白-瓊脂糖4B復合體(GST-PilS-Sepharose 4B)。將谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白重組質粒菌株接種于濃度為50μg/ml的氨芐抗菌素的2×TY液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至600nm吸光度值為1～2，加入異丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)使其濃度為0.1mmol/L誘導，30℃振蕩培養(yǎng)4小時，濃縮菌株，超聲破碎，加入三硝基甲苯-100(TritonX-100)使其濃度為1％，輕混30分鐘，5000轉/分鐘離心5分鐘，取上清，加入谷胱甘肽瓊脂糖4B(Gluthathion-Sepharose4B)，室溫混合30分鐘，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，即得到純化的谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白-瓊脂糖4B復合體(GST-PilS-Sepharose 4B)。
上述2×TY液體培養(yǎng)基為1升水中溶解蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaCl 5g。
2、構建隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫和引物。構建長度為88個堿基的單鏈DNA(ssDNA)文庫5’-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3’，其中N代表堿基A，G，T，C中的任意一個，該文庫的容量約為1014～1015；構建上游引物5’-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3’，其中畫線部分為T7啟動子的序列，該引物含有DNA限制性內切酶EcoRI的酶切位點；構建下游引物5’-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3’，該引物中含有DNA限制性內切酶BamHI的酶切位點。隨機單鏈DNA文庫和引物可由引物合成公司合成。
3、單鏈DNA文庫合成雙鏈DNA文庫。將單鏈DNA文庫0.1μg、下游引物0.3nmol、由立陶宛MBI公司生產的10倍的大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(KlenowFragment)反應緩沖液5μl、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段5個活性單位和1n mol脫氧核糖核酸(dNTP)加入雙蒸水中，使總體積為50μl；然后放入PCR儀中，55℃反應10分鐘，37℃15反應分鐘，70℃10分鐘滅活Klenow Fragment，得到雙鏈DNA文庫。
4、雙鏈DNA文庫的PCR擴增。將步驟3中的雙鏈DNA文庫10μl、上游引物0.1nmol、下游引物0.1nmol、25mmol/L MgCl210μl、2mmol/L dNTP10μl，由立陶宛MBI公司生產的10倍DNA聚合酶反應緩沖液10μl和DNA聚合酶2.5個活性單位，加入雙蒸水中，使總體積為100μl；然后放入PCR儀中，先進行94℃反應2分鐘預變性，按以下條件循環(huán)8次94℃反應30秒、60℃反應1分鐘、72℃反應2分鐘，再72℃反應3分鐘，便得到雙鏈DNA文庫PCR擴增的產物；5、PCR擴增產物的純化。用含有濃度為0.5μg/ml溴化乙錠的2％的瓊脂糖凝膠，將步驟4中的雙鏈DNA文庫PCR擴增的產物進行電泳，電泳后將2％的瓊脂糖凝膠放在260nm熒光透視板上，將凝膠中呈橘紅色條帶的雙鏈DNA文庫PCR擴增產物切下，用德國Qiagen公司提供的DNA純化回收試劑盒純化。
6、RNA文庫的制備。將α-P32(P的同位素)標記的尿嘧啶(UTP)50μCi(微居)或UTP 0.5mmol/L、2μg～5μg雙鏈DNA文庫、T7RNA聚合酶(美國Promega公司提供)40個活性單位、5倍T7RNA聚合酶反應緩沖液(美國Promega公司提供)20μl、100mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)10μl，100mmol/L核糖核酸ATP、GTP、UTP和CTP各0.5μl加入雙蒸水中，使總體積為100μl；將其放入PCR儀中，在37℃條件下反應2小時，得到RNA隨機文庫。
7、RNA隨機文庫的純化。將步驟6獲得的RNA隨機文庫加入5個活性單位的無RNA酶的DNA酶，將其放入PCR儀中，在37℃條件下反應15分鐘，然后用德國Qbiogene公司提供的RNA純化回收試劑盒純化。
8、SELEX篩選。取0.2mg的GST-PilS-Sepharose 4B，每次用1ml的SELEX篩選緩沖液洗滌3～5次。將步驟7的純化RNA文庫200-500 pmol加入到50μl的SELEX篩選緩沖液中，再加入到GST-PilS-Sepharose 4B中，室溫下輕輕振動15分鐘，用5000轉/分鐘離心5分鐘，去上清，以棄去未與GST-PilS-Sepharose4B結合的RNA，用3～6ml的SELEX篩選緩沖液洗滌3～6次，然后加入SELEX篩選洗脫液100μl，4℃靜置1小時，用5000轉/分鐘離心5分鐘，取上清，然后用美國Qbiogene公司提供的RNA純化回收試劑盒純化，得到純化的RNA。
上述SELEX篩選緩沖液為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液(Tris-Cl)，50mmol/L KCl，200mmol/L NaCl，0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5％甘油(Glycerol)，0.5mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)。
上述SELEX篩選洗脫液為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液(Tris-Cl)，50mmol/LKCl，1mol/L NaCl，0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5％甘油(Glycerol)，0.5mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)。
9、RNA逆轉錄PCR擴增(RT-PCR)。將上游引物0.1nmol、下游引物0.1nmol、10mmol/L MgSO42μl、10mmol/L dNTP2μl、由美國Promega公司提供的5倍RT-PCR反應緩沖液10μl、DNA聚合酶2個活性單位、逆轉錄酶2個活性單位和步驟8中純化的RNA 25μl加入到雙蒸水中，使總體積為50μl，將其放入PCR儀中，48℃反應45分鐘，94℃反應2分鐘預變性，然后按下列條件循環(huán)20次94℃反應30秒、60℃反應1分鐘、72℃反應2分鐘，再72℃反應3分鐘，得到RT-PCR擴增產物；10、重復步驟5～9，并將步驟5中的“步驟4中的PCR擴增產物”用步驟9得到的RT-PCR擴增產物替代，得到RT-PCR擴增產物；11、將步驟5～9重復6輪，把步驟5中的“步驟4中的PCR擴增產物”用每次新得到的RT-PCR擴增產物替代，并將其中的步驟8改為將步驟7得到的RNA文庫溶于50μl的SELEX篩選緩沖液，將其加入到0.5mg的谷胱甘肽硫轉移酶-瓊脂糖4B中，室溫下輕輕振動15分鐘，以吸附與谷胱甘肽硫轉移酶-瓊脂糖4B結合的RNA，離心，取上清，再將上清加入到0.2mg的谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白-瓊脂糖4B中，室溫下輕輕振動15～20分鐘，離心，去上清，用SELEX篩選緩沖液洗滌3～6次，再加入SELEX篩選洗脫液100μl，4℃靜置1小時，離心，取上清，用RNA純化回收試劑盒純化，得到純化的RNA；12、重復步驟5～7，將步驟5中的“步驟4中的PCR擴增產物”用步驟11最后一輪得到的RT-PCR擴增產物替代，得到可與傷寒桿菌IVB纖毛結構蛋白高度親和的RNA適配子庫；13、將步驟11最后一輪得到的RT-PCR擴增產物，經DNA限制性內切酶EcoRI和BamHI消化，連于質粒pUC19上，轉化到大腸桿菌DH5α，氨芐抗性篩選，挑取單個生長菌落進行測序；14、將各單個生長菌落所對應的RNA適配子3μg分別加入含有3.0×106個野生型傷寒桿菌的50μl菌液中，15～20℃靜置15分鐘后，將處理過的傷寒桿菌加入到500μl含有2.5×105個人白血病單核細胞(THP-1)的1640細胞培養(yǎng)液中，在5％二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃反應2小時，隨后加入1mlPBS，2000轉/分鐘離心10分鐘，去上清，如此洗滌3～5次，洗滌后加入慶大霉素使其濃度為100μg/ml，在5％二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃反應1小時，再用PBS洗滌3～5次后，加入500μl的細胞裂解液，在55℃的烤箱內裂解細胞1小時，然后迅速放于94℃的烤箱內反應10分鐘，隨后在其中加入酚、氯仿抽提液1ml，上下顛倒振蕩5分鐘使液體充分混合，然后12000轉/分鐘離心5分鐘，取400μl上層水相，在該水相中加入0.8ml乙醇，再將其靜置于-80℃冰箱中12小時沉淀DNA，最后20000轉/分鐘離心15分鐘，去上清，15～20℃自然風干殘余水分后，加入15～20μl雙蒸水溶解沉淀的DNA，取34.4ngDNA作為模板，用熒光定量PCR試劑盒(QuantiTectTMSYBR Green PCR kit由德國Qiagen公司提供)進行定量PCR反應，擴增所用的上游引物為5’GCTTCTATAACTAGCAACGT 3’；下游引物為5’CTTCTGGCAAGATATTCTGA 3’，反應條件為95℃，15分鐘預變性，然后按下列條件循環(huán)40次95℃反應45秒、50℃反應45秒、72℃反應30秒，再進行72℃反應3分鐘，在進行反應的同時，運用定量PCR儀檢測細胞內傷寒桿菌基因組DNA的含量，選取細胞內傷寒桿菌基因組DNA含量較少的一組，該組即為能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子。
上述細胞裂解液為25ml雙蒸水中加入250μl的1mol/LTris-Cl，500μl的0.5mol/LEDTA，2.5ml的10％硫酸十二烷酸鈉(SDS)，1ml的1mol/LDTT，0.25ml的20g/L蛋白酶K。
上述酚、氯仿抽提液為將25ml的酚，24ml的氯仿，1ml異戊醇混合。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學<120>能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子及其制備方法<130>能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子及其制備方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>65<212>RNA<213>Salmonella typhi<400>1gggaacaguc cgagccucac uguuauccga uagcagcgcg ggaugagggu caaugcguca60uagga6權利要求
1.一種能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子，其特征在于，該RNA適配子的RNA序列為5’-GGGAACAGUCCGAGCCUCACUGUUAUCCGAUAGCAGCGCGGGAUGAGGGUCAAUGCGUCAUAGGA-3’。
2.制備權利要求1所述的能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子的方法，其特征在于，該方法按下列步驟順序進行a、將谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白重組質粒菌株接種于含氨芐抗菌素的2×TY液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至600nm吸光度值為1～2，加入異丙基硫代β-D半乳糖苷，30℃振蕩培養(yǎng)4～6小時，濃縮菌株，超聲破碎，加入三硝基甲苯-100輕混30～40分鐘，離心、取上清，加入谷胱甘肽瓊脂糖4B，室溫混合20～30分鐘，用磷酸鹽緩沖液洗滌2～4次，即得到純化的谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白-瓊脂糖4B復合體；b、構建單鏈DNA文庫5’-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3’，構建上游引物5’-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3’，構建下游引物5’-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3’；c、將單鏈DNA文庫0.1μg、下游引物0.3nmol、10倍大腸桿菌DNA聚合酶I大片段反應緩沖液5μl、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段5個活性單位和1nmol脫氧核糖核酸加入雙蒸水中，使總體積為50μl；然后放入PCR儀中，55℃反應10分鐘，37℃15反應分鐘，70℃反應10分鐘滅活，得到雙鏈DNA文庫；d、將步驟c中的雙鏈DNA文庫10μl、上游引物0.1nmol、下游引物0.1nmol、25mmol/LMgCl210μl、2mmol/L dNTP10μl，10倍DNA聚合酶反應緩沖液10μl和DNA聚合酶2.5個活性單位，加入雙蒸水中，使總體積為100μl；然后放入PCR儀中，先進行94℃反應2分鐘預變性，按以下條件循環(huán)8次94℃反應30秒、60℃反應1分鐘、72℃反應2分鐘，再72℃反應3分鐘，便得到雙鏈DNA文庫PCR擴增產物；e、將步驟d中的PCR擴增產物用含0.5μg/ml溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠進行電泳，然后將其放在260nm熒光透視板上，把呈橘紅色條帶的PCR擴增產物切下，用DNA純化回收試劑盒純化，；f、將α-P32標記的尿嘧啶50微居或尿嘧啶0.5mmol/L、2μg～5μg雙鏈DNA文庫、T7RNA聚合酶40個活性單位、5倍T7RNA聚合酶反應緩沖液20μl、100mmol/L二硫蘇糖醇10μl，100mmol/L核糖核酸ATP、GTP、UTP和CTP各0.5μl加入雙蒸水中，使總體積為100μl；然后放入PCR儀中，在37℃條件下反應2小時，得到RNA文庫；g、將步驟f得到的RNA文庫加入5個活性單位的無RNA酶的DNA酶，將其放入PCR儀中，在37℃條件下反應15分鐘，然后用RNA純化回收試劑盒純化，得到純化的RNA文庫；h、取0.2mg的谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白-瓊脂糖4B，用SELEX篩選緩沖液洗滌3～5次，將步驟g純化的RNA文庫200-500pmol加入到50μl的SELEX篩選緩沖液中，然后加入到谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白-瓊脂糖4B中，室溫下輕輕振動15～20分鐘，離心，去上清，用SELEX篩選緩沖液洗滌3～6次，再加入SELEX篩選洗脫液100μl，4℃靜置1小時，離心，取上清，用RNA純化回收試劑盒純化，得到純化的RNA；i、將上游引物0.1nmol、下游引物0.1nmol、10mmol/L MgSO42μl、10mmol/LdNTP2μl、5倍RT-PCR反應緩沖液10μl、DNA聚合酶2個活性單位、逆轉錄酶2個活性單位和步驟h中純化的RNA 25μl加入到雙蒸水中，使總體積為50μl，將其放入PCR儀中，48℃反應45分鐘，94℃反應2分鐘預變性，然后按下列條件循環(huán)20次94℃反應30秒、60℃反應1分鐘、72℃反應2分鐘，再72℃反應3分鐘，得到RT-PCR擴增產物；j、重復步驟e～i，并將步驟e中的“步驟d中的PCR擴增產物”用步驟i得到的RT-PCR擴增產物替代，得到RT-PCR擴增產物；k、重復步驟e～i6輪，將步驟e中的“步驟d中的PCR擴增產物”用每次新得到的RT-PCR擴增產物替代，并將其中的步驟h改為將步驟g得到的RNA文庫溶于50μl的SELEX篩選緩沖液，將其加入到0.5mg的谷胱甘肽硫轉移酶-瓊脂糖4B中，室溫下輕輕振動15分鐘，以吸附與谷胱甘肽硫轉移酶-瓊脂糖4B結合的RNA，離心，取上清，再將上清加入到0.2mg的谷胱甘肽硫轉移酶-IVB型纖毛結構蛋白融合蛋白-瓊脂糖4B中，室溫下輕輕振動15～20分鐘，離心，去上清，用SELEX篩選緩沖液洗滌3～6次，再加入SELEX篩選洗脫液100μl，4℃靜置1小時，離心，取上清，用RNA純化回收試劑盒純化，得到純化的RNA；l、重復步驟e～g，將步驟e中的“步驟d中的PCR擴增產物”用步驟k最后一輪得到的RT-PCR擴增產物替代，得到可與傷寒桿菌IVB纖毛結構蛋白高度親和的RNA適配子庫；m、將步驟k最后一輪得到的RT-PCR擴增產物，經DNA限制性內切酶EcoRI和BamHI消化，連于質粒pUC19上，轉化到大腸桿菌DH5α，氨芐抗性篩選，挑取單個生長菌落進行測序；n、將各單個生長菌落所對應的RNA適配子3μg分別加入含有3.0×106個野生型傷寒桿菌的50μl菌液中，15～20℃靜置15分鐘后，將處理過的傷寒桿菌加入到500μl含有2.5×105個人白血病單核細胞的1640細胞培養(yǎng)液中，在5％二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃反應2小時，隨后加入1mlPBS，2000轉/分鐘離心10分鐘，去上清，如此洗滌3～5次，洗滌后加入慶大霉素使其濃度為100μg/ml，在5％二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃反應1小時，再用PBS洗滌3～5次后，加入500μl的細胞裂解液，在55℃的烤箱內裂解細胞1小時，然后迅速放于94℃的烤箱內反應10分鐘，隨后在其中加入酚、氯仿抽提液1ml，上下顛倒振蕩5分鐘使液體充分混合，然后12000轉/分鐘離心5分鐘，取400μl上層水相，在該水相中加入0.8ml乙醇，再將其靜置于-80℃冰箱中12小時沉淀DNA，最后20000轉/分鐘離心15分鐘，去上清，15～20℃自然風干殘余水分后，加入15～20μl雙蒸水溶解沉淀的DNA，取34.4ngDNA作為模板，用熒光定量PCR試劑盒進行定量PCR反應，擴增所用的上游引物為5’GCTTCTATAACTAGCAACGT 3’；下游引物為5’CTTCTGGCAAGATATTCTGA 3’，反應條件為95℃，15分鐘預變性，然后按下列條件循環(huán)40次95℃反應45秒、50℃反應45秒、72℃反應30秒，再進行72℃反應3分鐘，在進行反應的同時，運用定量PCR儀檢測細胞內傷寒桿菌基因組DNA的含量，選取細胞內傷寒桿菌基因組DNA含量較少的一組，該組即為權利要求1所述的能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子。
3.根據權利要求2所述的制備能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子的方法，其特征在于，步驟a所述的氨芐抗菌素的濃度為50μg/ml，加入異丙基硫代β-D半乳糖苷后異丙基硫代β-D半乳糖苷的濃度為0.1mmol/L，加入三硝基甲苯-100后三硝基甲苯-100的濃度為1％，所述的離心其轉速為5000轉/分鐘，時間為5分鐘；所述的2×TY液體培養(yǎng)基為1升水中溶解蛋白胨16g、酵母提取物10g、NaCl5g。
4.根據權利要求2所述的制備能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子的方法，其特征在于，步驟h所述的SELEX篩選緩沖液為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液、50mmol/L KCl、200mmol/LNaCl、0.2mmol/L 乙二胺四乙酸、5％甘油、0.5mmol/L二硫蘇糖醇；所述的SELEX篩選洗脫液為25mmol/L崔氏堿鹽酸緩沖液、50mmol/LKCl、1mol/LNaCl、0.2mmol/L 乙二胺四乙酸、5％甘油、0.5mmol/L二硫蘇糖醇；所述的離心其轉速為5000轉/分鐘，時間為5分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能抑制傷寒桿菌侵入人體細胞的RNA適配子，涉及微生物感染免疫和檢驗，以及SELEX技術。該RNA適配子為預防和治療傷寒桿菌腸熱癥提供了新型的拮抗劑，為克服臨床上傷寒感染治療出現的日益嚴重的耐藥問題，提供了新的解決途徑。本發(fā)明還公開了制備上述RNA適配子的方法，該方法通過制備和純化IVB型纖毛結構融合蛋白－瓊脂糖4B、隨機單鏈DNA文庫的構建、合成雙鏈DNA文庫、PCR擴增、RNA文庫制備、SELEX篩選、熒光定量PCR選取，得到RNA適配子。本發(fā)明的RNA適配子可直接作為傷寒桿菌拮抗劑使用，可預防和治療傷寒桿菌腸熱癥。為克服臨床傷寒治療出現的日益嚴重耐藥問題提供了新的解決途徑。
文檔編號A61P31/00GK1563401SQ20041001297
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月6日 優(yōu)先權日2004年4月6日
發(fā)明者章曉聯, 潘勤 申請人:武漢大學