專利名稱：一種抗艾滋病毒的中藥組合物、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有黃芩提取粉、茜草提取粉、人參皂甙粉和冬蟲夏草粉的藥物組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述的藥物組合物的制備方法以及所述的藥物用于治療艾滋病的用途。
背景技術(shù)：
黃芩為清熱燥濕藥，為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的根，主要含黃酮類成分，主要作用有抗炎、抗過(guò)敏、抗病原微生物、解熱及解毒等作用。茜草，又名茜根、血見(jiàn)愁、活血草，為茜科植物茜草Rubia cordifolia L的干燥跟及根莖，茜草含有的主要成分是脂溶性成分蒽醌、還原蒽醌以及它們的糖甙和水溶性成分環(huán)己肽類，另外尚富含鈣離子等等，其有涼血止血、化瘀行血、抗癌、抗病原微生物等作用。人參根味甘、微苦、性溫，具有調(diào)氣養(yǎng)血、安神益智、生津止咳、滋補(bǔ)強(qiáng)身之功效，被譽(yù)為“百草之王”，在中國(guó)自古就是調(diào)理身體的優(yōu)選藥物。而冬蟲夏草為子囊菌麥角科蟲草屬冬蟲夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc的子座及其宿主蝙蝠科昆蟲蟲草蝙蝠蛾Hepialus armoricanus oberthur的幼蟲尸體的復(fù)合體。冬蟲夏草含粗蛋白、脂肪、粗纖維、碳水化合物、灰分、蟲草酸、冬蟲夏草素、蟲草多糖、核苷類、肽類、二十烷等，主要有益精壯陽(yáng)、扶正益氣、補(bǔ)腎平喘、強(qiáng)身延年的作用，同時(shí)還有抗炎、抗心律失常、抗腫瘤的作用。
許多實(shí)驗(yàn)表明，人參可提高動(dòng)物與人的體力及智力活動(dòng)能力，并能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)各種有害刺激的非特異性抵抗力，在治療劑量下對(duì)正常生理功能無(wú)干擾亦無(wú)副作用，是一類有益無(wú)害的全身性強(qiáng)壯滋補(bǔ)藥。
在發(fā)現(xiàn)人參的上述藥物作用的基礎(chǔ)上，科技工作者對(duì)人參提取物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在人參中起作用的主要含30多種人參皂甙，如Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg、Rh1、Rh2、F2，和擬人參甙F1，RTs及西洋參皂甙LI等，這些人參皂苷的藥理研究主要有抗衰老作用、增強(qiáng)免疫功能的作用、降低血脂的作用，并能引起心臟及血管的一些改變。但迄今為止，尚沒(méi)有關(guān)于人參、人參提取物或任何一種人參皂苷能治療艾滋病的公開(kāi)。艾滋病即“人類獲得性免疫缺損”綜合癥疾病的簡(jiǎn)稱。其病原為“艾滋病毒(HIV)”，主要侵犯人體免疫系統(tǒng)，尤其是CD4淋巴細(xì)胞，最后摧毀機(jī)體免疫功能，引發(fā)條件性感染，導(dǎo)致死亡。
抗艾滋病毒藥物的研究，第一個(gè)被報(bào)道的是蘇拉明(Suramin)，1985年發(fā)現(xiàn)AZT具有體外抗艾滋病毒的活性，1986年進(jìn)行了臨床研究，1987年AZT作為第一個(gè)被美國(guó)批準(zhǔn)用于治療艾滋病的藥，其主要問(wèn)題是毒性和抗藥性，以后又有其它藥物出現(xiàn)，到目前為止被美國(guó)批準(zhǔn)的抗艾滋病毒藥有20個(gè)，按其作用機(jī)理主要屬于三類，除2002年底批準(zhǔn)的T20是作用于阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其它均是即病毒逆轉(zhuǎn)酶抑制劑，如AZT、DDC、DDI等，和病毒蛋白酶抑制劑，其中后者在美國(guó)FDA批準(zhǔn)了5種藥物，分別是沙奎那維(saquinavir)、利托那韋(ritonavir)、indinavir硫酸鹽、奈非那韋(nefinavir)等，1995年，美國(guó)科學(xué)家采用兩種逆轉(zhuǎn)酶抑制劑和一種蛋白酶抑制劑聯(lián)合用藥，即現(xiàn)在應(yīng)用的高活性抗逆轉(zhuǎn)酶療法(HAART)，組合的藥稱之為“三聯(lián)”，此療法提高了療效，進(jìn)一步延長(zhǎng)了病人壽命，至今應(yīng)用6-7年，尚有少數(shù)病人活存。
目前我國(guó)已有三種藥配制HAART療法的藥，但只有抗逆轉(zhuǎn)錄酶的藥物，缺乏抑制蛋白酶的藥物，而且毒性很大，有近20％的病人不能服用。因此在應(yīng)用中仍面臨毒性和抗藥性問(wèn)題。如前所述，T20雖然可以阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞，但由于T20是一種肽類，不能口服，只能注射，且價(jià)格十分昂貴。因此迫切需要毒性小的抗艾滋病毒藥物。
祖國(guó)醫(yī)藥是一個(gè)偉大的寶庫(kù)，值得挖掘發(fā)揚(yáng)。發(fā)明人經(jīng)過(guò)十多年的研究，找到一些中藥提取物或組分或單一成分具有確切的抗艾滋病毒的活性，研究了其抗艾滋病毒作用的靶點(diǎn)，并明顯提高機(jī)體免疫功能，具有比HAART價(jià)格便宜、毒性小等的優(yōu)勢(shì)，而且由于HAART療法有抗藥性，需要不斷更新治療組合的藥物，因此，中藥治療艾滋病具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)含有黃芩提取粉、茜草提取粉、人參皂甙粉和冬蟲夏草粉的藥物組合物具有明顯的治療艾滋病的作用。
因此，本發(fā)明一方面涉及一種藥物組合物，其含有黃芩提取粉、茜草提取粉、人參皂甙粉和冬蟲夏草粉，優(yōu)選地，以100份組合物計(jì)，所述的黃芩提取粉的含量范圍為10～30重量份，所述的茜草提取粉的含量為10～25重量份，所述的人參皂甙粉的含量范圍為18～25重量份，所述的冬蟲夏草粉的含量范圍為30～55重量份。
在所述的組合物中，優(yōu)選地，所述的黃芩提取粉的含量為18重量份，所述的茜草提取粉的含量為17重量份，所述的人參皂甙粉的含量范圍為18重量份，所述的冬蟲夏草粉的含量為47重量份。
在上述組合物中，所述的提取粉為醇提粉，可以為任何現(xiàn)有技術(shù)獲得的提取粉，所述的黃芩提取粉、茜草提取粉優(yōu)選按照下述方法制備，而人參皂甙粉可以是符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的市售品，優(yōu)選的標(biāo)準(zhǔn)是人參皂甙粉中含有Rb115～20wt％，Rb215～20wt％，Rb330～90wt％，Rc30～90wt％。所述的冬蟲夏草粉可以為天然藥用粉或人工培養(yǎng)的冬蟲夏草粉。
本發(fā)明另一方面涉及一種制備所述的藥物組合物的方法，包括以下步驟a.將黃芩的生藥粉碎，加入4～5倍的乙醇浸泡至少6小時(shí)；將浸泡的原料藥與浸泡液一起倒入滲濾罐進(jìn)行滲濾，滲濾的速度為3～4.5ml/kg.分鐘-1；再加入乙醇，同時(shí)進(jìn)行滲濾，使得收集到的滲濾液為相當(dāng)于生藥重量的10～20倍；收集并濃縮滲濾液，使得與水相比，最終獲得的濃縮液的重量比為水∶濃縮液＝1∶1.1～1.35；將上述濃縮液噴霧干燥成黃芩提取粉；同時(shí)或先后b.將茜草的生藥粉碎，加入4～5倍的乙醇浸泡至少6小時(shí)；將浸泡的原料藥與浸泡液一起倒入滲濾罐進(jìn)行滲濾，滲濾的速度為3～4.5ml/kg.分鐘-1；再加入乙醇，同時(shí)進(jìn)行滲濾，使得收集到的滲濾液為相當(dāng)于生藥重量的10～20倍；收集并濃縮滲濾液，使得與水相比，最終獲得的濃縮液的重量比為水∶濃縮液＝1∶1.1～1.35；將上述濃縮液噴霧干燥成茜草提取粉；c.按100重量份計(jì)，將10～30份黃芩提取粉、10～25份茜草提取粉、18～25份人參皂甙粉和30～55份冬蟲夏草粉混合獲得權(quán)利要求1的藥物組合物。上述方法中所用的乙醇優(yōu)選為30～70％，更優(yōu)選50％。
本發(fā)明再一方面涉及上述藥物組合物用于制備抗艾滋病毒的藥物中的用途。
所述的藥物組合物可以與抗艾滋病毒藥聯(lián)合應(yīng)用。所述的抗艾滋病毒藥是優(yōu)選是AZT、DDC、DDI、沙奎那維(saquinavir)、利托那韋(ritonavir)、indinavir硫酸鹽、奈非那韋(nefinavir)。
所述的藥物組合物的給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。
本發(fā)明藥物組合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。其它載體如聚丙烯酸樹脂類、脂質(zhì)體，水溶性載體如PEG4000和PEG6000、PVP等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。
例如為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明藥物組合物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。
例如，將本發(fā)明組合物制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的。
此外，如需要，也可以向組合物中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥，優(yōu)選口服給藥。
本發(fā)明的藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如艾滋病患者病程的嚴(yán)重程度，患者的性別、年齡、體重、性格及個(gè)體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來(lái)講，本發(fā)明中藥物成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。可以根據(jù)本發(fā)明組合物中最后的制劑中所含有的實(shí)際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治療目的。本發(fā)明組合物的每天的合適劑量范圍為0.03～0.50mg/Kg體重/天。上述劑量可以分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。


圖1顯示ZL-1治療病人6個(gè)月后CD4變化情況示意圖。
圖2顯示ZL-1猴體內(nèi)試驗(yàn)CD4+淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化。
圖3顯示本發(fā)明藥物組合物對(duì)猴感染SIV后病毒增殖的抑制作用。
圖4顯示茜草(CD)、人參皂甙(JH)以及本發(fā)明組合物(ZL-1)的作用靶點(diǎn)的研究。
圖5顯示本發(fā)明藥物組合物對(duì)CXCR4、CCR5輔助受體的作用。
圖6本發(fā)明組合物組分之一JHR作用于CD4受體的檢測(cè)結(jié)果。
圖7顯示茜草(CD)對(duì)gp41(穿膜蛋白)的結(jié)合作用，圖7B顯示人參皂甙(JHR)對(duì)gp41的結(jié)合作用具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖描述本發(fā)明。
實(shí)施例1本發(fā)明藥物組合物的制備取180kg黃芩、150kg茜草生藥，粉碎，加入50％乙醇1400L浸泡6小時(shí)；將浸泡的原料藥與浸泡液一起倒入滲濾罐進(jìn)行滲濾，滲濾的速度為3～4.5ml/kg.分鐘-1；陸續(xù)分次加入乙醇，繼續(xù)進(jìn)行滲濾，收集到4000L滲濾液；通過(guò)回收乙醇濃縮滲濾液，使得與水相比，最終獲得的濃縮液的重量比為水∶濃縮液＝1∶1.1～1.35；將上述濃縮液噴霧干燥成粉；黃芩和茜草的提取粉的收率分別為8～10％和10～15％，因此，所獲得的干燥粉相當(dāng)于18kg黃芩提取粉、17kg茜草提取粉。并將獲得的干燥粉與18kg人參皂甙粉和47kg冬蟲夏草粉混合得到本發(fā)明組合物ZL-1，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法加入適量藥用載體制成本發(fā)明的膠囊粉，然后裝入膠囊待用。每粒膠囊中含有本發(fā)明組合物為約0.5g。
實(shí)施例2取180kg黃芩生藥，粉碎，加入50％乙醇720L浸泡6小時(shí)；將浸泡的原料藥與浸泡液一起倒入滲濾罐進(jìn)行滲濾，滲濾的速度為3～4.5ml/kg.分鐘-1；再陸續(xù)50％的乙醇，繼續(xù)進(jìn)行滲濾，收集到滲濾液2200L；通過(guò)揮發(fā)乙醇濃縮滲濾液，使得與水相比，最終獲得的濃縮液的重量比為水∶濃縮液＝1∶1.1～1.35；將上述濃縮液噴霧干燥成粉，得到18kg黃芩提取粉。
取150kg茜草生藥，粉碎，加入40％乙醇600L浸泡6小時(shí)；將浸泡的原料藥與浸泡液一起倒入滲濾罐進(jìn)行滲濾，滲濾的速度為3～4.5ml/kg.分鐘-1；陸續(xù)加入40％的乙醇，繼續(xù)進(jìn)行滲濾，收集到滲濾液1800L；通過(guò)揮發(fā)乙醇濃縮滲濾液，使得與水相比，最終獲得的濃縮液的重量比為水∶濃縮液＝1∶1.1～1.35；將上述濃縮液噴霧干燥成粉，獲得17kg茜草提取粉。
將獲得的干燥粉與18kg人參皂甙粉和47kg冬蟲夏草粉混合得到本發(fā)明組合物ZL-1，裝入膠囊待用。
實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明藥物組合物的臨床實(shí)驗(yàn)患者來(lái)源2002年在河南省新蔡縣、商丘對(duì)1000例病人治療后，抽取60例病人的血液，樣本選擇點(diǎn)對(duì)象為1992年至1995年間因賣血感染愛(ài)滋病的人員，共60人，其中男19人，女41人，年齡最大58歲，最小27歲，平均年齡38.9歲，均為農(nóng)民。其中59個(gè)丙型肝炎抗體檢測(cè)為陽(yáng)性，7人梅毒PPR檢驗(yàn)為陽(yáng)性，2人合并肺結(jié)核感染，乙肝檢驗(yàn)均為陰性。
服藥方法每天3次，每次4粒，口服。
1.治療前后病毒載量變化分別于治療前和治療后6個(gè)月抽取病人血，離心取血漿，-80℃保存，檢測(cè)時(shí)按羅氏(Rocher)RNA定量PCR儀器及試劑盒要求的方法先提取RNA，用羅氏儀器檢測(cè)病毒載量，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1ZL-1治療后病毒載量(VL)的變化

2.治療前后P24抗原量的變化采用Microelisa方法及試劑，測(cè)定上述標(biāo)本中的P24抗原量，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2ZL-1治療后HIV P24抗原的變化

從表2的結(jié)果可以看出，服用本發(fā)明的藥物組合物以后，病人血漿中的病毒載量在治療6個(gè)月后明顯下降，及維持不變的達(dá)70％，30％僅輕微上升。
3.治療前后CD4檢測(cè)情況對(duì)所采的血液標(biāo)本采用流式細(xì)胞儀對(duì)其全血進(jìn)行CD4檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3.60例病人的CD4檢測(cè)情況

從表3結(jié)果可以看出，經(jīng)本發(fā)明藥物組合物治療以后，病人血中的CD4明顯上升，表明本發(fā)明藥物組合物可以明顯提高病人血中的CD4水平。服藥后一個(gè)月CD4增加一倍，繼續(xù)服藥，CD4持續(xù)上升，6個(gè)月時(shí)增加了156.7％，CD4接近300，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)CD4在200以下為病人，200以上向正?；謴?fù)。
另外，目前國(guó)內(nèi)艾滋病人應(yīng)用的輔助藥物，其批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)為必須50％或以上的病人CD4數(shù)量的增加30％以上，本發(fā)明人還對(duì)經(jīng)本發(fā)明藥物組合物ZL-1治療6個(gè)月后全血中的CD4進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1中可以看出，本發(fā)明組合物有86％的病人CD4增加超過(guò)30％，有80％的病人的CD4增加超過(guò)50％，……甚至有37％的病人CD4數(shù)量增加了400倍。
4.對(duì)上述60例病人治療前后臨床指征變化的觀察，結(jié)果見(jiàn)表4A、4B。
表4A

表4B


以上數(shù)據(jù)表明臨床癥狀及指征明顯改善。
5.本發(fā)明藥物組合物的體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)(1)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果給大鼠灌胃給藥，大于20克/公斤未見(jiàn)任何毒性。
(2)亞急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果給大鼠連續(xù)灌胃6個(gè)月后，大、中、小三個(gè)劑量組的大鼠生長(zhǎng)情況正常，ALT、BUN、RBC、WBC及白細(xì)胞分類均正常，病理切片表明心、肝、腎、脾、肺、胰、腦、睪丸、卵巢等臟器未見(jiàn)異常。
6.安全性評(píng)價(jià)體外治療指數(shù)檢測(cè)，見(jiàn)表5。
表5

實(shí)驗(yàn)例2本實(shí)施例描述一典型病例，倪××，遼寧人，32歲，經(jīng)本發(fā)明藥物組合物治療前后病毒載量的變化情況，見(jiàn)表6，其中的服藥方法同實(shí)施例1的描述。
表6用本發(fā)明藥物組合物治療的一例病人的病毒載量變化

實(shí)驗(yàn)例3本發(fā)明藥物組合物的藥效學(xué)研究體外實(shí)驗(yàn)分別用HIV-1病毒感染三種細(xì)胞(MT4，Hela-CD4，PBMC)，觀察根據(jù)實(shí)施例1制備的藥物ZL-1對(duì)HIV-1復(fù)制的抑制作用。
(1)MT4細(xì)胞病毒HIV-1，NL4株方法將實(shí)施例1的藥物組合物配制成1mg/ml的濃度，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成不同濃度備用。①在96孔培養(yǎng)板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，于各孔加入100μl藥液，每個(gè)濃度藥液至少設(shè)兩個(gè)孔。另取新鮮培養(yǎng)的MT4細(xì)胞，每管5×105細(xì)胞，加HIV-1病毒1×103TCID50/ML，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，兩小時(shí)后離心，棄去上清，再用RPMI1640洗一次，去除游離的病毒，加培養(yǎng)基到5×105/1ml。于96孔板每個(gè)加有藥的孔中加入100μL此感染HIV-1的細(xì)胞(5×104/100μL)二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。第三天換藥，于孔中吸出100μL上清，加入100μL與本孔相同濃度的新鮮藥液，對(duì)照組加入100μL培養(yǎng)基。第六天，各孔取上清，采用Microelisa方法及試劑，測(cè)定P24抗原量。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)病毒對(duì)照，細(xì)胞對(duì)照及AZT陽(yáng)性藥對(duì)照，根據(jù)所測(cè)P24抗原量按下列公式計(jì)算抑制率 不同濃度藥液所得的不同抑制率，經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理，求得半數(shù)制率量(IC50)。
(2)Hela—CD4細(xì)胞病毒HIV的單一生活周期的報(bào)告病毒(Single-life-cycle reportervirus)由帶HIV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染而得。
方法24孔板接種Hela-CD4-LTR--gal細(xì)胞0.4×105/孔，放置24小時(shí)，使之吸附，貼壁，第二天，吸去孔中上清，加100ul藥(藥對(duì)照)或藥及HIV-1(可不同濃度藥液)或培養(yǎng)基(Mock)，兩小時(shí)后各孔加入200μl相同藥液或培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48小時(shí)，按下列方法檢測(cè)。
固定各孔吸去上清加入固定液(1ml)再以K4[Fe(CN)6]·3H2O，K3[Fe(CN)6]及X-gel染色。
計(jì)數(shù)每孔蘭色細(xì)胞數(shù)以下列公式計(jì)算抑制率，再計(jì)算IC50。
(3)PBMC細(xì)胞病毒NL4-3方法以醫(yī)院中新鮮取得的PBMC(人外周血新分離的淋巴細(xì)胞)，計(jì)數(shù)、離心1200rpm棄去上清，配成3×106細(xì)胞/ml。所用培養(yǎng)基應(yīng)加入IL2.(1000×的IL2按每ml培養(yǎng)基中加入1μl)37℃過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)以5×106為一感染單位，JHR濃度為0.4mg/ml相同濃度設(shè)兩孔，病毒對(duì)照兩孔，細(xì)胞對(duì)照也設(shè)兩孔，24孔板每孔5×106細(xì)胞在0.5ml藥液或培養(yǎng)基中，NL4.3病毒(HIV-1)，病毒量為每孔加入4×104IU，吹打均勻，轉(zhuǎn)入12孔板，再加入相同藥液或培養(yǎng)基，1.5ml，使總量為2ml，37℃培養(yǎng)，每3-4天取上清，每孔取100μl，放-80℃保存，全部收集完測(cè)定RT，藥物組與病毒對(duì)照組比較計(jì)算抑制率。
所得結(jié)果如下MT4細(xì)胞株半數(shù)抑制量IC50＝139μg/mlHela-CD細(xì)胞株半數(shù)抑制量IC50＝54.8μg/mlPBMC細(xì)胞(本發(fā)明組合物組分之一JHR)(人外周血新分離的淋巴細(xì)胞)服藥6天的半數(shù)抑制量IC50＝77μg/ml。
結(jié)果表明ZL-1在體外試驗(yàn)中對(duì)HIV-1有明顯的抑制作用。
實(shí)驗(yàn)例4本發(fā)明藥物組合物對(duì)恒河猴的治療作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用恒河猴，4.5～5.5Kg，雌雄各半，共10只，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所靈長(zhǎng)類繁殖中心，用商品化膨化飼料飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前經(jīng)體檢無(wú)異常，經(jīng)血清學(xué)間接免疫熒光(IFA)抗體檢查法檢查排除潛在的猴免疫缺陷病毒(SIV)，猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV)和猴T淋巴細(xì)胞性I型病毒(STLV-I)的感染。
感染毒株和劑量用美國(guó)Aaron Diamond艾滋病研究中心darx博士贈(zèng)與的SIVmac251病毒株，每只動(dòng)物用相當(dāng)于3MID100病毒劑量的病毒液1ml靜脈感染。
藥物及實(shí)驗(yàn)治療方案ZL-1和AZT均由本發(fā)明人提供，劑型為膠囊。動(dòng)物分AZT陽(yáng)性藥物治療組和SIVmac251感染對(duì)照組，每組動(dòng)物3～4只，雌雄各半。ZL-1治療組動(dòng)物在病毒感染前10天開(kāi)始給藥，每日給藥一次，一次2粒膠囊，經(jīng)口服用，連續(xù)不間斷給藥70天；AZT陽(yáng)性藥物對(duì)照組動(dòng)物在病毒感染后30分鐘開(kāi)始給藥，每動(dòng)物每日給藥一次，每次100mg經(jīng)口服用，連續(xù)不間斷給藥60天。SIVmac251感染對(duì)照組不給藥治療。
感染前后觀察感染前除一般體檢外，稱體重，采血(作感染前的各項(xiàng)指標(biāo)檢查)。感染和治療后繼續(xù)做一般觀察和檢查，并按程序定時(shí)采血測(cè)定血漿病毒滴度、血液中CD4+淋巴細(xì)胞數(shù)和抗體滴度。60天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死動(dòng)物。
血漿病毒分離動(dòng)物感染SIVmac251后，選擇第7、11、14、21、28、42、60天采取血樣，肝素抗凝分離血漿，血漿分別從200μl開(kāi)始以5倍遞減量稀釋于24孔板內(nèi)，以10％小牛血清RPMI-1640補(bǔ)至每孔1ml，然后加入105個(gè)SIVmac251敏感細(xì)胞株CEMX174細(xì)胞液0.6ml，置37℃CO2孵箱，每3-4天觀察和細(xì)胞傳代一次。以接種最小量的標(biāo)本仍然出現(xiàn)典型的細(xì)胞融合病變?yōu)闃?biāo)本的病毒滴度。每標(biāo)本接種8個(gè)滴度即200ul、40ul、8ul、1.6ul、0.32ul、0.064ul、0.0128ul和0.00256ul，各相當(dāng)于每毫升血漿SIV病毒5、25、125、625、3125、15625、78125和390625個(gè)TCID值。標(biāo)本觀察3周判定病毒分離結(jié)果。
血液中CD4+淋巴細(xì)胞數(shù)測(cè)定選擇動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前和感染SIVmac251后第14、28、42、60天采取血樣標(biāo)本，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞，用直接熒光標(biāo)記抗CD4單克隆抗體染色后，上機(jī)FACS計(jì)數(shù)得到CD4+淋巴細(xì)胞百分率，結(jié)合普通血象檢查的白細(xì)胞總數(shù)和分類結(jié)果，計(jì)算出血液中含CD4+淋巴細(xì)胞的總數(shù)。
1.藥物治療前后恒河猴體內(nèi)CD4+淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化結(jié)果結(jié)果如圖5、表7所示。


以上結(jié)果表明猴感染SIV后，病毒量上升的同時(shí)，CD4細(xì)胞數(shù)急劇下降，而ZL-1治療組在感染后2，4周時(shí)，可保護(hù)45-48％細(xì)胞不受病毒侵害，而AZT組35％細(xì)胞受保護(hù)，6，8周后ZL-1治療組仍有32-38％細(xì)胞受到保護(hù).
2.藥物治療前后恒河猴體內(nèi)病毒量的變化結(jié)果如表8、圖3所示。
表8恒河猴治療實(shí)驗(yàn)(恒河猴感染SIVmac251，為急性感染)藥后周數(shù) 1 2 3 4抑制率(％) 17.0％ 80.2％ 70.7％ 70.2％結(jié)果表明祛毒增寧對(duì)恒河猴感染的SIV有明顯的抑制作用。
傳統(tǒng)治療艾滋病藥物AZT有明顯抑制SIV的作用，抑制率達(dá)90％以上，本發(fā)明藥物組合物也有明顯的抑制作用，在所用的劑量下，可使抑制率維持在70～80％。
實(shí)驗(yàn)例5本發(fā)明藥物組合物作用靶點(diǎn)1.病毒生活周期中作用階段的檢測(cè)目的觀察本發(fā)明藥物組合物作用于病毒生活周期哪個(gè)或哪幾個(gè)階段，包括病毒進(jìn)入細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、轉(zhuǎn)錄、蛋白酶。應(yīng)用病毒“單一生活周期”(single life cycle)模型研究藥物作用靶點(diǎn)。
(1)MAGI法合病毒為重組病毒，以HIV的LTR，使β-半乳糖苷酶報(bào)告基因得以表達(dá)，形成病毒的一種“單一生活周期”的模型。此模型如前述用Hela-CD4細(xì)胞以K4[Fe(CN)6]、K3[Fe(CN)6]、x-gel染色，顯微鏡下藍(lán)色細(xì)胞表示帶有病毒基因。
(2)Luciferase法采用重組、轉(zhuǎn)染的VSVG病毒，細(xì)胞系用H9細(xì)胞株，檢查方法采用發(fā)光法檢測(cè)Luciferase的活性，病毒量多則此酶活性高。
實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞感染病毒后設(shè)不同組，分別于感染后0，6，12，18，24，36小時(shí)加藥，作用至感染后48小時(shí)，分別進(jìn)行MAGI或Luciferase法檢測(cè)。
以上兩種檢測(cè)方法均為病毒“單一生活周期”模型，其最大優(yōu)點(diǎn)是感染的不同時(shí)間表示病毒繁殖的不同階段。2-6小時(shí)是病毒進(jìn)入細(xì)胞，10-14小時(shí)是逆轉(zhuǎn)錄階段，20小時(shí)以后是整合、轉(zhuǎn)錄階段。故不同時(shí)間給藥其抑制作用表示作用于何靶點(diǎn)。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)對(duì)JHR和Rb3的作用靶點(diǎn)進(jìn)行了分析。
結(jié)果見(jiàn)圖4所示，結(jié)果表明ZL-1作用于阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞，以及逆轉(zhuǎn)錄酶及整合酶諸階段。ZL-1組合物中的茜草提取物(CD)僅對(duì)病毒進(jìn)入及逆轉(zhuǎn)錄酶階段有作用，而人參皂甙(JHR)對(duì)病毒進(jìn)入及整合酶階段有作用，表明組合物優(yōu)于單一提取物。
2.作用于輔助受體CXCR4CCR5的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)使用MAGI法進(jìn)行方法同上，檢測(cè)CXCR4受體用嗜T淋巴細(xì)胞，病毒用NL4，檢測(cè)CCR5受體用嗜M淋巴細(xì)胞，病毒用YU2.
結(jié)果見(jiàn)圖5。
從圖5中可以看出，本發(fā)明組合物對(duì)CXCR4輔助受體、CCR5輔助受體均有抑制作用，則表明其作用可能在嗜T及嗜M淋巴細(xì)胞共同有的CD4受體或者病毒與細(xì)胞的融合過(guò)程，而不是此兩輔助受體本身。
3.作用于CD4受體的檢測(cè)本研究使用本發(fā)明組合物組分之一JHR進(jìn)行。
使用流式細(xì)胞儀的方法進(jìn)行測(cè)試。方法如下采用SupT1細(xì)胞與藥物37℃共同培育2小時(shí)，以PBS+2％FCS洗滌，于4℃冰浴條件加CD4PE放置30分鐘，洗滌，離心后加CD4單抗，冰浴中培育30分鐘，洗滌，離心，冰浴條件，懸浮于50ul的二抗Ab抗-小鼠-FITC中20分鐘，洗滌一次，懸浮于300-500ul的PBS/2％CS+PI中，F(xiàn)ACS(進(jìn)行流式儀檢測(cè))。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。
結(jié)果表明JHR對(duì)CD4受體無(wú)作用。
4.作用于病毒跨膜蛋白gp41的檢測(cè)本研究采用本發(fā)明組合物成分之一茜草(CD)和JHR進(jìn)行。其對(duì)gp41(穿膜蛋白)的結(jié)合作用的結(jié)果見(jiàn)76A、6B。將基因重組的gp41分別置于BIACORE檢測(cè)儀的芯片上，分別加入一定濃度的茜草或JHR提取物，儀器即檢測(cè)出是否與之結(jié)合。作為組合物組分致之一的茜草(CD)和JHR與病毒的gp41都有結(jié)合作用。
實(shí)驗(yàn)例6本發(fā)明藥物組合物與其他治療愛(ài)滋病藥物的聯(lián)合用藥目的觀察ZL-1與AZT有無(wú)協(xié)同作用采用ZL-1組成藥物之一JHR進(jìn)行。
方法實(shí)驗(yàn)采用MAGI+est方法(如前)①單獨(dú)用藥AZT從1uM至3.9nM，設(shè)五個(gè)劑量AZT1-5JHR-1從400ug/ml至1.56ug/ml，設(shè)五個(gè)劑量分別求得IC50②合并應(yīng)用以AZT與JHR-1各1/2量相加為一個(gè)樣品AZT1分別與JHR1-JHR5五個(gè)組合AZT2、AZT3、AZT4、AZT5亦分別與JHR-1-JHR-5五個(gè)組合，故為25個(gè)濃度組合，每個(gè)濃度設(shè)兩孔，另設(shè)細(xì)胞、病毒對(duì)照。
③以各藥物組合與病毒組比較，求得抑制率。以各藥物組合抑制率與單獨(dú)AZT IC50比較作用增減。
以下表9顯示本發(fā)明藥物組合物JHR-1與AZT的聯(lián)合用藥結(jié)果。
表9

從表9可以看出，本發(fā)明藥物組合物與AZT具有協(xié)同藥物作用。最大劑量組可增效7.9倍。
實(shí)驗(yàn)例7本發(fā)明藥物組合物組分之一對(duì)HIV蛋白酶抑制劑抗性毒株的抑制作用本發(fā)明人進(jìn)一步研究了本發(fā)明藥物組合物對(duì)HIV蛋白酶抑制劑抗性株的抑制作用。
HIV-1對(duì)一種蛋白酶抑制劑形成的抗性株，毒力為5.7×104IU/ml，采用Hela-CD4細(xì)胞，MAGI實(shí)驗(yàn)方法觀察JHR的作用，有無(wú)交叉抗性，結(jié)果JHR劑量為0.4mg/ml，病毒5ul或8ul抑制率均達(dá)100％，表明對(duì)白酶抑制劑形成的抗性株也有作用，結(jié)果見(jiàn)表10。
表10

*PRIV是蛋白酶抑制劑的抗性株病毒。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其含有黃芩提取粉、茜草提取粉、人參皂甙粉和冬蟲夏草粉的，其特征在于以100重量份組合物計(jì)，所述的黃芩提取粉的含量范圍為10～30重量份，所述的茜草提取粉的含量為10～25重量份，所述的人參皂甙粉的含量范圍為18～25重量份，所述的冬蟲夏草粉的含量范圍為30～55重量份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中在所述的組合物中，所述的黃芩提取粉的含量為18重量份，所述的茜草提取粉的含量為17重量份，所述的人參皂甙粉的含量范圍為18重量份，所述的冬蟲夏草粉的含量為47重量份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述的黃芩提取粉、茜草提取粉或人參皂甙粉為醇提取粉，所述的冬蟲夏草粉為天然藥用粉或人工培養(yǎng)的冬蟲夏草粉。
4.一種制備如權(quán)利要求1所述的藥物組合物的方法，包括以下步驟a.將黃芩的生藥粉碎，加入4～5倍的乙醇浸泡至少6小時(shí)；將浸泡的原料藥與浸泡液一起倒入滲濾罐進(jìn)行滲濾，滲濾的速度為3～4.5ml/kg.分鐘-1；再加入乙醇，同時(shí)進(jìn)行滲濾，使得收集到的滲濾液為相當(dāng)于生藥重量的10～20倍；收集并濃縮滲濾液，使得與水相比，最終獲得的濃縮液的重量比為水∶濃縮液＝1∶1.1～1.35；將上述濃縮液噴霧干燥成黃芩提取粉；同時(shí)或分別b.另將茜草的生藥粉碎，加入4～5倍的乙醇浸泡至少6小時(shí)；將浸泡的原料藥與浸泡液一起倒入滲濾罐進(jìn)行滲濾，滲濾的速度為3～4.5ml/kg.分鐘-1；再加入乙醇，同時(shí)進(jìn)行滲濾，使得收集到的滲濾液為相當(dāng)于生藥重量的10～20倍；收集并濃縮滲濾液，使得與水相比，最終獲得的濃縮液的重量比為水∶濃縮液＝1∶1.1～1.35；將上述濃縮液噴霧干燥成茜草提取粉；c.按100重量份計(jì)，將10～30份黃芩提取粉、10～25份茜草提取粉、18～25份人參皂甙粉和30～55份冬蟲夏草粉混合獲得權(quán)利要求1的藥物組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的乙醇為30～70％的乙醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～3所述的藥物組合物用于制備抗艾滋病毒的藥物中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的藥物組合物可以與抗艾滋病毒藥聯(lián)合應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的抗艾滋病毒藥是AZT、DDC、DDI、沙奎那維、利托那韋、indinavir硫酸鹽、奈非那韋。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有黃芩提取粉、茜草提取粉、人參皂甙粉和冬蟲夏草粉的藥物組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述的藥物組合物的制備方法以及所述的藥物用于治療艾滋病的用途。
文檔編號(hào)A61K36/068GK1754559SQ20041008051
公開(kāi)日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月30日
發(fā)明者李澤琳, 曾越, 曾毅, 曾欣 申請(qǐng)人:北京世紀(jì)康醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)有限公司