專利名稱:肽及含有所述肽的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及在PACAP/VIP衍生物的生產(chǎn)和儲(chǔ)存及在體內(nèi)異構(gòu)化作用受抑制并且具有高穩(wěn)定性的肽衍生物。
背景技術(shù):
血管活性腸肽(VIP)被稱為腦-腸肽,其是一類能加速血流和降低血壓的生物活性肽。VIP提取自豬腸,并由28個(gè)氨基酸殘基組成(參見(jiàn),例如,S.I.Said等,Science,U.S.A,1970,Vol.169,p.1217)。相對(duì)的,垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(PACAP)是由38個(gè)氨基酸殘基組成的肽,其分離自綿羊下丘腦,其結(jié)構(gòu)根據(jù)用于在培養(yǎng)的垂體細(xì)胞中激活腺苷酸環(huán)化酶的生物分析系統(tǒng)來(lái)測(cè)定。存在兩類PACAP,即PACAP38和PACAP27(參見(jiàn),例如,A.Miyata等,Biochemical and Biologicalresearch communications,U.S.A,1989,Vol.164,p.567)。由PACAP的N-末端的27個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)與VIP的結(jié)構(gòu)非常相似。由于VIP和PACAP的氨基酸序列與胰泌素、胰高血糖素等的序列相似,VIP和胰高血糖素被認(rèn)為是屬于胰高血糖素-分泌素超家族的肽。VIP和PACAP通過(guò)PACAP/VIP受體顯示其生物活性。這些PACAP/VIP受體廣泛分布于生物體的體內(nèi),因此,PACAP/VIP據(jù)報(bào)道有多種生物活性。生物活性的例子包括抗哮喘作用(日本專利公開(Kokai)號(hào)8-333276A(1996)),降血壓作用(日本專利公開(Kokai)號(hào)63-179894A(1988)),恢復(fù)毛發(fā)的作用(日本專利公開(kokai)號(hào)1-83012 A(1989)),緩解男性勃起功能障礙的作用(日本專利公開(kokai)號(hào)1-19097 A(1989)),增加陰道潤(rùn)滑的作用(日本專利公開(Kokai)號(hào)1-501937 A(1989)),抑制胃腸道運(yùn)動(dòng)的作用(日本專利公開(Kohyo)號(hào)6-507415 A(1994)),緩解神經(jīng)退行性疾病、組織缺氧和記憶技能下降的作用(日本專利公開(Kokai)號(hào)7-69919 A(1995)),治療皮膚潰瘍的作用(日本專利公開(Kokai)號(hào)8-40926 A(1996)),加速神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的作用(日本專利公開(Kokai)號(hào)2001-226284 A),和作為改善構(gòu)象病的藥物的活性(Onoue S等,F(xiàn)EBSLetters,Hooand,2002,Vol.522,pp.65-70)。如果考慮這些生物活性,則PACAP和VIP的醫(yī)學(xué)應(yīng)用可以非常廣泛。然而,生物活性肽,如PACAP和VIP通常不穩(wěn)定,它們尤其在生物體內(nèi)被迅速代謝,因此,其作用的時(shí)段非常短。因此,本發(fā)明人構(gòu)建了具有抵抗酶作用的新功能的PACAP和VIP衍生物(日本專利公開(Kokai)號(hào)8-333276 A(1996))。發(fā)明人表示該P(yáng)ACAP和VIP衍生物具有對(duì)體內(nèi)蛋白酶如胰蛋白酶引起的代謝的優(yōu)良的穩(wěn)定性(Kashimoto K等,Peptide Chemistry,1996,Vol.1997,pp.249-252),并且這種衍生物對(duì)延長(zhǎng)以支氣管擴(kuò)張作為指示的藥物作用具有顯著的效果(Yoshihara S等,Peptides,U.S.A,1998,Vol.19,pp.593-597;和Yoshihara S等,British Journal OfPharmacology,1997,Vol.121,pp.1730-1734)。因此,長(zhǎng)時(shí)間起作用的PACAP和VIP衍生物被認(rèn)為在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中非常有用,并且被認(rèn)為是靶向上述不同的生物學(xué)和藥物學(xué)活性的合適的候選藥物。盡管PACAP和VIP衍生物的生物化學(xué)穩(wěn)定性得到確認(rèn),還發(fā)現(xiàn)這種衍生物可能導(dǎo)致在藥物穩(wěn)定性,尤其是在溶液中長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定性方面的嚴(yán)重問(wèn)題。這種劇烈的降解引起了對(duì)PACAP和VIP活性降低,產(chǎn)生的雜質(zhì)導(dǎo)致的不需要的副作用等的深入關(guān)注。由于PACAP和VIP的生物學(xué)和藥物學(xué)活性,單次施用含有其的藥物難以充足,因此,可以容易的推測(cè)這種藥物必須在臨床實(shí)踐中長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)施用。因此,與穩(wěn)定性相關(guān)的各種問(wèn)題產(chǎn)生的副產(chǎn)品的產(chǎn)生是尤其嚴(yán)重的問(wèn)題。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及提供含有高穩(wěn)定性并且臨床使用安全的PACAP/VIP衍生物的藥物組合物。
本發(fā)明人集中研究了導(dǎo)致PACAP和VIP及其肽衍生物在溶液中不穩(wěn)定的因素。結(jié)果,他們發(fā)現(xiàn)異構(gòu)化發(fā)生在一些序列中的并且其用作藥物組合物的活性成分的臨床應(yīng)用不是優(yōu)選的。這種異構(gòu)化特定針對(duì)酸性氨基酸,如天冬氨酸或谷氨酸及其酰胺形式,如天冬酰胺和谷氨酰胺。據(jù)報(bào)道含有這些氨基酸的肽和蛋白可能在酸性或堿性條件下,根據(jù)相臨氨基酸的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生副產(chǎn)物琥珀酰亞胺或戊二酸酰亞胺(Bondanszky M等,Int.J.Pept.Protein.Res.,1978,12,69;Nobuo Izumiya等,“Pepuchido Gousei no Kiso to Jikken(肽合成基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)Fundamentalsand Experiment of Peptide Synthesis)”),Maruzen,71-72)。當(dāng)用二甲苯醚保護(hù)氨基酸側(cè)鏈時(shí)比側(cè)鏈游離時(shí)更有可能發(fā)生副反應(yīng)。天冬氨酰肽尤其不穩(wěn)定,并且其在中性條件下形成酰亞胺。當(dāng)甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或組氨酸出現(xiàn)在天冬氨酸和天冬酰胺的旁邊時(shí),肽變得尤其不穩(wěn)定。在VIP的例子中,24和25位的Asn-Ser序列尤其可能導(dǎo)致異構(gòu)化。肽4作為酶抗性VIP衍生物,除24和25位的Asn-Ser序列之外在28和29位的Asn-Gly序列產(chǎn)生相似的異構(gòu)化。根據(jù)Kitada等的報(bào)道(Peptide Chemistry,1990,1991,239-244),VIP及其相關(guān)的衍生物在8位和9位的Asp-Asn位置很容易形成琥珀酰亞胺。在PACAP的例子中,3位和4位的Asp-Gly序列能形成琥珀酰亞胺,因此其在溶液中的穩(wěn)定性是嚴(yán)重的問(wèn)題。
因此,本發(fā)明人集中研究這些序列并試圖用更穩(wěn)定的氨基酸序列取代這些序列以產(chǎn)生一組具有與PACAP/VIP相同生物活性并且穩(wěn)定性提高的化合物。
根據(jù)本發(fā)明人先前的報(bào)道(Onoue,S等,Biomed.Res.,1999,20,219-231;Onoue,S等,Peptides,2001,22,867-872;和Onoue,S等,Pharmacol.Rev.Commun.,2002,12,1-9),PACAP/VIP的N-末端結(jié)構(gòu)在PACAP/VIP和PACAP/VIP受體結(jié)合時(shí)與受體特異性識(shí)別的性質(zhì)顯著相關(guān),這對(duì)展示其功能而言非常重要。根據(jù)上述概念,用的穩(wěn)定的PACAP(i)序列的24和25位代替構(gòu)成VIP序列不穩(wěn)定因素的24和25位。
根據(jù)本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的事實(shí)VIP的Asn-28不決定活性(Nagano,Y等,Peptide Science 2001,2002,147-150),肽4(與野生型VIP相比Arg含量增加的修飾肽)的28位被刪除以消除Asn-Gly序列(ii)中產(chǎn)生的異構(gòu)化的風(fēng)險(xiǎn)。
VIP的Met-17在體內(nèi)即時(shí)代謝后或在其生產(chǎn)過(guò)程中被轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸亞砜,并顯著影響其活性。因此,Met-17被Leu或Nle代替(iii)。
此外,本發(fā)明人通過(guò)用Glu或Ala替換Asp-8,制備從VIP衍生的化合物,其異構(gòu)化的幾率比Asp低。當(dāng)VIP的8位用Ala替換,據(jù)報(bào)道其受體結(jié)合活性增加(Igarashi,H等,J.Pharmacol.Exp.Ther.,2002,37-50)。因此,可以預(yù)計(jì)該衍生物是穩(wěn)定的并具有高水平活性。
本發(fā)明人報(bào)道VIP的最小活性單位由23個(gè)殘基組成(Nagano,Y等,Peptide Science 2001,2002,147-150)。因此,如果從N-末端保留至少23個(gè)殘基,則預(yù)計(jì)在上述氨基酸替換的VIP衍生物中保留VIP的生物活性。
為了抑制PACAP的3位形成琥珀酰肽,可以用VIP的相同位置的氨基酸殘基Ala替換Gly-4使其穩(wěn)定(iv)。該替換可有效穩(wěn)定PACAP相關(guān)的肽,如肽3(PACAP 38),肽5(PACAP30),和肽6(與PACAP38相比Arg含量增加的修飾的肽),以及穩(wěn)定肽2(PACAP27)。
已知PACAP的最小活性單位由N-末端23個(gè)殘基組成,在VIP的例子中也是一樣(Kitada,C等,Peptide Chemistry 1990,1991,239-244)。因此,PACAP衍生物組,如果其含有N-末端的至少23個(gè)殘基,則預(yù)期具有PACAP的生物學(xué)和藥物學(xué)作用。
基于這樣的觀點(diǎn),本發(fā)明人合成了多種肽,并發(fā)現(xiàn)了具有與野生型VIP或PACAP相似或者更高生物活性并具有高穩(wěn)定性的肽。
更具體地,本發(fā)明提供下列(1)到(12)。
(1)由通式(I)表示的包括肽N-末端至少23個(gè)殘基的肽或其藥用鹽His-Ser-Asp-Ala-A-Phe-Thr-B-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-H-I-Tyr-Leu-Ala-Ala-J-K-L(SEQ ID NO1)(I)其中A代表Val或Ile;B代表Asp,Glu或Ala;C代表Asn或Ser;D代表Thr或Ser;E代表Leu或Tyr;F,H和I分別獨(dú)立代表Lys或Arg;G代表Leu或nLeu;J代表Ile或Val;K代表Leu,Leu-Asn,Leu-Gly,Leu-Gly-Lys,Leu-Gly-Arg,Leu-Gly-Lys-Lys,Leu-Gly-Lys-Arg,Leu-Gly-Arg-Arg,Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys或Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg;并且L代表可以被修飾的C-末端氨基酸的α-羧基基團(tuán)的一部分,即-NH2或-OH。
(2)根據(jù)(1)的肽或其藥用鹽,由通式(I)代表的肽的N-末端23個(gè)氨基酸殘基組成,其中A代表Val;B代表Asp;C代表Asn;D代表Thr;E代表Leu;F,H和I分別獨(dú)立代表Arg;G代表Leu;L代表-NH2。具體地,上述肽等同于肽10(SEQ ID NO11)。
(3)根據(jù)(1)的肽或其藥用鹽,其中,在通式(I)中A代表Val;B代表Asp;C代表Asn;D代表Thr;E代表Leu;F,H和I分別獨(dú)立代表Arg;G代表Leu;J代表Ile;K代表Leu-Gly-Arg-Arg;并且L代表-NH2。具體地,上述肽等同于肽12(SEQ ID NO13)。
(4)根據(jù)(1)的肽或其藥用鹽,其中在通式(I)中,A代表Val;B代表Glu;C代表Asn;D代表Thr;E代表Leu;F,H和I分別獨(dú)立代表Arg;G代表Leu;J代表Ile;K代表Leu-Gly-Arg-Arg;并且L代表-NH2。具體地,上述肽等同于肽21(SEQ ID NO22)。
(5)根據(jù)(1)的肽或其藥用鹽,其中在通式(I)中,A代表Val;B代表Ala;C代表Asn;D代表Thr;E代表Leu;F,H和I分別獨(dú)立代表Arg;G代表Leu;J代表Ile;K代表Leu-Gly-Arg-Arg;并且L代表-NH2。具體地,上述肽等同于肽23(SEQ ID NO24)。
(6)根據(jù)(1)的肽或其藥用鹽,其中在通式(I)中,A代表Val;B代表Asp;C代表Asn;D代表Thr;E代表Leu;F,H和I分別獨(dú)立代表Arg;G代表Leu;J代表Val;K代表Leu-Gly-Arg-Arg;并且L代表-NH2。具體地,上述肽等同于肽25(SEQ ID NO26)。
(7)根據(jù)(1)的肽或其藥用鹽,其中在通式(I)中,A代表Ile;B代表Asp;C代表Ser;D代表Ser;E代表Tyr;F,H和I分別獨(dú)立代表Arg;G代表Leu;J代表Val;K代表Leu-Gly-Arg-Arg;并且L代表-NH2。具體地,上述肽等同于肽26(SEQ ID NO27)。
(8)根據(jù)(1)的肽或其藥用鹽,其中在通式(I)中,A代表Ile;B代表Asp;C代表Ser;D代表Ser;E代表Tyr;F,H和I分別獨(dú)立代表Arg;G代表Leu;J代表Val;K代表Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg;并且L代表-NH2。具體地,上述肽等同于肽29(SEQ ID NO30)。
(9)根據(jù)(1)的肽或其藥用鹽,其由通式(I)表示的肽的N-末端23個(gè)氨基酸殘基組成,其中A代表Ile;B代表Asp;C代表Ser;D代表Ser;E代表Tyr;F,H和I分別獨(dú)立代表Arg;G代表Leu;并且L代表-NH2。具體地,上述肽等同于肽31(SEQ ID NO32)。
肽10,12,21,23,25,26,29和31是已經(jīng)施加了上述修飾(i)到(iv)的修飾肽。此外,在肽21和23的8位的氨基酸已被改變?yōu)镚lu或Ala。
(10)含有(1)到(9)任一肽或其藥用鹽的藥物組合物。
(11)根據(jù)(10)的藥物組合物,包括以基于作為活性成分的全部生物活性肽重量計(jì)至少50%重量的(1)到(9)任一項(xiàng)的肽或其藥用鹽。
術(shù)語(yǔ)“活性成分”指包含在藥物組合物中具有治療、預(yù)防、改變或緩解受試者的疾病、癥狀或病癥的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“生物活性肽”指對(duì)受試者具有生物活性的肽。在本說(shuō)明書中,這樣的肽包括PACAP/VIP肽,其鹽和其衍生物?!癙ACAP/VIP肽”包括人或動(dòng)物的野生型PACAP或VIP,具有與PACAP或VIP相似氨基酸序列的肽,以及具有與PACAP或VIP相似生物活性的肽。此外,“PACAP/VIP肽”包括屬于胰高血糖素-胰泌素超家族的肽。
(12)根據(jù)(10)或(11)的藥物組合物,用于治療或預(yù)防一種或多種選自下列的疾病或癥狀包括腦栓塞和腦血栓的缺血性腦血管疾病,對(duì)中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)產(chǎn)生毒性的疾病,腦血管缺血,血栓癥,構(gòu)象病,神經(jīng)退行性疾病,脫發(fā),勃起障礙,癡呆,腎衰竭,視覺(jué)神經(jīng)退行性疾病,包括視神經(jīng)萎縮和缺血性視神經(jīng)病變,和視網(wǎng)膜退行性疾病,以提改善血流,松弛支氣管平滑肌或抑制胃腸道的運(yùn)動(dòng)。
下文中,詳細(xì)描述本發(fā)明。
具體地,根據(jù)本發(fā)明的高穩(wěn)定肽衍生物由通式(I)表示的氨基酸序列組成。所述肽的代表性的例子顯示于表1。此處顯示的肽10到肽32對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO11到33。肽10,22,24,31和32是對(duì)應(yīng)于從N-末端的23個(gè)殘基組成的區(qū)域,肽13,28和32每個(gè)獨(dú)立地具有結(jié)合到N-末端氨基的乙?;?,以及肽14具有結(jié)合到N-末端氨基的硬脂?;?。肽33(SEQ ID NO34)由與肽31(SEQ ID NO32)具有相同氨基酸序列的23個(gè)殘基組成,除了4位的氨基酸為甘氨酸。
表1
使用上述肽時(shí),極性的或非極性的物質(zhì)(如脂肪酸或?;?可以結(jié)合到其N-末端改變分子的極性,或可以將聚合物分子如聚乙二醇或聚氨基葡萄糖(透明質(zhì)酸)與其結(jié)合增強(qiáng)對(duì)酶的抗性。這種肽可以結(jié)合到脂質(zhì)體支持物上以被封裝到脂質(zhì)體內(nèi),或它們可以固相化在脂膜的表面。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道引入?;鶗?huì)抑制自身聚集及提高活性。
本發(fā)明的肽被發(fā)現(xiàn)在例如蒸餾水或緩沖液的水溶液中非常穩(wěn)定。當(dāng)本發(fā)明的肽在40℃儲(chǔ)存于pH水平6.0和7.0的溶液中一周后,例如,該肽能保持70%的比例或更高,優(yōu)選80%或更高,更優(yōu)選85%或更高。當(dāng)該肽在55℃儲(chǔ)存于pH水平6.0和7.0的溶液3天后,其可以保持85%的比例或更高,以及優(yōu)選90%或更高。在本發(fā)明中,肽10,12,21,23,25,26,29是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的用于誘導(dǎo)軸突的肽沒(méi)有特別限定,并且其可以根據(jù)常規(guī)的肽合成技術(shù)合成。這些肽可以根據(jù)例如“肽”,Vol.1,1996,Schreder和Luhke,Academic press,New York,U.S.A.或“肽合成”,Izumiya等,Maruzen,1975描述的方法合成。更具體地,肽合成可以通過(guò)多種技術(shù)進(jìn)行,例如疊氮化物方法,酰基氯方法,酸酐方法,混合酐方法,DCC方法,活性酯法(如p-硝基苯基酯方法,N-羥基琥珀酰亞胺酯方法,或氰基甲基酯法),使用Woodward試劑K的方法,碳咪唑法,氧化還原法,以及DCC添加劑(HONB,HOBt,或HOSu)方法。這些技術(shù)可以應(yīng)用到固相合成和液相合成中。
本發(fā)明中,肽合成采用前述的多肽合成的通用技術(shù)進(jìn)行。例如,肽合成通過(guò)氨基酸依次順序地與末端氨基酸殘基逐個(gè)融合的稱作逐步方法的技術(shù)進(jìn)行。或者,氨基酸被分成幾個(gè)片段,并且這些片段彼此連接。
逐步固相肽合成方法的一個(gè)具體的例子是Merrifield,R.B.方法(固相肽合成,J.Amer.Chem.Soc.,85,2149-2159,1963),其可以以下面的方式進(jìn)行。C-末端氨基酸(被保護(hù)的氨基)首先通過(guò)其羧基結(jié)合到不溶性樹脂上,然后除去C-末端氨基酸的氨基保護(hù)基團(tuán)。隨后,氨基保護(hù)的氨基酸的活性羧基與得到的游離活性氨基按照目標(biāo)肽的氨基酸順序融合。因此,以逐步的方式合成全序列并將該肽與不溶性的樹脂分離。
任何不溶性的樹脂只要其能結(jié)合活性羧基都可以用于固相肽合成。其例子包括二苯甲胺(BHA)樹脂,氯甲基樹脂,氧甲基樹脂,氨基甲基樹脂,甲基二苯甲胺(BHA)樹脂,4-氨基甲基苯氧基甲基樹脂,4-羥基甲基苯氧基甲基樹脂和4-氧甲基苯基乙酰胺甲基樹脂。
當(dāng)9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)基團(tuán)被用作α-氨基保護(hù)基團(tuán),例如,使用可在三氟乙酸(TEA)的幫助下從中消除肽的4-羥基甲基苯氧基甲基樹脂是優(yōu)選的。當(dāng)使用叔-丁氧基羰基(Boc)基團(tuán),例如,使用能在氟化氫的幫助下消除肽的4-氧甲基苯基乙酰胺甲基(PAM)樹脂是優(yōu)選的。肽的含量?jī)?yōu)選為每克樹脂中含0.5毫摩爾或更低。
上述的方法需要保護(hù)基團(tuán)結(jié)合到參與氨基酸肽鍵形成的氨基上,消除保護(hù)基團(tuán),和活化參與氨基酸肽鍵形成的羧基。
氨基保護(hù)基團(tuán)的例子包括例如苯甲氧基羰基(Z),叔-丁氧基羰基(Boc),叔-戊氧基羰基(Aoc),異冰片基氧羰基,p-甲氧基苯甲基氧羰基,2-氯-苯甲基氧羰基,金剛烷基氧羰基,三氟乙酰基,鄰苯二甲?;柞;?,o-硝基苯基亞磺?;投交蜢⒒?。
氨基酸的側(cè)鏈功能性基團(tuán),如His,Tyr,Thr,Lys,Asp,Arg和Ser是優(yōu)選保護(hù)的。功能基團(tuán)可以常規(guī)的技術(shù)保護(hù),其中下列的通常保護(hù)基團(tuán)結(jié)合到功能基團(tuán)上。在反應(yīng)完成后,去除保護(hù)基團(tuán)。
His的亞氨基保護(hù)基團(tuán)的例子包括苯甲基氧甲基(Bom),p-甲苯磺?;?Tos),苯甲基(Bzl),苯甲基氧羰基(Z)和三苯甲基。
Ser和Thr的羥基可以通過(guò)例如酯化或醚化進(jìn)行保護(hù),盡管這種保護(hù)不是必須的。適合酯化的基團(tuán)的例子包括如乙?;耐轷;鶊F(tuán),如苯甲酰基的芳?;腿绫郊柞;豸驶鸵一豸驶膩?lái)自碳酸的基團(tuán)。適合醚化的基團(tuán)的例子包括苯基,四氫吡喃基和叔-丁基基團(tuán)。
Tyr的羥基的保護(hù)基團(tuán)的例子包括苯甲基(Bzl),溴苯甲基氧羰基(Br-Z),二氯苯甲基(Cl2-Bzl),苯甲基氧羰基(Z),乙?;蚿-甲苯磺?;?Tos)。
Lys的氨基的保護(hù)基團(tuán)的例子包括苯甲基氧羰基(Z),氯苯甲基氧羰基(Cl-Z),二氯苯甲基(Cl2-Bzl),叔-丁氧基羰基(Boc)和p-甲苯磺酰基(Tos)。
Arg的胍基的保護(hù)基團(tuán)的例子包括p-甲苯磺?;?Tos),硝基,苯甲基氧羰基(Z),和叔-戊氧基羰基(Aoc)。
Asp的羧基通過(guò),例如在苯甲醇、甲醇、乙醇、叔-丁醇和環(huán)己基(cHex)的幫助下進(jìn)行酯化而保護(hù)。
其他氨基酸的保護(hù)基團(tuán),諸如Trp的吲哚基的例子包括甲?;?、芐酯基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基,和2,2,2-三氯乙基氧羰基,盡管這些保護(hù)不是必須的。
保護(hù)Met的硫甲基的方法包括先制備甲基亞砜,然后將其還原,盡管這一方法不是必須的。
與之相對(duì),可以通過(guò)常規(guī)的方法活化羧基,已知的試劑等可以充分選擇用于活化。例如,羧基可以通過(guò)將其與多種試劑反應(yīng)形成相關(guān)的酰基氯、酸酐、或者酸酐,疊氮化物或活性酯(例如,與五氯苯酚,p-硝基苯酚,N-羥基琥珀酸亞胺、N-羥基苯并三唑或N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二羰基酰亞胺的酯)的混合物進(jìn)行活化、。
任何可用于肽鍵形成的溶劑都可用于固相合成中活性氨基和活性羧基之間的縮合反應(yīng)(肽鍵形成)。例如,無(wú)水的或水合的二甲基甲酰胺(DMF),二甲基亞砜(DMSO),吡啶、氯仿、二噁烷、二氯甲烷(DCM)、四氫呋喃(THF)、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮或六甲基磷酰三胺(HMPA)可以單獨(dú)使用或兩者或兩者以上組合使用。
上述的縮合反應(yīng)可以在縮合試劑,例如碳二亞胺試劑如二環(huán)己基羧基酰亞胺(DCC)或碳二咪唑、四乙基焦磷酸鹽和六氟磷酸苯并三唑-N-羥基-三-二甲基氨基-鏻-鹽(Bop試劑)存在的條件下進(jìn)行。
合成的肽可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行脫鹽和純化。常規(guī)技術(shù)的例子包括DEAE-纖維素上的離子交換層析、Sephadex LH-20或Sephadex G25上的分配色譜,硅膠上的正相色譜、ODS硅膠上的反相色譜和高效液相色譜。
上述純化的肽可以根據(jù)需要使用不同類型的酸將其轉(zhuǎn)化為藥用鹽的形式,例如乙酸鹽,鹽酸鹽或硫酸鹽。
肽或其鹽通過(guò)使用藥用的溶劑、賦形劑、載體或佐劑按照常規(guī)的方法制備成液體、注射劑、片劑、粉劑、顆粒、栓劑、腸溶糖衣片、滴鼻劑、吸入式制劑、口腔制劑、膠囊、滴眼液、油膏、經(jīng)皮的制劑、緩釋試劑和其他藥物給藥系統(tǒng)形式的藥物組合物用于生產(chǎn)藥物制劑。
本發(fā)明的肽或其鹽具有與已知的PACAP/VIP相同的生物活性,并可以以相同的方式使用。肽及其鹽能夠誘導(dǎo)神經(jīng)軸突形成,因此可有效用作軸突誘導(dǎo)劑。這些試劑可尤其有效預(yù)防和治療各種與神經(jīng)細(xì)胞退行相關(guān)的疾病例如阿爾茲海默癡呆、帕金森病、神經(jīng)細(xì)胞死亡、成神經(jīng)細(xì)胞瘤或健忘癥。此外,肽和其鹽可有效用于抵抗對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有害的藥物。另外,由于肽擴(kuò)張支氣管的作用它們還有效用作抗哮喘試劑,和用作內(nèi)窺鏡下胃蠕動(dòng)的抑制劑。在PACAP/VIP的例子中,包括本發(fā)明的肽或其鹽的藥物組合物還可以用于治療或預(yù)防一種或多種下述的疾病或癥狀局部腦血管缺血疾病包括腦栓塞和腦血栓,由上述的局部缺血病變或其他因素引起的顱部或外周神經(jīng)缺陷,構(gòu)象病,神經(jīng)退行性疾病,脫發(fā),勃起障礙、癡呆、腎衰竭、視神經(jīng)退行性疾病包括視神經(jīng)萎縮和局部視神經(jīng)障礙,和視網(wǎng)膜退行性疾病。所述藥物組合物還可用于改善血流,松弛支氣管平滑肌,或用于抑制已知胃腸道的活動(dòng),但其應(yīng)用不限于此。應(yīng)該注意本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PACAP/VIP肽能保護(hù)神經(jīng)抵抗導(dǎo)致構(gòu)象病的具體蛋白(日本專利申請(qǐng)2001-386699)。
本發(fā)明的藥物組合物可以安全地根據(jù)需要以腸道外地或口服或例如滴鼻液,吸入劑、緩釋試劑、滴眼液、油膏、透皮制劑或口腔制劑的給藥途徑施用給哺乳動(dòng)物如人、小鼠、大鼠、兔、狗或貓。給藥途徑、劑量形式、劑量頻率和其他條件可以由技術(shù)人員如內(nèi)科醫(yī)生根據(jù)疾病類型、期望效果和病人的總體情況來(lái)決定。給藥裝置的例子包括,但不限于,滴鼻器,如Jetlizer、Puvlizer、和鼻腔吹入器和吸入器如Spinhaler,E-haler,F(xiàn)lowCaps、Jethaler、Diskhaler、Rotahaler、Turbuhaler、Easyhaler、Accuhaler、Clickhaler、Inspir-Ease和Inhalation Aid。藥物組合物的劑量可以根據(jù)劑量形式、給藥途徑、條件和其他因素而有很多變化。當(dāng)組合物被施用到哺乳動(dòng)物包括人時(shí),例如肽以大約每公斤體重每天1pg到1mg施用給病人。在這一情況下,本發(fā)明的肽或其鹽占作為組合物的活性成分的生物活性肽的的50%重量比或更多,優(yōu)選80%重量比或更多,更優(yōu)選95%重量比或更多。這表明未由通式(I)表示的生物活性肽的含量在組合物中為50%重量比或更少,優(yōu)選20%重量比或更少,特別優(yōu)選5%重量比或更少。
本說(shuō)明書包括日本專利申請(qǐng)2002-344523的說(shuō)明書和/或附圖的部分或全部?jī)?nèi)容,該專利申請(qǐng)是本發(fā)明的優(yōu)先權(quán)文獻(xiàn)。
圖1是顯示肽4(I)和樣品(II)的色譜,其通過(guò)將肽4溶解于pH 7.0的磷酸緩沖液(濃度300μg/mL)并使溶液在55℃溫箱中保持24小時(shí)而進(jìn)行制備。
圖2顯示根據(jù)高級(jí)結(jié)構(gòu)分析方法計(jì)算的肽1,7和8高級(jí)結(jié)構(gòu)中的螺旋含量。
圖3顯示肽7和肽8與肽1(野生型VIP)相比的抑制鼠胃平滑肌收縮的相對(duì)比例。
圖4(A)顯示肽12,圖4(B)顯示肽21,圖4(C)顯示肽23對(duì)支氣管的松弛效應(yīng)。
圖5顯示對(duì)照(沒(méi)有添加肽的標(biāo)本),肽1(野生型VIP),肽4,肽12,肽21和肽23誘導(dǎo)軸突形成的作用。
圖6顯示肽4,12,21和23保護(hù)神經(jīng)免受異常朊病毒(prion)(PrP106-126)的作用,其中“##”代表與沒(méi)有肽的標(biāo)本具有顯著的差異(P<0.01),”**”代表與肽1具有顯著差異(P<0.01)。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案下文通過(guò)實(shí)施例更具體描述本發(fā)明,但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于此。
實(shí)施例1.肽的合成具有SEQ ID NO13顯示的氨基酸序列的肽12以常規(guī)的固相肽合成的方法制備。
將MBHA·HCl樹脂(聚苯乙烯-二乙烯基苯(1%)共聚物,100到200目)添加到手動(dòng)合成反應(yīng)容器中(玻璃制成,直徑6.0×29.5cm),樹脂用甲醇洗2到3次,同時(shí)進(jìn)行攪拌,然后在攪拌中對(duì)洗過(guò)的樹脂用二氯甲烷溶脹(量為樹脂的2到3倍)。在10%三乙胺/二氯甲烷中進(jìn)行中和,加入大約樹脂量2倍的對(duì)應(yīng)于C-末端端氨基酸的Boc-Arg(Tos)-OH,并加入雙環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基苯并三唑進(jìn)行縮合反應(yīng)。在反應(yīng)進(jìn)行大約2小時(shí)(同時(shí)攪拌)后,用甲醇合二氯甲烷洗滌樹脂,通過(guò)Kaiser檢測(cè)確認(rèn)消除了α-氨基,然后通過(guò)用50%三氟乙酸/二氯甲烷處理樹脂30分鐘去保護(hù)。隨后,在10%三乙胺/二氯甲烷中進(jìn)行中和,再次用甲醇和二氯甲烷洗滌,再次通過(guò)Kaiser檢測(cè)確認(rèn)去保護(hù)。在確認(rèn)后,重復(fù)相同的步驟用于偶聯(lián)位于C-末端第二位的Boc-Arg(Tos)-OH。其后,Boc-Gly-OH、Boc-Leu-OH、Boc-Ile-OH、Boc-Ala-OH、Boc-Ala-OH、Boc-Leu-OH、Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH、Boc-Arg(Tos)-OH、Boc-Arg(Tos)-OH、Boc-Val-OH、Boc-Ala-OH、Boc-Leu-OH、Boc-Gln(Xan)-OH、Boc-Arg(Tos)-OH、Boc-Arg(Tos)-OH、Boc-Leu-OH、Boc-Arg(Tos)-OH、Boc-Thr(Bzl)-OH、Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH、Boc-Asn(Xan)-OH、Boc-Asp(OcHex)-OH、Boc-Thr(Bzl)-OH、Boc-Phe-OH、Boc-Val-OH、Boc-Ala-OH、Boc-Asp(OcHex)-OH、Boc-Ser(Bzl)-OH和Boc-His(Bom)-OH進(jìn)行順序偶聯(lián)和去保護(hù),以獲得對(duì)應(yīng)于肽12的保護(hù)的肽His(Bom)-Ser (Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr (Bzl)-Asp (OcHex)-Asn-Tyr (Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-MBHA。無(wú)水的氟化氫添加到保護(hù)的肽MBHA樹脂上,并在乙二硫醇和茴香醚存在的條件下彼此反應(yīng)。反應(yīng)后,通過(guò)減壓蒸餾去除無(wú)水氟化氫,用醚洗滌殘留物,向其中加入10%乙酸以提取肽。提取物通過(guò)反相色譜純化并凍干得到肽12。
下面的肽1到肽33是使用與上述相同的方式化學(xué)合成得到的。
肽1(SEQ ID NO2)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2肽2(SEQ ID NO3)
His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-NH2肽3(SEQ ID NO4)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys-NH2肽4(SEQ ID NO5)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Arg-Arg-NH2肽5(SEQ ID NO6)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2肽6(SEQ ID NO7)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg-NH2肽7(SEQ ID NO8)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-NH2肽8(SEQ ID NO9)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met(O)-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-NH2肽9(SEQ ID NO10)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2肽10(SEQ ID NO11)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2肽11(SEQ ID NO12)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Asn-NH2肽12(SEQ ID NO13)
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2肽13(SEQ ID NO14)乙酰基-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2肽14(SEQ ID NO15)硬脂?;?His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2肽15(SEQ ID NO16)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-OH肽16(SEQ ID NO17)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Nle-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Glu-Arg-Arg-NH2肽17(SEQ ID NO18)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-NH2肽18(SEQ ID NO19)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Lys-NH2肽19(SEQ ID NO20)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-NH2肽20(SEQ ID NO21)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Lys-Arg-NH2肽21(SEQ ID NO22)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2肽22(SEQ ID NO23)
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2肽23(SEQ ID NO24)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Ala-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2肽24(SEQ ID NO25)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Ala-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2肽25(SEQ ID NO26)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2肽26(SEQ ID NO27)His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2肽27(SEQ ID NO28)His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2肽28(SEQ ID NO29)乙?;?His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Ieu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2肽29(SEQ ID NO30)His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg-NH2肽30(SEQ ID NO31)His-Ser-Asp-Ala-ne-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg-NH2肽31(SEQ ID NO32)His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2肽32(SEQ ID NO33)
乙?;?His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2肽33(SEQ ID NO34)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2實(shí)施例2.肽4的穩(wěn)定性肽4,比野生型VIP具有更高的Arg含量的修飾肽被稱重并分成大約1mg的小份,這些小份溶解于pH調(diào)整到4.0,5.0,6.0和7.0的蒸餾水(Otsuka蒸餾水)中,并調(diào)整終濃度為10μg/mL。得到的溶液在40℃溫箱(LH20-11M,Nagano Kagaku)放置24小時(shí),通過(guò)反相HPLC進(jìn)行分析(波長(zhǎng)220nm,流動(dòng)相28%乙腈/0.1%三氟乙酸;柱ODS-120T(Tosoh);柱溫度25℃),然后檢查剩余的肽4的含量。如表2所示,在大約中性pH區(qū)域肽的降解顯著。
表2
實(shí)施例3突變的肽4的氨基酸和LC-MS分析肽4溶解于磷酸鹽緩沖液(pH 7.0;濃度300μg/mL)中,并在55℃溫箱放置24小時(shí)。獲得如圖1(II)所示的譜圖。圖1(I)是顯示肽4(對(duì)照)的表。突變體A和B通過(guò)HPLC分成級(jí)分,然后進(jìn)行氨基酸分析。突變體的氨基酸分析與表3顯示的肽4的理論值基本在相同水平。
表3
結(jié)果顯示突變體的氨基酸序列與肽4的非常相似,只有酸性氨基酸Asx和Glx與其有不同。
此外,通過(guò)LC-MS測(cè)量這些突變體的分子量,結(jié)果顯示于表4。
表4
表4顯示的結(jié)果表明所有突變體的分子量與肽4相比增加1。如果考慮氨基酸分析的結(jié)果,這意味著Asn轉(zhuǎn)化為Asp或Gln轉(zhuǎn)化為Glu。根據(jù)肽4的氨基酸序列,據(jù)推測(cè)在含Asn的區(qū)域形成了琥珀酰胺,同時(shí)去除了氨基酸殘基,因此分子量增加了1。所以可以確定在肽4的24和25位的Asn-Ser序列或28和29位Asn-Gly序列發(fā)生了α-ω轉(zhuǎn)肽作用。
實(shí)施例4.肽7和肽8的結(jié)構(gòu)VIP(肽1,SEQ ID NO2),對(duì)應(yīng)于VIP的N端的25個(gè)殘基的肽7(SEQ ID NO8)和肽7的甲硫氨酸17被氧化的衍生物肽8,溶解于20mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.4),使用Jssco J-720(Jasco公司)檢測(cè)其圓二色譜。根據(jù)Greenfield等高級(jí)結(jié)構(gòu)分析計(jì)算,肽1的螺旋含量為大約50%。雖然肽7含有大量這些高級(jí)結(jié)構(gòu),帶有氧化的甲硫氨酸的肽8的螺旋含量降低到大約肽1的一半,這顯示顯著的結(jié)構(gòu)改變。
實(shí)施例5.肽7和肽8的藥學(xué)活性9周齡的ICR小鼠預(yù)飼養(yǎng)1周,然后在其10到18周齡的階段內(nèi)使用。在小鼠接受頸脊柱脫位后,立即隨后進(jìn)行腹部手術(shù)以切除整個(gè)胃,用生理鹽水徹底沖洗胃的內(nèi)面以準(zhǔn)備標(biāo)本。完成的標(biāo)本懸浮在Magus池中(體積20mL;溫度37℃;重量2g;用95%CO2和5%CO2充氣,Riken Kaihatsu)。使用Krebs-Henseleit緩沖液修飾的溶液(Sigma)作為生理溶液。使用記錄儀R-64M(Rika Denki)通過(guò)放大器RMP-6004(Nihon Kohden公司)記錄反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中,標(biāo)本安放在Magnus設(shè)備上,在基線穩(wěn)定后向標(biāo)本上施加100μL碳酰膽堿溶液(濃度6×10-3M)。在其后10分鐘加入純化的肽的樣品溶液,觀察對(duì)標(biāo)本的松弛效果。肽1(野生型VIP)對(duì)抗碳酰膽堿誘導(dǎo)的收縮的作用設(shè)定為100%,測(cè)定加入肽7或肽8時(shí)對(duì)平滑肌收縮的最大抑制。圖3相對(duì)顯示在肽1,7和8的終濃度為10-6M時(shí),鼠胃平滑肌收縮的最大抑制。肽8的活性與肽7的相比明顯減弱,這表明甲硫氨酸殘基氧化具有強(qiáng)烈的影響。根據(jù)實(shí)施例4,該減弱的活性還與化合物的螺旋含量密切相關(guān)。更具體地,VIP/PACAP的甲硫氨酸殘基的氧化誘導(dǎo)分子水平的高級(jí)結(jié)構(gòu)的改變并顯著影響活性。
實(shí)施例6.肽12的穩(wěn)定性足量的肽12通過(guò)稱重被分成小份,溶解于蒸餾水中(1mg/mL,Otsuka蒸餾水),用0.1N的NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0和7.0。此外,肽12被稀釋到10μg/mL,然后在40℃溫箱中放置24小時(shí)。然后進(jìn)行反相HPLC分析(波長(zhǎng)220nm,流動(dòng)相29%乙腈/0.1%三氟乙酸;柱ODS-120T(Tosoh);柱溫度25℃)以檢測(cè)剩余的肽12的量。結(jié)果,標(biāo)本在pH6.0或7.0的水平?jīng)]有觀察到有明顯不一致的峰產(chǎn)生。這表明肽12是穩(wěn)定的。
實(shí)施例7.肽4,12,21和23的穩(wěn)定性足量的肽通過(guò)稱重被分成小份,然后溶解于pH值調(diào)節(jié)到6.0和7.0的蒸餾水中(Otsuka Distilled Water),使終濃度為10μg/mL,得到的溶液在55℃溫箱中(FC-610,Advantec)放置3天,然后進(jìn)行反相HPLC分析(波長(zhǎng)220nm,流動(dòng)相29.5%乙腈/0.1%三氟乙酸;柱ODS-120T(Tosoh);柱溫度25℃)檢測(cè)剩余的肽4,12,21和23的量。如表5顯示,肽4,12,21和23的穩(wěn)定性與肽4相比顯著提高。在pH7.0使尤其明顯。
表5
實(shí)施例8.肽4,12,21和23的穩(wěn)定性足量的肽4,12,21和23通過(guò)稱重被分成小份,溶解于調(diào)節(jié)pH至7.0的蒸餾水中(1mg/mL,Otsuka蒸餾水),使終濃度為100μg/mL。得到的溶液在55℃溫箱(FC-610,Advantec)中放置0,10,20和30天。然后進(jìn)行反相HPLC分析(波長(zhǎng)220nm,流動(dòng)相29.5%乙腈/0.1%三氟乙酸;柱ODS-120T(Tosoh);柱溫度25℃)檢測(cè)剩余的肽4,12,21和23的量。如表6顯示,肽4在儲(chǔ)存10天后完全消失,而肽12,21和23在30天后仍然保留。這表明其穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。
表6
實(shí)施例9.肽4,12,21和23的穩(wěn)定性足量的肽4,12,21和23通過(guò)稱重被分成小份,然后溶解于調(diào)節(jié)pH至6.0和7.0的磷酸鹽緩沖液(0.001%的磷酸二氫鈉的水溶液)中,使終濃度為100μg/mL。得到的溶液在40℃和75%RH的thermo-hygrostat(LH-20-11,Nagano Kagaku)溫箱中放置一周,然后進(jìn)行反相HPLC分析(波長(zhǎng)220nm,流動(dòng)相29.5%乙腈/0.1%三氟乙酸;柱ODS-120T(Tosoh);柱溫度25℃)檢測(cè)剩余的肽4,12,21和23的量。如表7顯示,肽12,21和23的穩(wěn)定性比肽4顯著增強(qiáng)。
表7
實(shí)施例10.肽4,12,21和23的穩(wěn)定性足量的肽4,12,21和23通過(guò)稱重被分成小份,溶解于調(diào)節(jié)pH至7.0的磷酸鹽緩沖液中(0.001%磷酸二氫鈉的水溶液),使終濃度為100μg/mL。得到的溶液在40℃和75%RH的thermo-hygrostat(LH-20-11,Nagano Kagaku)溫箱中放置0,10,20和30天,并進(jìn)行反相HPLC分析(波長(zhǎng)220nm,流動(dòng)相29.5%乙腈/0.1%三氟乙酸;柱ODS-120T(Tosoh);柱溫度25℃)檢測(cè)剩余的肽4,12,21和23的量。如表8顯示,肽12,21和23的穩(wěn)定性比肽4顯著增強(qiáng)。此外,肽4在30天后消失,而肽12,21,23還保留。
表8
實(shí)施例11.對(duì)胃蠕動(dòng)的抑制作用肽9,10和33對(duì)胃蠕動(dòng)的抑制作用通過(guò)與實(shí)施例5相同的方式來(lái)檢查。采用9周齡的ICR小鼠。在小鼠接受頸脊柱脫位后,隨后立即進(jìn)行腹部手術(shù)以切除整個(gè)胃,用生理鹽水徹底沖洗胃的內(nèi)面以準(zhǔn)備標(biāo)本。完成的標(biāo)本懸浮在Magus池中(體積20mL;溫度37℃;重量2g;用95%CO2和5%CO2充氣,Riken Kaihatsu)。使用Krebs-Henseleit緩沖液修飾溶液(Sigma)作為生理溶液。使用記錄儀R-64M(Rika Denki)通過(guò)放大器RMP-6004(Nihon Kohden公司)記錄反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中,標(biāo)本安放在Magnus設(shè)備上,在基線穩(wěn)定后向標(biāo)本上施加100μL碳酰膽堿溶液(濃度3×10-6M)。當(dāng)收縮穩(wěn)定后,加入測(cè)試肽(10-6M),觀察對(duì)標(biāo)本的松弛效果。在施加碳酰膽堿之前的收縮程度設(shè)定為0%,其添加并穩(wěn)定后收縮程度設(shè)定為100%,測(cè)定加入樣品溶液對(duì)胃收縮的抑制水平。表9顯示各物質(zhì)在施用藥物后15分鐘抑制收縮的水平。表9顯示各物質(zhì)(肽10和33)抑制收縮的水平,假定作為對(duì)照的肽9的水平為100。
表9
實(shí)施例12.對(duì)支氣管平滑肌的松弛作用通過(guò)以下的方式來(lái)檢查肽12,21和23是否能暫時(shí)收縮擴(kuò)張的支氣管平滑肌。
7周齡的Hartley雄性豚鼠(440g,日本SLC)在麻醉下通過(guò)股動(dòng)脈放血而處死,打開其胸廓以摘除氣管。盡可能除去吸附在氣管上的脂肪組織等,去除的組織沿軟骨切開至覆蓋4或5個(gè)軟骨的寬度,食道對(duì)面的軟骨被縱長(zhǎng)切片。從上、中、下食道獲得的切片用作標(biāo)本。標(biāo)本懸浮在Magus池中(體積20mL;溫度37℃;重量0.5g;用95%CO2和5%CO2充氣)。使用Krebs-Henseleit緩沖液修飾溶液(Sigma)作為生理溶液。在記錄儀R-64M(Rika Denki)上通過(guò)放大器RMP-6004(NihonKohden公司)使用等量度傳感器(TB-611T,Nihon,Kohden公司)記錄反應(yīng)。在碳酰膽堿(3×10-7M)誘導(dǎo)的收縮穩(wěn)定后,累計(jì)施加肽12(10-9M到3×10-6M),和單次施加肽21和肽23(3×10-6M)。測(cè)量之后,施加異丙腎上腺素(10-6M),這時(shí)獲得的值被設(shè)定為“100%松弛”,而各測(cè)試物質(zhì)的放松水平在此基礎(chǔ)上測(cè)定。如圖4所示這表明肽12,21和23具有顯著的肽添加依賴性的松弛氣管的作用。
實(shí)施例13.誘導(dǎo)神經(jīng)突觸形成的作用以下面描述的方式測(cè)試肽1,4,12,21和23誘導(dǎo)神經(jīng)突觸形成的作用。PC-12細(xì)胞培養(yǎng)在含有5%馬血清和5%胎牛血清的Dulbecco氏修飾的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)在5%CO2和95%空氣存在的條件下在37℃培養(yǎng)。用胰蛋白酶將細(xì)胞與培養(yǎng)瓶分離,然后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為1.0×104細(xì)胞/mL。含有細(xì)胞的液體培養(yǎng)基以各1mL被加到Biocoat IV膠原蛋白包被的24孔板中然后在5%CO2和95%空氣存在的條件下在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后更換培養(yǎng)基,同時(shí)添加肽(100nM)。上述培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)3天然后拍照。圖5顯示照片。每個(gè)照片中的比例尺代表100μm。如照片中顯示,肽4,12,,21和23與對(duì)照中的情況(不添加肽的標(biāo)本)和肽1(野生型VIP)相比顯著誘導(dǎo)神經(jīng)突觸形成。
實(shí)施例14.神經(jīng)保護(hù)作用已經(jīng)證實(shí)正常的朊病毒通過(guò)構(gòu)象轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)變?yōu)楫惓5碾貌《?J.Neurochem,2000,Vol.75,pp 2536-2545)。于是,使用作為大腦和神經(jīng)系統(tǒng)研究模型的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤衍生的PC12細(xì)胞來(lái)檢測(cè)朊病毒蛋白(106-126)異常折疊導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。PC12細(xì)胞在含有5%馬血清和5%胎牛血清的Dulbecco氏修飾的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)中在5%CO2和95%空氣存在的條件下在37℃培養(yǎng)。用胰蛋白酶將細(xì)胞與培養(yǎng)瓶分離,然后在96孔板上培養(yǎng)(104細(xì)胞/孔)。朊病毒(106-126,50μM,American Peptide Company Inc)和10-7神經(jīng)肽(肽1,4,12,21和23)被添加到培養(yǎng)的PC12細(xì)胞中,通過(guò)WST-8分析計(jì)算活細(xì)胞數(shù)量,并定量對(duì)異常朊病毒的神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果顯示于圖6。肽1(野生型VIP)的活細(xì)胞數(shù)比不含肽的標(biāo)本的活細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著多(##,P<0.01),并且肽1顯示顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。此外,肽4,12,21和23的神經(jīng)保護(hù)作用比肽1的顯著要高(**,P<0.01)。
實(shí)施例15.生產(chǎn)吸入制劑和滴鼻劑的制劑的生產(chǎn)基本根據(jù)日本專利公開(Kokai)2003-34652揭示的生產(chǎn)粉末試劑的方法來(lái)生產(chǎn)用于生產(chǎn)吸入制劑和滴鼻劑的制劑。
研磨條件使用的設(shè)備 A-O-Jet 研磨機(jī)(Seishin Enterprise Co.,Ltd.)給料的方式 自動(dòng)給料給料空氣壓力 6.0Kg/cm2G研磨空氣壓力 6.5Kg/cm2G
灰塵收集 收集袋在以上描述的方法中,肽4,12,21和23用乳糖或赤藻糖醇稀釋。赤藻糖醇載體(平均顆粒直徑70μm)或乳糖載體(平均顆粒直徑50μm)使用不帶電的袋與精細(xì)研磨的產(chǎn)品以產(chǎn)品載體為0.4∶1的比例混合。
實(shí)施例16.滴眼液的生產(chǎn)神經(jīng)肽 10mg硼酸 700mg硼酸鈉 足量氯化鈉 500mg羥甲基纖維素 0.5g乙二胺四乙酸鈉 0.005mgpH 7.0無(wú)菌的純凈水 加滿(總共100mL)無(wú)菌的純凈水(80mL)被加熱到大約80℃,向其中加入羥甲基纖維素,攪動(dòng)得到的混合物,并將液體的溫度冷卻至室溫。神經(jīng)肽、氯化鈉、硼酸鈉、乙二胺四乙酸鈉和苯扎氯銨(Benzalkonium Chloride)被加入并溶解于上述液體。加入足量的硼酸鈉使pH為7.0。溶液的總量通過(guò)添加無(wú)菌的純凈水精確調(diào)節(jié)到100mL。
肽4,12,21和23用作神經(jīng)肽。
實(shí)施例17.注射制劑的生產(chǎn)神經(jīng)肽10mg氯化鈉900mg1N氫氧化鈉足量注射用蒸餾水 加滿(總量100mL)
這些組分根據(jù)常規(guī)的注射制劑的制備技術(shù)無(wú)菌混合。肽4,12,21和23用作神經(jīng)肽。
此處引用的所有公開物,專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖巳囊胱鳛閰⒖肌?br>
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明可以提供可長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存并避免由于產(chǎn)生副產(chǎn)物而導(dǎo)致不需要的副作用的PACAP/VIP衍生物。
序列列表文本文件SEQ ID NO1合成肽SEQ ID NO2合成肽SEQ ID NO3合成肽SEQ ID NO4合成肽SEQ ID NO5合成肽SEQ ID NO6合成肽SEQ ID NO7合成肽SEQ ID NO8合成肽SEQ ID NO9合成肽SEQ ID NO10合成肽SEQ ID NO11合成肽SEQ ID NO12合成肽SEQ ID NO13合成肽SEQ ID NO14合成肽SEQ ID NO15合成肽SEQ ID NO16合成肽SEQ ID NO17合成肽SEQ ID NO18合成肽SEQ ID NO19合成肽SEQ ID NO20合成肽
SEQ ID NO21合成肽SEQ ID NO22合成肽SEQ ID NO23合成肽SEQ ID NO24合成肽SEQ ID NO25合成肽SEQ ID NO26合成肽SEQ ID NO27合成肽SEQ ID NO28合成肽SEQ ID NO29合成肽SEQ ID NO30合成肽SEQ ID NO31合成肽SEQ ID NO32合成肽SEQ ID NO33合成肽SEQ ID NO34合成肽序列表<110>伊藤火腿株式會(huì)社(ITOHAM FOODS INC.)<120>肽及含有所述肽的藥物組合物(A peptide and a pharmaceuticalcomposition containing the peptide)<130>SCT052154-66<150>JP2002/344523<151>2002-11-27<160>34<170>PatentIn Ver. 2.0<210>1<211>27<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
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<223>Description of Artificial SequenceSynthetic Peptide<220>
<221>MOD_RES<222>(23)<223>AMIDATION<400>32His Ser Asp Ala Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln1 5 10 15Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu20<210>33<211>23<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceSynthetic Peptide<220>
<221>MOD_RES<222>(1)
<223>ACETYLATION<220>
<221>MOD_RES<222>(23)<223>AMIDATION<400>33His Ser Asp Ala Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln1 5 10 15Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu20<210>34<211>23<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceSynthetic Peptide<220>
<221>MOD_RES<222>(23)<223>AMIDATION<400>34
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln1 5 10 15Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu20
權(quán)利要求
1.由通式(I)代表的肽的N-末端至少23個(gè)殘基組成的肽或其藥用鹽His-Ser-Asp-Ala-A-Phe-Thr-B-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-H-I-Tyr-Leu-Ala-Ala-J-K-L(SEQ ID NO1)(I)其中A代表Val或Ile;B代表Asp,Glu,或Ala;C代表Asn或Ser;D代表Thr或Ser;E代表Leu或Tyr;F,H和I每個(gè)獨(dú)立地代表Lys或Arg;G代表Leu或nLeu;J代表Ile或Val;K代表Leu,Leu-Asn,Leu-Gly,Leu-Gly-Lys,Leu-Gly-Arg Leu-Gly-Lys-Lys,Leu-Gly-Lys-Arg,Leu-Gly-Arg-Arg,Leu-Gly-Lys-Arg-Tyl-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys,或Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg;并且L代表可以被修飾的C-末端氨基酸的α-羧基基團(tuán)的一部分;即-NH2或-OH。
2.權(quán)利要求1的肽或其藥用鹽,由通式(I)代表的肽的N-末端的23個(gè)殘基組成,其中A代表Val;B代表Asp;C代表Asn;D代表Thr;E代表Leu;F,H和I每個(gè)獨(dú)立地代表Arg;G代表Leu;并且L代表-NH2。
3.權(quán)利要求1的肽或其藥用鹽,其中在通式(I)中,A代表Val;B代表Asp;C代表Asn;D代表Thr;E代表Leu;F,H和I每個(gè)獨(dú)立地代表Arg;G代表Leu;J代表Ile;K代表Leu-Gly-Arg-Arg;并且L代表-NH2。
4.權(quán)利要求1的肽或其藥用鹽,其中在通式(I)中,A代表Val;B代表Glu;C代表Asn;D代表Thr;E代表Leu F,H和I每個(gè)獨(dú)立地代表Arg;G代表Leu;J代表Ile;K代表Leu-Gly-Arg-Arg;L代表-NH2。
5.權(quán)利要求1的肽或其藥用鹽,其中在通式(I)中,A代表Val;B代表Ala;C代表Asn;D代表Thr;E代表Leu;F,H和I每個(gè)獨(dú)立地代表Arg;G代表Leu;J代表Ile;K代表Leu-Gly-Arg-Arg;并且L代表-NH2。
6.權(quán)利要求1的肽或其藥用鹽,其中在通式(I)中,A代表Val;B代表Asp;C代表Asn;D代表Thr;E代表Leu;F,H和I每個(gè)獨(dú)立地代表Arg;G代表Leu;J代表Val;K代表Leu-Gly-Arg-Arg;并且L代表-NH2。
7.權(quán)利要求1的肽或其藥用鹽,其中在通式(I)中,A代表Ile;B代表Asp;C代表Ser;D代表Ser;E代表Tyr;F,H和I每個(gè)獨(dú)立代表Arg;G代表Leu;J代表Val;K代表Leu-Gly-Arg-Arg;并且L代表-NH2。
8.權(quán)利要求1的肽或其藥用鹽,其中在通式(I)中,A代表Ile;B代表Asp;C代表Ser;D代表Ser;E代表Tyr;F,H和I每個(gè)獨(dú)立地代表Arg;G代表Leu;J代表Val;K代表Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg;并且L代表-NH2。
9.權(quán)利要求1的肽或其藥用鹽,其由通式(I)代表的肽的N-末端23個(gè)殘基組成,其中A代表Ile;B代表Asp;C代表Ser;D代表Ser;E代表Tyr;F,H和I每個(gè)獨(dú)立地代表Arg;G代表Leu;L代表-NH2。
10.藥物組合物,含有權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)的肽或其藥用鹽。
11.權(quán)利要求10的藥物組合物,其包括權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)的肽或其藥用鹽,其含量以作為活性成分的全部生物活性肽重量計(jì)為至少50wt%。
12.權(quán)利要求10或11的藥物組合物用于治療或預(yù)防一種或多種選自下列的疾病或癥狀包括腦栓塞和腦血栓的缺血性腦血管疾病,對(duì)中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)產(chǎn)生毒性的疾病,構(gòu)象病,神經(jīng)退行性疾病,脫發(fā),勃起功能障礙,癡呆,腎衰竭,包括視神經(jīng)萎縮和缺血性視神經(jīng)病變的神經(jīng)退行性疾病,以及視網(wǎng)膜退行性疾病,以提改善血流,松弛支氣管平滑肌或抑制胃腸道的運(yùn)動(dòng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有衍生自PACAP肽或VIP肽的肽或其藥用鹽作為活性成分的藥物組合物。因此本發(fā)明提供在溶液中互變異構(gòu)化得以抑制并且可以長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用于臨床的PACAP/VIP衍生物。這些肽可有效緩解諸如神經(jīng)退行性疾病、勃起功能障礙和支氣管哮喘等疾病的癥狀。
文檔編號(hào)A61P7/02GK1732182SQ20038010776
公開日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月27日
發(fā)明者尾上誠(chéng)良, 遠(yuǎn)藤?gòu)V介, 松本麻美 申請(qǐng)人:伊藤火腿株式會(huì)社