專(zhuān)利名稱(chēng)：含有人參皂甙F1作為活性成分用于控制Bc1－2表達(dá)的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于控制Bcl-2表達(dá)的試劑，該試劑含有由下列分子式1表示的人參皂甙F1(20-氧-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人參萜三醇)(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)作為活性成分。
分子式1
背景技術(shù)紫外輻射線是太陽(yáng)光線的一部分，波長(zhǎng)在200-400納米之間，并且是電磁波譜的一部分；特別的是波長(zhǎng)在280-320納米之間的UVB(紫外光-B)是造成皮膚衰老、導(dǎo)致皮膚灼傷和皮膚癌的紫外輻射線的主要部分。當(dāng)皮膚暴露于紫外輻射時(shí)，細(xì)胞中的DNA、蛋白、類(lèi)脂等受到損傷，由此產(chǎn)生太陽(yáng)灼傷細(xì)胞(sunburn-cell)。這些太陽(yáng)灼傷細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)伴隨著DNA片段化、凋亡酶(caspase)的激活等等。高劑量的輻射會(huì)對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重的不能修復(fù)的DNA損傷；而凋亡則通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡來(lái)阻止細(xì)胞發(fā)育成腫瘤。因此，為防止癌癥并保持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，根據(jù)細(xì)胞損傷程度選擇性地誘導(dǎo)或阻止細(xì)胞凋亡是非常重要的。
Bcl-2在皮膚細(xì)胞凋亡過(guò)程中起非常重要的作用。Bcl-2基因?qū)Υ嬖谟诤四ず途€粒體外膜上的26kDa蛋白進(jìn)行編碼。Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，其通過(guò)粘附到加速凋亡的蛋白如Bax上來(lái)抑制它的功能。因此，細(xì)胞凋亡能夠用Bcl-2與Bax的濃度比例來(lái)確定。
已知UVB輻射可降低人體角質(zhì)細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)。另外，Bcl-2轉(zhuǎn)染的HaCaT細(xì)胞或Bcl-2過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示對(duì)UVB-誘導(dǎo)型凋亡有抵抗作用。然而，Bcl-2的過(guò)量表達(dá)會(huì)阻止DNA嚴(yán)重?fù)p傷的細(xì)胞的凋亡，從而引起癌癥。因此，有選擇地控制Bcl-2的表達(dá)是非常重要的。
到目前為止，與Bcl-2的功能相比，用于控制Bcl-2表達(dá)的技術(shù)或方法還未被大量公開(kāi)。只公開(kāi)了神經(jīng)細(xì)胞中的一些轉(zhuǎn)錄因子如pRb、c-myb和Bm-3a。特別是，據(jù)報(bào)道，IV型POU區(qū)轉(zhuǎn)錄因子Bm-3a可粘附到Bcl-2的P2啟動(dòng)子上并控制Bcl-2基因的表達(dá)從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于凋亡。
然而，在源于人類(lèi)皮膚的HaCaT細(xì)胞中，還沒(méi)有公開(kāi)控制Bcl-2表達(dá)的機(jī)制或因子。
另外，還未公開(kāi)無(wú)毒并易于施用于人體的用于控制Bcl-2表達(dá)的物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
在這些情況下，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)從純化的人參皂角苷(ginseng saponin)中獲得的人參皂甙(ginsenoside)F1通過(guò)保持Bcl-2的恒定水平來(lái)保護(hù)人體HaCaT細(xì)胞免于UVB-誘導(dǎo)型凋亡。也就是說(shuō)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人參皂甙F1可控制Bcl-2的表達(dá)并因此能抑制細(xì)胞凋亡，由此完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的是提供含有人參皂甙F1作為活性成分用于控制Bcl-2表達(dá)的試劑。
本發(fā)明另一目的是提供含有人參皂甙F1作為活性成分的凋亡促進(jìn)劑或凋亡抑制劑。
本發(fā)明提供用于控制Bcl-2表達(dá)的試劑，該試劑含有由下列分子式1表示的人參皂甙F1作為活性成分。
分子式1
低劑量UVB輻射時(shí)，人參皂甙F1通過(guò)保持Brn-3a的恒定水平以及對(duì)Bcl-2下調(diào)的相應(yīng)抑制，來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受UVB-誘導(dǎo)型凋亡。也就是說(shuō)，人參皂甙F1本身不能促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，但可以抑制由紫外輻射造成的Bcl-2的下調(diào)。相反，在高劑量紫外線輻射下，它能誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá)的降低來(lái)促進(jìn)凋亡。
總之，人參皂甙F1在低劑量紫外線輻射下能抑制Bcl-2表達(dá)的降低從而避免細(xì)胞凋亡；然而相反，在高劑量紫外線輻射下它能誘導(dǎo)凋亡，由此防止皮膚癌。因此，人參皂甙F1可以用作能抑制細(xì)胞損傷的抗衰老物質(zhì)。
本發(fā)明證實(shí)，人參皂甙F1可控制Bcl-2的轉(zhuǎn)錄因子Brn-3a的表達(dá)，由此能將Bcl-2的表達(dá)程度維持在正常水平。
因此，人參皂甙F1能通過(guò)將細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的表達(dá)程度維持在適宜水平來(lái)避免凋亡。然而，人參皂甙F1本身不能促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)。這些表明人參皂甙F1具有防止由紫外線輻射引起的凋亡和細(xì)胞損傷而不產(chǎn)生皮膚癌的功效。


圖1是從MTT化驗(yàn)結(jié)果得到的HaCaT皮膚細(xì)胞存活率的示意圖，其中將用人參皂甙F1處理過(guò)并暴露于紫外線中的細(xì)胞與未用人參皂甙F1處理的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較；
圖2顯示細(xì)胞形狀的變化，其中將用人參皂甙F1處理過(guò)并暴露于紫外線中的細(xì)胞與未用人參皂甙F1處理的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較；圖3顯示細(xì)胞DNA片段化的程度，其中將用人參皂甙F1處理過(guò)并暴露于紫外線中的細(xì)胞與未用人參皂甙F1處理的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較；圖4顯示由蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果獲得的細(xì)胞PARP分裂程度，其中將用人參皂甙F1處理過(guò)并暴露于紫外線中的細(xì)胞與未用人參皂甙F1處理的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較；圖5顯示mRNA水平Bcl-2的表達(dá)程度，其中將用人參皂甙F1處理過(guò)并暴露于紫外線中的細(xì)胞與未用人參皂甙F1處理的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較；圖6顯示由蛋白質(zhì)印跡法獲得的Bcl-2的轉(zhuǎn)錄因子Brn-3a的表達(dá)程度，其中將用人參皂甙F1處理過(guò)并暴露于紫外線中的細(xì)胞與未用人參皂甙F1處理的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較。Hsp70代表使用的蛋白量相同。
具體實(shí)施例方式
下面將參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。然而，這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的范圍。
參考實(shí)施例1 純化人參皂角苷的制備將2千克紅人參(KT&G公司，6年的紅人參)加入到4升含水的甲醇中，回流3次，然后15℃沉淀6天。通過(guò)過(guò)濾和離心來(lái)分離殘?jiān)蜑V液(remainders)，然后減壓濃縮濾液來(lái)獲得提取物。將提取物懸浮于水中，再用1升乙醚重新抽提5次來(lái)除掉色素，然后用500毫升1-丁醇將所得到的水層抽提3次。上述獲得的1-丁醇層用5％KOH處理并用蒸餾水洗滌，然后減壓濃縮來(lái)獲得1-丁醇提取物。將所述提取物(1-丁醇提取物)溶解在少量甲醇中，并往其中加入大量乙酸乙酯來(lái)獲得沉淀。將沉淀干燥，獲得70克純化的人參皂角苷提取物。
參考實(shí)施例2 人參皂甙F1的制備將10克上述參考實(shí)施例1中獲得的純化的人參皂角苷溶解在1000毫升檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.0)中，并加入15克從青霉菌(penicillium sp.)中獲得的柚苷酶，在40℃攪拌反應(yīng)48小時(shí)。反應(yīng)后，將反應(yīng)混合物加熱10分鐘使酶失活，然后用相同量的乙酸乙酯將反應(yīng)混合物抽提3次，并濃縮。獲得的產(chǎn)物進(jìn)行柱層析(氯仿∶甲醇＝9∶1)，最后分離到1.5克人參皂甙F1。
實(shí)施例1 用人參皂甙F1處理時(shí)，對(duì)紫外線誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡的抑制作用<步驟1>細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)人體角質(zhì)細(xì)胞HaCaT(得自Dr.Fusenig in German Cancer ResearchCenter(DKFZ))在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium；Gibco 1210-0038)中，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。
<步驟2>用人參皂甙F1處理時(shí)對(duì)紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用用胰蛋白酶處理在步驟1中培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)獲得單細(xì)胞懸浮液，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞將其接種到6孔培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24小時(shí)。之后，細(xì)胞在新的不含胎牛血清的DMEM中再培養(yǎng)24小時(shí)，然后用1、5、10μM的人參皂甙F1處理。人參皂甙F1溶解在100％乙醇中形成的濃度為培養(yǎng)基濃度的1/1000。用人參皂甙F1處理24小時(shí)后，細(xì)胞培養(yǎng)物用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，并在含有PBS的狀態(tài)下暴露于60-120毫焦/平方厘米的UVB輻射下。然后除去PBS，將培養(yǎng)基更換成含相同濃度人參皂甙F1的新鮮培養(yǎng)基。另外，培養(yǎng)未用人參皂甙F1處理的細(xì)胞作為對(duì)照。UVB輻射24小時(shí)后，在用人參皂甙F1處理和未用人參皂甙F1處理的所有細(xì)胞中加入3-[4，5-二甲基四唑]-2，5-二苯基四唑溴鎓鹽(3-[4，5-dimethyl tetrazole]-2，5-diphenyltetrazoliumbromide)(MTT，Sigma)，然后在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)后，細(xì)胞用二甲亞砜溶解，然后用ELISA計(jì)數(shù)儀(Thermo Max，Molecular Devices公司)測(cè)量540納米時(shí)甲臜染料(formazan dye)產(chǎn)生的光密度(OD)值。未暴露于UVB的細(xì)胞的OD值假定為100％，然后計(jì)算并確定其它細(xì)胞的相對(duì)值作為其存活率。結(jié)果在圖1中顯示。當(dāng)暴露于UVB中時(shí)，與未處理的細(xì)胞相比，用人參皂甙F1處理的細(xì)胞顯示出的凋亡抑制作用提高了1.5倍。然而在120毫焦/平方厘米的UVB輻射下，用人參皂甙F1處理的細(xì)胞與未處理的細(xì)胞相比顯示出更多凋亡。
實(shí)施例2 用人參皂甙F1處理時(shí)，對(duì)紫外線誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞DNA片段化的抑制作用<步驟1>細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)使用與實(shí)施例1中步驟1相同的方法。
<步驟2>用人參皂甙F1處理時(shí)，對(duì)紫外線誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞DNA片段化的抑制作用用胰蛋白酶處理在步驟1中培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)獲得單細(xì)胞懸浮液，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞將其接種到6孔培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24小時(shí)。之后，細(xì)胞在新的不含胎牛血清的DMEM中再培養(yǎng)24小時(shí)，然后用5μM的人參皂甙F1處理。用人參皂甙F1處理24小時(shí)后，培養(yǎng)物用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，并在含有PBS的狀態(tài)下暴露于60毫焦/平方厘米的UVB輻射下。然后除去PBS，將培養(yǎng)基更換成含相同濃度人參皂甙F1的新鮮培養(yǎng)基。另外，培養(yǎng)未用人參皂甙F1處理的細(xì)胞作為對(duì)照。
UVB輻射24小時(shí)后，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌所有用人參皂甙F1處理和未用人參皂甙F1處理的細(xì)胞，并用含4％低聚甲醛的磷酸緩沖鹽溶液處理15分鐘來(lái)固定細(xì)胞。然后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞，并在含有0.05％吐溫20和0.2％牛血清蛋白(BSA)的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中反應(yīng)15分鐘。在反應(yīng)混合物中加入末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxynucleotide transferase)反應(yīng)液(TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒，Upstate，美國(guó))，反應(yīng)1小時(shí)。之后加入反應(yīng)中止緩沖液(reaction termination buffer)(TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒，Upstate，美國(guó))以結(jié)束反應(yīng)，并往其中加入封閉液(TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒，Upstate，美國(guó))，反應(yīng)20分鐘。之后再加入抗生物素蛋白-異硫氰酸熒光素(FITC)(TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒，Upstate，美國(guó))，反應(yīng)30分鐘，然后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌。
用500nM碘化丙啶(propidium iodide)溶液進(jìn)行復(fù)染色，并用顯微鏡觀察。通過(guò)觀察大約200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算所有細(xì)胞中DNA片段化的數(shù)量。當(dāng)暴露在UVB時(shí)，與未處理的細(xì)胞相比，用人參皂甙F1處理的細(xì)胞DNA片段化降低了2.4倍。結(jié)果在圖3中顯示。
實(shí)施例3用人參皂甙F1處理時(shí)，對(duì)紫外線誘導(dǎo)的PARP蛋白分解程度的抑制作用<步驟1>細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)使用與實(shí)施例1中步驟1相同的方法。
<步驟2>用人參皂甙F1處理時(shí)，對(duì)紫外線誘導(dǎo)的PARP蛋白分解程度的抑制作用用胰蛋白酶處理在步驟1中培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)獲得單細(xì)胞懸浮液，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞將其接種到6孔培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24小時(shí)。之后，細(xì)胞在新的不含胎牛血清的DMEM中再培養(yǎng)24小時(shí)，然后用5μM的人參皂甙F1處理。用人參皂甙F1處理24小時(shí)后，細(xì)胞培養(yǎng)物用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，并在含有PBS的狀態(tài)下暴露于60毫焦/平方厘米的UVB輻射下。然后除去PBS，將培養(yǎng)基更換成含5μM人參皂甙F1的新鮮培養(yǎng)基。另外，培養(yǎng)未用人參皂甙F1處理的細(xì)胞作為對(duì)照。
UVB輻射24小時(shí)后，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌所有用人參皂甙F1處理和未用人參皂甙F1處理的細(xì)胞，用胰蛋白酶處理來(lái)收集細(xì)胞，再用8M尿素、2％CHAPS、50mM1，4-二硫酥糖醇(DTT)、2M硫脲、2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和500微升的含100微克/毫升亮抑酶肽(leupeptine)的蛋白提取緩沖液處理這些細(xì)胞，并在室溫下放置10分鐘；然后用15,000克力于4℃離心10分鐘，收集上清液，然后用BIO-Rad Protein Dye ReagentTM確定蛋白的量。用8％十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺膠電泳(SDS-PAGE)根據(jù)分子大小分離出20微克蛋白，并將所得蛋白用50伏電壓印跡到PDF膜(BioRad)上，維持12小時(shí)。獲得的印跡用5％脫脂牛奶溶液封閉1小時(shí)，用Amersham Bioscience的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒，通過(guò)使用抗PARP多克隆抗體(Santa Cruz)作為初次抗體并使用結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶的抗兔IgG(amersham)作為二次抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。
將反應(yīng)的印跡曝光到X線富士膠片上并沖洗顯影以觀察蛋白表達(dá)程度。用PowerLook 2100XL(umax)對(duì)膠片上的條帶進(jìn)行掃描，并用ImageMaster2D Elite(Amersham Bioscience)圖像分析程序進(jìn)行分析。用與對(duì)照相比的相對(duì)量來(lái)評(píng)價(jià)PARP蛋白分裂的量。當(dāng)暴露在UVB時(shí)，用人參皂甙F1處理的細(xì)胞與那些未處理的細(xì)胞相比，其PARP蛋白分裂顯示降低了1.4倍。結(jié)果在圖4中顯示。
實(shí)施例4用人參皂甙F1處理時(shí)，對(duì)紫外線誘導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)降低的抑制作用<步驟1>細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)使用與實(shí)施例1中步驟1相同的方法。
<步驟2>用人參皂甙F1處理時(shí)，對(duì)紫外線誘導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)降低的抑制作用用胰蛋白酶處理在步驟1中培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)獲得單細(xì)胞懸浮液，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞將其接種到6孔培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24小時(shí)。之后，細(xì)胞在新的不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24小時(shí)，然后用5μM的人參皂甙F1處理。用人參皂甙F1處理24小時(shí)后，細(xì)胞培養(yǎng)物用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，并在含有PBS的狀態(tài)下暴露于60毫焦/平方厘米的UVB輻射下。然后除去PBS，將培養(yǎng)基更換成含5μM人參皂甙F1的新鮮培養(yǎng)基。另外，培養(yǎng)未用人參皂甙F1處理的細(xì)胞作為對(duì)照。
UVB輻射24小時(shí)并在預(yù)定的時(shí)間間隔不受UVB輻射，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌所有用人參皂甙F1處理和未用人參皂甙F1處理的細(xì)胞，并用Oligotex Direct mRNA試劑盒(QIAGEN，Hilden，德國(guó))提取mRNA，然后進(jìn)行定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)。進(jìn)行定量RT-PCR的Bcl-2引物序列和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物序列在表1中顯示。
表1進(jìn)行定量RT-PCR的Bcl-2和GAPDH引物序列

在含有50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、0.1M DTT、10mM dNTP和40單位/毫升核糖核酸酶抑制劑的25微升反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液中加入1微克mRNA，然后再加入0.5微克/毫升寡聚(oligo)(dT)16引物和200單位SuperScript II(GiboBRL)反轉(zhuǎn)錄聚合酶并在42℃下反應(yīng)1小時(shí)。2.5微升反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液與含有50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.3)、5mM MgCl2、100μM dNTP的50微升PCR緩沖液混合，再加入10μM引物和0.5單位TaqDNA聚合酶，然后重復(fù)下列循環(huán)30次95℃30秒、58℃30秒、72℃30秒。PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并掃描，然后用ImageMaster 2D Elite(Amersham Bioscience)圖像分析程序進(jìn)行分析。Bcl-2的表達(dá)量用與GAPDH表達(dá)量的相對(duì)值來(lái)評(píng)價(jià)。
當(dāng)細(xì)胞只用人參皂甙F1處理時(shí)，Bcl-2按時(shí)間階段的表達(dá)跟未處理的細(xì)胞沒(méi)有差別。當(dāng)用UVB輻射時(shí)，未用人參皂甙F1處理的細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)降低，在24小時(shí)后Bcl-2幾乎不表達(dá)。然而，甚至是當(dāng)UVB輻射時(shí)，用人參皂甙F1處理的細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)與未被UVB輻射時(shí)相比幾乎保持相同。也就是說(shuō)，當(dāng)用人參皂甙F1處理細(xì)胞時(shí)，與未處理的細(xì)胞相比，Bcl-2的表達(dá)增加3倍。結(jié)果在圖5中顯示。
實(shí)施例5用人參皂甙F1處理時(shí)，對(duì)紫外線誘導(dǎo)的Brn-3a表達(dá)降低的抑制作用<步驟1>細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)使用與實(shí)施例1中步驟1相同的方法。
<步驟2>用人參皂甙F1處理時(shí)，對(duì)紫外線誘導(dǎo)的Brn-3a表達(dá)降低的抑制作用用胰蛋白酶處理在步驟1中培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)獲得單細(xì)胞懸浮液，以每孔2×105細(xì)胞將其接種到6孔培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24小時(shí)。之后，細(xì)胞在新的不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24小時(shí)，然后用5μM的人參皂甙F1處理。用人參皂甙F1處理24小時(shí)后，細(xì)胞培養(yǎng)物用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，并在含有PBS的狀態(tài)下暴露于60毫焦/平方厘米的UVB輻射下。然后除去PBS，將培養(yǎng)基更換成含5μM人參皂甙F1的新鮮培養(yǎng)基。另外，培養(yǎng)未用人參皂甙F1處理的細(xì)胞作為對(duì)照。
UVB輻射24小時(shí)后，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌所有用人參皂甙F1處理和未用人參皂甙F1處理的細(xì)胞，用胰蛋白酶處理來(lái)收集細(xì)胞，再用8M尿素、2％CHAPS、50mM DTT、2M硫脲、2mM PMSF和500微升含100微克/毫升亮抑酶肽的蛋白提取緩沖液處理這些細(xì)胞，在室溫下放置10分鐘；然后用15,000克力于4℃離心10分鐘，收集上清液，然后用BIO-RadProtein Dye ReagentTM確定蛋白的量。用8％SDS-PAGE根據(jù)分子大小分離出20微克蛋白，并將所得蛋白以50伏電壓印跡到PDF膜(BioRad)上，保持12小時(shí)。獲得的印跡用5％脫脂牛奶溶液封閉1小時(shí)，用AmershamBioscience的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒，通過(guò)使用抗PARP多克隆抗體(Santa Cruz)作為初次抗體并使用結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶的抗兔IgG(amersham)作為二次抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。
將反應(yīng)的印跡曝光到X線富士膠片上并沖洗顯影來(lái)觀察蛋白表達(dá)量。用PowerLook 2100XL(umax)對(duì)膠片上的條帶進(jìn)行掃描，用ImageMaster 2DElite(Amersham Bioscience)的圖像分析程序進(jìn)行分析。當(dāng)被UVB輻射時(shí)，Brn-3a的表達(dá)降低，然而當(dāng)用人參皂甙F1處理時(shí)所述表達(dá)得到恢復(fù)。結(jié)果在圖6中顯示。
如上所述，本發(fā)明的人參皂甙F1能抑制由紫外輻射造成的Bcl-2表達(dá)的下降，從而抑制紫外輻射誘導(dǎo)的凋亡，相反，在高劑量紫外線輻射下，人參皂甙F1能促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而避免細(xì)胞發(fā)育成癌細(xì)胞。
序列表<110>株式會(huì)社太平洋(AMOREPACIFIC CORPORATION)<120>含有人參皂甙F1作為活性成分用于控制Bcl-2表達(dá)的試劑<130>I5O76YOL<150>KR10-2002-0085716<151>2002-12-28<160>4<170>PatentIn 3.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Bcl-2正向引物<400>1tacgataacc gggagatagt ga22<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Bcl-2反向引物<400>2caggtgccgg ttcaggtact 20<210>3<211>23<219>DNA
<213>人工序列<220>
<223>GAPDH正向引物<400>3caactacatg gtttacatgt tcc 23<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GAPDH反向引物<400>4ggactgtggt catgagtcct 20
權(quán)利要求
1.一種用于控制Bcl-2表達(dá)的試劑，其特征在于，該試劑含有人參皂甙F1作為活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其中，所述人參皂甙F1通過(guò)控制Brn-3a的表達(dá)來(lái)控制Bcl-2的表達(dá)。
3.一種凋亡抑制劑，其中，該抑制劑含有人參皂甙F1作為活性成分，并抑制由低劑量紫外輻射誘導(dǎo)的凋亡。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凋亡抑制劑，其中，所述人參皂甙F1通過(guò)抑制Bcl-2表達(dá)的降低來(lái)抑制凋亡。
5.一種凋亡促進(jìn)劑，其中，該促進(jìn)劑含有人參皂甙F1作為活性成分，并促進(jìn)由高劑量紫外輻射誘導(dǎo)的凋亡。
6.一種用于控制Brn-3a表達(dá)的試劑，其中，該試劑含有人參皂甙F1作為活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于控制Bcl－2表達(dá)的試劑，其中該試劑含有由下列分子式1表示的人參皂甙F1(20－氧－β－D－吡喃葡萄糖基－20(S)－原人參萜三醇)作為活性成分。
文檔編號(hào)A61K31/704GK1732010SQ200380107840
公開(kāi)日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2003年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月28日
發(fā)明者曹始泳, 李恩嬉, 金修晶, 申宜錫, 張希景, 金德姬, 廉明勛, 禹光植, 李泰龍, 沈榮哲 申請(qǐng)人:株式會(huì)社太平洋