專(zhuān)利名稱(chēng)：中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療方法
本申請(qǐng)要求2002年12月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)No.60/437,104的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)?jiān)诒疚闹斜徽w引用作為參考。
背景中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，包括脊髓損傷，可能是最具破壞性和致殘性的損傷之一。根據(jù)損傷的嚴(yán)重程度，會(huì)導(dǎo)致不同程度的癱瘓。下肢癱瘓和四肢癱瘓通常是由脊髓嚴(yán)重?fù)p傷造成的。其對(duì)受害者(可以是人或者動(dòng)物)產(chǎn)生的影響是嚴(yán)重的?；颊邥?huì)陷于一種幾乎不能行動(dòng)或者更糟的狀態(tài)。對(duì)于人類(lèi)而言，由這種嚴(yán)重軀體殘疾引起的精神創(chuàng)傷會(huì)比軀體殘疾本身更具破壞性。
在哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，神經(jīng)纖維在損傷或疾病后開(kāi)始再生，但卻突然停止生長(zhǎng)且無(wú)法形成功能性連接。這一形成神經(jīng)連接的故障阻止了神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)通過(guò)損傷區(qū)域，這是疾病或CNS損傷后災(zāi)難性的行為能力缺失的生物學(xué)基礎(chǔ)?？朔@一障礙的一種方法在損傷區(qū)域提供一些能誘導(dǎo)顯著神經(jīng)再生的刺激。雖然這已經(jīng)通過(guò)植入外周神經(jīng)橋，導(dǎo)入神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)或腦衍生神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)等化學(xué)生長(zhǎng)因子，或者運(yùn)用電刺激等方法在有限情況下的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得以實(shí)現(xiàn)，但是這些方法中的任何一個(gè)都存在著限制或排斥其運(yùn)用于人體的嚴(yán)重不足。例如，沒(méi)有證據(jù)表明外周神經(jīng)橋確實(shí)在動(dòng)物中改善了行為能力的喪失。因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)需要冒著額外損傷的危險(xiǎn)進(jìn)行大量的脊髓手術(shù)或腦手術(shù)，外科醫(yī)生也不太可能采納外周神經(jīng)橋的使用。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NGF和BDNF等生長(zhǎng)因子的導(dǎo)入具有顯著的副作用，會(huì)加重患者病情和/或刺激潛伏腫瘤的生長(zhǎng)。
而且，盡管采用如振蕩場(chǎng)電刺激(OFS)的技術(shù)進(jìn)行電刺激已經(jīng)發(fā)展成為一種前景良好的脊髓損傷治療方法，外加電壓仍然存在問(wèn)題。只有在損傷后最初的3個(gè)星期內(nèi)將OFS刺激器植入到狗和動(dòng)物體內(nèi)，OFS方法才能發(fā)揮作用。很明顯，這一技術(shù)在慢性損傷的患者中不引起神經(jīng)再生。到目前為止，在超過(guò)100例慢性損傷(損傷后2個(gè)月以上)的實(shí)驗(yàn)豚鼠中，OFS方法沒(méi)能引起神經(jīng)再生(Borgens等，(1993)RestorNeurol and Neurosci 5，173-179)。由于預(yù)計(jì)存在約250,000-350,000名長(zhǎng)時(shí)間脊髓損傷的患者，無(wú)法成功治療慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提出了一個(gè)根本性挑戰(zhàn)。
因此，需要有能在CNS損傷(尤其是慢性CNS損傷)中促進(jìn)神經(jīng)再生的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種治療患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷(包括脊髓損傷)的方法。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一種結(jié)合電刺激(如振蕩場(chǎng)電刺激(OFS))運(yùn)用和嘌呤核苷或其類(lèi)似物(如肌苷)給藥的二分療法能引起神經(jīng)再生，起到在CNS損傷的患者中至少部分恢復(fù)神經(jīng)機(jī)能和行為能力的效果。本發(fā)明的方法對(duì)于治療急性和慢性損傷都有效。同時(shí)使用嘌呤核苷或其類(lèi)似物(如肌苷)，擴(kuò)大了OFS治療慢性CNS損傷的療效。
一方面，本發(fā)明提供了一種治療脊髓損傷患者的方法，這一方法包括在損傷位置進(jìn)行電刺激和對(duì)患者進(jìn)行嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥，使得受損脊髓至少部分恢復(fù)，和/或使脊髓損傷位置的神經(jīng)再生被激活?？梢酝ㄟ^(guò)為患者植入一個(gè)裝置，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)損傷位置的電刺激。較佳地，這一裝置是振蕩場(chǎng)電刺激(OFS)裝置。
另一方面，本發(fā)明提供了一種在能有效激活損傷位置神經(jīng)再生的情況下，和/或在能有效地至少部分恢復(fù)受損脊髓中的神經(jīng)功能的情況下，通過(guò)對(duì)患者進(jìn)行嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥，來(lái)治療脊髓損傷患者的方法。
脊髓損傷可以是脊髓的完全切斷，脊髓的部分切斷，或者脊髓的壓砸傷或壓迫傷。脊髓損傷可以發(fā)生在治療前3個(gè)月以上，治療前3個(gè)星期以上，或者治療前2星期以上。
神經(jīng)功能的恢復(fù)可以通過(guò)神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)的恢復(fù)、傳導(dǎo)動(dòng)作電位的可檢測(cè)升高、解剖學(xué)連續(xù)性檢測(cè)、一個(gè)以上脊髓根水平的恢復(fù)、反射行為的增加，或其組合來(lái)證明。
嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以是對(duì)患者進(jìn)行全身給藥，包括口服或皮下給藥。嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以是對(duì)脊髓損傷部位進(jìn)行局部給藥。嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以通過(guò)為患者植入一個(gè)嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥裝置來(lái)給藥。嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以用藥學(xué)上可接受的載體來(lái)局部給藥。優(yōu)選的嘌呤核苷包括肌苷。
本發(fā)明還包括一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷的治療試劑盒，這一試劑盒包括第一成分，一種在損傷部位進(jìn)行電刺激的方法；和第二成分，一種嘌呤核苷或其類(lèi)似物。在某些實(shí)施方案中，在損傷部位進(jìn)行電刺激的方法是振蕩場(chǎng)電刺激(OFS)裝置。在某些實(shí)施方案中，嘌呤核苷或其類(lèi)似物包括肌苷。在某些實(shí)施方案中，這一試劑盒還包括一種用于皮下、靜脈內(nèi)或鞘內(nèi)輸遞嘌呤核苷或其類(lèi)似物的裝置。在某些實(shí)施方案中，這一試劑盒還包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷治療的書(shū)面說(shuō)明。
定義如本文所用，術(shù)語(yǔ)“患者”包括易遭受中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述患者是人?；颊叩钠渌影茵B(yǎng)寵物(如狗和貓)或其它哺乳動(dòng)物(如羊和牛)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“中樞神經(jīng)系統(tǒng)”或“CNS”包括腦和脊髓的神經(jīng)組織。該術(shù)語(yǔ)不包括外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“脊髓”包括脊柱的所有神經(jīng)元結(jié)構(gòu)。
除非另有說(shuō)明，“一個(gè)”、“這一”和“至少一個(gè)”可以互換使用，指一個(gè)或一個(gè)以上。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示作為脊髓損傷的行為能力指標(biāo)的皮膚肌干(CTM)反射。如圖1A所示，在豚鼠左側(cè)標(biāo)出了皮膚肌干(CTM)反射的傳入路徑和傳出路徑。在豚鼠脊髓的右側(cè)的脊髓損傷(為了便于說(shuō)明，用一個(gè)大缺口標(biāo)出)只中斷了這一側(cè)上行性CTM束。在背部皮膚上產(chǎn)生了一個(gè)不再對(duì)觸覺(jué)刺激產(chǎn)生反應(yīng)的區(qū)域(反射消失區(qū))。圖1B顯示完整的CTM感受域的概圖。這一區(qū)域內(nèi)的觸覺(jué)探測(cè)會(huì)引起背部皮膚的抽搐，而在這個(gè)區(qū)域外，刺激不會(huì)引起CTM皮膚收縮。從上方，將一系列對(duì)鎮(zhèn)靜動(dòng)物的皮膚輕微觸覺(jué)刺激情況進(jìn)行錄像，并用計(jì)算機(jī)重新構(gòu)圖。圖1C顯示了全寬脊髓壓迫損傷的結(jié)果。在CTM感受域的下半部分標(biāo)出的區(qū)域是反射消失區(qū)。正是這CTM感受域的下半部分不再對(duì)觸覺(jué)刺激作出應(yīng)答。圖1D標(biāo)出了CTM恢復(fù)的區(qū)域。在這一區(qū)域內(nèi)，CTM應(yīng)答性已經(jīng)恢復(fù)。圖1E是一個(gè)顯示畫(huà)在動(dòng)物去毛背部上的點(diǎn)狀坐標(biāo)的錄像重構(gòu)圖。
圖2顯示用內(nèi)置標(biāo)記裝置進(jìn)行的橫切面組織學(xué)檢測(cè)。在所有的脊髓顯微照片中，脊髓都是按照長(zhǎng)軸由照片的頂部到底部的方向?！绊敳俊笔穷^端(頭側(cè))，而尾側(cè)(尾端)在底部。在圖2A的照片中可以看到脊髓的兩側(cè)邊緣。但在圖2B中只能看到右側(cè)的邊緣。陰影線代表由標(biāo)記物確定的橫切面。在圖2A中，盡管標(biāo)記物從插入的中線位置移到了靠近脊髓右側(cè)邊緣的位置，移除標(biāo)記物后留下的洞還清晰可見(jiàn)。由于可以根據(jù)疤痕和洞的殘余部分缺少軸突來(lái)清楚地確定橫切面的左側(cè)邊緣，即使在這些脊髓中還是可以很方便地確定橫切面。如圖2B所示，在另一個(gè)組織切片中標(biāo)記物移向了右側(cè)。圈出的區(qū)域是一個(gè)充滿(mǎn)了巨噬細(xì)胞的囊泡，在圖2D中進(jìn)一步放大顯示。圖2C中顯示了一個(gè)位于脊髓中心的標(biāo)記物洞(邊緣在視野之外)。要注意的是，在標(biāo)記物洞的殘余部分中(圖2E)，長(zhǎng)軸突在相鄰的疤痕組織中雜亂排列，在右側(cè)半切斷手術(shù)的殘余部分的未受損實(shí)質(zhì)中有序排列。橫切面延伸到脊髓的右側(cè)邊緣，在視野之外。
圖3顯示了實(shí)驗(yàn)性治療后的上行(區(qū)域1到4，從左向右移動(dòng))和下行(區(qū)域1到4，從右向左移動(dòng))軸突投射。本圖中，脊髓的頭(吻)端畫(huà)在右側(cè)，末(尾)端畫(huà)在左側(cè)。在圖的中部，用從中線到圖右側(cè)邊緣的粗黑線標(biāo)出了右側(cè)半切斷(只切斷脊髓的右側(cè))的位置。用淺灰色和黑色(分別代表從尾側(cè)和頭側(cè)標(biāo)記)標(biāo)出的纖維投射穿過(guò)了橫切面(根據(jù)標(biāo)記物洞的位置確定)。在脊髓的右側(cè)，圖示的纖維可終止在距橫切面較遠(yuǎn)的位置上(小于250μm；區(qū)域1)或投射到橫切面250μm以?xún)?nèi)或更近的位置(區(qū)域2)。也發(fā)現(xiàn)有纖維終止于橫切面上，有時(shí)沿著平面邊緣運(yùn)動(dòng)一小段距離(區(qū)域3)，或者繞過(guò)或經(jīng)過(guò)橫切面投射進(jìn)入相鄰的椎節(jié)(區(qū)域4)。
示例性實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明主要涉及治療哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷(包括但不限于脊髓損傷)，使之至少部分恢復(fù)神經(jīng)功能的方法。本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)了一種結(jié)合對(duì)受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行電刺激和嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥的二分療法，在急性和慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中都能引起神經(jīng)再生和修復(fù)神經(jīng)功能。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用振蕩場(chǎng)電刺激(OFS)和嘌呤核苷肌苷的聯(lián)合療法來(lái)進(jìn)行脊髓損傷的治療，用于在急性和慢性脊髓損傷中引起脊髓神經(jīng)再生以及神經(jīng)機(jī)能和行為能力的恢復(fù)。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各種損傷都可以用本發(fā)明的方法來(lái)治療。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“損傷”一般指神經(jīng)細(xì)胞膜的破裂，以致于神經(jīng)細(xì)胞膜喪失了分隔神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)部鹽溶液(細(xì)胞質(zhì))和包圍神經(jīng)細(xì)胞的鹽溶液(細(xì)胞外液)的能力。這兩種液艙中的鹽種類(lèi)差異很大，由損傷引起的離子和水分交換，導(dǎo)致神經(jīng)無(wú)法產(chǎn)生和傳遞神經(jīng)沖動(dòng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。損傷包括直接或間接影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常機(jī)能的損傷。損傷可以是結(jié)構(gòu)性的、物理性的或機(jī)械性的損傷，也可以是由物理碰撞造成的，如神經(jīng)纖維的壓砸、擠壓或拉伸。疾病、內(nèi)分泌不平衡、或者生理功能障礙等原因也會(huì)造成細(xì)胞膜破壞或降解，如缺氧(例如中風(fēng))、動(dòng)脈瘤、或再灌注損傷。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷包括，例如但不限于，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷，外傷性腦損傷，中風(fēng)導(dǎo)致的損傷，腦動(dòng)脈瘤導(dǎo)致的損傷，包括單癱、雙癱、下肢癱瘓、偏癱和四肢癱瘓?jiān)趦?nèi)的脊髓損傷，神經(jīng)增殖失調(diào)，或神經(jīng)病變性疼痛綜合征。
哺乳動(dòng)物的脊髓損傷后，脊髓中的神經(jīng)間的連接被破壞。因?yàn)閾p傷影響了神經(jīng)束，這種損傷阻斷了神經(jīng)沖動(dòng)流，導(dǎo)致了感覺(jué)功能和運(yùn)動(dòng)功能減退。脊髓損傷可以是由脊髓擠壓或其它挫傷，或脊髓壓砸或切斷造成的。脊髓切斷，這里也稱(chēng)“橫斷”，可以是脊髓的完全切斷或部分切斷。
本發(fā)明的方法可用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性和慢性損傷，包括但不限于急性和慢性的脊髓損傷。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法被用于治療脊髓的慢性損傷。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“急性損傷”包括發(fā)生不久的損傷。例如，急性損傷可以是剛剛發(fā)生的，可以是1小時(shí)以?xún)?nèi)發(fā)生的，可以是1天以?xún)?nèi)發(fā)生的，可以是1個(gè)星期以?xún)?nèi)發(fā)生的，可以是2個(gè)星期以?xún)?nèi)發(fā)生的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“慢性損傷”是指持續(xù)了一段時(shí)間的損傷。例如，慢性損傷可以是2個(gè)星期前發(fā)生的，可以是3個(gè)星期以前發(fā)生的，可以是2個(gè)月以前發(fā)生的，也可以是3個(gè)月以前發(fā)生的。
本發(fā)明的治療CNS損傷的二分療法(two-part therapy)的一個(gè)部分是對(duì)CNS損傷部位進(jìn)行電刺激。二十年前，就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)電刺激可以在損傷后增強(qiáng)哺乳動(dòng)物脊髓軸突的再生和減少軸突退行性變性。各種將電刺激傳遞到CNS損傷部位的已知方法都可以使用。這一方法包括使用電流通過(guò)損傷部位，和/或在損傷部位加上電勢(shì)差或電位差。電流可以是交流電或直流電。電流和/或電勢(shì)差可以是恒定的或變化的。對(duì)CNS損傷的電刺激可以通過(guò)植入生物電刺激器來(lái)實(shí)現(xiàn)。
對(duì)損傷部位進(jìn)行電刺激的優(yōu)選方法是使用電場(chǎng)極性周期性倒轉(zhuǎn)的振蕩場(chǎng)電刺激(OFS)。振蕩場(chǎng)電刺激(OFS)，在治療狗的急性、嚴(yán)重、自然發(fā)生的下肢癱瘓中取得了積極有益的效果(美國(guó)專(zhuān)利No.4,919,140)，目前正在進(jìn)行人急性脊髓損傷治療的臨床試驗(yàn)。然而，到目前為止的所有電刺激的成功應(yīng)用都只限于急性損傷的治療。哺乳動(dòng)物CNS中受損神經(jīng)的再生，只在損傷發(fā)生后非常短的一段時(shí)間內(nèi)立即發(fā)生。在這段很短的時(shí)間之后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)再生。因此，能有效治療慢性損傷的結(jié)果是激動(dòng)人心和出乎意料的。
在損傷部位植入裝置(如生物電植入器)和用OFS進(jìn)行損傷部位電刺激的方法是本領(lǐng)域所熟知的。形成電流，以產(chǎn)生穿越損傷部位的電勢(shì)差或電位差。優(yōu)選的生物電植入器在損傷周?chē)a(chǎn)生幾百μV/mm(例如100μV/mm-500μV/mm)的恒定直流電(DC)電場(chǎng)。例如在小狗中，可以通過(guò)在損傷兩側(cè)的2個(gè)電極間約200μA的電流，產(chǎn)生這樣的電場(chǎng)。如下所述，在人體上最好使用多對(duì)電極。刺激裝置很小，可以方便地通過(guò)外科手術(shù)植入到背部皮膚下。產(chǎn)生弱電場(chǎng)所需的電流量，根據(jù)損傷部位的橫截面積和電極之間的距離而變化。優(yōu)選使用2對(duì)或2對(duì)以上電極來(lái)傳遞所需電流，這樣可以降低通過(guò)介入組織的電流量。隨著橫截面積的增加，用于產(chǎn)生電場(chǎng)的電極對(duì)數(shù)量也最好相應(yīng)增加。例如，橫截面積增加3倍，為了將通過(guò)任一組織截面的電流量都保持在安全水平，就需要電極數(shù)也增加3倍。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，6個(gè)電極(3對(duì))被連接到脊柱上，并固定在損傷部位的上方和下方。導(dǎo)線(電極)在脊柱外，并不接觸脊髓本身，但是他們產(chǎn)生的電場(chǎng)通過(guò)了脊髓。在植入大約14個(gè)星期后，手術(shù)拆除整個(gè)裝置。通過(guò)脊髓損傷患者的一期人體臨床試驗(yàn)，已經(jīng)證明這種植入/移出是完全安全的。參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利No.4,919,140，Borgens等，(1986)J Comp Neurol 250，168-180；Borgens等，(1987)Science 238，366-369；Borgens等，(1999)J CompNeurol 296，634-653；Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，305-322；Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，173-179；Borgens和Bohnert(1997)Exp Neurol 145，376-89；Borgens等，(1999)J Neurtrauma 16，639-57；Borgens(1999)Neuroscience 91，251-64；以及Borgens(2003)Restoring Function to the InjuredHuman Spinal Cord，(Springer-Verlag，Heidelberg)。典型生物電刺激器的全部核心電路和電路圖都已經(jīng)在如Borgens等，(1999)J Neurtrauma 16，639-57等資料中說(shuō)明。本發(fā)明的二分療法中，電刺激(通過(guò)“生物植入物”實(shí)施)和保健食品添加劑肌苷或其它嘌呤核苷或其類(lèi)似物(口服或經(jīng)皮下給藥)可以在損傷之后的任何時(shí)間實(shí)施，較佳地，二者同時(shí)實(shí)施。
進(jìn)行受損部位電刺激(如OFS)的時(shí)間長(zhǎng)度可以不同。電刺激可以進(jìn)行幾天，例如，1天、2天、3天、4天、5天、或者其間任何時(shí)間段。電刺激可以進(jìn)行幾個(gè)星期，例如，1個(gè)星期、2個(gè)星期、3個(gè)星期、4個(gè)星期、或者其間任何時(shí)間段。電刺激可以進(jìn)行幾個(gè)月，例如，1個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月、或者其間任何時(shí)間段。對(duì)于急性損傷的治療，對(duì)損傷部位的電刺激可以在損傷發(fā)生以后馬上開(kāi)始進(jìn)行，或者對(duì)損傷部位的電刺激可以在損傷發(fā)生后幾個(gè)小時(shí)或者幾天開(kāi)始進(jìn)行。例如，治療可以在損傷后8-12小時(shí)、損傷后幾天、或者損傷后14-21天開(kāi)始進(jìn)行。對(duì)于慢性損傷的治療，電刺激可以在任何時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始進(jìn)行。例如，在損傷后2個(gè)星期、損傷后3個(gè)星期或1個(gè)月、或損傷后幾個(gè)月或幾年開(kāi)始進(jìn)行。
本發(fā)明的治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的二分療法的第二部分是嘌呤核苷或其類(lèi)似物的給藥。如本文所用，“嘌呤核苷”包括任何連接了糖基的嘌呤堿基或其類(lèi)似物。例如，嘌呤核苷包括鳥(niǎo)苷、肌苷或腺苷，其類(lèi)似物包括6-硫代鳥(niǎo)嘌呤(6-TG)和其他相似物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述嘌呤核苷是肌苷。
最近研究表明，嘌呤核苷(肌苷和鳥(niǎo)苷)能作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑，在體外施用于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞時(shí)能刺激軸突發(fā)生(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.6,440,455和Benowitz等，(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96，13486-90)。肌苷是一種沒(méi)有已知副作用的天然代謝產(chǎn)物。而且正如本發(fā)明所述，在體內(nèi)給藥時(shí)，肌苷作為一個(gè)“溫和”的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，不會(huì)產(chǎn)生更熟知的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(如NGF)給藥時(shí)所產(chǎn)生的嚴(yán)重副作用。本發(fā)明中所用的嘌呤核苷及其類(lèi)似物都是容易得到的。例如，肌苷可以從化學(xué)藥品供應(yīng)公司(包括如Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri)或銷(xiāo)售保健品的保健商店購(gòu)得。
必須了解，嘌呤核苷或其類(lèi)似物，既能根據(jù)本發(fā)明作為二分療法的一個(gè)部分；也能不結(jié)合損傷部位的電刺激單獨(dú)進(jìn)行治療。在后者中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷優(yōu)選為脊髓損傷，可以是急性損傷也可以是慢性損傷。
嘌呤核苷或其類(lèi)似物(如肌苷)給藥的時(shí)間周期的長(zhǎng)度可以不同。嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以給藥幾個(gè)小時(shí)，例如，1個(gè)小時(shí)、2個(gè)小時(shí)、4個(gè)小時(shí)、6個(gè)小時(shí)、8個(gè)小時(shí)、12個(gè)小時(shí)或者其間任何時(shí)間段。嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以給藥幾天，例如，1天、2天、3天、4天、5天或者其間任何時(shí)間段。嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以給藥幾個(gè)星期，例如，1個(gè)星期、2個(gè)星期、3個(gè)星期、4個(gè)星期或者其間任何時(shí)間段。嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以給藥幾個(gè)月，例如，1個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月或者其間任何時(shí)間段。對(duì)于急性損傷的治療，嘌呤核苷或其類(lèi)似物的給藥可以在損傷發(fā)生后立即開(kāi)始。嘌呤核苷或其類(lèi)似物的給藥也可以在損傷發(fā)生后幾個(gè)小時(shí)或幾天開(kāi)始。例如，治療可以在損傷發(fā)生后1-2個(gè)小時(shí)、損傷發(fā)生后4-6個(gè)小時(shí)、損傷發(fā)生后2-6天、或損傷發(fā)生后14-21天開(kāi)始。對(duì)于慢性損傷的治療，嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥可以在任何時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始。例如，給藥可以在損傷后2個(gè)星期開(kāi)始，可以在損傷后3個(gè)星期或1個(gè)月開(kāi)始，或者可以在損傷后幾個(gè)月或幾年開(kāi)始。
在本發(fā)明的方法中，嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以通過(guò)藥學(xué)上可接受的載體給藥。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”包括所有溶劑、分散媒劑、包被劑、抗菌劑和抗真菌劑，等滲和吸收延遲劑，和類(lèi)似的生理協(xié)調(diào)劑。這類(lèi)載體包括水(優(yōu)選無(wú)菌水，包括去離子水)和其他任何本領(lǐng)域熟知的、不會(huì)對(duì)治療產(chǎn)生反效果的藥學(xué)上可接受的載體。在某些實(shí)施方案中，肌苷的優(yōu)選載體是無(wú)菌的乳酸林格爾液。
本發(fā)明的另一方面，嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以用藥學(xué)上可接受的制劑給藥。這種藥學(xué)上可接受的制劑可以是分散體系，例如脂基制劑、脂質(zhì)體制劑、多泡脂質(zhì)體制劑、納米膠囊、微球體、微珠、或是包括水包油乳劑、微團(tuán)、混合微團(tuán)、合成膜囊和重新包封的紅細(xì)胞在內(nèi)的脂基制劑。藥學(xué)上可接受的制劑也包括選自合成多聚體(包括聚酯(PLA，PLGA)、聚乙二醇、波洛沙姆(poloxomer)、聚酐和聚醚等)，或選自天然多聚體(包括白蛋白、藻酸鹽、纖維素衍生物、膠原、纖維蛋白、明膠和多糖等)的多聚基質(zhì)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，藥學(xué)上可以接受的制劑，能夠在其給藥后至少1個(gè)星期、2個(gè)星期、3個(gè)星期或4個(gè)星期，使嘌呤核苷在患者中的持續(xù)釋放或“緩慢釋放”。本發(fā)明中制劑的持續(xù)釋放，可以通過(guò)使用如緩釋膠囊或輸液泵的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案中使用嘌呤核苷或其類(lèi)似物的精確量，可以根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的因素而改變，這些因素包括但不限于嘌呤核苷或其類(lèi)似物的物理和化學(xué)性質(zhì)、藥學(xué)上可接受的載體的性質(zhì)、預(yù)期的劑量方案、患者損傷的情況和嘌呤核苷或其類(lèi)似物的給藥方法。因此，提出一個(gè)在所有應(yīng)用中都有效的嘌呤核苷或其類(lèi)似物的劑量是不現(xiàn)實(shí)的。然而，結(jié)合考慮上述因素，可以用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)決定適當(dāng)?shù)膭┝?。治療上有效的肌苷濃度的非限制性范圍?μM-100mM，更佳地是50μM-50mM。治療上有效的鳥(niǎo)苷濃度的非限制性范圍是1μM-100mM，更佳地是50μM-50mM。
在本發(fā)明中，嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以通過(guò)各種不同方式向患者給藥。嘌呤核苷或其類(lèi)似物，可以向需要CNS損傷治療的患者進(jìn)行全身給藥。例如，嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以通過(guò)靜脈內(nèi)(經(jīng)由血液供應(yīng))、皮下、腹膜內(nèi)、穿透皮膚或口服給藥。對(duì)于皮下給藥，可以使用輸液泵或者微泵。同樣地，嘌呤核苷或其類(lèi)似物也可以對(duì)CNS損傷部位進(jìn)行局部給藥。例如，嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以鞘內(nèi)給藥進(jìn)入脊柱髓鞘。輸液泵或微泵也可用于這種局部給藥。
對(duì)于CNS損傷治療，損傷部位的電刺激和嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥，可以在同一時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始。本發(fā)明的二分療法中的一部分也可以先于另一部分開(kāi)始。也就是說(shuō)，損傷部位的電刺激可以先于嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥開(kāi)始，或者嘌呤核苷或其類(lèi)似物的給藥可以先于對(duì)損傷部位的電刺激開(kāi)始。換句話(huà)說(shuō)，損傷部位的電刺激和嘌呤核苷或其類(lèi)似物的給藥，可以在相同或不同的時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始和/或停止。
或者，本發(fā)明的二分療法中的一部分可以先于另一部分完成。也就是說(shuō)，損傷部位的電刺激可以在嘌呤核苷或其類(lèi)似物的給藥結(jié)束前停止，或者嘌呤核苷或其類(lèi)似物的給藥可以在對(duì)損傷部位的電刺激結(jié)束前停止。
較佳地，在治療期間，有一段時(shí)間是損傷部位的電刺激和嘌呤核苷或其類(lèi)似物的給藥同時(shí)或協(xié)同實(shí)施的。然而，必須注意，本發(fā)明也包括損傷部位的電刺激和嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥的依次實(shí)施。在依次實(shí)施時(shí)，兩部分治療之間的間隔時(shí)間以短為佳，例如幾小時(shí)內(nèi)或幾天之內(nèi)。同樣地，本發(fā)明包括電刺激和嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥的交替或間隔實(shí)施。換句話(huà)說(shuō)，本發(fā)明不受兩種治療實(shí)施的前后順序或兩種治療是否嚴(yán)格同步實(shí)施的限制。既然電刺激和嘌呤核苷或其類(lèi)似物的協(xié)同實(shí)施更好，至少可以預(yù)見(jiàn)兩種療法都是協(xié)同治療計(jì)劃的一部分。
本發(fā)明的方法能有效地在CNS損傷后至少部分恢復(fù)的神經(jīng)功能和/或神經(jīng)再生。本發(fā)明的治療功效可以通過(guò)各種方法確定。例如，本發(fā)明的治療功效可以通過(guò)檢測(cè)神經(jīng)功能恢復(fù)的方法來(lái)確定。通過(guò)受損部位的動(dòng)作電位(如CAP)傳導(dǎo)的恢復(fù)或增加，可以作為神經(jīng)功能至少部分恢復(fù)的指標(biāo)。如果在治療后動(dòng)作電位傳導(dǎo)增加，可以認(rèn)為神經(jīng)功能已經(jīng)至少部分恢復(fù)。較佳地，治療能使CAP傳導(dǎo)達(dá)到至少10％的增加。此外，如實(shí)施例中所述，解剖學(xué)連續(xù)性的恢復(fù)也可以通過(guò)高分辨率光學(xué)顯微鏡鏡檢和/或修復(fù)的神經(jīng)組織(如修復(fù)的軸突)胞內(nèi)熒光染料的分布，或?qū)π迯?fù)的軸突膜的直接觀測(cè)來(lái)檢測(cè)。另外，在人體應(yīng)用中，優(yōu)選治療的功效可以通過(guò)一個(gè)以上脊髓根節(jié)段的修復(fù)來(lái)確定，這種修復(fù)可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的美國(guó)脊髓損傷聯(lián)合會(huì)(ASIA)運(yùn)動(dòng)評(píng)分和/或國(guó)家動(dòng)物脊髓損傷研究會(huì)(NASCIS)值來(lái)判斷，參見(jiàn)Wagih等，(1996)Spine21，614-619。此外，在動(dòng)物應(yīng)用中，就像在實(shí)施例中有更全面描述的，對(duì)皮膚肌干(CTM)反射的行為能力分析，可用于確定治療的功效和神經(jīng)功能是否已經(jīng)至少部分恢復(fù)。使用這種分析，如果治療后出現(xiàn)反射行為的增加，則認(rèn)為神經(jīng)功能已經(jīng)至少部分恢復(fù)，但是較佳的，希望治療能夠使皮膚肌干(CTM)行為能力修復(fù)區(qū)域增加至少10％的反射行為。本發(fā)明治療方法的功效也可以通過(guò)上述方法的結(jié)合來(lái)確定。
本發(fā)明治療的功效可以用檢測(cè)神經(jīng)再生的方法來(lái)確定。例如，如實(shí)施例中所述，神經(jīng)再生可以通過(guò)高分辨率光學(xué)顯微鏡鏡檢和/或修復(fù)的神經(jīng)組織(如修復(fù)的軸突)胞內(nèi)熒光染料的分布、或?qū)π迯?fù)的軸突膜的直接觀測(cè)來(lái)檢測(cè)。
在某些實(shí)施方案中，與單獨(dú)進(jìn)行CNS損傷部位的電刺激或單獨(dú)進(jìn)行嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥相比，對(duì)患者進(jìn)行CNS損傷部位的電刺激和嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥聯(lián)合治療所引起的神經(jīng)功能恢復(fù)增加更大。在某些實(shí)施方案中，對(duì)患者進(jìn)行CNS損傷部位的電刺激和嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥，會(huì)引起神經(jīng)功能恢復(fù)的協(xié)同增加。也就是說(shuō)，二分療法獲得的神經(jīng)功能的恢復(fù)，要大于單獨(dú)進(jìn)行CNS損傷部位的電刺激或單獨(dú)進(jìn)行嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥所獲得的神經(jīng)功能恢復(fù)的總和。
在某些實(shí)施方案中，除了用電刺激和嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥進(jìn)行損傷治療以外，本發(fā)明還包括用其他常規(guī)治療化合物和/或復(fù)合物來(lái)進(jìn)行損傷治療。例如，損傷也可以用聚亞烷基二醇或類(lèi)固醇(如甲基氫化潑尼松)來(lái)治療。例如，如WO 02/092,107和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.09/438,206(1999年11月12日申請(qǐng))所述，用聚亞烷基二醇進(jìn)行治療。
用嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥、而不在損傷部位進(jìn)行電刺激的方法來(lái)進(jìn)行CNS損傷治療，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，脊髓損傷，包括但不限于慢性脊髓損傷，可以通過(guò)肌苷給藥、而不在損傷部位進(jìn)行電刺激的方法進(jìn)行治療。
本發(fā)明提供了一種治療CNS損傷(包括但不限于脊髓損傷)的試劑盒。試劑盒主要包括在合適包裝材料中的第一成分和第二成分。第一成分是一種對(duì)損傷部位進(jìn)行電刺激的方法，例如振蕩場(chǎng)電刺激(OFS)裝置。第二成分是有效治療量的嘌呤核苷或其類(lèi)似物。嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以是適于皮下、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、局部給藥或其他類(lèi)似給藥方式的藥學(xué)制劑。嘌呤核苷或其類(lèi)似物可以是肌苷。此外，試劑盒還可以包括實(shí)施本發(fā)明所需的其他試劑，如緩沖液和溶液。關(guān)于用進(jìn)行電刺激和/或嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥來(lái)治療CNS損傷的說(shuō)明書(shū)通常也包括在內(nèi)。試劑盒還包括嘌呤核苷或其類(lèi)似物皮下、鞘內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥等所必需的輔助裝置和試劑。這些裝置或試劑包括微泵、注射器、針、局部麻醉劑和其他相類(lèi)似的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包裝材料”指一種或多種用于收藏試劑盒內(nèi)容的物理結(jié)構(gòu)。包裝材料是用眾所周知的方法構(gòu)設(shè)的，以提供一個(gè)無(wú)菌、無(wú)污染的環(huán)境為佳。包裝材料帶有一個(gè)說(shuō)明第一成分和第二成分可被用于治療CNS損傷的標(biāo)簽。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包裝”指玻璃、塑料、紙張、金屬片和其他類(lèi)似的固體基質(zhì)或材料?！笆褂谜f(shuō)明”主要包括描述治療CNS損傷試劑盒的第一和/或第二成分的準(zhǔn)備和運(yùn)用的真實(shí)表述。
結(jié)合下列實(shí)施例，具體闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，本文所述的特定實(shí)施方案、材料、劑量和方法只用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1同時(shí)運(yùn)用兩種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子產(chǎn)生的行為學(xué)和解剖學(xué)協(xié)同作用運(yùn)用胞外電壓梯度和肌苷在本實(shí)施例中，振蕩場(chǎng)電刺激(OFS)和肌苷注入的聯(lián)合治療被用于增強(qiáng)脊髓損傷(SCI)后的功能反應(yīng)。成年豚鼠的慢性皮膚肌干(CTM)功能缺失被選作研究脊髓損傷的行為學(xué)模型，有以下幾個(gè)原因首先，切斷相關(guān)的上行CTM白質(zhì)束引起了動(dòng)物終身的CTM功能永久性缺失。而且，盡管在豚鼠和狗下肢癱瘓的臨床病例的損傷急性階段中，行為能力缺陷可以通過(guò)施加電場(chǎng)來(lái)部分逆轉(zhuǎn)(Borgens等，(1999)J CompNeurol 296，634-653；Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，173-179；Borgens(1999)Neuroscience 91，251-64)，對(duì)較久的、慢性損傷的治療并沒(méi)有發(fā)生改善功能的修復(fù)。尤其是，上百次的實(shí)驗(yàn)中，在成年豚鼠2個(gè)月以上的皮膚肌干(CTM)損傷中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后的CTM機(jī)能的自發(fā)性修復(fù)或電場(chǎng)施加所引起的修復(fù)(Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，305-322)。
本實(shí)施方案第一次報(bào)道了這種慢性的CTM損傷可以通過(guò)單一肌苷治療或肌苷結(jié)合OFS治療獲得部分逆轉(zhuǎn)。此外，肌苷結(jié)合OFS治療取得了比單一OFS治療或單一肌苷治療更強(qiáng)的修復(fù)效果。
本研究包括兩個(gè)部分，第一部分研究和第二部分研究。主要研究(第一部分研究)是對(duì)在肌苷和OFS治療后成年豚鼠慢性SCI恢復(fù)情況進(jìn)行的解剖學(xué)和行為能力檢驗(yàn)。第二部分研究?jī)H檢測(cè)了對(duì)成年豚鼠SCI進(jìn)行短期肌苷和OFS治療后，被切斷的白質(zhì)作出的解剖學(xué)反應(yīng)。除非特別指明，下列方法可用于以上兩部分研究。
動(dòng)物、麻醉和手術(shù)本研究使用約400克重的成年雌性豚鼠(Hartley Strain)。在手術(shù)前用常規(guī)方法(Borgens等，(2002)J.Exp.Biol.205，1-12)進(jìn)行氯胺酮/二甲苯嗪麻醉，手術(shù)后用熱燈來(lái)保溫，并且在觀測(cè)期間單獨(dú)飼養(yǎng)和隨意喂食。研究結(jié)束時(shí)用過(guò)量麻醉法處死動(dòng)物，然后收集脊髓以待解剖學(xué)研究(參見(jiàn)Borgens等，(2002)J.Exp.Biol.205，1-12)。
用椎板切除法揭開(kāi)所有動(dòng)物的脊髓背面(T9到T11之間)。用特殊切割裝置進(jìn)行右側(cè)半切斷手術(shù)(圖1)，將尖銳的針劃過(guò)切開(kāi)的組織來(lái)“完成”(也就是，不留下多余的實(shí)質(zhì))。這個(gè)手術(shù)切斷了從中線到脊髓右側(cè)最遠(yuǎn)端的整個(gè)右側(cè)脊髓，形成一個(gè)頭節(jié)和一個(gè)尾節(jié)。整個(gè)左側(cè)脊髓還保持完整。如Borgens等，(1986)J.Comp.Neurol.250，168-180以及Borgens和Bohnert.(1997)Exp.Neurol.145，376-389所述，切斷手術(shù)后，一個(gè)外科不銹鋼制成的標(biāo)記裝置被立即插入到傷口。這個(gè)裝置在研究過(guò)程中被留在原處，到組織學(xué)處理前被移除。這種方法在組織上留下一個(gè)洞，即使在數(shù)月的慢性損傷中也能準(zhǔn)確標(biāo)明正確的橫切面(圖1和圖2)。
如圖1A所示，CTM反射的傳入和傳出途徑在豚鼠的左側(cè)標(biāo)出。皮膚的痛覺(jué)受體通過(guò)背皮神經(jīng)(DCN)將感官傳入投射到脊髓中。DCN有部分是基本平行排列的，垂直于脊髓，作為背根的成分投射進(jìn)入脊髓。上行CTM傳入成束地投射到脊髓。在腹索中，CTM束正好位于脊髓丘腦束的左右兩個(gè)側(cè)面。投射到位于頸/胸交匯處運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元群的上行束幾乎不轉(zhuǎn)接。這些上行束接著經(jīng)由臂叢的胸支，將傳出的運(yùn)動(dòng)纖維投射回到皮膚的皮膚肌干。盡管脊髓的上行CTM投射中有少量對(duì)側(cè)神經(jīng)支配，左側(cè)和右側(cè)神經(jīng)元群之間不存在神經(jīng)連接。脊髓損傷(為了便于說(shuō)明，用大缺口標(biāo)出)只在豚鼠脊髓右側(cè)中斷了上行CTM束。這使得背部皮膚上的一個(gè)區(qū)域不再對(duì)觸覺(jué)刺激產(chǎn)生應(yīng)答(反射消失)。這一反射消失區(qū)域處于脊髓右側(cè)半切斷位置的同側(cè)下方。要注意的是，CTM反射的同側(cè)上方和對(duì)側(cè)都不受到損傷的影響。危及CTM束的全寬度損傷，將會(huì)降低動(dòng)物在傷口下方兩側(cè)的皮膚應(yīng)答能力。損傷頭側(cè)的背部皮膚不會(huì)受到這種脊髓損傷的影響。這在圖1的錄像重構(gòu)圖中顯示出來(lái)。圖1B顯示了完整的CTM感受域的概圖。在這一區(qū)域內(nèi)的觸覺(jué)探測(cè)，會(huì)產(chǎn)生背部皮膚的抽搐，而在這個(gè)區(qū)域外的刺激不會(huì)產(chǎn)生CTM皮膚收縮。從上方，將一系列對(duì)鎮(zhèn)靜動(dòng)物的皮膚輕微觸覺(jué)刺激情況進(jìn)行錄像，并用計(jì)算機(jī)重新構(gòu)圖。圖1C顯示了全寬脊髓壓迫傷的結(jié)果。在CTM感受域的下半部分標(biāo)出的區(qū)域是反射消失區(qū)。正是這CTM感受域的下半部分不再對(duì)觸覺(jué)刺激作出應(yīng)答。圖1D標(biāo)出了CTM恢復(fù)的區(qū)域。在這一區(qū)域內(nèi)，CTM應(yīng)答性已經(jīng)恢復(fù)。圖1E是一個(gè)顯示畫(huà)在動(dòng)物去毛背部上的點(diǎn)狀坐標(biāo)的錄像重構(gòu)圖。結(jié)合在CTM測(cè)試中畫(huà)在動(dòng)物背上的標(biāo)記，這些坐標(biāo)可用于進(jìn)一步量化CTM反射。
所有的實(shí)驗(yàn)組都再進(jìn)行3個(gè)月的檢測(cè)后處死。
對(duì)第一部分研究，動(dòng)物進(jìn)行了脊髓切斷，并在此后3個(gè)月內(nèi)不作任何處理。然后如下所述，對(duì)慢性損傷動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療。
在第二部分研究中，動(dòng)物進(jìn)行了脊髓切斷，并在切斷后24小時(shí)內(nèi)就進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療。在切斷后30天向脊髓中注射胞內(nèi)軸突標(biāo)記物，18小時(shí)后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行安樂(lè)死并收集脊髓。對(duì)于第二部分研究中的動(dòng)物只進(jìn)行解剖學(xué)檢測(cè)，而不進(jìn)行行為能力測(cè)試。
實(shí)驗(yàn)組在第一部分研究中，有下列3個(gè)實(shí)驗(yàn)組1)“單一肌苷”組。15只動(dòng)物在頸部的背部皮膚下方皮下植入Alzet微滲泵(型號(hào)1002)。這個(gè)泵以0.25毫升(mL)/小時(shí)的速度釋放肌苷溶液(10毫摩(mM)，溶于無(wú)菌乳酸林格爾液中)。肌苷的連續(xù)注入持續(xù)14天后停止，直到約2個(gè)半月后處死都不再繼續(xù)。
2)“肌苷和OFS”組。16只動(dòng)物接受與上述相同的肌苷注射，此外還同時(shí)植入一個(gè)小型OFS裝置(Moriarty and Borgens.(1999)Restor Neuro Neurosci 14，53-64)。這一小型OFS裝置產(chǎn)生約45毫安(mA)總電流，以15分鐘為工作周期倒轉(zhuǎn)電極極性，持續(xù)4個(gè)星期(參見(jiàn)下述刺激器設(shè)計(jì)和植入)。
3)15只動(dòng)物的“對(duì)照”組。這些動(dòng)物植入了一個(gè)只釋放無(wú)菌乳酸林格爾液的Alzet微滲泵和一個(gè)無(wú)功能的假OFS刺激器。
在這部分研究結(jié)束時(shí)，第一部分研究中的所有動(dòng)物都進(jìn)行了CTM行為能力測(cè)定和白質(zhì)的解剖學(xué)檢驗(yàn)。
第一部分研究不包括本研究中的假OFS植入或單一植入有作用OFS的研究組。更準(zhǔn)確的說(shuō)，由于在過(guò)去的實(shí)驗(yàn)中，使用有作用的和假的OFS刺激器植入進(jìn)行了大量的慢性損傷豚鼠類(lèi)似治療，這些數(shù)據(jù)已經(jīng)在別處報(bào)道了(Borgens等，(1999)RestorNeuro Neurosci 5，305-322)，這些過(guò)去的數(shù)據(jù)也在這里被引用。簡(jiǎn)要地說(shuō)，如Borgens.(1993)Restor Neuro & Neurosci 5，173-179中詳細(xì)報(bào)道的，26只在半切斷手術(shù)后3個(gè)月植入了假的刺激器的動(dòng)物中，其中21只在半切斷手術(shù)后持續(xù)觀測(cè)12個(gè)月以上，1只觀測(cè)6個(gè)月，還有3只觀測(cè)少于6個(gè)月。在整個(gè)觀測(cè)過(guò)程中，所有動(dòng)物的反射消失區(qū)都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有性質(zhì)、大小或側(cè)面的改變。所有的假治療動(dòng)物中，都出現(xiàn)典型的反射消失區(qū)內(nèi)對(duì)于觸覺(jué)刺激應(yīng)答的CTM反射活力的完全缺失。在半切斷手術(shù)3個(gè)月后植入有作用的電刺激器的動(dòng)物中，13只頭側(cè)加上負(fù)電場(chǎng)的動(dòng)物沒(méi)有出現(xiàn)CTM反射的恢復(fù)，其中8只觀測(cè)了至少9個(gè)月，5只觀測(cè)了3個(gè)月；另外11只尾側(cè)加上負(fù)電場(chǎng)的動(dòng)物中也沒(méi)有出現(xiàn)CTM反射的恢復(fù)，其中8只觀測(cè)了9個(gè)月，3只觀測(cè)了3個(gè)月。和假治療組一樣，在研究期間電刺激治療組的動(dòng)物的反射消失區(qū)沒(méi)有發(fā)生形態(tài)和性質(zhì)的變化。
在第二部分研究中，“單一肌苷”組(14只動(dòng)物)，“肌苷和OFS”組(15只動(dòng)物)，和“對(duì)照”組(13只動(dòng)物)在60天后只用解剖學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。
脊髓損傷(SCI)后CTM反射的行為能力檢測(cè)CTM反射是一種檢測(cè)SCI后感覺(jué)運(yùn)動(dòng)機(jī)能的行為學(xué)模型(Blight等，(1990)J ofComp Neurol 296，614-633；Borgens.(2003)Restoring Function to the InjuredHuman Spinal Cord(Springer-Verlag，Heidelberg))。CTM反射，是指皮膚的肌肉收縮，和在對(duì)側(cè)面皮膚的局部觸覺(jué)刺激所產(chǎn)生的“起皺”反應(yīng)。脊髓損傷后的CTM反射及其神經(jīng)學(xué)回路都已經(jīng)在大鼠(Theriault和Diamond.(1988)J Neurophysiol60，446-462)和豚鼠(Blight等，(1990)J of Comp Neurol 296，614-33)中完全研究清楚，在本領(lǐng)域中是眾所周知的。因?yàn)榧词乖谕耆袛嘁院筮€很可能出現(xiàn)脊髓(反射性的)行走和步進(jìn)，而且進(jìn)行自發(fā)性移動(dòng)的神經(jīng)回路還無(wú)法有效確定，本研究沒(méi)有采用大鼠和豚鼠的SCI自發(fā)性“行走和步進(jìn)”模型。CTM反射模型的一個(gè)重要特征是，在切斷脊髓中的上行傳入束后，CTM的應(yīng)答能力完全徹底地消失，而且終身無(wú)法(在任何程度上)自發(fā)修復(fù)(Blight等，(1990)J of Comp Neurol296，614-633；Borgens.(2003)Restoring Function to the Injured Human Spinal Cord(Springer-Verlag，Heidelberg))。在這一研究中，未治療的動(dòng)物中切斷部位同側(cè)(右側(cè))、和下方的背部皮膚肌肉收縮的都不應(yīng)再起作用。
在Borgens等，(2002)J.Exp.Biol.205，1-12中，已經(jīng)完整說(shuō)明了描述、分析和量化CTM行為能力的方法。簡(jiǎn)要地說(shuō)，在豚鼠的去毛背部皮膚上標(biāo)記上點(diǎn)狀矩陣。當(dāng)皮膚收縮時(shí)(通常是向著局部刺激的方向)，記號(hào)點(diǎn)也發(fā)生移動(dòng)。從上方錄像，記錄用單絲探測(cè)器進(jìn)行背部皮膚刺激引起CTM移動(dòng)的全過(guò)程(圖1)。在SCI前，對(duì)未處理(未損傷)的動(dòng)物進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，以確定每個(gè)動(dòng)物各自的CTM移動(dòng)模式。
技術(shù)人員用可干擦的記號(hào)筆在未處理的動(dòng)物身上標(biāo)出應(yīng)答的和不應(yīng)答的皮膚的分界線，給出了動(dòng)物背部皮膚上整個(gè)CTM感受域的完整圖。CTM反射缺失是指一個(gè)區(qū)域的皮膚不再對(duì)觸覺(jué)刺激產(chǎn)生應(yīng)答，而CTM反射的恢復(fù)是指這一區(qū)域?qū)p微的觸覺(jué)刺激產(chǎn)生應(yīng)答的皮膚收縮恢復(fù)。而刺激后CTM應(yīng)答的矢量、收縮速度和反應(yīng)時(shí)間，可以根據(jù)對(duì)錄像的行為進(jìn)行計(jì)算機(jī)定量測(cè)定而得出(Borgens等，(2002)J.Exp.Biol.205，1-12)，最重要的標(biāo)準(zhǔn)是相對(duì)于最初完整的感受域的CTM缺失面積百分比。例如，如果脊髓在胸部中間從左到右被完全切斷，將會(huì)破壞所有感受域的約50％。這是因?yàn)樵跈M切面上方的感受域完全不受影響，能正常行使機(jī)能。因此，在損傷“下方”(尾側(cè))的50％的CTM應(yīng)答能力喪失，而在損傷“上方”(頭側(cè))的50％的CTM應(yīng)答能力不受影響。
本實(shí)施方案中所用的切斷方法(右側(cè)單側(cè)半切斷法)中，脊髓只在中線的一側(cè)被完全切斷，因此在損傷平面“上方”和“對(duì)側(cè)”的CTM機(jī)能還是正常的。這通常引起整個(gè)感受域的25％的CTM應(yīng)答能力喪失。
脊髓白質(zhì)軸突的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記在大量過(guò)去的文獻(xiàn)中，都報(bào)道了將不同的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物注射到豚鼠的脊髓白質(zhì)中。參見(jiàn)Borgens等，(1986)J Comp Neurol 250，168-180和Borgens等，(1999)JNeurtrauma 16，639-57。簡(jiǎn)要地說(shuō)，在動(dòng)物處死前約18小時(shí)，手術(shù)揭開(kāi)脊髓，用Hamiliton注射器注入約20mL熒光標(biāo)記的右旋糖酐。標(biāo)記物(溶于去離子水中，濃度50％，10,000道爾頓)注射到橫切面(由于有內(nèi)置的標(biāo)記裝置，通常是可見(jiàn)的)頭側(cè)和尾側(cè)2個(gè)椎節(jié)的白質(zhì)實(shí)質(zhì)的深處。在橫切面的頭側(cè)注入連接了異硫氰酸熒光素(FITC)的右旋糖酐(“Flouro-emerald”)，在橫切面的尾側(cè)注入連接了若丹明的右旋糖酐(“Flouro-ruby”)。這樣，這種順行性雙標(biāo)記把從傷口下方朝傷口投射的上行纖維(多數(shù)是感覺(jué)傳入纖維)和從傷口上方朝傷口投射的下行軸突(主要是運(yùn)動(dòng)纖維)都標(biāo)記了?？v向水平切片提供了組織學(xué)樣本，其中單個(gè)軸突的投射的整個(gè)范圍可以是沒(méi)有達(dá)到、或延伸到、環(huán)繞、或穿過(guò)橫切面。
本方法有時(shí)可以提供單個(gè)軸突退化和再生的樣本。但是不能用于縱向水平切片上的獨(dú)立軸突計(jì)數(shù)。因?yàn)檩S突經(jīng)常走曲折、彎曲的路線，在單個(gè)的組織學(xué)樣品中會(huì)被重復(fù)計(jì)數(shù)。此外，神經(jīng)的發(fā)芽和分支也會(huì)導(dǎo)致對(duì)于單個(gè)從殘余部分?jǐn)U大生長(zhǎng)的被切斷纖維的錯(cuò)誤計(jì)數(shù)。更確切地說(shuō)，就是比較軸突停止在距橫切面(可以用內(nèi)置標(biāo)記物準(zhǔn)確確定)250μm以上、距橫切面250μm以?xún)?nèi)、和穿過(guò)橫切面進(jìn)入相鄰的椎節(jié)的動(dòng)物比例。檢測(cè)者得到這些數(shù)據(jù)時(shí)，并不知道這些動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)治療情況。圖像來(lái)源于Olympus Van Ox顯微鏡觀測(cè)，用Optronics DEI-750彩色錄像機(jī)拍攝，用Adobe Twain32軟件進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析。
刺激器的設(shè)計(jì)和植入用與過(guò)去文獻(xiàn)報(bào)道相同的方法，將小型的OFS裝置植入到豚鼠中(Moriarty和Borgens.(1999)Restor Neurol Neurosci 14，53-64)。OFS裝置的裝配和電路原理是本領(lǐng)域中已知的(Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，305-322；Borgens.(1999)Neuroscience 91，251-64)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，各個(gè)裝置用醫(yī)用級(jí)的特氟綸包被，輸出總電流為30μA直流電，每15分鐘顛倒一下電極極性。特氟綸包被的刺激器前端，通過(guò)外科手術(shù)從刺激器植入位點(diǎn)(背部皮膚下)插入到脊柱，并被脊柱旁肌肉組織固定在這一位置。將鉑/銥醫(yī)用級(jí)電極的非絕緣末端分別放到脊髓傷口頭側(cè)和尾側(cè)2個(gè)椎節(jié)。預(yù)計(jì)該裝置能產(chǎn)生45μA/cm2的有效電流密度和約10mV/mm的電場(chǎng)強(qiáng)度。這種估計(jì)是根據(jù)對(duì)刺激中的電流密度和電場(chǎng)強(qiáng)度進(jìn)行四極檢測(cè)得出的(Borgens等，(1990)J Comp Neurol 296，634-653)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)。無(wú)母數(shù)評(píng)價(jià)和方法比較通常使用Mann-Whitney或Wilcoxian檢驗(yàn)，而用費(fèi)希爾(Fishers’)精確度檢驗(yàn)、或更保守的X平方分布檢測(cè)進(jìn)行比例比較。所用的比較都采用Instat軟件。
本研究的一般方法在第一部分研究的慢性損傷動(dòng)物中，在進(jìn)行了手術(shù)和植入兩個(gè)裝置(OFS裝置和滲透泵)后就要注意動(dòng)物的長(zhǎng)期存活和健康情況，要求動(dòng)物在最初的脊髓手術(shù)后還能長(zhǎng)期存活(6個(gè)月)。但是，在進(jìn)行第一部分研究的46只動(dòng)物中，仍然有7只因?yàn)椴煌脑虮桓鼡Q。2只動(dòng)物在手術(shù)后約3個(gè)月、實(shí)驗(yàn)性“治療”開(kāi)始前被取出。它們是由于有證據(jù)表明損傷“失效”而被取出的，例如脊髓損傷沒(méi)有破壞CTM行為能力。1只動(dòng)物在最初的手術(shù)后立即死去。3只動(dòng)物因?yàn)槌霈F(xiàn)自食而在治療開(kāi)始前被取出。1只動(dòng)物因?yàn)檠b置植入部位的持續(xù)感染而在實(shí)驗(yàn)性治療開(kāi)始前被替換。感染發(fā)生在OFS植入的位置上，這只動(dòng)物被人道地實(shí)施了安樂(lè)死，沒(méi)有進(jìn)行了行為能力或解剖學(xué)檢測(cè)。
在研究結(jié)束時(shí)，用面積法(planimitry)分析CTM缺失的范圍。每個(gè)動(dòng)物完整的CTM感受域的單位面積(記為100％)用于比較半切斷手術(shù)后的缺失百分比。這樣就可以根據(jù)CTM缺失的單位面積來(lái)確定所有的實(shí)驗(yàn)組是否接受了相似的標(biāo)準(zhǔn)化損傷。所有接受手術(shù)的實(shí)驗(yàn)組都引起統(tǒng)計(jì)學(xué)上相似的CTM缺失。
CTM反射的行為能力恢復(fù)在15只植入了泵(只釋放無(wú)菌鹽水)和一個(gè)沒(méi)作用的OFS裝置的對(duì)照動(dòng)物中，沒(méi)有一個(gè)動(dòng)物修復(fù)了無(wú)功能的CTM感受域。在研究結(jié)束時(shí)，它們CTM應(yīng)答能力性質(zhì)與脊髓半切斷術(shù)所產(chǎn)生的CTM應(yīng)答能力性質(zhì)相同，即約25％的感受域沒(méi)有活性。在“單一肌苷”和“肌苷加OFS”實(shí)驗(yàn)組中都出現(xiàn)了不同程度的CTM恢復(fù)。在肌苷治療組中一定程度恢復(fù)CTM行為能力的動(dòng)物數(shù)量(11只動(dòng)物)要多于聯(lián)合治療組(6只動(dòng)物)；盡管這個(gè)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.16；費(fèi)希爾精確度檢驗(yàn))。然而，與對(duì)照組相比，兩種治療都產(chǎn)生了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的CTM反射恢復(fù)(“對(duì)照”和“單一肌苷”的對(duì)比；P＜0.0001；“對(duì)照”和“肌苷加OFS”的對(duì)比；P＜0.01，費(fèi)希爾精確度檢驗(yàn))。在聯(lián)合治療中，除了一只外，所有的恢復(fù)的動(dòng)物都在實(shí)驗(yàn)性治療后一個(gè)月出現(xiàn)了CTM。在聯(lián)合治療中，CTM的恢復(fù)要更晚(因?yàn)?1只“肌苷加OFS”組的動(dòng)物中只有3只在治療后的同一時(shí)間段恢復(fù))。盡管兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中恢復(fù)的動(dòng)物的總數(shù)較少，這一差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.04；費(fèi)希爾精確度檢驗(yàn))。
在研究結(jié)束時(shí)，聯(lián)合治療產(chǎn)生的CTM感受域恢復(fù)百分率很不穩(wěn)定，但要大于單一肌苷治療所產(chǎn)生的恢復(fù)百分率(平均28.1±17.8對(duì)比23.5±3.6)，然而這一差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.5；Mann Whitney)。
軸突再生的解剖學(xué)下方的表1分別列出了3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中注射胞內(nèi)標(biāo)記物的脊髓數(shù)(N)和沒(méi)有組織學(xué)意義的脊髓數(shù)(LTH)。被檢脊髓數(shù)量中有標(biāo)記纖維進(jìn)入四個(gè)區(qū)域的脊髓比例也列出了。實(shí)驗(yàn)組兩兩之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較列在了圖表的底部(費(fèi)希爾精確度雙尾檢驗(yàn))。若丹明標(biāo)記的上行纖維和FITC標(biāo)記的下行投射的數(shù)據(jù)都列出了。要注意的是，任何兩組間的沒(méi)有組織學(xué)意義的脊髓數(shù)都沒(méi)有明顯差異。
表1上行
下行
表1總結(jié)了第一部分研究中所有慢性損傷動(dòng)物的脊髓內(nèi)上行束和下行束的順行性標(biāo)記的結(jié)果。要注意的是，并不是所有的脊髓都有比較價(jià)值。沒(méi)有在這里被比較或討論的脊髓的最主要的問(wèn)題是沒(méi)有很好地吸收標(biāo)記物。這些“失效的標(biāo)記”很容易被排除，因?yàn)榭山邮艿募顾柙诩顾枳髠?cè)(未切斷側(cè))的傷口處的兩個(gè)脊椎截面有吸收了標(biāo)記物的纖維束。通常在半切斷手術(shù)后，它們通?？梢酝渡?厘米以上。因此，如果明顯跡象表明脊髓標(biāo)記物吸收不足或者在組織學(xué)處理中出現(xiàn)其他問(wèn)題，則不對(duì)這些脊髓作檢定。換句話(huà)說(shuō)，只有對(duì)那些在中線左側(cè)(也就是鄰近半切斷位置)出現(xiàn)完整的、標(biāo)記的軸突的脊髓才進(jìn)行解剖學(xué)檢測(cè)。確定相對(duì)于傷口的軸突投射范圍或距離時(shí)，只用了一種其他方法。非常清晰的情況下，軸突的末端是鈍的、或者有時(shí)是尖銳的。通常由于熒光有強(qiáng)度衰退，如果末端不明顯，就認(rèn)為纖維還沒(méi)有停止。用切片機(jī)切割纖維時(shí)會(huì)將殘余部分帶到下一個(gè)組織切片上，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生軸突末端的假象(參見(jiàn)Borgens等，(1986) J Comp Neurol 250，168-180)。然而，在特定實(shí)驗(yàn)組中這并不經(jīng)常發(fā)生，而且切片是在不了解它們實(shí)驗(yàn)性治療的情況下進(jìn)行檢驗(yàn)和評(píng)分的。
任何一個(gè)實(shí)驗(yàn)組中都有30％到40％的脊髓沒(méi)有足夠吸收標(biāo)記物(和/或其他組織學(xué)處理的問(wèn)題)。當(dāng)比較兩組之間沒(méi)有組織學(xué)意義的脊髓數(shù)時(shí)-包括比較頭側(cè)和尾側(cè)標(biāo)記的質(zhì)量(下行束和上行束分開(kāi)進(jìn)行)，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有顯著差異(表1)。最后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在右旋糖酐注射點(diǎn)和傷口之間的背根吸收了標(biāo)記物，所以沒(méi)有據(jù)此進(jìn)行排除(參見(jiàn)Borgens和Bohnert(1997) Exp Neurol 145，376-89)。
所有的對(duì)照動(dòng)物中，除了3只以外，順行性標(biāo)記的纖維都停止在距橫切面頭側(cè)或尾側(cè)250μm以上的位置處。在這3只(上行軸突)中只有1只，纖維是從標(biāo)記點(diǎn)(傷口的尾側(cè))向傷口平面投射的，但不穿過(guò)傷口平面。在同一動(dòng)物中，來(lái)自頭側(cè)脊髓的纖維投射沒(méi)有到達(dá)傷口平面，但落在了距傷口平面約100μm以?xún)?nèi)。在其他兩只動(dòng)物中，順行性標(biāo)記的上行和下行纖維穿過(guò)了250μm平面，但是沒(méi)有投射到如前一個(gè)樣本距傷口這么近的位置。
為了簡(jiǎn)化對(duì)于解剖學(xué)數(shù)據(jù)的討論，對(duì)于標(biāo)記的上行束和下行束的討論分別進(jìn)行說(shuō)明。表1列出了對(duì)于動(dòng)物比例的詳細(xì)比較和它們之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。盡管上行束的比較中可用于研究的脊髓數(shù)較少，對(duì)照組與兩個(gè)治療組之間的差異都十分顯著。尤其是，肌苷/OFS聯(lián)合治療能明顯增加了有上行性纖維停在距傷口250μm ms內(nèi)、和停在傷口平面上的脊髓數(shù)量。9個(gè)對(duì)照脊髓中只有2個(gè)有纖維在距傷口250μms內(nèi)，其中只有1個(gè)朝向半切斷平面。約90％的肌苷/OFS治療的脊髓中都在這些位置的纖維，這些脊髓軸突中45％進(jìn)入頭節(jié)。對(duì)照組與聯(lián)合治療組之間，所有3種比較(即靠近、位于、或越過(guò)橫切面)都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肌苷注入治療組中，帶有位于橫切面250μm ms以?xún)?nèi)的軸突的脊髓的增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而對(duì)帶有到達(dá)橫切面、或在橫切面周?chē)?或穿過(guò)橫切面的軸突的脊髓的比較，沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)。
盡管對(duì)照組、單一肌苷組和肌苷加OFS聯(lián)合治療組之間沒(méi)有組織學(xué)意義的脊髓數(shù)的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用FITC-標(biāo)記的右旋糖酐對(duì)下行束中的軸突進(jìn)行順行性標(biāo)記，明顯要比用若丹明-標(biāo)記的右旋糖酐吸收更好、整合更好。只有對(duì)照組和聯(lián)合治療組之間，帶有進(jìn)入尾節(jié)(繞過(guò)或穿過(guò)傷口)的纖維的脊髓數(shù)的比較才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)對(duì)帶有在橫切面上或250μm ms以?xún)?nèi)的纖維的脊髓進(jìn)行比較時(shí)，只有肌苷治療組與對(duì)照組相比有顯著差異。
綜上所述，盡管檢測(cè)所用的脊髓數(shù)量較少，與下行纖維束相比，上行束中由實(shí)驗(yàn)性治療引起的損傷后軸突退行性變性減少和軸突再生都更明顯。而且，聯(lián)合治療要比單一肌苷治療更有效的產(chǎn)生這樣的結(jié)果。
實(shí)施例2OFS和肌苷聯(lián)合治療在狗下肢癱瘓臨床治療中的效果在由椎間盤(pán)突出引起自然發(fā)生的脊髓損傷的狗中，進(jìn)行OFS結(jié)合肌苷聯(lián)合治療的臨床試驗(yàn)。選擇標(biāo)準(zhǔn)與以前在Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，305-322中所述一樣。簡(jiǎn)要地說(shuō)，選擇標(biāo)準(zhǔn)可以包括下述的一條或多條經(jīng)神經(jīng)學(xué)檢驗(yàn)和電生理學(xué)測(cè)試確定的下肢完全癱瘓；未受影響的節(jié)段反射；因椎間盤(pán)突出和局灶性病變而引起脊髓壓迫的放射學(xué)和脊髓攝影證據(jù)；壞死沒(méi)有明顯地向頭尾傳播；體重在16公斤以下。對(duì)急性和慢性損傷都可以研究。急性損傷的特征是癱瘓?jiān)谥委熐耙粋€(gè)月以?xún)?nèi)發(fā)生。慢性損傷的特征是癱瘓?jiān)谥委熐耙粋€(gè)月以上發(fā)生。OFS裝置的手術(shù)植入與以前在Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，305-322中所述一樣。用如實(shí)施例1所述的一般方法進(jìn)行肌苷治療。研究組包括用OFS加肌苷治療的動(dòng)物和只用肌苷治療的動(dòng)物。此外，本研究中的對(duì)照組包括任何下述動(dòng)物用假OFS和假肌苷治療的動(dòng)物，用假OFS治療的動(dòng)物，用假肌苷治療的動(dòng)物，和沒(méi)有接受治療的動(dòng)物。用與以前在Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，305-322中所述相同的方法，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)學(xué)和電生理學(xué)檢測(cè)。
實(shí)施例3OFS和肌苷治療的人類(lèi)臨床試驗(yàn)如本文所述，招募脊髓損傷的患者參加OFS和肌苷聯(lián)合治療的一期、二期和三期臨床試驗(yàn)。從相應(yīng)的研究機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)獲得批準(zhǔn)。從符合FDA的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GMP)的供應(yīng)商處購(gòu)買(mǎi)肌苷。在治療后一年的時(shí)間內(nèi)，追蹤觀測(cè)患者情況。
在本發(fā)明提及的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、出版物和電子版資料(包括在GenBank和RefSeq遞交的核酸序列，在SwissProt、PIR、PRF、PDB遞交的氨基酸序列，以及對(duì)GenBank和RefSeq中注明的編碼序列的變換)都在本申請(qǐng)中引用作為參考。進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明和實(shí)施例，只是為了便于清楚理解，并不由此產(chǎn)生任何不必要的限制。本發(fā)明不限于已經(jīng)描述和給出的詳細(xì)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員據(jù)此作出的各種改動(dòng)也包括在本發(fā)明所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍內(nèi)。
所有的標(biāo)題是為了方便讀者，除非特別指出，否則不應(yīng)被用于限制標(biāo)題后正文的意義。
權(quán)利要求
1.一種治療脊髓損傷患者的方法，所述方法包括對(duì)脊髓損傷部位進(jìn)行電刺激；和對(duì)患者進(jìn)行嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥；其中，所述受損脊髓中的神經(jīng)功能至少部分恢復(fù)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括給患者植入一個(gè)在脊髓損傷部位進(jìn)行電刺激的裝置。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述裝置是振蕩場(chǎng)刺激裝置。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述嘌呤核苷包括肌苷。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述嘌呤核苷或其類(lèi)似物是向患者全身性給藥的。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述嘌呤核苷或其類(lèi)似物是口服或皮下給藥的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述嘌呤核苷或其類(lèi)似物是在脊髓損傷部位局部給藥的。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，還包括給患者植入一個(gè)進(jìn)行嘌呤核苷或其類(lèi)似物局部給藥的裝置。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述脊髓損傷發(fā)生在治療前3個(gè)月以上。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述患者是人。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述患者是家養(yǎng)寵物。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述神經(jīng)功能的恢復(fù)可以通過(guò)神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)的恢復(fù)、傳導(dǎo)動(dòng)作電位的可檢測(cè)升高、解剖學(xué)連續(xù)性的檢測(cè)、一個(gè)以上脊髓根水平的恢復(fù)、反射行為的增加、或其組合來(lái)證明。
13.一種治療脊髓損傷患者的方法，所述方法包括對(duì)脊髓損傷部位進(jìn)行電刺激；和對(duì)患者進(jìn)行嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥；其中，脊髓損傷部位的神經(jīng)再生被激發(fā)。
14.一種治療脊髓損傷患者的方法，所述方法包括在有效恢復(fù)所述受損脊髓的神經(jīng)功能的情況下對(duì)患者進(jìn)行嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥。
15.一種治療脊髓損傷患者的方法，所述方法包括在有效激發(fā)脊髓損傷部位神經(jīng)再生的情況下對(duì)患者進(jìn)行嘌呤核苷或其類(lèi)似物給藥。
16.一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的試劑盒，所述試劑盒包括向損傷部位施加電刺激和嘌呤核苷或其類(lèi)似物的方法。
17.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，所述向損傷部位施加電刺激的方法包括振蕩場(chǎng)電刺激裝置以及包括肌苷在內(nèi)的嘌呤核苷或其類(lèi)似物。
18.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，還包括用于皮下、靜脈內(nèi)或鞘內(nèi)輸遞嘌呤核苷或其類(lèi)似物的裝置。
19.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，還包括關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷治療的文字說(shuō)明。
全文摘要
對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，尤其是脊髓損傷，是通過(guò)給予患者嘌呤核苷或類(lèi)似物并任選電刺激損傷部位來(lái)治療的。
文檔編號(hào)A61N1/08GK1732011SQ200380107820
公開(kāi)日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2003年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月30日
發(fā)明者R·B·博根斯 申請(qǐng)人:泊達(dá)研究基金會(huì)