專利名稱：用于調(diào)變免疫反應(yīng)的模塊化抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子(mat分子)和相關(guān)的構(gòu)建體、方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及刺激和抑制免疫系統(tǒng)以預(yù)防、治療或診斷與免疫系統(tǒng)激活不足或過(guò)度激活相關(guān)的疾病，所述疾病包括感染性疾病、腫瘤性疾病、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病、移植物排異反應(yīng)等等。本發(fā)明的核心是一種新的方法，該方法通過(guò)一種MAT分子影響免疫系統(tǒng)，所述MAT分子至少由以下三種組分組成1.一種轉(zhuǎn)運(yùn)模塊(module)，其作用是使得MAT分子能夠自細(xì)胞外穿透到細(xì)胞內(nèi)，2.一種細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)向模塊，其作用是使得MAT分子在細(xì)胞內(nèi)被加工以便產(chǎn)生改變的免疫應(yīng)答或改變的抗原呈遞，和3.一種抗原模塊，其決定所調(diào)變的免疫應(yīng)答的特異性。
這三種元件的組合產(chǎn)生了一種MAT分子，由此能夠以導(dǎo)向性和特異性的方式調(diào)變被處理的個(gè)體的免疫系統(tǒng)，或能夠改變抗原呈遞細(xì)胞的抗原呈遞。
背景技術(shù)：
抗原呈遞細(xì)胞對(duì)抗原的加工抗原呈遞細(xì)胞(APC)通過(guò)兩者途徑對(duì)抗原進(jìn)行加工。存在于細(xì)胞內(nèi)部的抗原通過(guò)細(xì)胞表面的MHC I(I類主要組織相容性復(fù)合物，I類MHC)分子呈遞，而細(xì)胞外的抗原通過(guò)細(xì)胞表面的MHC II(II類主要組織相容性復(fù)合物，II類MHC)分子呈遞。這兩種機(jī)制引發(fā)了宿主對(duì)抗原的免疫反應(yīng)。自抗原被細(xì)胞攝取直至以MHC II-抗原復(fù)合物的形式呈遞在細(xì)胞表面的途徑通過(guò)多種細(xì)胞器而進(jìn)行，其中經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、高爾基體反面的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、溶酶體、內(nèi)體并經(jīng)由II類MHC區(qū)室(compartment)(MHC)。MHC在MHC II-介導(dǎo)的抗原呈遞中具有重要作用。在這些細(xì)胞器中，MHC II分子被加載了低分子量抗原或蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)水解片段。在這一過(guò)程中，最初結(jié)合于MHC II分子的恒定鏈(也稱為MHC IIγ鏈或Ii)發(fā)生蛋白質(zhì)水解降解，而抗原在多種直接或間接結(jié)合于MHC II的蛋白質(zhì)的調(diào)控下結(jié)合于MHC II分子[1]。這些調(diào)節(jié)分子包括HLA-DM、HLA-DO、LAMP-1、LAMP-2、CD63、CD83等等。這些蛋白質(zhì)的確切功能尚未完全明了，但其中很多蛋白質(zhì)具有信號(hào)序列，這些信號(hào)序列促使這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至溶酶體、內(nèi)體、高爾基體反面的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、MHC等等[2-4]。一些蛋白酶參與了這些必需的蛋白質(zhì)水解反應(yīng)，由此使得抗原能夠在MHC II分子上呈遞。MHC中的蛋白酶包括組織蛋白酶家族的多種成員，例如組織蛋白酶S和組織蛋白酶L[1]。
導(dǎo)向作用和導(dǎo)向序列具有在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外特異性聚集于特定位點(diǎn)或特定細(xì)胞器的特性的氨基酸序列通常被稱為導(dǎo)向序列。在這種情況中應(yīng)該注意到，各種類型的導(dǎo)向作用可以是不同的。具體來(lái)說(shuō)，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外導(dǎo)向作用是有區(qū)別的。對(duì)于細(xì)胞外導(dǎo)向，可使用例如抗體，其在細(xì)胞外結(jié)合于細(xì)胞表面直接可到達(dá)的結(jié)構(gòu)，例如膜蛋白的細(xì)胞外部分。結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面蛋白的抗體可偶聯(lián)例如一種細(xì)胞毒素。這樣，該抗體將細(xì)胞毒素在細(xì)胞外導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞，由此能夠?qū)⒑笳叨ㄏ驓?。這種類型的導(dǎo)向作用明顯不同于細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)向。在后者，通常必需克服細(xì)胞內(nèi)的膜，或?qū)蛐蛄薪Y(jié)合于細(xì)胞內(nèi)受體且由此穿透進(jìn)入例如特定的細(xì)胞器，或?qū)蛐蛄锌纱┩赣商囟ǖ鞍踪|(zhì)形成的特定的通道，進(jìn)入到該導(dǎo)向序列對(duì)其具有特異性的細(xì)胞器。本申請(qǐng)以下所提及的導(dǎo)向序列或?qū)蚰K原則上所指的都是細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)向而非細(xì)胞外導(dǎo)向。此外，在本申請(qǐng)中，導(dǎo)向作用并非指的是所有類型的細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)向，而僅僅是指將分子轉(zhuǎn)運(yùn)至參與抗原加工、修飾和/或結(jié)合于MHC分子的細(xì)胞器或細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)向。此類細(xì)胞器或細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的例子是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、高爾基體反面的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、內(nèi)體、溶酶體和MHC。來(lái)自各種蛋白質(zhì)的導(dǎo)向序列可參見(jiàn)文獻(xiàn)[1-5]。
轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)運(yùn)序列此外，文獻(xiàn)中記載了眾多促進(jìn)蛋白質(zhì)、肽和其他類型的物質(zhì)(例如核酸或具有藥物活性的物質(zhì))轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的氨基酸序列，特別是來(lái)自病毒的序列，例如HIV tat或來(lái)自單純皰疹病毒的蛋白質(zhì)VP22。為此，可將這些所謂的轉(zhuǎn)運(yùn)序列通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵連接于待轉(zhuǎn)運(yùn)的分子(也稱為貨物分子)。這樣可將得到的轉(zhuǎn)運(yùn)序列和貨物分子化合物在細(xì)胞外添加給細(xì)胞。然后轉(zhuǎn)運(yùn)序列使得貨物分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。這一原理同樣已經(jīng)被許多研究所披露，特別是對(duì)于HIV Tat序列而言[6-8]。
盡管已經(jīng)可以并有意將抗原作為貨物分子，但至今仍無(wú)法僅僅借助于已知的轉(zhuǎn)運(yùn)手段在個(gè)體中產(chǎn)生在導(dǎo)向作用和劑量方面足以達(dá)到特定要求的免疫應(yīng)答，例如達(dá)到對(duì)變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行脫敏的要求。因此仍然亟需用于導(dǎo)向免疫調(diào)變的進(jìn)一步的方法。
發(fā)明目的因此，本發(fā)明的目的是提供將各種各樣的抗原中的任意一種以足夠準(zhǔn)確的導(dǎo)向方式提供給其加工位點(diǎn)的手段，以使得抗原具有更好的治療和診斷用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種方法，其能夠?qū)⒖乖詷O準(zhǔn)確的導(dǎo)向方式提供給細(xì)胞，以產(chǎn)生有效的特異性免疫反應(yīng)。所述方法首先能夠?qū)⒖乖行У刈约?xì)胞外空間運(yùn)送至細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)空間，且其次能夠在抗原進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后使其有效達(dá)到對(duì)其進(jìn)一步加工以用于抗原呈遞的細(xì)胞器。這種兩階段的方法可廣泛用于對(duì)個(gè)體的免疫反應(yīng)進(jìn)行導(dǎo)向性的有效的調(diào)變。
已經(jīng)產(chǎn)生了作為用于實(shí)現(xiàn)這些作用的工具的特殊分子，本申請(qǐng)?jiān)谙挛闹袑⑵浞Q為“模塊化抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Modular antigen transporter)”分子或MAT分子。本申請(qǐng)的權(quán)利要求書(shū)詳細(xì)表征了這些MAT分子、相關(guān)的核酸、載體、細(xì)胞、細(xì)胞系、小泡、免疫球蛋白、以及屬于本發(fā)明并涉及這些組分或通過(guò)這些組分而起作用的用途和方法。
為了實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種以往未曾被描述過(guò)的至少三種模塊的組合，其產(chǎn)生了一類新的分子，稱為MAT分子(模塊化抗原轉(zhuǎn)運(yùn)分子)。這三種模塊包括至少一種轉(zhuǎn)運(yùn)模塊、至少一種導(dǎo)向模塊和至少一種抗原模塊。三種不同的模塊通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵彼此偶聯(lián)?？蓪⑷绱酥苽涞腗AT分子直接施用于個(gè)體以影響其對(duì)MAT分子中的抗原的免疫反應(yīng)。或者，可用MAT分子在體外處理細(xì)胞，并將如此處理的細(xì)胞施用于該個(gè)體。在該方法中，轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的作用在于使得MAT分子能夠穿透進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)向模塊的作用在于使得MAT分子進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)加工以便產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而抗原模塊中的抗原本身決定了免疫反應(yīng)所針對(duì)的抗原。這種調(diào)變個(gè)體的免疫應(yīng)答的新方法的一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)在于其通用性，即其能夠以各種抗原、各種轉(zhuǎn)運(yùn)模塊和各種導(dǎo)向模塊起作用。此外，轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的使用使得該方法不再限于特定的組織或細(xì)胞，而是廣泛適用于對(duì)幾乎所有類型的細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)變。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于MAT分子的模塊結(jié)構(gòu)。模塊結(jié)構(gòu)使得MAT分子能夠快速適應(yīng)特定的醫(yī)療用途。還可以改變MAT分子的三種組分的精確排列及其連接特性，條件是所有三種類型的模塊均至少有一種存在于MAT分子中。本發(fā)明的方法對(duì)抗原沒(méi)有限制。該方法可用于例如激活個(gè)體的免疫系統(tǒng)以抵抗病原體，例如病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等等，也就是說(shuō)可非常廣泛地用作疫苗。此外，該方法可用于激活免疫系統(tǒng)以抵抗退化細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞等等。不過(guò)，在另一方面，其也可用于降低個(gè)體的免疫系統(tǒng)對(duì)變應(yīng)原例如花粉、動(dòng)物毛發(fā)、屋塵螨、昆蟲(chóng)毒素等等的敏感性，或用于對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行導(dǎo)向性抑制，例如在存在自身免疫反應(yīng)的情況下，例如關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病、糖尿病、SLE(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)等等，以及用于抑制移植物排異反應(yīng)。類似地，本發(fā)明的MAT分子還可用于治療其他那些沒(méi)有明確提及的、與免疫反應(yīng)過(guò)強(qiáng)或過(guò)弱有關(guān)聯(lián)的疾病。
至今，現(xiàn)有技術(shù)一般認(rèn)為，如果轉(zhuǎn)運(yùn)序列不具有特定細(xì)胞類型特異性、反而在所有細(xì)胞類型中均具有活性，這是非常不利的[9]。不過(guò)，在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的功能通用性成為一種巨大的優(yōu)勢(shì)，這是迄今為止在現(xiàn)有技術(shù)中不曾認(rèn)識(shí)到的?，F(xiàn)有技術(shù)一直在試圖保護(hù)借助于轉(zhuǎn)運(yùn)序列進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的“貨物分子”免于在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生蛋白質(zhì)水解降解[9]。而在本發(fā)明中，這恰恰是特別需要的且對(duì)于實(shí)施本發(fā)明來(lái)說(shuō)是有利的?？乖K在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生蛋白質(zhì)水解降解對(duì)于本發(fā)明的效果即有效的抗原呈遞來(lái)說(shuō)是有利的。因此本發(fā)明所采用的導(dǎo)向模塊特異性地促進(jìn)抗原模塊轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞區(qū)室內(nèi)，在那里抗原模塊發(fā)生蛋白質(zhì)水解降解。
可用作用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的最為熟知的氨基酸序列是HIV Tat和VP22序列。文獻(xiàn)記載，這些序列不但轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)細(xì)胞膜，而且轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核[7]。對(duì)于本發(fā)明，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核是不希望的，因?yàn)榧?xì)胞核內(nèi)不進(jìn)行抗原加工，且因此不會(huì)產(chǎn)生有效的抗原呈遞。本發(fā)明使用了一種導(dǎo)向模塊，該導(dǎo)向模塊的作用在于使得MAT分子不會(huì)在細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，而是特異性地轉(zhuǎn)移至那些進(jìn)行抗原加工或?qū)⒖乖虞d于MHC分子的細(xì)胞器中，由此，本發(fā)明解決了這一此前未被解決的問(wèn)題。因此，本發(fā)明的MAT分子的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)模塊消除了現(xiàn)有技術(shù)所揭示的Tat抗原融合蛋白的一個(gè)重要的不利之處。
由導(dǎo)向序列(如MHC II分子的恒定鏈)和抗原組成的融合蛋白也是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。不過(guò)，這些融合蛋白不能有效穿透至抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)部。為此，當(dāng)用其免疫個(gè)體時(shí)，需要使用佐劑來(lái)促進(jìn)融合蛋白攝取到細(xì)胞內(nèi)部。不過(guò)，這些佐劑，例如礦物油、分枝桿菌提取物或弗氏佐劑，具有以下不良反應(yīng)，例如局部炎癥反應(yīng)。本發(fā)明使用的MAT分子優(yōu)于常規(guī)疫苗之處在于其直接偶聯(lián)于一種生理學(xué)耐受良好的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊，所述轉(zhuǎn)運(yùn)模塊可非常有效地促進(jìn)其被攝取到細(xì)胞內(nèi)。由此可以在一些情況中完全或部分地?zé)o需使用佐劑。其結(jié)果是使用MAT分子進(jìn)行免疫將明顯減少不良反應(yīng)。
早已知道由MHC I呈遞的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)抗原可引起細(xì)胞毒免疫應(yīng)答，但不會(huì)引起強(qiáng)的保護(hù)性體液免疫應(yīng)答。不過(guò)，通過(guò)使用MAT分子，可將抗原模塊內(nèi)的抗原在細(xì)胞外進(jìn)行添加，但其卻起到細(xì)胞內(nèi)抗原的作用，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)運(yùn)模塊將抗原轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)空間，而導(dǎo)向模塊影響了抗原的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，由此引起體液免疫應(yīng)答。采用這種新的方法，使得通過(guò)在細(xì)胞外添加抗原(MAT分子)來(lái)實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)強(qiáng)體液免疫應(yīng)答這一多年的需求成為可能。
為此，不同于現(xiàn)有技術(shù)的是，本發(fā)明將兩種本身是已知的機(jī)制以一種新的方式結(jié)合在一起，由此明顯增強(qiáng)了抗原的免疫效果。這兩種機(jī)制均是導(dǎo)向性抗原轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，其在總體上引起十分有效的免疫應(yīng)答。這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制均是所定義的MAT分子的模塊所產(chǎn)生的，其為1.將抗原自細(xì)胞外空間轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)空間(轉(zhuǎn)運(yùn)模塊)結(jié)合2.將抗原在細(xì)胞內(nèi)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)至負(fù)責(zé)抗原加工的細(xì)胞器內(nèi)部(導(dǎo)向模塊)其結(jié)果是非常有效的免疫，只產(chǎn)生IgG，不產(chǎn)生IgE兩種已知轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的這種新的結(jié)合使得有可能以例如更低的抗原濃度進(jìn)行免疫，同時(shí)還具有一個(gè)非常重要的且出乎預(yù)料的優(yōu)點(diǎn)，即主要引起Th1型免疫應(yīng)答，即IgG抗體形式的免疫應(yīng)答，而非引發(fā)變態(tài)反應(yīng)的IgE抗體形式的免疫應(yīng)答。
具體實(shí)施例方式
轉(zhuǎn)運(yùn)序列/轉(zhuǎn)運(yùn)模塊在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)運(yùn)序列和轉(zhuǎn)運(yùn)模塊可以作為等價(jià)物而相提并論，且具有相同的含意。引入轉(zhuǎn)運(yùn)模塊這一術(shù)語(yǔ)是為了清楚地表明轉(zhuǎn)運(yùn)模塊僅僅是用于本發(fā)明的MAT分子的一部分。此外，轉(zhuǎn)運(yùn)模塊不僅代表天然存在的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列例如HIV tat，也代表例如能夠承擔(dān)與天然存在的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列相同的功能的肽模擬物或其他結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明包括各種轉(zhuǎn)運(yùn)模塊用于制備MAT分子的用途，所述MAT分子由至少一種轉(zhuǎn)運(yùn)模塊、至少一種導(dǎo)向模塊和至少一種抗原模塊組成。一般而言，所有目前已知的以及將來(lái)將要得知的轉(zhuǎn)運(yùn)序列均適合用于本發(fā)明的目的。文獻(xiàn)中記載了眾多合適的轉(zhuǎn)運(yùn)序列。這些轉(zhuǎn)運(yùn)序列包括病毒序列、同源異型蛋白質(zhì)序列、亮氨酸拉鏈序列、富含精氨酸和富含賴氨酸序列、以及其他各種盡管缺乏分泌信號(hào)序列而仍然能夠分泌的蛋白質(zhì)序列。
適合用作轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的病毒肽序列適合用作本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的肽序列包括病毒蛋白質(zhì)或病毒蛋白質(zhì)的部分序列，例如HIV轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白質(zhì)(HIV tat)。除了HIV-1病毒的Tat蛋白以外，合適的Tat蛋白還包括其他慢病毒屬的Tat蛋白[9]。已經(jīng)有多種經(jīng)修飾的Tat蛋白被認(rèn)為是可引起轉(zhuǎn)運(yùn)的序列。這些包括僅代表Tat蛋白的部分序列的Tat肽[10]、包含點(diǎn)突變的Tat肽[10]、序列倒轉(zhuǎn)的(反向)Tat肽[10]、或包含少見(jiàn)氨基酸例如氨基酸D異構(gòu)體的Tat肽[10]，等等。所有這些肽序列的變體因此一般均適合用作轉(zhuǎn)運(yùn)模塊。那些來(lái)源于其他病毒例如VP22(單純皰疹病毒-1VP22間層蛋白質(zhì))[9]的肽也適合用作本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊?，F(xiàn)在已經(jīng)有了商品化的包含適合用于轉(zhuǎn)運(yùn)的VP22序列的表達(dá)載體。這些表達(dá)載體因此可用于制備VP22融合蛋白(VoyagerTMVP22系統(tǒng)，Invitrogen，Breda，theNetherlands)。不過(guò)，使用該表達(dá)系統(tǒng)的融合蛋白中沒(méi)有導(dǎo)向模塊。其他病毒，如馬立克氏病病毒-1，其是一種引起雞淋巴瘤的病毒，也表達(dá)一種與VP22有關(guān)聯(lián)的且同樣適合用作轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的蛋白質(zhì)[11]。這些蛋白質(zhì)和這些蛋白質(zhì)的部分序列僅僅是作為例子而在此提及，適合用作本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的肽還有其他眾多目前已知的以及在將來(lái)將要成為已知的肽。
適合用作轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的同源異型蛋白質(zhì)適合用于本發(fā)明的另一組轉(zhuǎn)運(yùn)模塊是來(lái)源于果蠅同源異型A蛋白ntennapedia(ANTp)的肽[9]。其中，適合用作轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的ANTp肽是那些包含一種ANTp的反向序列的ANTp肽[7]、包含氨基酸D異構(gòu)體的ANTp肽[7]、或在其序列中包含點(diǎn)突變的ANTp肽[7]。此外還預(yù)期可對(duì)ANTp序列進(jìn)行眾多其他的修飾且推測(cè)也可進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。ANTp肽變體也稱為轉(zhuǎn)運(yùn)肽。其他同源異型蛋白質(zhì)例如Engrailed 1(En1)、Engrailed 2(En2)、Hoxa-5、Hoxc-8、Hoxb-4和KNOTTED-1[7]同樣包含可用作用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的序列。KNOTTED-1實(shí)際上是一種植物蛋白質(zhì)，但同樣適合用作動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊。所提及的這些肽僅僅是作為例子，且眾多其他包含適合用作本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的肽序列的同源異型蛋白質(zhì)是已知的[12]。其他以往未曾公開(kāi)的同源異型蛋白質(zhì)也可包含適合用作轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的序列。
適合用作轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的亮氨酸拉鏈蛋白質(zhì)另一組適合用作本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的序列是包含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的肽。其中的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域可用作轉(zhuǎn)運(yùn)序列的蛋白質(zhì)的例子例如為人cFos-(139-164)、人cJun-(252-279)、或酵母轉(zhuǎn)錄因子酵母GCN4-(231-252)[8]。其他已知的亮氨酸拉鏈蛋白質(zhì)或在將來(lái)將要成為已知的亮氨酸拉鏈蛋白質(zhì)也同樣適合用作本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊。
適合用作轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的富含精氨酸肽或富含賴氨酸的肽富含精氨酸肽，通常來(lái)源于RNA-結(jié)合蛋白和DNA-結(jié)合蛋白，代表了另一種可用作用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的肽序列。此類序列的例子為HIV-1rev-(34-50)、禽畜棚病毒(flock house virus)外殼蛋白FHV外殼-(35-49)、BMV Gag-(7-25)、HTLV-II Rex-(4-15)、CCMV Gag-(7-25)、P22N-(14-30)、λN-(1-22)、21N-(12-29)和來(lái)自酵母的PRP6-(129-144)[8]。同樣可用于本發(fā)明的是具有4-6個(gè)精氨酸殘基[8]或者具有多于16個(gè)精氨酸殘基的聚精氨酸肽。除了聚精氨酸肽，同樣可用作轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的肽是那些，除了包含精氨酸以外，還包含其他氨基酸的肽，如W/R肽(RRWRRWWRRWWRRWRR)[9]或R9-Tat肽，其中Tat肽的總共11個(gè)氨基酸中的9個(gè)中央的氨基酸殘基被精氨酸殘基(GRRRRRRRRRQ)取代[8]。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)例如由9個(gè)賴氨酸殘基組成的肽也具有作為本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的能力[13]。所提及的這些肽僅僅是作為例子，眾多其他的富含精氨酸或富含賴氨酸的肽也適合用作本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊[8，13]。其他目前已知的或?qū)?lái)將要已知的富含精氨酸或富含賴氨酸的肽推測(cè)起來(lái)也適合用作轉(zhuǎn)運(yùn)模塊。包含胍基或脒基的序列也適合用作本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊[14]。
適合用作轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的無(wú)信號(hào)序列的蛋白質(zhì)其他許多不具有分泌信號(hào)序列的蛋白質(zhì)也具有自內(nèi)而外穿透細(xì)胞膜的功能，即能夠被分泌。這些蛋白質(zhì)通常也能夠自細(xì)胞外逆向穿透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。這些蛋白質(zhì)或這些蛋白質(zhì)的部分序列因此也可用作用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊。此類蛋白質(zhì)的一些示范性的例子為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1(FGF-1)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF-2)、小窩蛋白-1(caveolin-1)、乳鐵蛋白、硫氧還蛋白、白細(xì)胞介素1β和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)[7]、或白細(xì)胞介素1α、輸精管蛋白、血小板衍生的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PR-ECGF)、胸腺素、旁胸腺素(para-thymosin)、14.5kDa凝集素(L14)、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、硫氧還蛋白樣蛋白(ADF)、坐骨神經(jīng)生長(zhǎng)促進(jìn)活性、因子X(jué)IIIa、乳腺衍生的生長(zhǎng)抑制因子、Galectin、硫氰酸酶[15]。所提及的這些肽僅僅是作為例子，其他眾多目前已知的或?qū)?lái)將要已知的肽也適合用作本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊。
適合用作轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的毒素多種毒素或毒素的部分序列具有作為轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的特性，例如以下毒素完整相思豆毒素、完整篦麻毒素、完整莫迪素(modeccin)、完整假單胞外毒素A、完整白喉毒素、完整百日咳毒素、完整志賀氏菌毒素、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、莫迪素A鏈、假單胞外毒素的酶活性結(jié)構(gòu)域、白喉毒素A的A鏈、百日咳毒素酶活性結(jié)構(gòu)域、志賀氏菌毒素酶活性結(jié)構(gòu)域、Gelonin、美洲商陸抗病毒蛋白、皂草素、Tritin、大麥毒素和蛇毒肽[16]。所提及的這些毒素僅作為例子，其他眾多未提及的毒素或?qū)?lái)將要已知的毒素也適合用作本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊。
轉(zhuǎn)運(yùn)模塊效率的調(diào)控可通過(guò)例如改變聚精氨酸鏈的長(zhǎng)度或通過(guò)例如特異性缺失HIV Tat序列的部分序列來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)的效率，由此可根據(jù)具體的要求進(jìn)行相應(yīng)的MAT分子的非常高效的轉(zhuǎn)運(yùn)或較低效的轉(zhuǎn)運(yùn)[8，13]。非常高效的轉(zhuǎn)運(yùn)的優(yōu)勢(shì)在于可提高M(jìn)AT分子的效率和/或降低所需所MAT分子的劑量，由此降低疫苗的成本。MAT分子劑量的降低的優(yōu)勢(shì)的進(jìn)一步的優(yōu)勢(shì)在于可較少出現(xiàn)不良反應(yīng)。另一方面，轉(zhuǎn)運(yùn)效率的降低能夠使得MAT分子在被處理的個(gè)體中分布更廣泛，例如在靜脈注射后，這是因?yàn)槠洳粫?huì)立即穿透局部細(xì)胞而幾乎大量進(jìn)入鄰近的細(xì)胞內(nèi)。
作為轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的最小序列的實(shí)例為了作為本發(fā)明的MAT分子的有效的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊，不必使用所有上述例舉的轉(zhuǎn)運(yùn)序列的完整蛋白質(zhì)作為MAT分子的成分。相反，對(duì)于許多此類蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，已知可使用一種最小序列區(qū)作為轉(zhuǎn)運(yùn)序列。這種序列區(qū)例如包括，對(duì)于HIV Tat來(lái)說(shuō)，例如以下序列Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg，對(duì)于VP22為以下序列Asp-Ala-Ala-Thr-Ala-Thr-Arg-Gly-Arg-Ser-Ala-Ala-Ser-Arg-Pro-Thr-Glu-Arg-Pro-Arg-Ala-Pro-Ala-Arg-Ser-Ala-Ser-Arg-Pro-Arg-Arg-Pro-Val-Glu，對(duì)于antennapedia為以下序列Arg-Gln-Iso-Lys-Iso-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-LysTrp-Lys-Lys[17]。此外，還可使用這些序列的片段形式，只要所得到的序列仍具有轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的功能，這些片段可與目前已知的最小功能性序列片段不同。
因此，為了作為本發(fā)明的MAT分子的有效的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊，作為MAT分子的組分，轉(zhuǎn)運(yùn)模塊不需要是完整的蛋白質(zhì)或完整的分子。相反，對(duì)例如上述蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，可用作轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的序列區(qū)是已知的。此外，還可使用蛋白質(zhì)序列的片段形式，只要所得到的序列仍具有轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的功能，這些片段可與此前公開(kāi)的功能性序列片段不同。例如可通過(guò)采用熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊或通過(guò)采用酶標(biāo)記的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊或通過(guò)采用以金屬顆粒標(biāo)記的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊來(lái)探知轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的功能。將以這些方法標(biāo)記的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊施用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或體外培養(yǎng)的細(xì)胞，并采用諸如FACS(熒光激活的細(xì)胞分選)、顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡、電子顯微鏡等方法來(lái)追蹤轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的痕跡。文獻(xiàn)中記載了這些用于檢測(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的功能的技術(shù)，且其中一些技術(shù)已經(jīng)被用于探知用于轉(zhuǎn)運(yùn)的序列的功能[8，18]。
導(dǎo)向序列/導(dǎo)向模塊在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)導(dǎo)向序列和導(dǎo)向模塊可以作為等價(jià)物而相提并論，且具有相同的含意。在本申請(qǐng)中，導(dǎo)向作用(Targeting)一般總是指細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)向。引入導(dǎo)向模塊這一術(shù)語(yǔ)是為了清楚地表明導(dǎo)向模塊僅僅是用于本發(fā)明的MAT分子的一部分。
本發(fā)明包括各種作為導(dǎo)向模塊的序列用于制備MAT分子的用途，所述MAT分子由至少一種轉(zhuǎn)運(yùn)模塊、至少一種導(dǎo)向模塊和至少一種抗原模塊組成。一般而言，所有目前已知的以及將來(lái)將要得知的且能夠介導(dǎo)導(dǎo)向作用的氨基酸序列和分子均適合用作本發(fā)明的導(dǎo)向模塊。文獻(xiàn)中記載了眾多合適的序列。屬于這些適合用作導(dǎo)向模塊的序列的序列是所有那些具有如下作用的序列，即能夠使得MAT分子在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的一些位點(diǎn)或細(xì)胞器，而所述位點(diǎn)或細(xì)胞器參與了MAT分子內(nèi)的抗原模塊的呈遞。這些細(xì)胞內(nèi)的位點(diǎn)和細(xì)胞器具體包括MHC II類區(qū)室(MHC)、內(nèi)體、溶酶體、高爾基體、高爾基體反面的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。這些細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器參與了例如以下一些過(guò)程抗原的轉(zhuǎn)運(yùn)或加工、給MHC II分子制備和加載抗原或經(jīng)過(guò)加工的抗原、以及將加載了抗原的MHC II分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面等等。
包含適合作為導(dǎo)向模塊的序列的MHC分子許多序列特別適合作為本發(fā)明的導(dǎo)向模塊。MHC II分子的恒定鏈(Ii，恒定鏈，MHC II γ鏈)是文獻(xiàn)中最常提及的能夠介導(dǎo)導(dǎo)向作用的序列。人的恒定鏈的各種不同的變體已經(jīng)被公開(kāi)并被稱為IiP33、IiP41、IiP35和IiP43[1]且適合用作導(dǎo)向模塊。其他適合作為本發(fā)明的導(dǎo)向模塊的序列是MHC II分子的β鏈[19]。所述序列的片段也適合用作導(dǎo)向模塊。
包含適合作為導(dǎo)向模塊的序列的溶酶體膜蛋白許多存在于溶酶體中且是其中的一種主要蛋白質(zhì)組分的膜蛋白具有導(dǎo)致溶酶體的序列基序。這組蛋白質(zhì)包括Lamp 1(溶酶體相關(guān)性膜蛋白-1)、LAMP 2、LAMP 3、Limp II(溶酶體整合性膜蛋白II)和LAP(溶酶體酸性磷酸酶)[4]。這些以及其他的目前已知的或?qū)?lái)將要已知的且具有導(dǎo)向序列基序的溶酶體蛋白質(zhì)均可用作用于本發(fā)明的導(dǎo)向模塊，也可使用完整的蛋白質(zhì)序列或其部分序列作為導(dǎo)向模塊。
包含適合作為導(dǎo)向模塊的序列的Tetraspan蛋白質(zhì)具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族的成員(Tetraspan蛋白)同樣適合作為本發(fā)明的導(dǎo)向模塊，這是因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)可非常有效地進(jìn)入MIIC?！癟etraspan”蛋白進(jìn)入MIIC的機(jī)制還不清楚，因?yàn)槠浒粗木哂袑?dǎo)向作用的氨基酸序列。盡管如此，存在將這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至MIIC內(nèi)部的機(jī)制這一事實(shí)說(shuō)明它們可用作用于本發(fā)明的導(dǎo)向模塊?！癟etraspan”蛋白家族包括CD37、CD53、CD63、CD81、CD82和CD86[20]。已知的CD63和CD82與MHC II、HLA-DO和HLA-DM分子相關(guān)[20]。“Tetraspan”蛋白同樣存在于外來(lái)體的膜中，外來(lái)體是MIIC與原生質(zhì)膜融合后形成的并因此被抗原呈遞細(xì)胞釋放的小泡。外來(lái)體包含MHC II分子并能夠呈遞抗原，且由此刺激T細(xì)胞[20]。其他與“Tetraspan”蛋白家族非常相似的且因此同樣適合用作本發(fā)明的導(dǎo)向模塊的蛋白質(zhì)是曼氏血吸蟲(chóng)(Schistosoma mansoni)膜蛋白SM23和腫瘤相關(guān)抗原CO-029[21]。其他未明確提及的或目前尚未知的Tetraspan蛋白或Tetraspan蛋白的部分序列可同樣包含適合作為導(dǎo)向模塊的序列。
具有適合作為導(dǎo)向模塊的序列的其他蛋白質(zhì)在各種類型的細(xì)胞的內(nèi)體/溶酶體區(qū)室中可發(fā)現(xiàn)眾多其他的蛋白質(zhì)，因此這些蛋白質(zhì)是以目前尚未完全了解的機(jī)制達(dá)到內(nèi)體/溶酶體區(qū)室的。這些蛋白質(zhì)或這些蛋白質(zhì)的部分序列因此也適合用作本發(fā)明的導(dǎo)向模塊。這些存在于內(nèi)體/溶酶體區(qū)室中的蛋白質(zhì)包括低密度脂蛋白質(zhì)(LDL)、胰島素、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、聚合免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、陽(yáng)離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體、陽(yáng)離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體、CD3等等[21]和CD1b[22]，以及許多其他目前已知的或?qū)?lái)將要已知的并可導(dǎo)向進(jìn)入內(nèi)體/溶酶體區(qū)室的那些蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)序列。這些序列可用作本發(fā)明的導(dǎo)向模塊。也有各種商品化的包含編碼適合用于導(dǎo)向作用的序列的核酸序列的表達(dá)載體。例如BD Bioscience Clontech(PaloAlto，CA，USA)和Stratagene(La Jolla，CA，USA)均提供具有導(dǎo)向模塊的表達(dá)載體，所述導(dǎo)向模塊可將得到的融合蛋白導(dǎo)引至高爾基體或過(guò)氧物酶體。不過(guò)，這些表達(dá)載體無(wú)法產(chǎn)生包含轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的融合蛋白，因此不同于本發(fā)明的MAT分子。例如，在Clontech的載體中，使用了鈣網(wǎng)蛋白的序列(KDEL“挽回序列(retrieval sequence)”)將融合蛋白導(dǎo)向高爾基體。其他未明確提及的或目前尚未知的蛋白質(zhì)可同樣包含適合作為本發(fā)明的導(dǎo)向模塊的序列。
存在于某些導(dǎo)向序列組中的序列基序已經(jīng)被探知某些序列基序?qū)τ诟鞣N作為導(dǎo)向模塊的蛋白質(zhì)序列的功能是十分重要的。例如對(duì)于HLA-DM的β鏈來(lái)說(shuō)，已經(jīng)將序列基序酪氨酸-蘇氨酸-脯氨酸-亮氨酸鑒定為導(dǎo)向基序，且酪氨酸殘基和亮氨酸殘基顯然具有特別重要的功能[2]。已經(jīng)鑒定了對(duì)于多種溶酶體膜蛋白例如LAP(溶酶體酸性磷酸酶)、LAMP 1(溶酶體相關(guān)性膜蛋白1)、LAMP2和Lamp 3[3，4]以及CD1b[22]的細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)向具有重要作用的酪氨酸基序。還鑒定出一種亮氨酸基序?qū)τ诹硪环N溶酶體蛋白Limp II(溶酶體整合性膜蛋白II)的細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)向可能具有重要的作用[4]。還發(fā)現(xiàn)對(duì)于Ii來(lái)說(shuō)，有兩種序列區(qū)對(duì)于細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)向具有相互獨(dú)立的重要作用(第1至11位氨基酸和第12至29位氨基酸)[23]。這兩種導(dǎo)向序列甚至僅依靠自身即可行使功能，且序列1至11在位置7和8包含一個(gè)功能上必需的亮氨酸-異亮氨酸基序[23]。MHC II分子的β鏈同樣包含一個(gè)序列基序，該序列基序包含一或兩個(gè)具有重要功能的亮氨酸殘基，以及一個(gè)位于N-端的剛好位于該亮氨酸基序前方的保守甘氨酸殘基[19]。因此，概況來(lái)說(shuō)，亮氨酸和酪氨酸殘基在導(dǎo)向序列中具有特別重要的功能，且因此可以設(shè)計(jì)出特別合適的氨基酸序列作為導(dǎo)向模塊。這些均可用作本發(fā)明的導(dǎo)向模塊。
可用作導(dǎo)向模塊的“非氨基酸結(jié)構(gòu)”不同于一種氨基酸序列或一種氨基酸的分子也可用作本發(fā)明的MAT分子的導(dǎo)向模塊。一個(gè)早已為人所知的適合用于導(dǎo)向溶酶體的結(jié)構(gòu)的例子是甘露糖-6-磷酸[24]。包含甘露糖-6-磷酸殘基的蛋白質(zhì)被不同的甘露糖-6-磷酸受體轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體。這一機(jī)制可在本發(fā)明中用于將MAT分子轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體以便實(shí)現(xiàn)有效的抗原呈遞。為此，可將甘露糖-6-磷酸殘基共價(jià)地或非共價(jià)地、單獨(dú)地或作為更為復(fù)雜的糖結(jié)構(gòu)的組分，偶聯(lián)于MAT分子。通?？梢允褂酶事短?6-磷酸受體的所有配體作為本發(fā)明的MAT分子的導(dǎo)向模塊。其他的目前已知的或?qū)?lái)將要已知的能夠?qū)騇HC、內(nèi)體、溶酶體、高爾基體、高爾基體反面的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)可用作本發(fā)明的導(dǎo)向模塊。
作為本發(fā)明的MAT分子的有效的導(dǎo)向模塊，所有舉例提及的導(dǎo)向模塊不需要以完整蛋白質(zhì)或完整分子的形式作為MAT分子的組分。相反，例如對(duì)于一些所述的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，可用作導(dǎo)向模塊的序列區(qū)是已知的。此外，舉例提及的蛋白質(zhì)序列可采用片段的形式，所述片段與以往公開(kāi)的功能性序列片段不同，條件是所得到的序列仍然具有導(dǎo)向模塊的功能。例如可通過(guò)采用熒光標(biāo)記的導(dǎo)向模塊或通過(guò)采用酶標(biāo)記的導(dǎo)向模塊或通過(guò)采用以金屬顆粒標(biāo)記的導(dǎo)向模塊來(lái)探知導(dǎo)向模塊的功能。將以這些方式標(biāo)記的導(dǎo)向模塊施用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或體外培養(yǎng)的細(xì)胞，并通過(guò)例如FACS(熒光激活的細(xì)胞分選)、顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡、電子顯微鏡等方法來(lái)追蹤導(dǎo)向模塊的痕跡。
抗原模塊一般來(lái)說(shuō)所有類型的能夠調(diào)變免疫應(yīng)答的抗原均可用作本發(fā)明的抗原模塊。目前已知的抗原和將來(lái)將要已知的抗原均適合。在一些情況下，抗原也可以是那些以現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法進(jìn)行免疫接種不能引起免疫應(yīng)答、但應(yīng)用于本申請(qǐng)的新的方法中卻可在個(gè)體中引起免疫應(yīng)答發(fā)抗原。可以用作本發(fā)明的抗原的不僅有蛋白質(zhì)和肽，還有糖結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)如脂多糖、脂磷壁酸質(zhì)(lipoteichoic acids)和細(xì)菌膜的其他組分(例如CD1b結(jié)合糖結(jié)構(gòu)和脂質(zhì))、核酸如包含CpG基序的DNA、有機(jī)物質(zhì)例如膠乳或具有藥物活性的物質(zhì)?？乖蓙?lái)自人、動(dòng)物、植物、真菌、寄生蟲(chóng)、單細(xì)胞或多細(xì)胞微生物、病毒和其他生命形式?？乖梢允且呀?jīng)自生物材料中分離的、已經(jīng)作為重組抗原被制備好的或通過(guò)合成制備好的，例如通過(guò)肽合成。通過(guò)合成制備的抗原可以是天然存在的物質(zhì)或非天然存在的但可化學(xué)合成的物質(zhì)。非天然存在的但在一些情況下適合用作抗原的物質(zhì)的實(shí)例例如為合成制備的藥物中的物質(zhì)、或具有非天然存在的氨基酸序列的肽、或肽模擬物等等。天然存在的或合成的或重組的抗原可通過(guò)分子生物學(xué)方法、酶方法、化學(xué)方法以及其他方法進(jìn)行修飾，以便使其在具體的應(yīng)用中具有更加優(yōu)越的特性。這些優(yōu)越的特性可以是抗原的活性更高或更低、抗原的作用更廣泛或更加特異性、更加易溶于親水性或疏水性溶劑、抗原模塊對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞器的膜、血腦屏障、血CSF屏障等等具有更好的通透性、在體內(nèi)或體外具有更長(zhǎng)或更短的半衰期、更低或更高的毒性、以MAT分子的形式應(yīng)用抗原后能夠在體內(nèi)或體外更容易地檢測(cè)到抗原。此外，本發(fā)明還可將多種抗原在一個(gè)抗原模塊中進(jìn)行組合[25]。為此，抗原模塊中的相同的抗原可以有一個(gè)以上的拷貝，或者可以將例如同一種抗原的不同變體組合在一個(gè)抗原模塊中。也可以進(jìn)行抗原的組合，例如將抗原1與另一種抗原例如抗原2組合于一個(gè)抗原模塊中，等等。其他組合，例如將一個(gè)以上拷貝的抗原1與單拷貝的抗原2組合于一個(gè)抗原模塊中，等等。此外MAT分子還可以含有一或多個(gè)不同的和/或一或多個(gè)相同的抗原模塊。一般來(lái)說(shuō)本發(fā)明可以進(jìn)行所有各種可能的來(lái)自于一或多種不同抗原的單個(gè)或多個(gè)存在的相同的或不同的拷貝的組合。
可用作抗原模塊的抗原和變應(yīng)原文獻(xiàn)中已經(jīng)揭示了眾多抗原、特別是變應(yīng)原。下文中具體已知的變應(yīng)原可用作本發(fā)明的抗原模塊?，F(xiàn)有技術(shù)中已知其他同樣可用作本發(fā)明的抗原模塊的變應(yīng)原和變應(yīng)原的變體[26，27]?？蓪⒆儜?yīng)原分成不同的組，例如來(lái)自植物和草的變應(yīng)原、來(lái)自樹(shù)木的變應(yīng)原、來(lái)自真菌的變應(yīng)原、來(lái)自昆蟲(chóng)的變應(yīng)原、來(lái)自食物的變應(yīng)原、以及其他變應(yīng)原例如膠乳變應(yīng)原。以下是列舉的名單微生物的學(xué)名、變應(yīng)原的常用縮寫(xiě)、其后是已知的變應(yīng)原的GeneBank登記號(hào)(括號(hào)內(nèi))。
植物和草變應(yīng)原豚草(Ambrosia artemisiifa)，Amb a 1 and Amb a 2；Mercurialisannua，Mer a 1(Y13271)；墻草(Parietaria judaica)，Par j 1(X77414)，Par j 2(X95865；X95866)；狗牙根(Cynodon dactylon)，Cyn d 1(S83343)；鴨茅(Dactlis glomerata)，Dac g 3(U25343)；Holcus lanatus，Hol I 1(Z27084，Z68893)；黑麥草(Lolium perenne)，Lol p 1(M57474)，Lol p 2(X73363)Lol p 5(M59163)；喜濕虉草(Phalaris aquatica)，Pha a1(S80654)；貓尾草(Phleum pratense)，PhI p 1(X78813)，PhI p 2(X75925)，PhI p 3，PhI p 5(X74735)樹(shù)木變應(yīng)原黑赤楊(Alnus glutinosa)，Aln g 1(S50892)；白樺(Betulaverrucosa)，Bet v 1(X15877)，Bet v 2，Bet v 1d；歐洲鵝耳櫪(Carpinusbetulus)，Car b 1(X66932，X66918)；歐洲榛(Corylus avellana)，Cor a 1(X70999，X71000，X70997，X70998，Z72439，Z72440，AF136945，AF323973，AF323974，AF323975)；Ligustrum vulgare，Lig v 1(X77787，X77788)；油橄欖(Olea europea)，Ole e 1(S75766)，Ole e 9(AF249675)；丁香(Syringa vulgaris)，Syr v 1(X76541)；日本柳杉(Cryptomeria japonica)，Cry j 1，Cry j 2(D29772，D37765)；Cupressusarizonica，Cup a 1(AJ278498)；柏(Cupressus sempervirens)，Cup s 1(AF257491)；Juniperus ashei，Jun a 2(AJ404653)螨蟲(chóng)變應(yīng)原Blomia tropicalis，Blo t 5(U59102)；粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae)，Der f 1，Der f 2，Der f 11；屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus)，Der p 1，Der p 2，Der p 5，Der p 7；Lepidoglyphusdestructor，Lep d 2(X81399)；P.americana，Cra-A；普通谷螨(T.putrescentiae)，Tyr p 2動(dòng)物變應(yīng)原家牛(Bos domesticus)，Bos d 2(L42867)；馬(Equus caballus)，Equc 1(U70823)；家貓(Felisdomesticus)，F(xiàn)el d 1(M74952，M74953)真菌變應(yīng)原煙草赤星病(Alternaria alternata)，Alt a 1(U82633)，Alt a 2(U62442)；黃曲霉(Aspergillus flvus)，Asp fl 1(AFl37272)；煙曲霉(Aspergillus fumigatus)，Asp f 1(M83781，S39330)，Asp fl/a，Asp f 2(U56938)，Asp f 3(U20722，U58050)，Asp f 4，Asp f 6，Asp f 8；黑曲霉(Aspergillus niger)，Asp n 18；米曲霉(Aspergillus oryzae)，Asp o 13(X17561)；C.comatus，Cop c 1；黃青霉(Penicillium chrysogenum)，Pench 13(AF193420)，Pen ch 20(S77837)；草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)，Pen o 18(AAG44478)；馬拉色菌(Malassezia sympodialis)，Mal s 1(X96486)昆蟲(chóng)變應(yīng)原意大利蜜蜂(Apis mellifera)，Api m 1(X16709)，Api m 2(L10710)，Api m 4(X02007)；PLA2(X16709)；德國(guó)小蠊(Blattella germanica)，Blag 1(AF072219，L47595，AF072221，AF072220)，Bla g 2(U28863)，Bla g4(U40767)，Bla g 5(U92412)；美洲大蠊(Periplaneta americana)，Per a1(AF072222)，Per a 3(L40819)；Dolichovespula maculata，Dol m 1(X66869)，Dol m 2(L34548)，Dol m 5(J03601)；Dolichovespula arenaria，Dol a 5(M98859)，Polistes annularies，Pol a 5(M98857)；Vespula vulgaris，Ves v 1(L43561)，Ves v 2(L43562)，Ves v 5(M98858)；Myrmeciapilosula，Myr p 1(X70256)，Myr p 2(581785)食物變應(yīng)原鮭魚(yú)(Salmo salar)，Sal s 1(X97824)；家牛(Bos domesticus)，Bos d4(M18780)，Bos d 5(X14712)；家雞(Galllus domesticus)，Gal d 1(J00902)，Gal d 2(J00992)；對(duì)蝦(Metapenaeus ensis)，Met s 1(U08008)；大麥(Hordeum vulgare)，Hor v 15(X63517)；水稻(Oryzasativa)，Ory s 1(U31771)；芹菜(Apium graveolens)，Api g 1(Z48967)；胡蘿卜(Daucus carota)，Dau c 1(U47087，D88388)；蘋(píng)果(Malusdomestica)，Mal d 1(X83672)；西洋梨(Pyrus communis)，Pyr c 1(AF057030)；鄂梨(Persea americana)，Pers a 1(Z78202)；杏(Prunusarmeniaca)，Pru ar 1(U93165)；櫻桃(Prunus avium)，Pru av 1(U66076)；花生(Arachis hypogaea)，Ara h 1(L34402)，Ara h 2(L77197)；巴西果(Bertholletia excelsa)，Ber e 1(M17146)；核桃(Juglans regia)，Jug r 1(U66866)，Jug r 2(AF066055)；蓖麻(Ricinuscommunis)，Ric c 1(X54158)；芝麻(Sesamum indicum)，Ses i 1(AF240005)其他變應(yīng)原(膠乳)橡膠(Hevea brasiliensis)，Hev b 1(X56535)，Hev b 2，Hev b 3，Hevb 5(U42640)，Hev b 6(M36986)，Hev b 7，Hev b 8這些已知的變應(yīng)原僅是例舉，其他同樣可用于本發(fā)明的抗原模塊的變應(yīng)原是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。
除了變應(yīng)原，還有許多病原體目前尚無(wú)法獲得有效的或持久的免疫。由于本發(fā)明的方法所基于的是一種新的免疫策略，因此有可能針對(duì)這些至今尚無(wú)滿意的免疫接種預(yù)防性治療的疾病顯示出免疫效果。這些疾病具體包括HIV病毒感染、丙型肝炎病毒感染、結(jié)核病原體(結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))感染、麻風(fēng)病(麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae))、鼠疫(鼠疫桿菌(Yersinia pestis))以及瘧疾(瘧原蟲(chóng)例如惡性瘧原蟲(chóng))。
MAT分子可具有的其他模塊除了上述三種模塊——轉(zhuǎn)運(yùn)模塊、導(dǎo)向模塊和抗原模塊——MAT分子必須至少具有這些模塊，MAT分子也可具有其他任選的模塊。這些任選的模塊包括例如可用于分離或檢測(cè)MAT分子的模塊。在現(xiàn)有技術(shù)中，此類模塊通常被稱為“標(biāo)記物”，故在本申請(qǐng)的下文中被稱為標(biāo)記模塊。其他任選地存在于MAT分子中的模塊可以是間隔模塊，即排列在其他模塊之間的模塊，其作用是使得這些模塊彼此偶聯(lián)。這些模塊在本申請(qǐng)的下文中被稱為間隔模塊。某些模塊也可能同時(shí)行使兩種或兩種以上模塊的功能。例如許多標(biāo)記模塊可同時(shí)用于MAT分子的分離和檢測(cè)，或者M(jìn)AT分子中的一種抗原模塊可能也可用于MAT分子的檢測(cè)和/或分離，例如當(dāng)存在抗該抗原模塊的抗體的情況下，等等。
MAT分子可具有的標(biāo)記模塊在本發(fā)明中，可將一或多種不同的標(biāo)記模塊和/或一或多種相同的標(biāo)記模塊作為MAT分子的組成部分。標(biāo)記模塊可以是短肽，通常由不超過(guò)20個(gè)氨基酸殘基組成，但也可相當(dāng)于完整的蛋白質(zhì)序列或蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)域。標(biāo)記模塊也可以是不含有氨基酸的功能性基團(tuán)，例如生物素或洋地黃毒甙。幾乎所有的標(biāo)記模塊均可有兩種不同的使用方式，其一為用于分離MAT分子，其二為用于檢測(cè)MAT分子的存在。一般來(lái)說(shuō)，所有目前已知的標(biāo)記模塊以及所有將來(lái)將要已知的標(biāo)記模塊均適合用于本發(fā)明。適合用于本發(fā)明的合適的標(biāo)記分子的實(shí)例為4-12或更多的組氨酸序列，優(yōu)選地為直接連續(xù)的組氨酸殘基、也稱為His標(biāo)記、His6標(biāo)記、HIS6標(biāo)記、Penta HisTM、Tetra HisTM、RGS HisTM等等(Qiagen，Hilden，Germany)，Myc或c-Myc標(biāo)記、PinPointTM標(biāo)記(一種信號(hào)序列，其作用是使得細(xì)菌在體內(nèi)為相應(yīng)的蛋白質(zhì)提供生物素基團(tuán))、HA標(biāo)記、6xHN標(biāo)記(Promega Biosciences Inc.，San Louis Obispo，CA，USA)、XpressTM標(biāo)記、myc標(biāo)記、V5標(biāo)記(Invitrogen，Breda，theNetherlands)、S標(biāo)記、CBD標(biāo)記、GST標(biāo)記、HSV標(biāo)記、T7標(biāo)記(Novagen Inc.，Madison，WI，USA)、FLAG標(biāo)記、HA標(biāo)記、c-myc標(biāo)記、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽標(biāo)記(CBP)標(biāo)記(Stratagene，La Jolla，CA，USA)、His標(biāo)記、A蛋白標(biāo)記、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)記(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)、Strep-tagII(IBA GmbH，Gttingen，Germany)、His標(biāo)記(Roche Applied Science，Rotkreuz，Switzerland)、FLAG標(biāo)記、GST標(biāo)記、A蛋白標(biāo)記(Sigma，St.Louis，MO，USA)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、殼多糖結(jié)合標(biāo)記(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)、His標(biāo)記(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA，USA)。對(duì)于這些標(biāo)記模塊中的一些來(lái)說(shuō)，將一種以上的標(biāo)記模塊用于分子的應(yīng)用已經(jīng)被公開(kāi)。例如，可將兩種標(biāo)記模塊偶聯(lián)于一種蛋白質(zhì)的N端或C端，或?qū)⒁环N標(biāo)記模塊偶聯(lián)于N端和C端(Qiagen，Hilden，Germany andStratagene，La Jolla，CA，USA)?？蓪?biāo)記模塊引入其他蛋白質(zhì)序列的內(nèi)部，例如一種蛋白質(zhì)的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間(Strep-tagII，IBA，Gttingen，Germany)。
其他標(biāo)記模塊主要用于檢測(cè)與之偶聯(lián)的分子。不過(guò)，這些標(biāo)記分子通常也可用于分離蛋白質(zhì)，例如通過(guò)親和層析。本發(fā)明可使用例如偶聯(lián)了抗這些標(biāo)記模塊的抗體的層析材料。本發(fā)明也可使用的標(biāo)記模塊例如為綠色熒光蛋白(GFP)、增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)、增強(qiáng)的藍(lán)色熒光蛋白(ECFP)、增強(qiáng)的黃色熒光蛋白(EYFP)、紅色熒光蛋白(DsRed2)(BD Bioscience Clontech，Palo Alto，CA，USA)、Renilla綠色熒光蛋白(hrGFP)(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。這些標(biāo)記模塊可位于例如一種融合蛋白的N端以及C端。除了熒光標(biāo)記模塊，也可使用酶作為標(biāo)記模塊。通常使用的酶的實(shí)例為螢光素酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶，等等?？赏ㄟ^(guò)這些酶的相應(yīng)的酶活性對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，例如基于這些酶對(duì)其底物的轉(zhuǎn)化作用。有多種類型的適合用于本發(fā)明的底物，例如吸收可見(jiàn)光的底物、熒光底物、其轉(zhuǎn)化后可發(fā)光的底物、或可采用各種檢測(cè)方法通過(guò)底物濃度的降低或產(chǎn)物濃度的升高而確定其酶性轉(zhuǎn)化的底物，等等。
另一種可用于本發(fā)明的標(biāo)記模塊例如是可作為激酶底物的肽序列。可通過(guò)添加放射性磷和添加激酶而對(duì)這些肽序列進(jìn)行放射性標(biāo)記。可以這種方式用于本發(fā)明的標(biāo)記模塊的實(shí)例有激酶底物肽(kemptide)標(biāo)記(一種可被蛋白激酶A磷酸化的肽)、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽標(biāo)記(CBP)，其同樣可被蛋白激酶A磷酸化(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，等等。
另一種可用于本發(fā)明的標(biāo)記模塊例如是可特異性結(jié)合其他蛋白質(zhì)或其他結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或肽序列。文獻(xiàn)中記載的此類標(biāo)記模塊的實(shí)例有A蛋白、G蛋白、A蛋白/G、L蛋白，這些蛋白質(zhì)均結(jié)合抗體結(jié)構(gòu)(Pierce，Rockford，IL，USA)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，其結(jié)合谷胱甘肽，麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)，其結(jié)合直鏈淀粉，鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，兩者均結(jié)合生物素，鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽，其結(jié)合鈣調(diào)蛋白，殼多糖結(jié)合標(biāo)記，其結(jié)合殼多糖，等等。一般來(lái)說(shuō)，所有特異性結(jié)合其他分子的分子均可作為本發(fā)明的標(biāo)記模塊，即受體-配體、抗體-抗原、凝集素-糖結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)-脂質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)等等，以及文獻(xiàn)中提及的其他眾多實(shí)例[28]。
間隔模塊可用于本發(fā)明的間隔模塊是所有適合用于將作為MAT分子的成分的其他模塊彼此偶聯(lián)的分子。既可通過(guò)共價(jià)鍵也可通過(guò)非共價(jià)鍵進(jìn)行偶聯(lián)。間隔模塊的作用是使得MAT分子的各種模塊在空間上彼此分隔，這樣使得它們不會(huì)對(duì)各自的功能相互產(chǎn)生不良影響。本發(fā)明的MAT分子的模塊可通過(guò)間隔模塊偶聯(lián)，這些間隔模塊可隨后經(jīng)化學(xué)或酶反應(yīng)而再次裂解，例如通過(guò)蛋白酶。這樣，在需要的時(shí)候可以再次將通過(guò)間隔模塊連接的MAT分子的模塊彼此分開(kāi)。
一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以使用所有目前已知的或?qū)?lái)將要已知的蛋白酶[29，30]。目前通常使用的蛋白酶是凝血酶、因子X(jué)a、腸激酶或TAGZyme系統(tǒng)(Qiagen，Hilden，Germany)，等等。本領(lǐng)域人員已知各種適合用于裂解間隔模塊的化學(xué)反應(yīng)，或者可以自間隔分子的生產(chǎn)商(例如Pierce)提供的信息中找到這些化學(xué)反應(yīng)。
具體來(lái)說(shuō)，間隔模塊可以是肽序列或有機(jī)分子。各種可用于本發(fā)明的間隔分子是本領(lǐng)域已知的。此外，也可將將來(lái)會(huì)研發(fā)或發(fā)現(xiàn)的間隔分子用于本發(fā)明。合適的間隔模塊包括肽間隔分子、交聯(lián)劑、天然的或合成的聚合物例如核酸、有或沒(méi)有取代基的碳?xì)浠衔铮鹊?。此外還可將分子組合用作間隔模塊，所述分子能夠通過(guò)非共價(jià)相互作用彼此形成復(fù)合體，由此使得兩種或兩種以上的模塊結(jié)合在一起形成MAT分子。此類彼此結(jié)合的分子組合的一個(gè)已知的實(shí)例是生物素/鏈霉抗生物素蛋白。
肽序列作為間隔模塊許多由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的蛋白質(zhì)在其氨基酸序列中具有短序列區(qū)，文獻(xiàn)中也將此類短序列區(qū)稱為間隔。這些間隔的作用是在空間上將蛋白質(zhì)的各種結(jié)構(gòu)域彼此分隔開(kāi)，這樣使得它們不會(huì)對(duì)各自的功能相互產(chǎn)生不良影響。為此，應(yīng)該特別保證間隔序列是柔性的，以便兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在空間上不會(huì)影響彼此的功能。
此類肽序列可用作本發(fā)明的間隔模塊。文獻(xiàn)中描述了眾多間隔肽序列。這些間隔優(yōu)選地具有2至60個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，但也可以具有更長(zhǎng)的序列。間隔也可僅由一個(gè)氨基酸組成。多種商品化的表達(dá)載體已經(jīng)包含了編碼肽間隔的序列區(qū)，所述肽間隔例如將標(biāo)記序列連接于準(zhǔn)備引入表達(dá)載體中的蛋白質(zhì)序列。非常短的肽間隔僅由兩個(gè)氨基酸組成，例如通常使用亮氨酸-甘氨酸、甘氨酸-丙氨酸或絲氨酸-丙氨酸(IBA GmbH，Gttingen，Germany)，或由甘氨酸和/或丙氨酸組成的長(zhǎng)度為4-6個(gè)氨基酸的短氨基酸序列(Qbiogene Inc.，Carlsbad，CA，USA)。文獻(xiàn)中還提及了眾多其他的間隔序列，均可用作本發(fā)明的間隔模塊。一般來(lái)說(shuō)所有目前已知的間隔分子和將來(lái)將要已知的間隔分子均可用作本發(fā)明的MAT分子的間隔模塊。一種用于鑒定適合作為間隔模塊的氨基酸序列的方法是使用數(shù)據(jù)庫(kù)篩選蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。優(yōu)選地，以這種方式在位于兩種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸序列中鑒定得到的長(zhǎng)度為2至60個(gè)氨基酸的短氨基酸序列可用作本發(fā)明的間隔模塊。目前已有的用于鑒定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域且因此也可用于鑒定適合作為間隔模塊的肽序列的數(shù)據(jù)庫(kù)是“SBASE蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域文庫(kù)”[31]。
交聯(lián)劑作為間隔模塊也可將交聯(lián)劑形式的間隔模塊引入本發(fā)明的MAT分子。為此，制備好所述MAT分子的各個(gè)模塊，然后以交聯(lián)劑通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將其彼此共價(jià)偶聯(lián)。多種商品化的交聯(lián)劑可用于此目的。例如Pierce(PierceBiotechnology，Inc.，Rockford，IL，USA)提供了多種不同的交聯(lián)劑。目前可以例如自Pierce選擇與氨基、巰基、糖結(jié)構(gòu)、羧基、羥基反應(yīng)的交聯(lián)劑或與那些待組合形成MAT分子的模塊非選擇性反應(yīng)的交聯(lián)劑。目前也可自例如Pierce Biotechnology Inc.得到用于制備MAT分子的、可通過(guò)特定化學(xué)反應(yīng)而再次分開(kāi)的交聯(lián)劑，例如巰基、堿、高碘酸鹽、羥胺、通過(guò)光的作用或通過(guò)非特異性反應(yīng)。此外可通過(guò)導(dǎo)向選擇交聯(lián)劑來(lái)具體確定所述MAT分子的各個(gè)模塊之間的距離。例如，Pierce目前提供引入的距離為1.4埃(Angstrm)(N-琥珀酰碘代乙酸酯)至34.7埃(雙(β-(4-疊氮水楊酰胺)乙基)二硫化物)的交聯(lián)劑，取決于所使用的交聯(lián)劑。另一種使用交聯(lián)劑偶聯(lián)各種模塊以形成本發(fā)明的MAT分子的可能的變化是可以使用來(lái)自Pierce Biotechnology Inc.的交聯(lián)劑Sulfo-SBED。Sulfo-SBED在一方面通過(guò)共價(jià)反應(yīng)偶聯(lián)兩種模塊，并在引入的間隔分子上額外包含一個(gè)生物素基團(tuán)。因此可以通過(guò)非共價(jià)鍵將MAT分子的另一個(gè)模塊連接于該生物素基團(tuán)。為此，待引入的模塊例如可偶聯(lián)于抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。然后可將以這種方式產(chǎn)生的偶聯(lián)于鏈霉抗生物素蛋白的模塊通過(guò)交聯(lián)劑中的生物素基團(tuán)偶聯(lián)于其他模塊。一般來(lái)說(shuō)，所有目前已知的交聯(lián)劑和將來(lái)將要已知的交聯(lián)劑均可用于將模塊連接形成本發(fā)明的MAT分子。
其他間隔模塊本發(fā)明的間隔模塊的組成例如可以是氨基酸的L異構(gòu)體和D異構(gòu)體、少見(jiàn)氨基酸、具有翻譯后修飾的氨基酸、核酸、PNA(肽核酸)、脂質(zhì)、糖結(jié)構(gòu)、其他天然的或合成的聚合物例如有取代基的或無(wú)取代基的碳?xì)浠衔铩⒕垡宜?、聚乙二醇、環(huán)糊精、聚甲基丙烯酸酯、明膠、oligourea等等、或其他物質(zhì)或上述物質(zhì)或其他物質(zhì)的組合。一般來(lái)說(shuō)，所有目前已知的適合用于將模塊連接在一起形成MAT分子的物質(zhì)和將來(lái)將要已知的具有相應(yīng)特性的分子均可用作間隔模塊將模塊連接形成本發(fā)明的MAT分子。
通過(guò)非共價(jià)相互作用連接在一起的間隔模塊文獻(xiàn)中存在大量此類間隔分子的實(shí)例。通過(guò)非共價(jià)相互作用連接在一起的且已經(jīng)商品化的此類分子組合的實(shí)例是生物素/鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白或Strep-tagII(IBA GmbH，Gttingen，Germany)或PinPointTM標(biāo)記(Stratagene，La Jolla，CA，USA)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/谷胱甘肽和A蛋白/抗體的不變區(qū)(FC部分)(Pharmacia Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden，Sigma，St.Louis，MO，USA)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)/直鏈淀粉(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)，組氨酸標(biāo)記/Ni螯合物(Qiagen，Hilden，Germany，BD Bioscience Clontech，Palo Alto，Ca，USA，Invitrogen，Breda，the Netherlands，Novagen Inc.，Madison，WI，USA，Roche Applied Science，Rotkreutz，Switzerland)、殼多糖結(jié)合標(biāo)記/殼多糖(Naw England Biolabs，Beverly，MA，USA)、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白/鈣調(diào)蛋白(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。此外還有大量其他的分子組合，例如受體/配體組合、抗體/抗原組合、凝集素/糖結(jié)構(gòu)組合，等等。可在數(shù)據(jù)庫(kù)中查到眾多目前已知的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，且均可用作本發(fā)明的間隔模塊[28]。一般來(lái)說(shuō)，所有目前已知的或?qū)?lái)將要已知的能夠彼此形成非共價(jià)鍵的分子組合，均可用作本發(fā)明的間隔模塊。將間隔模塊引入MAT分子的另一種方法是是使用雙特異性分子，其在一個(gè)分子中組合了兩種不同的結(jié)合位點(diǎn)。此類分子的實(shí)例可以是生物素標(biāo)記的凝集素(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL，USA)，其能夠?qū)⒗缫环N鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)記的模塊與具有結(jié)合了凝集素的糖結(jié)構(gòu)的另一種模塊連接在一起。另一種可用于這種偶聯(lián)方式的實(shí)例是識(shí)別兩種不同表位的雙特異性抗體，等等。
以下是另一種將間隔模塊引入MAT分子的變化首先，通過(guò)非共價(jià)連接間隔模塊將至少兩種模塊彼此偶聯(lián)，然后以化學(xué)交聯(lián)劑處理該復(fù)合體，在空間上接近的模塊之間引入共價(jià)鍵。這樣做的優(yōu)勢(shì)在于，在第一個(gè)步驟中，特定的模塊以導(dǎo)向和限定的方式彼此偶聯(lián)，然后將非共價(jià)偶聯(lián)轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的共價(jià)偶聯(lián)。如果直接以產(chǎn)生共價(jià)鍵的交聯(lián)劑處理模塊，模塊彼此偶聯(lián)的方式通常是隨機(jī)的而不是特異性的。
MAT分子的結(jié)構(gòu)一般來(lái)說(shuō)，可以對(duì)所述MAT分子的各個(gè)模塊進(jìn)行任何所需的排列。各個(gè)模塊在MAT分子中可出現(xiàn)一次或多次。最低的條件是需要具有至少一種轉(zhuǎn)運(yùn)模塊、至少一種導(dǎo)向模塊和至少一種抗原模塊。額外的模塊，例如標(biāo)記模塊、間隔模塊等等，可任選地存在，但不是必需的。所有模塊在MAT分子中均可出現(xiàn)一或多次。如果模塊出現(xiàn)一次以上，它們可以相同的拷貝的形式出現(xiàn)，或者在各種情況中，一種模塊的不同形式可以以單一拷貝或一個(gè)以上拷貝而存在。屬于同一類型模塊的完全不同的模塊，例如His標(biāo)記模塊和生物素標(biāo)記模塊，也可出現(xiàn)于一種MAT分子中。兩種模塊在MAT分子中在功能上承擔(dān)相同的任務(wù)(標(biāo)記模塊)，但就其分子結(jié)構(gòu)而言不需要有任何共同之處。
MAT分子中的兩種或兩種以上相同拷貝的抗原模塊的作用可以是例如引起針對(duì)有關(guān)抗原的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。兩種或兩種以上不同的抗原模塊可例如在一個(gè)MAT分子進(jìn)行組合，以便同時(shí)調(diào)變針對(duì)兩種或兩種以上不同抗原的免疫反應(yīng)。兩種或兩種以上不同的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊可用于一個(gè)MAT分子中。例如，Tat序列和VP22序列可使得轉(zhuǎn)運(yùn)更加有效，這是因?yàn)镸AT分子可在更為廣泛的不同細(xì)胞類型和組織類型中進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)運(yùn)。也可以例如在一個(gè)MAT分子中使用兩種或兩種以上標(biāo)記模塊，例如一種His標(biāo)記和一種FLAG標(biāo)記，在這種情況下，例如His標(biāo)記用于分離MAT分子，而例如FLAG標(biāo)記用于檢測(cè)MAT分子。在一個(gè)MAT分子中可以使用兩種或兩種以上不同的導(dǎo)向模塊，例如一種來(lái)自MHC II分子的恒定鏈的序列以及作為另一種導(dǎo)向模塊的一種甘露糖-6-磷酸基團(tuán)，其中例如恒定鏈作為進(jìn)入MIIC的導(dǎo)向模塊，而甘露糖-6-磷酸基團(tuán)用于導(dǎo)向溶酶體，由此可以全面提高抗原呈遞的功效或抗原呈遞細(xì)胞所呈遞的抗原的不同表位的數(shù)量。
也可根據(jù)需要改變MAT分子內(nèi)各個(gè)模塊的位置，條件是存在至少一種轉(zhuǎn)運(yùn)模塊、至少一種導(dǎo)向模塊和至少一種抗原模塊。MAT分子的所有或部分模塊還可以例如不以模塊的線性順序排列，而是采用環(huán)狀或分枝狀的模塊結(jié)構(gòu)或者是樹(shù)形(dendrimer)，或者是線性和/或分枝狀和/或環(huán)狀和/或樹(shù)形分子部分的組合?？赏ㄟ^(guò)例如兩個(gè)半胱氨酸殘基彼此發(fā)生反應(yīng)或通過(guò)一個(gè)半胱氨酸殘基與最初為線性結(jié)構(gòu)的模塊鏈內(nèi)部的硫羥酸酯基發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生MAT分子的環(huán)狀模塊結(jié)構(gòu)。表達(dá)載體的生產(chǎn)商可提供能夠通過(guò)這些機(jī)制制備環(huán)狀融合蛋白的具體的載體，例如IMPACTTM-TWIN系統(tǒng)，來(lái)自New England Biolabs，Beverly，MA，USA?？衫缤ㄟ^(guò)合成一些肽來(lái)制備分枝狀模塊，在所述的肽中，自多聚L-賴氨酸開(kāi)始，新的賴氨酸殘基被連接于每個(gè)后來(lái)的賴氨酸殘基的兩個(gè)游離氨基上，以這種方式可以產(chǎn)生具有任意分枝程度的肽結(jié)構(gòu)。然后例如可將轉(zhuǎn)運(yùn)模塊和/或?qū)蚰K隨后合成到分枝狀肽的基本結(jié)構(gòu)上[32]。也可通過(guò)蛋白質(zhì)連接將其他模塊偶聯(lián)到線性、環(huán)狀或分枝狀肽基本結(jié)構(gòu)上[33，34]。此外，可在合成肽的過(guò)程中將例如生物素基團(tuán)引入肽基本結(jié)構(gòu)中，然后可將模塊通過(guò)例如鏈霉抗生物素蛋白Strep標(biāo)記系統(tǒng)連接于這些生物素基團(tuán)或通過(guò)PinPointTM系統(tǒng)連接于肽基本結(jié)構(gòu)(分別來(lái)自IBAGmbH，Gttingen，Germany和Promega Biosciences Inc.，San Louis Obispo，CA，USA)。然后可將以這種方式連接的模塊通過(guò)非共價(jià)鍵偶聯(lián)于肽基本結(jié)構(gòu)。
圖1以各種模塊的組成方式和MAT分子內(nèi)模塊的排列方式舉例說(shuō)明了MAT分子的可能的結(jié)構(gòu)。
MAT分子的模塊的結(jié)構(gòu)肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、少見(jiàn)氨基酸、翻譯后修飾等等在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)肽和蛋白質(zhì)可以作為等價(jià)物而相提并論。在本申請(qǐng)中，肽或蛋白質(zhì)是指通過(guò)肽鍵將至少兩個(gè)氨基酸進(jìn)行共價(jià)連接。在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”和術(shù)語(yǔ)“氨基酸殘基”可以作為等價(jià)物使用，即這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)的含義是相同的。在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)氨基酸/氨基酸殘基和肽/蛋白質(zhì)取其最寬的定義。
用于本發(fā)明的氨基酸不僅是指由遺傳密碼確定的20個(gè)氨基酸，也指可由終止密碼子編碼的氨基酸，例如硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸(pyrro-lysine)。所有已知的氨基酸和肽衍生物例如糖基化的、磷酸化的、硫酸化的氨基酸/肽和氨基酸的L異構(gòu)體和D異構(gòu)體，以及將來(lái)將要已知的氨基酸和肽衍生物也包括在內(nèi)。可通過(guò)翻譯后修飾、通過(guò)化學(xué)修飾、通過(guò)酶修飾或基于其他機(jī)制產(chǎn)生或特異性制備氨基酸和肽衍生物。得到的肽可包含出現(xiàn)于肽分子內(nèi)任何區(qū)域的修飾。例如，修飾可出現(xiàn)于肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈、肽的N端或C端。修飾可發(fā)生于單個(gè)氨基酸、多個(gè)氨基酸或所有氨基酸，而且，肽中可以存在無(wú)修飾、一種類型的修飾或者多種類型的修飾的任意的組合。肽可以是分枝狀的，肽可以是環(huán)狀的，分枝狀和環(huán)狀肽的任意組合均是可能的。分枝狀和/或環(huán)狀肽可可通過(guò)天然的生物過(guò)程產(chǎn)生或通過(guò)合成而制備?？膳e例提及的少見(jiàn)氨基酸的實(shí)例有α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、β-氨基異丁酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、α-氨基己二酸、4-氨基苯酸、氨乙基半胱氨酸、α-氨基青霉烷酸、醛賴氨酸、4-羧基谷氨酸、胱硫醚、羧基谷氨酸、羧基氨基甲基半胱氨酸、羧甲基半胱氨酸、半胱磺酸、citroline、脫氫丙氨酸、二氨基丁酸、脫氫氨基-2-丁酸、乙硫氨酸、甘氨酸-脯氨酸二肽、4-羥脯氨酸、羥賴氨酸、羥脯氨酸、高絲氨酸、同型半胱氨酸、組胺、異纈氨酸、lysinoalanine、羊毛硫氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸、2-哌啶羧酸、焦谷氨酸、吡咯賴氨酸、脯氨酸-羥脯氨酸二肽、肌氨酸、4-硒代半胱氨酸、聯(lián)賴氨酸、硫代脯氨酸，等等。只要其結(jié)構(gòu)允許，所有上述氨基酸均可以是L異構(gòu)體或D異構(gòu)體形式的。一般來(lái)說(shuō)，所有目前已知的天然存在的或合成的或通過(guò)酶性或化學(xué)性或其他方式制備的氨基酸和氨基酸衍生物、以及將來(lái)將要已知的氨基酸的修飾，均包括在術(shù)語(yǔ)“氨基酸”之內(nèi)，并且可作為本發(fā)明的MAT分子的成分。
在此提及的可出現(xiàn)于本發(fā)明的MAT分子的一或多種模塊中的翻譯后修飾或化學(xué)修飾有用以下結(jié)構(gòu)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行修飾游離半胱氨酸與肽序列中的半胱氨酸結(jié)合、兩個(gè)半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵、甲基化、乙酰化、?；⒎峄?、甲?；?、geranylgeranylation、生物素?；?、硬脂?；?、棕櫚?；ipoylation、C-甘露糖苷化、肉豆寇酰化、磷酸化、sulfatylation、N-糖基化、O-糖基化、酰胺化、脫酰胺化、去甲基化、半胱氨酰化、羧化、羥化、碘化、氧化、聚乙二醇化、異戊烯化、ADP-核糖基化、5’-腺苷化、4’-phosphopan-theinations、谷胱甘肽化，以下物質(zhì)的共價(jià)結(jié)合黃素、血紅素基團(tuán)(或其他卟啉類)、核酸或核酸衍生物、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物、磷脂酰肌醇、糖基磷脂酰肌醇錨(GPI錨)、磷酸吡哆醛、甘露糖-6-磷酸，將半胱氨酸修飾為羧基氨基甲基半胱氨酸或羧甲基半胱氨酸或吡啶基乙基半胱氨酸、將賴氨酸修飾為硫辛酸、將谷氨酰胺修飾為焦谷氨酸、通過(guò)tRNA將氨基酸添加到肽上、用泛素標(biāo)記肽、肽的分支(如聚L-賴氨酸、肽的環(huán)化的形式，如通過(guò)在兩個(gè)半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵)，等等。文獻(xiàn)記載了眾多存檔于數(shù)據(jù)庫(kù)中的對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步修飾[35]。一般來(lái)說(shuō)，所有目前已知的天然存在的或合成的或通過(guò)酶性或化學(xué)性或其他方式制備的肽的修飾、以及將來(lái)將要已知的肽的修飾，均包括在術(shù)語(yǔ)“肽”之內(nèi)，并且可作為本發(fā)明的MAT分子的成分。
肽模擬物在本發(fā)明中，還可將模塊中的一或多個(gè)氨基酸或整個(gè)模塊或MAT分子中的所有模塊以由肽模擬物組成的結(jié)構(gòu)進(jìn)行取代。在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)肽模擬物取其最寬的定義。肽模擬物是這樣一種物質(zhì)，其包含非肽結(jié)構(gòu)元件且能夠模擬或拮抗其天然本體分子(natural parent molecule)的生物學(xué)效應(yīng)。本領(lǐng)域有眾多研究詳細(xì)探討了以肽模擬物作為常規(guī)肽結(jié)構(gòu)的替代物的可能性。一般來(lái)說(shuō)，MAT分子的一或多個(gè)模塊可以全部或部分地由肽模擬物組成[36-38]。這可以由多種優(yōu)勢(shì)。由此，轉(zhuǎn)運(yùn)模塊可更有效地穿透到細(xì)胞內(nèi)部，導(dǎo)向模塊可將MAT分子更有效地或更低效地和/或更特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)到所需的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器內(nèi)，抗原模塊可引起與常規(guī)抗原引起的免疫應(yīng)答相比更強(qiáng)或更弱的免疫應(yīng)答，或標(biāo)記模塊可具有更好的物理化學(xué)特性，使其更適合用于分離和/或檢測(cè)MAT分子，等等。此外，在一些情況中，還可通過(guò)使用肽模擬物降低或升高M(jìn)AT分子在體內(nèi)的穩(wěn)定性，降低或升高其毒性，提高其在親水性或疏水性介質(zhì)中的溶解性，以及延長(zhǎng)其在體外的穩(wěn)定性且相對(duì)于合成相應(yīng)的常規(guī)肽來(lái)說(shuō)可降低合成肽模擬物的成本。肽模擬物的一個(gè)實(shí)例是Spiegelmers，由NOXXON Pharma AG，Berlin，Germany提供。此類肽模擬物的優(yōu)勢(shì)例如在于其不引起免疫應(yīng)答且因此可能很值得用于例如MAT分子的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊、導(dǎo)向模塊、標(biāo)記模塊、間隔模塊，等等。不過(guò)，Spiegelmers可能不適合用作抗原模塊。
MAT分子的制備和分離本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是使用本領(lǐng)域人員已知的重組表達(dá)系統(tǒng)、層析方法、和化學(xué)合成方法來(lái)分離MAT分子。以這種方式分離的MAT分子可用于制備藥物和診斷劑以及用于制備用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和體外系統(tǒng)中的抗體。
制備MAT分子本領(lǐng)域人員已知的用于制備MAT分子的方法包括肽的重組表達(dá)。為了表達(dá)所述的肽，可采用的細(xì)胞系統(tǒng)例如為，細(xì)菌例如大腸桿菌，酵母細(xì)胞例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，昆蟲(chóng)細(xì)胞例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf-9)細(xì)胞，或哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。這些細(xì)胞可自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得。為進(jìn)行肽的重組表達(dá)，例如可采用分子生物學(xué)方法，將編碼完整MAT分子或MAT分子的各個(gè)分子的核酸序列，與合適的調(diào)控核酸序列例如選擇標(biāo)記物、啟動(dòng)子等，引入表達(dá)載體中。合適的選擇標(biāo)記物例如是抗生素如氨卡青霉素、卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素的抗性或代謝缺陷的抗性，例如，不能產(chǎn)生丙氨酸、亮氨酸、色氨酸等的酵母細(xì)胞，或缺乏次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶且因此不能在HAT培養(yǎng)基(次黃嘌呤，Aminopetrin，胸苷培養(yǎng)基)中存活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，等等。合適的啟動(dòng)子例如是巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子(CMV啟動(dòng)子)、SP1基本啟動(dòng)子或胸腺嘧啶核苷激酶啟動(dòng)子(TK啟動(dòng)子)。在選擇啟動(dòng)子時(shí)，需要選擇適合于具體細(xì)胞系統(tǒng)的啟動(dòng)子。例如，T7或T7/lacO啟動(dòng)子適合于細(xì)菌，而例如nmt1啟動(dòng)子適合于酵母細(xì)胞。如果MAT分子或MAT分子的模塊具有毒性，那么優(yōu)選地或有必要采用能夠在外部對(duì)這些分子的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的表達(dá)載體，例如Tet-OnTM和Tet-OffTM表達(dá)系統(tǒng)(Promega Biosciences，San Louis，CA，USA)。在該系統(tǒng)中，可通過(guò)向細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加四環(huán)素而調(diào)控表達(dá)載體的啟動(dòng)子的活性。其他可用來(lái)在外部調(diào)控MAT分子或MAT分子模塊表達(dá)的方法的實(shí)例是通過(guò)IPTG誘導(dǎo)T7聚合酶或使用蛻皮激素誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)，例如CompleteControl誘導(dǎo)型哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)(Stratagene，La Jolla，MO，USA)。當(dāng)使用包含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)序列的載體時(shí)，僅使用一種表達(dá)載體(如pLP-IRESneo載體，Promega Biosciences，San Louis；CA，USA)即可同時(shí)制備多個(gè)分子。通過(guò)這種方式，例如可使得MAT分子的兩種或兩種以上傾向于在彼此之間通過(guò)非共價(jià)鍵而相互作用的模塊，在數(shù)量上按照合適的化學(xué)計(jì)量比彼此平行地表達(dá)，且還可能平行地得到純化。多個(gè)公司提供商品化的用于各種細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)載體，例如Invitrogen，Qiagen，Stratagene，Clontech，Novagen，NewEngland Biolabs，Pharmingen，Promega，Pharmacia，等等。以這種方式分離的表達(dá)載體隨后可通過(guò)本領(lǐng)域人員已知的方式引入合適的細(xì)胞中，例如通過(guò)電穿孔、磷酸鈣共沉淀、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，等等?；蛘?，也可使用由分子生物學(xué)方法制備的重組病毒，用其轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并使得被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)MAT分子或MAT分子模塊。合適的病毒表達(dá)系統(tǒng)為，例如桿狀病毒系統(tǒng)如BacculoGold(BD Bioscience Pharmingen，Palo Alto，CA，USA)、腺病毒表達(dá)系統(tǒng)如ViraPortTM(Stratagene，La Jolla，CA，USA)、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)如AdEasy(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，等等。
作為轉(zhuǎn)染表達(dá)載體和病毒表達(dá)系統(tǒng)的替代選擇，可使用體外翻譯系統(tǒng)，其中例如使用兔網(wǎng)狀細(xì)胞裂解物或E.coli S30提取物或麥芽提取物來(lái)合成MAT分子或體外合成MAT分子模塊，而無(wú)需使用活細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。
用于制備MAT分子的細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞裂解物或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液可用作制備MAT分子或制備MAT分子的各個(gè)模塊的起始材料。例如，可以自細(xì)菌如E.coli、芽孢桿菌、柄桿菌、假單胞菌或鏈霉菌，或者酵母如糖酵母、畢赤酵母或漢遜酵母，或者昆蟲(chóng)細(xì)胞如Sf-9、Sf-21或High Five，或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、3T3細(xì)胞、BHK細(xì)胞、293細(xì)胞等獲得細(xì)胞系統(tǒng)?？赏ㄟ^(guò)使用引起蛋白質(zhì)自細(xì)胞內(nèi)部輸出到細(xì)胞外空間的信號(hào)序列，使得被表達(dá)的蛋白質(zhì)特異性聚集在細(xì)胞培養(yǎng)基中或例如細(xì)菌的壁膜間隙中。制備MAT分子或MAT分子模塊的另一種起始材料的來(lái)源可以是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因真菌或轉(zhuǎn)基因微生物，其中穩(wěn)定地或瞬時(shí)地引入了編碼MAT分子或MAT分子模塊的核酸。在這種情況中，相應(yīng)的核酸均可直接整合入特定生物體的基因組中，且可以是以質(zhì)粒的形式或其他DNA或RNA分子的形式被引入生物體中。然后可分離相應(yīng)的MAT分子或MAT分子模塊，例如分離自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁、卵、血清、尿液、組織等等，例如分離自轉(zhuǎn)基因植物的貯藏塊莖、種子、葉等等，例如分離自轉(zhuǎn)基因真菌的菌絲體、子實(shí)體等等，或者分離自體外培養(yǎng)的細(xì)胞或其他生物體，或分離自相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基。一般來(lái)說(shuō)所有生物體均適合用作制備MAT分子或MAT分子模塊的表達(dá)系統(tǒng)。
分離MAT分子可采用本領(lǐng)域人員已知的技術(shù)分離以這種方式制備的MAT分子或MAT分子模塊。為此，可采用多種本領(lǐng)域人員已知的分離蛋白質(zhì)的方法，例如沉淀法、液相分離法、層析法等等。合適的沉淀法包括免疫沉淀、硫酸銨沉淀、聚乙二醇沉淀、乙醇沉淀、三氯乙酸沉淀(TCA沉淀)、熱沉淀等等。液相分離法包括例如有機(jī)溶劑萃取，例如使用醇、丙酮、氯仿、乙腈等等。層析法包括例如陽(yáng)離子交換層析、陰離子層析、等電聚焦、反相層析、凝膠過(guò)濾、固定金屬離子親和層析(IMAC)，其可使用多種金屬離子例如鎳、鋅、鈷等等、羥磷灰石層析，多種不同的親和層析方法，例如免疫親和層析、使用固定核酸或固定蛋白酶抑制劑的親和層析，等等。所用的層析介質(zhì)的結(jié)構(gòu)可基于瓊脂糖基質(zhì)、基于磁性顆粒、膜的形式、中空纖維的形式、基于各種聚合物例如聚苯乙烯，等等。層析法通?？梢愿鞣N規(guī)模進(jìn)行，自體積為數(shù)微升的層析柱直至體積為數(shù)百升的大型層析柱不等。此外，層析可在正常大氣壓、范圍為1到50巴(如FPLC系統(tǒng)，Pharmacia Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)的中等壓力、范圍高達(dá)400巴的非常高的壓力以及甚至更高的壓力(HPLC系統(tǒng))條件下進(jìn)行。進(jìn)行層析的條件對(duì)MAT分子來(lái)說(shuō)可以是非變性的和變性的。親和層析可利用基質(zhì)材料與待分離的MAT分子或MAT分子的模塊之間的各種相互作用。這些包括多種標(biāo)記分子，所述標(biāo)記分子在本申請(qǐng)的其他部分已經(jīng)提及，其可與特定的官能團(tuán)或配體反應(yīng)，且因此可用于分離MAT分子或MAT分子模塊。不過(guò)，一般來(lái)說(shuō)可利用所有類型的相互作用，例如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、核酸-蛋白質(zhì)相互作用、核酸-核酸相互作用、糖-凝集素相互作用、糖-蛋白質(zhì)相互作用、受體-配體相互作用、抗體-抗原相互作用(如抗FLAG、抗HA、抗myc tag抗體)、半抗原-抗體相互作用、Spiegelmers相互作用(NOXXON Pharma AG，Berlin，Germany)，等等。
親和層析可用于親和層析的方法具體而言是那些基于標(biāo)記模塊與基質(zhì)的選擇性結(jié)合。可用于分離MAT分子的合適的標(biāo)記模塊與有關(guān)基質(zhì)的組合有組氨酸標(biāo)記與鎳螯合基質(zhì)(Qiagen，Hilden，Germany)、GST標(biāo)記與谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)、麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)記與直鏈淀粉基質(zhì)(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)、生物素標(biāo)記與鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白基質(zhì)(IBA GmbH，Gttingen，Germany)、殼多糖結(jié)合蛋白標(biāo)記與殼多糖基質(zhì)(New EnglandBiolabs，Beverly，MA，USA)、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽標(biāo)記與鈣調(diào)蛋白基質(zhì)(Stratagene，La Jolla，CA，USA)、A蛋白或G蛋白或A蛋白/G或L蛋白與抗體分子上可被相應(yīng)的蛋白質(zhì)識(shí)別的特定區(qū)域，例如抗體的Fc部分(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)、FLAG標(biāo)記、HA標(biāo)記、myc標(biāo)記、組氨酸標(biāo)記等，以及一種偶聯(lián)了針對(duì)上述特定標(biāo)記的抗體的基質(zhì)(很多不同的公司，包括Promega Biosciences Inc.，San Louis Obispo，CA，USA，Invitrogen，Breda，the Netherlands，Qiagen，Hilden，Germany)，等等。
蛋白酶識(shí)別序列以這種方式分離的MAT分子或MAT分子模塊可在適當(dāng)?shù)那闆r下自其標(biāo)記模塊和/或其他模塊分開(kāi)。為此可以將例如適當(dāng)位置處的蛋白酶識(shí)別序列引入特定的表達(dá)載體。本領(lǐng)域人員已知多種合適的蛋白酶識(shí)別序列，包括蛋白酶例如凝血酶、因子X(jué)a、腸激酶或TAGZyme系統(tǒng)(Qiagen，Hilden，Germany)的識(shí)別序列。添加的蛋白酶可例如通過(guò)固定的蛋白酶抑制劑而去除，例如以EK-AWAY去除腸激酶(Invitrogen，Breda，The Netherlands)，Xa去除樹(shù)脂(Qiagen Hilden，Germany)，用苯甲脒瓊脂糖凝膠去除凝血酶，等等。還可以使用內(nèi)含肽(inteins)來(lái)分離MAT分子或MAT分子模塊，即使用的蛋白酶是MAT分子的成分，且在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下可通過(guò)蛋白質(zhì)水解作用將其自身從MAT分子或MAT分子的模塊的其余部分去除(GeneaseTM，New England Biolabs，Beverly，MA，USA)。一般來(lái)說(shuō)，所有目前已知的蛋白酶識(shí)別序列[29，30]以及將來(lái)將要已知的蛋白酶識(shí)別序列均適合用于本發(fā)明中以去除MAT分子的組分。此外，蛋白酶識(shí)別序列可以是天然存在的或是特別設(shè)計(jì)的，且可以完全或部分地由天然氨基酸、少見(jiàn)氨基酸、肽模擬物等組成。
內(nèi)含體(Inclusion bodies)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是制備不正確折疊的蛋白質(zhì)聚合體(Aggregate)形式的MAT分子或MAT分子的模塊，這種不正確折疊的蛋白質(zhì)聚合體也稱為內(nèi)含體。內(nèi)含體可制備為包含轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的分子，所述轉(zhuǎn)運(yùn)模塊能夠?qū)崿F(xiàn)自細(xì)胞外空間經(jīng)由細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的轉(zhuǎn)運(yùn)。這種轉(zhuǎn)運(yùn)使得最初是不正確折疊的分子成為正確折疊的分子，并能夠在細(xì)胞內(nèi)象最初即為正確折疊的MAT分子一樣起作用。這一過(guò)程的優(yōu)勢(shì)在于可在變性條件下分離得到解折疊的(unfolded)蛋白質(zhì)，這在技術(shù)上來(lái)說(shuō)通常更為簡(jiǎn)單且成本更低。此外，內(nèi)含體是相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。在一些情況下，這有利于日后用于醫(yī)療目的的MAT分子的貯存和穩(wěn)定性。通過(guò)這種方法，也可在本發(fā)明中使用解折疊的或不正確折疊的MAT分子或MAT分子模塊。某些轉(zhuǎn)運(yùn)模塊引起的轉(zhuǎn)運(yùn)既可以是自細(xì)胞外空間進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，也可以是反向的轉(zhuǎn)運(yùn)。尚處于不正確折疊的MAT分子的轉(zhuǎn)換可以在準(zhǔn)備以MAT分子進(jìn)行治療的個(gè)體體內(nèi)直接進(jìn)行，或者可在體外在細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行MAT分子的折疊。此外，在一些情況下，可由同一種轉(zhuǎn)運(yùn)模塊實(shí)現(xiàn)將解折疊的MAT分子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并隨后將正確折疊的MAT分子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外空間。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些適合用作本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的序列采用了這種機(jī)制，例如VP22序列[39]。
MAT分子的修飾可通過(guò)眾多本領(lǐng)域人員已知的方法對(duì)MAT分子或MAT分子模塊進(jìn)行酶性、化學(xué)性或方法的修飾。例如，可使用激酶為肽提供含磷基團(tuán)，而含磷基團(tuán)可使用磷酸酶去除，糖結(jié)構(gòu)可使用糖苷酶而去除，等等。合適的激酶、磷酸酶和糖苷酶等以及合適的方法可自多個(gè)生產(chǎn)商獲得，例如New England Biolabs，Beverly，MA，USA。還可利用對(duì)MAT分子或MAT分子模塊的磷酸化，以放射性磷標(biāo)記MAT分子或MAT分子模塊，由此使其在體外和/或體內(nèi)更易于檢測(cè)。還可通過(guò)化學(xué)反應(yīng)對(duì)MAT分子或MAT分子模塊進(jìn)行修飾。例如，可通過(guò)還原破壞二硫鍵，硫酯基團(tuán)可與半胱氨酸殘基共價(jià)反應(yīng)，或者兩個(gè)半胱氨酸殘基可反應(yīng)形成二硫鍵，由此能夠制備出環(huán)狀或分枝狀的MAT分子或MAT分子模塊(如IMPACTTM-TWIN蛋白質(zhì)融合及純化系統(tǒng)，New England Biolabs，Beverly，MA，USA)。還可以通過(guò)選擇表達(dá)系統(tǒng)來(lái)對(duì)MAT分子或MAT分子模塊的修飾施加特異性的影響。例如，細(xì)菌內(nèi)不進(jìn)行糖基化，昆蟲(chóng)細(xì)胞僅合成特定類型的糖基化，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生全部糖基化。為進(jìn)行表達(dá)，也可使用經(jīng)過(guò)修飾的或經(jīng)過(guò)選擇的細(xì)胞系，所述修飾或選擇的方式使得細(xì)胞能夠特異性產(chǎn)生特定的翻譯后修飾或不能特異性產(chǎn)生翻譯后修飾。這些有利的特性可以是，在親水性溶劑或疏水性溶劑中具有更好的溶解性，MAT分子在例如室溫、37℃、4℃、-20℃、-70℃或其他溫度具有更高的穩(wěn)定性，MAT分子在單獨(dú)存在或與其他固體、液體或氣體物質(zhì)混合(如藥物或診斷劑制劑形式)具有更長(zhǎng)時(shí)間的分子穩(wěn)定性，MAT分子對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜、血腦屏障、血-CSF屏障以及其他生物膜和屏障等具有更高的穿透力，更高或更低的體內(nèi)或體外半衰期，更低或更高的毒性，MAT分子在體內(nèi)或體外具有更好的可檢測(cè)性，等等。
蛋白質(zhì)連接另外可通過(guò)蛋白質(zhì)連接來(lái)制備MAT分子或MAT分子模塊。蛋白質(zhì)連接是指例如一種化學(xué)反應(yīng)，其中通過(guò)一或多個(gè)化學(xué)反應(yīng)將兩個(gè)肽端頭共價(jià)連接在一起。這可以例如是硫羥酸酯與半胱氨酸側(cè)鏈的反應(yīng)(如IMPACTTM-TWIN蛋白質(zhì)融合和純化系統(tǒng)，New England Biolabs，Beverly，MA，USA)?？梢赃@種方式制備例如環(huán)狀肽?？衫缤ㄟ^(guò)化學(xué)合成聚賴氨酸肽來(lái)制備分枝狀MAT分子，在聚賴氨酸肽中，將兩個(gè)額外的賴氨酸殘基(賴氨酸的每個(gè)氨基上一個(gè)賴氨酸)連接于每個(gè)賴氨酸，并由此形成分枝狀聚賴氨酸肽。然后，可隨后在每個(gè)末端賴氨酸上合成一個(gè)肽鏈，或通過(guò)肽連接而共價(jià)連接一個(gè)肽。其他分枝狀聚合物也可用作本發(fā)明的MAT分子或MAT分子模塊的載體結(jié)構(gòu)。其中的一個(gè)例子是例如PEG星狀分子，其可通過(guò)以交聯(lián)的二乙烯基苯使環(huán)氧乙烷發(fā)生聚合而制備。
肽模擬物還可通過(guò)化學(xué)合成肽或肽模擬物[40]或肽和肽模擬物的組合來(lái)制備MAT分子或MAT分子模塊?？赏ㄟ^(guò)化學(xué)合成來(lái)制備MAT分子或MAT分子的模塊，例如通過(guò)Merrifield固相合成方法，采用可自多個(gè)生產(chǎn)商獲得自動(dòng)合成儀和合成的化學(xué)制品而進(jìn)行。提供肽模擬物合成法的一個(gè)公司例如是Peptide LaboratoryTM，Benicia，CA，USA。用于常規(guī)肽和肽模擬物的多種合成子(synthons)可自商業(yè)途徑得到，例如自Sigma-AldrichCo，St.Louis，MO，USA。
藥物和診斷劑組合物藥物和診斷劑中的MAT分子的肽部分、氨基酸部分、氨基酸衍生部分、肽模擬物部分等也可以是鹽的形式，條件是所述的鹽是藥物學(xué)可接受的鹽。準(zhǔn)備用于注射的藥物或診斷劑例如可以是無(wú)菌的水性或油性溶液，其根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)混合了合適的賦形劑例如分散劑、濕潤(rùn)劑和能夠穩(wěn)定懸液的制劑?？墒褂盟幬飳W(xué)可接受的稀釋劑或或溶劑例如1，3-丁二醇來(lái)制備用于注射的無(wú)菌溶液?？墒褂玫目山邮艿娜軇┖途彌_液是水、林格液、等張氯化鈉溶液，等等。此外，可使用無(wú)菌的油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，可使用脂肪酸例如油酸來(lái)制備注射溶液。此外，還可使用二甲基乙酰胺、去垢劑包括離子和非離子去垢劑、聚乙二醇，等等。前述物質(zhì)的混合物也是可以的。此外可將藥物制備為與生物可降解聚合物的混合物，所述生物可降解聚合物可連續(xù)地釋放藥物。該系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例例如是Atrigel系統(tǒng)(Atrix Labs，F(xiàn)ort Collins，CO，USA)。
可用于直腸施用的制劑那些由以下混合物組成的制劑，所述混合物由MAT分子和，在適當(dāng)情況下，其他物質(zhì)組成，所述其他物質(zhì)具有合適的、非刺激性軟膏基質(zhì)或填充物，例如可可油、合成的甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯、脂肪酸或聚乙二醇。此外還可含有著色劑、防腐劑和添味劑。這些以及其他合適的物質(zhì)在室溫為固體但在體溫時(shí)融化，從而釋放出所含的物質(zhì)。
口服施用可使用膠囊、片劑、丸劑、粉劑、顆粒等等。在這些劑型中，藥物和診斷劑中的活性物質(zhì)通常與適合特定劑型的佐劑相結(jié)合。這些物質(zhì)可使用乳糖、蔗糖、淀粉、纖維素酯、鏈烷酸、纖維素烷基酯、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸或亞硫酸的鈉鹽或鈣鹽、明膠、阿拉伯樹(shù)膠、藻酸鈉、聚乙烯吡烷酮、聚乙烯醇等加工成例如片劑、膠囊等。此類膠囊、片劑等可額外包含能夠進(jìn)行或促進(jìn)活性物質(zhì)控釋的物質(zhì)，例如羥丙基甲基纖維素。此外還可含有緩沖物質(zhì)，例如檸檬酸鈉、碳酸鎂或碳酸鈣或者碳酸氫鎂或碳酸氫鈣，等等。其他組分可以是著色劑、香料、調(diào)味劑、防腐劑和甜味劑。片劑、丸劑、膠囊等可額外加上涂層，涂層在一方面使其抵抗胃酸，而在另一方面，其可溶解于腸道內(nèi)的堿性環(huán)境中。
口服施用也可使用液體、藥物學(xué)可接受的乳劑、溶液、糖漿和類似凝膠的制劑。這些制劑可包含醫(yī)用溶劑，例如水、乙醇，等等。這些制劑還可包含佐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和混懸劑等，以及甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、防腐劑和添味劑。
用于注射目的的液體制劑可通過(guò)將無(wú)菌粉末或顆粒溶解于水性或非水性溶劑而制備。這些溶液所基于的粉末和顆?？砂换蚨喾N為口服施用藥物而提及的物質(zhì)。合適的溶劑是，水、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、玉米油、棉子油、椰子油、苯甲醇、氯化鈉溶液或多種其他緩沖液。其他可能的成分為著色劑、防腐劑，等等。
藥物中MAT分子的量以及其他成分的量取決于劑型、劑量頻率、所采用的施用途徑、患者的年齡、性別、體重和健康狀況，等等。需要考慮的一個(gè)其他因素是進(jìn)行的處理是用于診斷、治療還是用于預(yù)防，以及處理的目的是增強(qiáng)免疫反應(yīng)還是抑制免疫反應(yīng)。本領(lǐng)域人員已知眾多有關(guān)藥物的配制和劑量的文獻(xiàn)[41，42]。
使用MAT分子獲得抗體本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是使用MAT分子獲得單克隆、寡克隆或多克隆抗體。可用本領(lǐng)域人員熟知的常規(guī)方法獲得抗體。使用MAT分子得到的此類抗體能夠?qū)AT分子抗原模塊中的抗原進(jìn)行特異性免疫學(xué)檢測(cè)。抗體精確識(shí)別抗原模塊中的抗原、和/或與抗原模塊中的抗原相似的抗原、和/或抗原模塊中的抗原的一或多種表位、和/或抗原模塊中的抗原的一或多種新表位、和/或相應(yīng)的完整抗原，盡管抗原模塊中僅具有這些抗原的部分，等等。可通過(guò)免疫接種合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)產(chǎn)生多克隆抗體，例如、小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、兔、山羊、綿羊、貓、狗、猴子、牛、馬、驢、雞或者其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。可通過(guò)例如免疫接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物例如小鼠或大鼠，然后采用本領(lǐng)域人員已知的雜交瘤技術(shù)來(lái)產(chǎn)生單克隆抗體。單克隆抗體還可通過(guò)重組實(shí)驗(yàn)方法產(chǎn)生，其中例如自通過(guò)以MAT分子免疫接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系中分離編碼具體的單克隆抗體的核酸。這些核酸可用于重組表達(dá)系統(tǒng)或通過(guò)使用體外翻譯系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。如此產(chǎn)生的抗體可以完整抗體分子、由與其他氨基酸序列融合的完整抗體或部分抗體組成的蛋白質(zhì)、F(ab)片段、F(ab)2片段、單鏈可變片段(ScFv)或其他抗體片段的形式產(chǎn)生和使用。
本發(fā)明的藥物和診斷劑的施用途徑可通過(guò)多種途徑將本發(fā)明的藥物和診斷劑施用于患者或待免疫的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。這些方法包括口服和舌下給藥，例如使用片劑、帶涂層的片劑、膠囊、顆粒、液體溶液、待溶于液體的粉末等形式，在適當(dāng)?shù)那闆r下可使用例如帶涂層的片劑、片劑、顆粒和膠囊的組合物，如此使得藥物不會(huì)暴露于胃內(nèi)的酸性環(huán)境而到達(dá)腸道，且僅在該處釋放出藥物的成分。還可以將藥物通過(guò)局部施用于皮膚或粘膜，例如使用軟膏、噴劑、撒粉(dusting powders)、酊劑等形式，或以氣溶膠通過(guò)例如呼吸道粘膜而吸入。還可以栓劑、灌腸劑等形式施用于直腸。對(duì)于藥物的經(jīng)皮施用，還可使用一些輔助劑，例如貼劑或離子透入(iontoporesis)用具(借助于電流的經(jīng)皮施用)。其他適合用于本發(fā)明的藥物和診斷劑的施用形式是注射、輸注或以醫(yī)用泵系統(tǒng)進(jìn)行施用。注射、輸注或以泵系統(tǒng)進(jìn)行施用可以是經(jīng)靜脈、肌肉、皮下、皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、腹腔內(nèi)等等。還可以將MAT分子直接注射到淋巴結(jié)，例如腹股溝淋巴結(jié)。另一種可行的施用MAT分子的方法是體外處理患者的細(xì)胞，特別是專門(mén)進(jìn)行抗原呈遞的細(xì)胞，例如樹(shù)突細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、其他巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞，等等。作為進(jìn)一步的實(shí)例，可使用MAT分子來(lái)處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的細(xì)胞或細(xì)胞系。然后，將經(jīng)處理的細(xì)胞接下來(lái)施用于患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物。施用于患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的細(xì)胞可以是活細(xì)胞、不能再進(jìn)行分裂的滅活細(xì)胞、或已被殺死的細(xì)胞?？衫缤ㄟ^(guò)以合適的物質(zhì)或照射進(jìn)行處理，如放射性或紫外線處理，得到滅活細(xì)胞或死細(xì)胞。另一種可用于施用藥物、特別是本發(fā)明的MAT分子的方法，是以可表達(dá)MAT分子的載體穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞、人細(xì)胞或植物細(xì)胞。適當(dāng)情況下，可將如此修飾的細(xì)胞捕集(entrap)在一種基質(zhì)中，該基質(zhì)第一可固定所述細(xì)胞，第二可保護(hù)細(xì)胞抵抗患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，但在另一方面，該基質(zhì)可使得MAT分子自細(xì)胞中釋放而進(jìn)入患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物體內(nèi)。在一些情況中，還可將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞直接施用于患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物，其中細(xì)胞被適當(dāng)?shù)靥幚硪允蛊洳荒茉俜至?，例如通過(guò)照射或合適的化學(xué)制劑進(jìn)行處理。此外，可將藥物包裝在脂質(zhì)體或其他小泡例如外來(lái)體或deoxosomes中而施用，或以藥物與生物可降解聚合物的混合物的形式進(jìn)行施用，所述生物可降解聚合物可連續(xù)釋放所述藥物。此系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例例如是Atrigel系統(tǒng)(Atrix Labs，F(xiàn)ort Collins，CO，USA)。此外，還可以將其他物質(zhì)以與本發(fā)明的藥物或診斷劑給藥的相同的施用途徑或一或多種不同的施用途徑、同時(shí)或貫序施用。所述其他物質(zhì)可通過(guò)其免疫刺激特性而增強(qiáng)本發(fā)明的藥物或診斷劑的作用。此類同時(shí)或貫序施用的物質(zhì)可以是佐劑、礦物油、弗氏佐劑、免疫刺激性蛋白質(zhì)或介質(zhì)例如細(xì)胞因子、其他疫苗等等。此外，還可適當(dāng)?shù)赝瑫r(shí)或貫序施用免疫抑制物質(zhì)，以便例如降低或抑制不良的局部免疫反應(yīng)，而同時(shí)又保留了系統(tǒng)性免疫反應(yīng)。不過(guò)，也可放療采用同時(shí)或貫序施用免疫抑制物質(zhì)以預(yù)防相同性免疫反應(yīng)，而同時(shí)又保留了局部的免疫反應(yīng)。
測(cè)定MAT分子效率的可能性可采用多種體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定MAT分子調(diào)變個(gè)體的免疫應(yīng)答的效率。
合適的體外模型為，例如，得自患有變態(tài)反應(yīng)性疾病的患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。此類細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在于具體患者的變態(tài)反應(yīng)所針對(duì)的確切的抗原通常是已知的。據(jù)此有可能在對(duì)患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物進(jìn)行研究前，例如在體外對(duì)患者進(jìn)行模擬脫敏。為此，例如可用變態(tài)反應(yīng)者所針對(duì)的特定抗原或以抗原模塊中具有該特定變應(yīng)的MAT分子處理來(lái)自該變態(tài)反應(yīng)者的PBMC。由此可研究患者的原代細(xì)胞對(duì)該變應(yīng)原的各種劑型(完整MAT分子、有/沒(méi)有轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的分子、有/沒(méi)有導(dǎo)向模塊的分子，等等)的免疫學(xué)反應(yīng)。合適的測(cè)量參數(shù)例如為測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子。多種類型的T細(xì)胞參與了針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，例如1型(Th1細(xì)胞)或2型(Th2細(xì)胞)或0型(Th0細(xì)胞)T輔助細(xì)胞。在各種情況中，參與其中的T細(xì)胞的類型極大地影響了所誘導(dǎo)的針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答主要是由免疫球蛋白E(IgE)還是免疫球蛋白G(IgG)組成。自文獻(xiàn)中可知，具體來(lái)說(shuō)，IgE免疫應(yīng)答引起變態(tài)反應(yīng)和哮喘，而IgG免疫應(yīng)答通常與對(duì)抗原的耐受相關(guān)。例如通過(guò)測(cè)定細(xì)胞表面的表面抗原的表達(dá)，或通過(guò)測(cè)定信使分子(messengers)例如PBMC釋放的細(xì)胞因子，來(lái)確定以抗原處理的PBMC所激活的具體的T細(xì)胞類型?？蓽y(cè)定的Th1免疫應(yīng)答的標(biāo)記物是，例如，細(xì)胞培養(yǎng)基中的干擾素γ(INF-g)或白介素-1(IL-1)，而IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13代表Th2免疫應(yīng)答?？墒褂帽绢I(lǐng)域人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)檢測(cè)這些細(xì)胞因子，例如用ELISA測(cè)定例如來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，或用FACS分析存在于PBMC細(xì)胞表面或內(nèi)部的信使分子，或通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液或細(xì)胞裂解物的Western印跡方法。文獻(xiàn)中揭示了多種用于檢測(cè)這些以及其他信使分子的其他方法[43，44]。除了由PBMC釋放的信使分子，還可使用細(xì)胞內(nèi)或膜相關(guān)性信使分子或其他蛋白質(zhì)來(lái)對(duì)PBMC中的T細(xì)胞進(jìn)行免疫學(xué)表征。多種適合用于此類研究的抗體可購(gòu)自例如Pharmingen，San Diego，CA，USA、Beckmann Coulter Inc.，F(xiàn)ullerton，CA，USA、Santa CruzBiotechnology Inc.，Santa Cruz，CA，USA，等等。相應(yīng)的研究不僅可使用來(lái)自患者的原代細(xì)胞，也可使用來(lái)自適當(dāng)處理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的細(xì)胞，例如小鼠、大鼠、豚鼠等等。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究的優(yōu)勢(shì)在于不僅可對(duì)這些動(dòng)物的細(xì)胞進(jìn)行體外研究，而且可在以內(nèi)對(duì)完整生物體的免疫系統(tǒng)進(jìn)行研究。因此還可研究MAT分子以及相應(yīng)的對(duì)照組在劑量、組成以及施用形式上的效果，所述對(duì)照組例如為僅由抗原組成的分子，或僅由轉(zhuǎn)運(yùn)模塊和抗原模塊組成的分子，或僅由導(dǎo)向模塊和抗原模塊組成的分子。還可研究，如果采用常規(guī)方式將MAT分子或相應(yīng)的對(duì)照組直接注射至皮下或者例如直接注射至淋巴結(jié)，那么免疫應(yīng)答的性質(zhì)是否會(huì)有不同。還可研究非創(chuàng)傷性施用方式例如口服或舌下施用MAT分子及相應(yīng)的對(duì)照組的效果。可在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中進(jìn)行的另一個(gè)研究是，在施用MAT分子或相應(yīng)的對(duì)照組時(shí)，是否同時(shí)施用佐劑，例如礦物油、分枝桿菌提取物或弗氏佐劑。還可探知進(jìn)行免疫接種的最有效的或最佳可耐受的時(shí)間表，以及免疫接種的劑量和次數(shù)。還可測(cè)試不同的抗原模塊的效率。以這種方式還可探知將來(lái)用于人類患者的最佳免疫接種策略。
除了信使分子、細(xì)胞內(nèi)蛋白和表面蛋白，免疫球蛋白同樣特別適合用于表征體外培養(yǎng)的細(xì)胞的免疫反應(yīng)或用于表征實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或臨床研究中的患者的免疫反應(yīng)。可例如采用ELISA來(lái)研究因施用變應(yīng)原或抗原所釋放的抗體是IgE型的還是IgG型的，并進(jìn)行定量。這一數(shù)據(jù)可說(shuō)明參與其中的免疫反應(yīng)的類型。
由于由T細(xì)胞釋放的信使分子還例如可影響例如存在于PBMC制備物中的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的增殖，因此也可通過(guò)測(cè)定細(xì)胞例如PBMC的增殖情況來(lái)表征免疫應(yīng)答。為此，可進(jìn)行例如體外研究，例如以氚標(biāo)記的胸苷進(jìn)行DNA摻入研究以檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。眾多本領(lǐng)域人員已知的測(cè)定細(xì)胞增殖的其他方法同樣可用于這些研究中。還可例如以FACS研究來(lái)自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或參與研究的人類患者的血樣，在體內(nèi)測(cè)定免疫系統(tǒng)的特定細(xì)胞的增殖?？蛇x擇合適的抗體來(lái)定量例如血液中的不同細(xì)胞類型的亞群?？梢赃@種方式研究MAT分子或相應(yīng)的對(duì)照組的治療效果。
實(shí)施例以下例舉的實(shí)施方式意在舉例說(shuō)明本發(fā)明而無(wú)意于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1克隆用于MAT分子的表達(dá)載體以下所述的所有分子生物學(xué)方法均按照本領(lǐng)域人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[43]。使用載體pQE-30(Qiagen，Hilden，Germany)來(lái)克隆用于表達(dá)MAT分子(模塊化抗原轉(zhuǎn)運(yùn)分子)的載體。
第一步，將編碼轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的核酸序列引入細(xì)菌表達(dá)載體。以合成的寡核苷酸的形式將編碼HIV Tat的氨基酸GYGRKKRRQRRR的DNA序列引入載體pQE-30。除了HIV Tat序列，該寡核苷酸在5’端包含一個(gè)限制性內(nèi)切酶Bgl II的識(shí)別序列且在3’端包含BamH I、Spe I、Pst I和Hind III的識(shí)別序列。隨后以Bgl II和Hind III酶切合成制備的HIV Tat序列，并以限制性核酸內(nèi)切酶Bam HI和Hind III酶切載體pQE-30。然后使用NucleoSpin提取2合1(Macherey-Nagel，Oensingen，Switzerland)分離Tat序列和載體pQE-30，用連接酶連接在一起，通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌，并在含有氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)皿中鋪板。選擇一些所得的菌落，自其分離載體DNA。采用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)如此得到的載體進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)核酸序列。包含具有正確序列的載體的細(xì)菌克隆被用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中。第二步，將導(dǎo)向模塊引入載體。為此，使用本領(lǐng)域人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法自人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分離mRNA，并以逆轉(zhuǎn)錄酶PCR轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA(cDNA)。通過(guò)使用如此得到的cDNA并使用不同的PCR引物得到編碼MHC II恒定鏈1-110位氨基酸的人MHC II分子恒定鏈的核酸序列，其中所述不同的PCR引物在PCR產(chǎn)物5’端引入Bgl II識(shí)別序列并在PCR產(chǎn)物3’端引入Spe I、Bam HI、Pst I和Hind III識(shí)別序列。按照第一步，將MHC II的恒定鏈的序列區(qū)引入到已經(jīng)被引入pQE-30載體的Tat序列的3’端后方。測(cè)序以確認(rèn)所得載體的序列。采用本領(lǐng)域人員已知的定點(diǎn)誘變的標(biāo)準(zhǔn)方法以胸腺嘧啶取代292位的胞嘧啶，并以腺嘌呤取代318位的鳥(niǎo)嘌呤。這兩個(gè)點(diǎn)突變并不改變相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，而僅僅是去除了不希望的限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列。第三步，最后，將抗原模塊引入載體。通過(guò)使用其中已經(jīng)引入了編碼特定抗原的編碼序列的pQE-30載體以及使用PCR引物得到了各種抗原的核酸序列，其中所述PCR引物在PCR產(chǎn)物的5’端引入Spe I和/或BamH I識(shí)別序列以及在PCR產(chǎn)物的3’端引入終止密碼子和Pst I或Hind III識(shí)別序列。其中，得到的編碼抗原Der p 1(基于成熟Der p 1蛋白質(zhì)的氨基酸序列)的1-222位氨基酸的核酸序列作為抗原模塊。按照前兩個(gè)步驟，將抗原Der p 1的序列區(qū)引入到已經(jīng)被引入pQE-30載體中的MHC II恒定鏈序列的3’端后方。測(cè)序以便確認(rèn)所得載體的正確序列。在以后的實(shí)驗(yàn)中，使用QIAfilter plasmid midi試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，分離這些表達(dá)載體。實(shí)施例2獲得抗原Bet v 1、Asp f 1、Asp f 6和Der p 1的編碼序列以各種本領(lǐng)域人員已知的方法分離抗原模塊中的各種抗原的編碼序列[43]。通過(guò)合成的寡核苷酸得到Bet v 1序列，在以前的研究中已經(jīng)獲得了Asp f 1和Asp f 6序列，并自這些研究所用的載體將其分離[45，46]，并隨后引入pQE-30載體，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶PCR，使用來(lái)自屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的mRNA分離Der p 1序列。
實(shí)施例3在細(xì)菌中表達(dá)和分離MAT分子根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行MAT分子的表達(dá)和分離(Qiagen，Hilden，Germany)。具體來(lái)說(shuō)，在20ml培養(yǎng)基(2×YT培養(yǎng)基，100μg/ml氨卡青霉素，25μg/ml卡那霉素)中建立以特定的表達(dá)載體(pQE-30-MAT分子)轉(zhuǎn)染的E.coli M15細(xì)菌的預(yù)培養(yǎng)物，置于細(xì)菌搖床上，37℃過(guò)夜。然后將預(yù)培養(yǎng)物培養(yǎng)于2000ml培養(yǎng)基(2×YT培養(yǎng)基，100μg/ml氨卡青霉素，25μg/ml卡那霉素)中，置于細(xì)菌搖床上，在37℃，直至其在600nm波長(zhǎng)處的光密度達(dá)到0.6。添加IPTG得到終濃度為1mM，然后重新進(jìn)入4至15h的生長(zhǎng)期，離心2000g×20分鐘自培養(yǎng)基中分離細(xì)菌，將細(xì)菌沉淀物置于-20℃儲(chǔ)存。通過(guò)凍融細(xì)菌沉淀物制備細(xì)胞裂解物，重懸于8M尿素溶液中(每克細(xì)菌沉淀物濕重5ml尿素溶液)，小心攪拌1至2h，隨后離心48000g×30分鐘。將清澈的上清液用于MAT分子的鎳螯合預(yù)層析。分離MAT分子使用了49或18ml柱(Bio-RadLaboratories Inc.，Hercules，CA，USA)，柱中注有5至10ml的Ni-NTASuperflow基質(zhì)(Qiagen)，和來(lái)自Bio-Rad(Econo泵和UV監(jiān)視器)的層析系統(tǒng)。層析柱先以5個(gè)柱體積的緩沖液A(100mM NaH2PO4，10mMTris/HCl，6M鹽酸胍，以HCl將pH調(diào)整至8.0)沖洗，然后將細(xì)菌裂解物加至柱上，流速為1.4ml/min。然后將5至10個(gè)柱體積的每種緩沖液A和緩沖液B(緩沖液B100mM NaH2PO4，10mM Tris/HCl，8M尿素，pH8.0)抽吸到柱上，流速為1.4ml/min，在波長(zhǎng)280nm(A280)處觀察到流通(flow-through)的吸收。一旦流通在穩(wěn)定A280處為大約0.01以下，即以5至10個(gè)柱體積的緩沖液C(100mM NaH2PO4，10mM Tris/HCl，8M尿素，以HCl將pH調(diào)整至6.3)進(jìn)行沖洗直至最終達(dá)到穩(wěn)定A280為大約0.01以下。然后以緩沖液E(100mM NaH2PO4，10mM Tris/HCl，8M尿素，以HCl將pH調(diào)整至4.5)洗脫MAT分子并收集。
實(shí)施例4以SDS聚丙稀酰胺凝膠、考馬斯染色和抗His Western印跡檢測(cè)MAT分子SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳緩沖液、NuPAGE凝膠和Xcell SureLockTM電泳槽來(lái)自Invitrogen(Invitrogen Life Technologies，Breda，The Netherlands)，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行電泳。每道5或10μg的分離的MAT分子進(jìn)行電泳分離，凝膠為12％NuPAGENovex bis-Tris凝膠(Invitrogen)，恒壓200V，使用1×NuPAGESDS樣品緩沖液在還原條件下電泳35至50分鐘。電泳緩沖液為MES或MOPS緩沖液(MES緩沖液50mM MES(碼啉乙磺酸(morpholinoethanesulfonic acid))，50mM Tris/HCl，3.5mM SDS，1mMEDTA，pH 7.3，MOPS緩沖液50mM MOPS(3-(N-碼啉基)-2-羥基丙磺酸(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid))，50mM Tris/HCl，3.5mM SDS，1mM EDTA，pH 7.7)。
考馬斯蘭染色將凝膠置于染色溶液(200ml甲醇，50ml乙酸，250ml水，0.5g考馬斯蘭R-250)中染色1h，然后數(shù)次更換脫色溶液(200ml甲醇，50ml乙酸，250ml水)進(jìn)行脫色，直至凝膠的背景變得透明。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用Xcell IITM印跡裝置(Invitrogen)將蛋白質(zhì)自NuPAGE凝膠電轉(zhuǎn)至印跡膜上。使用含10或20％甲醇的1×NuPAGE轉(zhuǎn)移緩沖液，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明安裝印跡裝置。使用PVDF膜作為印跡膜，恒壓30V電轉(zhuǎn)1h。
免疫學(xué)檢測(cè)MAT分子根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用抗His抗體免疫學(xué)檢測(cè)MAT分子(抗RGS(His)4抗體，Qiagen，Hilden，Germany)。所有實(shí)驗(yàn)步驟均在室溫進(jìn)行。PVDF膜先進(jìn)行干燥然后直接與抗His抗體(Qiagen)孵育1小時(shí)(無(wú)需預(yù)先封閉游離蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn))，抗體濃度為1∶1000至1∶2000，溶于含3％BSA(牛血清白蛋白)的TBS(50mM Tris/HCl，150mM NaCl，pH7.5)。然后將膜以TBS，0.05％Tween 20，0.2％Triton X-100洗滌3次，每次10分鐘，然后以不添加其他成分的TBS洗滌1次。第二抗體為抗小鼠Ig-HRP綴合物(Amersham，Buckinghamshire，England)，濃度為1∶10000至1∶20000，溶于含10％奶粉的TBS，孵育1小時(shí)。最后，將印跡膜以TBS，0.05％Tween 20，0.2％Triton X-100洗滌4次，每次10分鐘。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，以ECLTM系統(tǒng)(Amersham)檢測(cè)綴合物。使用自顯影膠片檢測(cè)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。
實(shí)施例5將MAT分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞系和原代人類細(xì)胞中采用本領(lǐng)域人員已知的使用Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的密度梯度離心的標(biāo)準(zhǔn)方法，自來(lái)自志愿者的新鮮的、肝素抗凝血中得到PBMC(外周血單個(gè)核細(xì)胞)。Jurkat細(xì)胞系來(lái)自ATCC(American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA)。將細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，其中添加以下成分10％胎牛血清，200單位/ml青霉素，200μg/ml鏈霉素，MEM維生素，MEM非必需氨基酸，1mM丙酮酸鈉，2mM L-谷氨酰胺和0.001％2-巰基乙醇。為測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)，將細(xì)胞重懸于含有添加成分的RPMI培養(yǎng)基中，濃度為1×106/ml。將細(xì)胞按照附圖中相應(yīng)的說(shuō)明與濃度為0.01至5mM的重組分子或MAT分子在4、22或37℃孵育5分鐘。離心細(xì)胞，然后將細(xì)胞沉淀物與40μl裂解緩沖液(8M尿素，100mM磷酸鈉，10mM Tris/HCl，100mM氯化銨)在室溫孵育5分鐘。離心去除不溶的細(xì)胞組分(15000g，15分鐘)，然后按照實(shí)施例4所述以Western印跡對(duì)澄清的裂解物進(jìn)行分析。使用抗His抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)。
實(shí)施例6刺激來(lái)自患有變態(tài)反應(yīng)的患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)以下用于刺激PBMC以及用于確定經(jīng)刺激的PBMC的增殖的方法在文獻(xiàn)中均有記載[44]。通過(guò)使用Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的密度梯度離心方法，自來(lái)自志愿者的新鮮的、肝素抗凝血中得到PBMC。志愿者是患有變態(tài)反應(yīng)的患者，所述變態(tài)反應(yīng)針對(duì)的是病人個(gè)體已知的變應(yīng)原?；颊咭婪▽?duì)在其血液樣品上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)這一事實(shí)獲得知情并同意參與這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。獲得的PBMC被加入到RPMI培養(yǎng)基中，其中添加了實(shí)施例5所述的添加成分，并在各例中添加各特定的患者對(duì)其具有變態(tài)反應(yīng)的重組抗原，所述重組抗原的濃度為0.01至100nM。在各例中，研究了未修飾的抗原和偶聯(lián)了轉(zhuǎn)運(yùn)模塊和導(dǎo)向模塊的抗原(MAT分子)。在一些實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)方法中僅偶聯(lián)了轉(zhuǎn)運(yùn)模塊和抗原模塊，而沒(méi)有偶聯(lián)導(dǎo)向模塊(圖7A)。在一些實(shí)驗(yàn)中還使用了對(duì)照組，對(duì)照組僅為轉(zhuǎn)運(yùn)模塊或是無(wú)抗原模塊而是僅由轉(zhuǎn)運(yùn)模塊和導(dǎo)向模塊組成的構(gòu)建體。孵育5天后，在培養(yǎng)基中加入10μCi/ml氚標(biāo)記的胸苷。測(cè)定PBMC中的胸苷摻入情況，將其作為被處理的細(xì)胞的抗原呈遞效率及與此相關(guān)的增殖情況的指標(biāo)。為此，在8到10小時(shí)后，將具有放射性的細(xì)胞培養(yǎng)基去除，洗滌細(xì)胞，并通過(guò)測(cè)量放射性來(lái)確定放射性胸苷摻入的量。為此，使用了來(lái)自Wallac ADL AG，Hünenberg，Switzerland的1205 Betaplate液體閃爍計(jì)數(shù)器。作為對(duì)照組，未經(jīng)抗原刺激的細(xì)胞同樣與氚標(biāo)記的胸苷進(jìn)行孵育，然后以同樣方法進(jìn)行分析。得到的結(jié)果是放射性胸苷摻入的測(cè)定值，作為增殖的指標(biāo)且因此作為抗原呈遞效率的指標(biāo)。測(cè)得的胸苷摻入值越高說(shuō)明抗原呈遞越有效。由于在各個(gè)實(shí)驗(yàn)中的抗原濃度為0.01nM至100nM，因此還可以確定最大抗原呈遞出現(xiàn)的時(shí)的抗原濃度。濃度越低說(shuō)明抗原作為免疫應(yīng)答的調(diào)變劑越為有效。作為進(jìn)一步的對(duì)照組，以均為0.5μg/ml的抗CD3抗體和抗CD28抗體處理細(xì)胞，該處理代表一種非常強(qiáng)的增殖刺激。由此可以確定各個(gè)實(shí)驗(yàn)中因PBMC增殖引起的胸苷摻入的最大可能。
實(shí)施例7MAT分子刺激引起的細(xì)胞因子釋放如實(shí)施例5所述自變態(tài)反應(yīng)患者的血液分離PBMC并按106/ml以培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。將每份100μl的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，并以0.01至1000nM的分離的抗原處理5天。這次不更換細(xì)胞培養(yǎng)基。將96孔板離心后，取上清液儲(chǔ)存于-20℃直至分析其中的細(xì)胞因子。以抗原處理各例中的PBMC，所述抗原是自其分離PBMC的患者對(duì)其具有變態(tài)反應(yīng)的抗原。研究了如此獲得的上清液中的以下細(xì)胞因子干擾素γ(INFg)、白介素-10(IL-10)和白介素-5(IL-5)。圖8A和8B給出的結(jié)果來(lái)自對(duì)Bet v 1具有變態(tài)反應(yīng)的患者的PBMC。通過(guò)本領(lǐng)域人員已知的方法，使用來(lái)自R & D Systems Inc.，Minneapolis，USA.的DuoSetELISADevelopment Systems進(jìn)行INFg、IL-10和IL-5的免疫分析(ELISA＝酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))。
與獲得用于細(xì)胞因子測(cè)定的上清液相平行，以來(lái)自相同的供者的PBMC，按照實(shí)施例6所述進(jìn)行刺激實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖分析的結(jié)果在圖8A和8B中給出。
實(shí)施例8未修飾抗原和MAT分子抗原模塊的抗原的體內(nèi)效果免疫接種小鼠為了測(cè)試MAT分子的效率，采用本領(lǐng)域人員已知的方式，以重組MAT分子連同作為佐劑的氧化鋁免疫CBA/2小鼠3次，每次間隔2周。如實(shí)施例3所述產(chǎn)生重組MAT分子。以3種不同的途徑進(jìn)行免疫。對(duì)于皮下、腹腔內(nèi)和淋巴結(jié)內(nèi)注射抗原或?qū)φ战M等各種情況均進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于淋巴結(jié)內(nèi)注射，以外科手術(shù)暴露組織以便進(jìn)行直接注射。使用的MAT分子是一種蛋白質(zhì)，其組成為HIV Tat序列作為轉(zhuǎn)運(yùn)模塊，人恒定鏈作為導(dǎo)向模塊，和PLA2(來(lái)自蜂毒的磷脂酶A2)肽作為抗原模塊(命名為trans-target-PLA2)。將PLA2(命名為PLA2)用作對(duì)照，并將0.9％鹽溶液(命名為對(duì)照)用作另一種對(duì)照。用以下量的MAT分子或相應(yīng)量的對(duì)照蛋白質(zhì)或?qū)φ站彌_液連同作為佐劑的氧化鋁進(jìn)行免疫，淋巴結(jié)內(nèi)免疫使用0.1μg，皮下和腹腔內(nèi)免疫使用10μg。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組免疫3只動(dòng)物，故對(duì)于每種情況來(lái)說(shuō)，每組實(shí)驗(yàn)共使用9只動(dòng)物。進(jìn)行了3個(gè)系列的實(shí)驗(yàn)，且在每個(gè)系列的實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了不同的免疫途徑(皮下、腹腔內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi))。在首次免疫后以及其后2、4和6周自每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的尾靜脈取血。血液在室溫凝結(jié)，然后離心得到血清，置于-20℃直至進(jìn)行分析。使用如此制備的血清來(lái)測(cè)定PLA2特異性IgG和IgE的滴度。
測(cè)定小鼠血清中PLA2特異性IgG2a的滴度為了測(cè)定PLA2特異性IgG2a的滴度，將微滴定板(96孔)以100μl/孔的如下溶液在4℃包被過(guò)夜，所述溶液為5μg/ml PLA2(Sigma-Aldrich，Buchs DG，Switzerland)溶液，溶于碳酸鹽緩沖液。以磷酸緩沖的氯化鈉溶液(PBS)，0.05％Tween洗滌2次后，與封閉緩沖液(PBS，2.5％脫脂奶粉)進(jìn)行孵育以封閉游離蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，封閉緩沖液為200μl/孔，在室溫孵育1至2小時(shí)。重復(fù)洗滌2次，然后將按照1∶2連續(xù)稀釋于封閉緩沖液(50μl/孔)中的待測(cè)血清樣品(1∶2至1∶64稀釋)在室溫孵育3小時(shí)或在4℃孵育過(guò)夜。以無(wú)血清的孵育或與來(lái)自未處理的動(dòng)物的血清進(jìn)行孵育作為陰性對(duì)照。然后洗滌5次，并與按照1∶500稀釋于封閉緩沖液的生物素標(biāo)記的抗小鼠IgG2a(PharMingen GmbH，Hamburg，Germany)在室溫(100μl/孔)孵育2小時(shí)，然后再洗滌5次。最后，與100μl/孔的按照1∶1000稀釋于封閉緩沖液中的辣根過(guò)氧化物酶在室溫孵育1小時(shí)，然后洗滌6次。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，加入100μl/孔的ABTS溶液(2，2’-azinodi-(3-ethylbenzothiazolinesulfonic acid)溶于ABTS緩沖液)和0.1％(v/v)的30％過(guò)氧化氫溶液，產(chǎn)生生色反應(yīng)。大約30分鐘后，在405nm波長(zhǎng)處(參照濾光片595nm)測(cè)定吸光度。圖9給出了這些測(cè)試的結(jié)果。
測(cè)定小鼠血清中的PLA2特異性IgE滴度按照PLA2IgG2a ELISA的方案進(jìn)行PLA2IgE ELISA。與上述方案不同之處在于微滴定板以5μg/ml的抗小鼠IgE抗體包被。在進(jìn)行血清樣品孵育并洗滌滴定板后，與按照1∶333稀釋的生物素標(biāo)記的PLA2(Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，USA)進(jìn)行孵育。與ABTS發(fā)生的生色反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)。圖9給出了這些測(cè)試的結(jié)果。


圖1MAT分子的理論結(jié)構(gòu)圖1圖解性地舉例說(shuō)明如何構(gòu)建本發(fā)明的MAT分子的各個(gè)模塊。其中“Trans”代表轉(zhuǎn)運(yùn)模塊，“Target”代表導(dǎo)向模塊，“AG”代表抗原模塊，“Tag”蛋白質(zhì)標(biāo)記模塊，而破折號(hào)(-)代表連接模塊(linkermodule)。連接模塊可將其他模塊通過(guò)共價(jià)鍵和/或非共價(jià)鍵連接在一起。圖1A給出了各種模塊的線性排列的多種實(shí)例。圖1B給出了分枝狀MAT分子排列的多種實(shí)例，其中包括樹(shù)形結(jié)構(gòu)，而圖1C給出了環(huán)狀MAT分子排列的一些實(shí)例，可以將環(huán)狀排列與線性和/或分枝狀排列相結(jié)合。一般來(lái)說(shuō)，所有給出的排列均僅是一些實(shí)例，旨在舉例說(shuō)明可以存在非常多的排列形式這一事實(shí)。這些圖解性地給出的MAT分子實(shí)例決不能被理解為是對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍的限制。
圖2融合蛋白的表達(dá)、純化和檢測(cè)在E.coli中表達(dá)多種由標(biāo)記模塊(His6tag)、轉(zhuǎn)運(yùn)模塊(Tat序列)、導(dǎo)向模塊(人MHC II的恒定鏈)和抗原模塊(Asp f1＝煙曲霉(Aspergillusfumigatus)抗原1)組成的MAT分子，并在變性條件下采用固定金屬離子親和層析進(jìn)行分離。根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)商(Qiagen，Hilden，Germany)提供的說(shuō)明進(jìn)行這些步驟[47，48]。將10μg或5μg分離蛋白質(zhì)的樣品以SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，然后以考馬斯蘭染色(圖2A)或以Western印跡進(jìn)行分析，使用了識(shí)別標(biāo)記模塊的抗體(圖2B)。箭頭標(biāo)出的是表達(dá)的蛋白質(zhì)的位置。
圖3蛋白質(zhì)和MAT分子的溫度非依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)將原代的人外周單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)與濃度為1μM的特定的蛋白質(zhì)或MAT分子在4、22或37℃孵育5分鐘，洗滌，加入含有尿素的樣品緩沖液中并裂解。然后將裂解物通過(guò)SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，并電轉(zhuǎn)至PVDF膜，然后以特異性抗體(抗RGS(His)4抗體)檢測(cè)蛋白質(zhì)或MAT分子。箭頭顯示了蛋白質(zhì)或MAT分子的位置。在所有的溫度下，細(xì)胞的裂解物中均可檢測(cè)到融合蛋白，說(shuō)明已經(jīng)成功轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部。
圖4將MAT分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞系和原代細(xì)胞中圖4給出的結(jié)果基本上是以與圖3的實(shí)驗(yàn)相同的方法得到的，但有兩個(gè)不同之處圖4A顯示MAT分子的轉(zhuǎn)運(yùn)在原代人細(xì)胞(PBMC)和人腫瘤細(xì)胞系(Jurkat細(xì)胞)中均是成功的。箭頭顯示的是在Western印跡中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)或MAT分子的位置。此外，圖4A和4B顯示各種抗原模塊(Asp f 1＝煙曲霉變應(yīng)原，Der p 1＝屋塵螨變應(yīng)原，Bet v 1＝樺樹(shù)花粉變應(yīng)原)可通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)而進(jìn)入原代的人PBMC細(xì)胞。
圖5MAT分子轉(zhuǎn)運(yùn)的劑量動(dòng)力學(xué)圖5給出的結(jié)果基本上是以與圖3的實(shí)驗(yàn)相同的方法得到的，但其中使用了3或4種不同濃度的蛋白質(zhì)或MAT分子(0.01mM，0.1mM，1mM和5mM)。可以看出轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)具有明顯的劑量依賴性。隨著添加的MAT分子的濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)部檢測(cè)到了更多的特定的分子。箭頭標(biāo)出的是相應(yīng)分子的位置。
圖6MAT分子的多種功能性結(jié)構(gòu)圖6給出的結(jié)果基本上是以與圖3的實(shí)驗(yàn)相同的方法得到的，但其中研究了轉(zhuǎn)運(yùn)模塊(Tat序列)和抗原模塊(Asp f 1＝煙曲霉變應(yīng)原)的三種不同排列。圖6A的箭頭指出的是Western印跡中檢測(cè)到的融合蛋白的位置。圖6B給出了三種不同融合蛋白的結(jié)構(gòu)。研究了具有N端、反向C端和C端轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的融合蛋白。所有三種融合蛋白均通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)而成功地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)部。
圖7抗原/MAT分子介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)患者的PBMC的體外細(xì)胞增殖圖7描述了在體外加入了MAT分子的來(lái)自變態(tài)反應(yīng)患者的PBMC(外周血單個(gè)核細(xì)胞)上進(jìn)行的研究。MAT分子包含作為抗原模塊的特定變應(yīng)原，該變態(tài)反應(yīng)患者對(duì)該變應(yīng)原具有變態(tài)反應(yīng)。添加MAT分子使得變態(tài)反應(yīng)患者的抗原呈遞細(xì)胞的抗原呈遞更加有效，刺激了PBMC的生長(zhǎng)。由此引起的細(xì)胞增殖可通過(guò)放射性標(biāo)記的DNA構(gòu)件(胸苷)的摻入而定量(y軸)。x軸指出了用于特定的細(xì)胞刺激測(cè)試的MAT分子的濃度，或者是抗原分子的濃度，以nM為單位。當(dāng)使用相對(duì)低濃度的MAT分子時(shí)，以所有經(jīng)研究的抗原模塊(作為MAT分子的部分)進(jìn)行研究的所有患者均出現(xiàn)細(xì)胞增殖(＝免疫刺激＝胸苷摻入增加＝放射性增加)。作為對(duì)照，在每種情況中對(duì)相同的PBMC僅以不含MAT分子或抗原的水進(jìn)行處理(＝在圖例中為對(duì)照)。此外，測(cè)定以強(qiáng)生長(zhǎng)刺激(抗CD3和抗CD28抗體，均為0.5μg/ml)處理5天的細(xì)胞的胸苷摻入情況，將其作為各個(gè)實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)這種刺激而得到的生長(zhǎng)可用于核對(duì)所制備的PBMC就其增殖能力而言的質(zhì)量。圖7A的實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)值是77864±5347cpm，圖7B的實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)值是100374±11678cpm，而圖7C和D的實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)值是112205±5958cpm。
圖7A至7G顯示，對(duì)于7種測(cè)試的抗原，將抗原摻入MAT分子的抗原模塊，既便在相對(duì)低的濃度，也引起變態(tài)反應(yīng)患者的PBMC出現(xiàn)增殖。測(cè)試的抗原為Der p 1(屋塵螨變應(yīng)原；圖7A)，Bet v 2(樺樹(shù)花粉變應(yīng)原，圖7B)，Asp f 1(煙曲霉變應(yīng)原1，圖7C)，Asp f 6(煙曲霉變應(yīng)原6，圖7D)，Asp f 3(煙曲霉變應(yīng)原3，圖7E)，PLA2(來(lái)自蜂毒的磷脂酶A2變應(yīng)原，圖7F)和Fel d 1(家貓(Felis domesticus)，圖7G)。圖7H顯示，除了抗原Bet v 1，當(dāng)將抗原模塊中具有Bet v 1的MAT分子用于對(duì)Bet v 1具有變態(tài)反應(yīng)的4個(gè)不同患者(I.至IV.)時(shí)，在低于以Bet v 1作為抗原的濃度下，在所有4例中，每個(gè)患者的PBMC均出現(xiàn)增殖。
圖8抗原/MAT分子介導(dǎo)的來(lái)自變態(tài)反應(yīng)患者的PBMC在體外分泌細(xì)胞因子圖8A和8B顯示了兩個(gè)無(wú)關(guān)的對(duì)Bet v 1有變態(tài)反應(yīng)的患者的PBMC經(jīng)體外培養(yǎng)和Bet v 1抗原(Bet v 1單獨(dú)或作為MAT分子的模塊)刺激后，顯示出特征性的細(xì)胞因子分泌模式。I.顯示了各種情況下細(xì)胞增殖的結(jié)果(如圖7相似)，II.顯示了細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的干擾素γ(INFg)水平，III.顯示了細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的白介素-10(IL-10)的值，以及IV.顯示了細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的白介素-5(IL-5)水平。由于PBMC刺激具有脫敏作用，甚至以較低的抗原劑量也可以引起PBMC增殖和INFg釋放的增加。此外，IL-5的產(chǎn)生應(yīng)該降低。這種細(xì)胞因子分泌模式代表了變態(tài)反應(yīng)患者免疫細(xì)胞的脫敏(Th1免疫應(yīng)答而不是Th2免疫應(yīng)答)。IL-10濃度的增加解釋了為何當(dāng)抗原劑量更高時(shí)細(xì)胞增殖灰降低(圖I.)。兩例均出現(xiàn)了這種細(xì)胞因子分泌模式(圖8A和圖8B)。
圖9抗原/MAT分子在小鼠中介導(dǎo)的體內(nèi)免疫應(yīng)答分別以分離的PLA2、抗原模塊中具有PLA2的MAT分子、或?qū)φ站彌_液免疫CBA/2小鼠3次，間隔為2周，然后測(cè)定PLA2特異性血清的IgG2a和IgE抗體滴度。如果存在脫敏，則應(yīng)該僅出現(xiàn)PLA2特異性IgG抗體，而不出現(xiàn)PLA2特異性IgE抗體。IgE抗體負(fù)責(zé)變態(tài)反應(yīng)。研究了3種不同的抗原免疫途徑，皮下、腹腔內(nèi)和淋巴結(jié)內(nèi)。發(fā)現(xiàn)所有3種以PLA2進(jìn)行免疫的免疫途徑均引起明確的IgE免疫應(yīng)答(變態(tài)反應(yīng))(圖9，左側(cè))。但是以包含PLA2作為抗原模塊的MAT分子進(jìn)行免疫未出現(xiàn)IgE免疫應(yīng)答(無(wú)變態(tài)反應(yīng))。相反，以PLA2和以包含具有PLA2的抗原模塊的MAT分子進(jìn)行免疫均引起所需的IgG免疫應(yīng)答，后者不引起變態(tài)反應(yīng)。
本申請(qǐng)的所有實(shí)施例和列舉均旨在解釋本發(fā)明的主題而不是要限制權(quán)利要求書(shū)。具體來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)運(yùn)模塊、導(dǎo)向模塊、抗原模塊、間隔模塊以及標(biāo)記模塊的實(shí)例應(yīng)該被理解為僅僅是舉例，而非MAT分子的所有組分的窮舉。本發(fā)明的基本構(gòu)思并不是一種由具體的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊、具體的導(dǎo)向模塊和具體的抗原模塊組成的具體的組合。相反，本發(fā)明的基本構(gòu)思是采用一種至少三種模塊的組合以產(chǎn)生一種用于免疫的MAT分子。因此，各個(gè)模塊所具體使用的實(shí)例對(duì)于本發(fā)明的構(gòu)思而言是不重要的，因此也可將其他的實(shí)例，包括那些現(xiàn)在還不知道的實(shí)例，用作本發(fā)明的相應(yīng)的模塊。
如果本申請(qǐng)中的某一術(shù)語(yǔ)沒(méi)有被清楚地定義，或不是具體領(lǐng)域的本領(lǐng)域人員已知的，或某一術(shù)語(yǔ)無(wú)法在上下文中找到清楚的定義，那么以下標(biāo)準(zhǔn)著作中所提到的對(duì)相應(yīng)的術(shù)語(yǔ)的解釋可適用于上述情況。如果某一術(shù)語(yǔ)在以下列出的一部以上的著作中具有不同的定義，那么下列提及第一部著作的定義可適用于上述情況。為此，引用了以下出版物·The Merck Mannual[49]·Molecular Cloning-A Laboratory Manual[43]·Current Protocols in Immunology[44]·Current Protocols in Protein Science[50]·Current Protocols in Pharmacology[51]·Current Protocols in Cell Biology[52]
參考文獻(xiàn)1.Pieters，J.2000.MHC class II-restricted antigen processing andpresentation.Adv Immunol.75159-208.
2.Marks，M.S.，P.A.Roche，E.van Donselaar，L.Woodruff，P.J.Peters，and J.S.Bonifacino.1995.A Iysosomal targeting signal in thecytoplasmic tail of the beta chain dlrects HLA-DM to MHC class IIcompartments.J Cell Biol.131351-69.
3.Karlsson，K.，and S.R.Carlsson.1998.Sorting of Iysosomalmembrane glycoproteins lamp-1 and lamp-2 into vesicles distinct from mannose6-phosphate receptor/gamma-adaptin vesicles at the trans-Golgl network.J BiolChem.27318966-73.
4.Obermüller，S.，C.Kiecke，K.von Figura，and S.Honing.2002.Thetyrosine motifs of Lamp 1 and LAP determine their direct and indirect targettingto lysosomes.J Cell Sci.115185-94.
5.Chervonsky，A.V.，L.Gordon，and A.J.Sant.1994.A segment ofthe MHC class II beta chain plays a critical role in targeting class II molecules tothe endocytic pathway.Int Immunol.6973-82.
6.Frankel，A.，C.Pabo，J.G.Barsoum，S.E.Fawell，and R.B.Pepinsky.1995.Tat-derived transport polypeptides and fusions proteins.US.Patent 5,804,604.
7.Prochiantz，A.2000.Messenger proteinshomeoproteins，TAT andothers.Curr Opin Cell Biol.12400-6.
8.Futaki，S.，T.Suzuki，W.Ohashi，T.Yagami，S.Tanaka，K.Ueda，and Y.Sugiura.2001.Arginine-rich peptides.An abundant source ofmembrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellularprotein delivery.JBiol Chem，2765836-40.
9.Schwartz，J.J.，and S.Zh ang.2000.Peptide-mediated cellulardelivery.Curr Opln Mol Ther.2162-7.
10.Wender，P.A.，D.J.Mitchell，K.Pattabiraman，E.T.Pelkey，L.Steinman，and J.B.Rothbard.2000.The design，synthesis，and evaluation ofmolecules that enable or enhance cellular uptakepeptoid moleculartransporters.Proc Natl Acad SciUS A.9713003-8.
11.Dorange，F(xiàn).，S.EI Mehdaoui，C.Pichon，P.Coursaget，and J.F.Vautherot.2000.Marek′s disease virus (MDV)homologues of herpes simplexvirus type 1 UL 49(VP22)and UL48(VP16)geneshigh-level expression andcharacterization of MDV-1VP22and VP16.J Gen Virol.812219-30，12.Banerjee-Basu，S.，D.W.Sink，and A.D.Baxevanis.2001.TheHomeodomain Resourcesequences，structures，DNA binding sites and genomicinformation.Nucleic Acids Res.29291-3.
13.Park，J.，J.Ryu，K.A.Kim，H.J.Lee，J.H.Bahn，K.Han，E.Y.Choi，K.S.Lee，H.Y.Kwon，and S.Y.Choi.2002.Mutational analysis of a humanimmunodeficiency virus type 1 Tat protein transduction domain which isrequired for delivery of an exogenous protein into mammalian cells.J Gen Virol.831173-81.
14.Rothbard，J.B.，and P.A.Wender.2001.Composistions andmethods for enhancing drug delivery across biological membranes and tissues.In US patent US 09779693.
15.Florkiewicz，R.Z.，and A.Baird.1998.US 6083706Inhibitors ofleaderless protein export.In US patent US 6083706.Clblex Corporation(SanDiego，CA).
16.Anderson，D.C.，C.A.Morgan，A.P.G.，E.J.Nichols，and A.R.Fritzberg.1988.Covalently-linked complexes and methods for enhancedcytotoxicity and imaging.In European patent EP 0359347.Neorx corporation.
17.Schwarze，S.R.，and S.F.Dowdy.2000.In vivo proteintransductionintracellular delivery of biologically active proteins，compoundsand DNA.Trends Pharmacol Sci 2145-8.
18.Schwarze，S.R.，A.Ho，A.Vocero-Akbani，and S.F.Dowdy.1999.In vivo protein transductiondelivery of a biologically active protein into themouse.Sclence.2851569-72.
19，Zhong，G.，P.Romagnoli，and R.N.Germain.1997.Related Ieucine-based cytoplasmic targeting signals in invariant chain and majorhistocompatibility complex class II molecules control endocytic presentation ofdistinct determinants in a single protein.J Exp Med.185429-38.
20.Escola，J.M.，M.J.Kleijmeer，W.Stoorvogel，J.M.Griffith，0.Yoshie，and H.J.Geuze.1998.Selective enrichment of tetraspan proteins onthe internal vesicles of multivesicular endosomes and on exosomes secreted byhuman B-lymphocytes.J BiolChem.27320121-7.
21.August，T.J.，D.M.Pardoll，and F.G.Guarnieri.1993.Lysosomaltargeting of immunogens.In US patent US 5633234.The Johns HopkinsUniversity，Baltimore，MD，USA.
22.Sugita，M.，R.M.Jackman，E.van Donselaar，S.M.Behar，R.A.Rogers，P.J.Peters，M.B.Brenner，and S.A.Porcelli.1996.Cytoplasmic tail-dependent localization of CD1b antigen-presenting molecules to MllCs.Science.273349-52.
23.Pieters，J.，O.Bakke，and B.Dobberstein.1993.The MHC class II-associated invariant chain contains two endosomal targeting signals within itscytoplasmic tail.J Cell Sci.106831-46.
24.Kornfeld，S.，and I.Mellman.1989.The biogenesis of Iysosomes.Annu Rev Cell Biol.5483-525.
25.Schluesener，H.J.1996.Protection against experimental nervoussystem autoimmune diseases by a human immunodeficiency virus-1Tatpeptide-based polyvalent vaccine.J Neurosci Res.46258-62.
26.Larsen，J.N.，and H.Lowenstein.2000.Offical list of allergens，IUIS Allergen Nomenclature Subcommittee.ftp//biobase.dk/pub/who-iuis/a/lergen，list.
27.Larsen，J.N.，and H.Lowenstein.2001.List of isoallergens andvariants，IUIS Allergen Nomenclature Subcommittee.ftp//biobase.dk/pub/who-iuis/isoallergen.list.
28.Xenarios，I.，L.Salwinski，X.J.Duan，P.Higney，S.M.Kim，and D.Eisenberg.2002.DIP，the Database of Interacting Proteinsa research tool forstudying cellular networks of protein interactions.Nucleic Acids Res.30303-529.Barrett，A.J.，J.D.Rawlings，and J.F.Woessner.1998.Handbookof Proteolytic Enzymes.Academic Press，ISBN 0-12-079371-7.
30.Rawlings，N.D.，E.O′Brien，and A.J.Barrett.2002.MEROPStheprotease database.Nucleic Acids Res.30343-6.
31.Vlahovicek，K.，J.Murvai，E.Barta，and S.Pongor.2002.TheSBASE protein domain library，release 9.0an online resource for proteindomain identification，Nucleic Acids Res.30273-5.
32.Sheldon，K.，D.Liu，J.Ferguson，and J.Gariepy.1995.Loiigomersdesign of de novo peptide-based intracellular vehicles.Proc NatlAced Sci U SA.922056-60.
33.Dawson，P.E.，and S.B.Kent.2000.Synthesis of native proteinsby chemical ligation.Annu Rev Biochem.69923-60.
34.Yan，L.Z.，and P.E.Dawson.2001.Synthesis of peptides andproteins without cysteine residues by native chemical ligation combined withdesulfurization.J Am Chem Soc.123526-33.
35.Garavelli，J.S.，Z.Hou，N.Pattabiraman，and R.M.Stephens.2001.The RESID Database of protein structure modifications and the NRL-3DSequence-Structure Database.Nucleic Acids Res.29199-201.
36.Hruby，V.J.，J.M.Ahn，and S.Liao.1997.Synthesis ofoligopeptide and peptidomimetic libraries.Curr Opin Chem Biol.1114-9.
37.Senderowitz，H.，and R.Rosenfeld.2001.Design of structuralcombinatorial libraries that mimic biologic motifs.J Recept Signal TransductRes.21489-506.
38.Sulyok，G.A.，C.Gibson，S.L.Goodman，G.Holzemann，M.Wiesner，and H.Kessler.2001.Solid-phase synthesis of a nonpeptide RGDmimetic librarynew selective alphavbeta3 integrin antagonists.J Med Chem.441938-50.
39.Invitrogen.VoyagerTM NES Protein Produktion KitsRapid cloningand expression of VP22 fusion proteins in E.coll for translocation of purifiedrecombinant protein into the cytoplasma of mammalian cells.Invitrogen lifetechnologies.Version C 05030225-0377.
40.Goodman，M.，A.Felix，L.Moroder，and C.Toniolo.2002.Houben-WeylSynthesis of Peptides and Peptidomimetics.Thieme Medical andScientific Publishers.Vol.22.
41.Hover，J.E.1975，Remington′s Pharmaceutical Sciences.MackPublishing Co.，Easton，PA，USA.
42.Libermann，H.A.，and L.Lachman.1980.Pharmaceutical DosageForms.Marcel Decker Inc.，New York，NY，USA.
43.Sambrook，J.，and D.W.Russell.2001.Molecular Cloning-ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，USA.3rd Edition.
44.Coligan，J.E.，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W.Strober，and(Editors).2002.Current Protocols in Immunology.John Wiley &Son，Inc.，Hoboken，NJ，USA.
45.Moser，M.，R.Crameri，G.Menz，T.Schneider，T.Dudler，C.Virchow，M.Gmachl，K.Biaser，and M.Surer.1992.Cloning and expression ofrecombinant Aspergillus fumigatus allergen I/a (rAsp f l/a)with lgE binding andtype I skin test activity.J Immunol.149454-60.
46.Mayer，C.，S.Hemmann，A.Faith，K.Blaser，and R.Crameri.1997.Cloning，production，characterization and IgE cross-reactivity of differentmanganese superoxide dismutases in individuals sensitized to Aspergillusfumigatus.Int Arch Allergy Immunol.113213-5.
47.Qiagen.2001.The QIAexpressionistA handbook for high-levelexpression and purification of 6xHis-tagged proteins.Qiagen GmbH，Hilden，Germany.Fifth Edition1-128.
48.Qiagen.2001.QIAexpress Detection and Assay Handbook.QiagenGmbH，Hilden Germany.Third Edition1-100.
49.Beers，M.H.，R.Berkow，and (Editors).1999.The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy.Merck Research Laboratories，Whitehous Station，N J，USA.17th Edition.
50.Coligan，J.E.，B.M.Dunn，H.L.Ploegh，D.W.Speicher，P.T.Wingfield，and (Editors).2002.Current Protocols in Protein Science.John Wiley& Son，Inc.，Hoboken，NJ，USA.
51.Enna，S.J.，M.Williams，J.W.Ferkany，T.Kenakin，R.D.Porsolt，J.P.Sullivan，and (Editors).2002.Current Protocols in Pharmacology.JohnWiley & Son，Inc.，Hoboken，NJ，USA.
52.Bonifacino，J.S.，M.Dasso，J.Lippincott-Schwartz，J.B.Harford，K.M.Yamada，and (Editors).2002.Current Protocols in Cell Biology.JohnWiley & Son，Inc.，Hoboken，NJ，USA.
序列表□□<110>拜爾維申股份公司□□<120>用于調(diào)變免疫反應(yīng)的模塊化抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子(MAT分子)和相關(guān)的構(gòu)建體、方法和用途□□<130>MAT□□<150>EP02022774.0□<151>2002-10-11□□<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1
<211>870<212>DNA<213>Human immunodeficiency virus + Homo sapiens + Aspergillus fumigatus<400>1atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatctggtt acggtcgtaa aaagcgtcgc60cagcgtcgcc gtggatctat ggatgaccag cacgacctta tctccaacaa tgagcaactg120cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac180acaggctttt ccatcctggt gactctgctc ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc240ctgtaccagc agcagggccg gctggacaaa ctgacagtca cctcccagaa cttgcagctg300gagaacctgc gcatgaaact tcccaagcct cccaagcctg tgagcaagat gcgcatggcc360accccgctgc tgatgcaggc gctgcccatg ggagccctgc cccaggggac tagtggatcc420gcgacctgga catgcatcaa ccaacagctg aatcccaaga caaacaaatg ggaagacaag480cggcttctat acagtcaagc caaagccgaa agcaactccc accacgcacc tctttccgac540ggcaagaccg gtagcagcta cccgcactgg ttcactaacg gctacgacgg gaatggcaag600ctcatcaagg gtcgcacgcc catcaaattc ggaaaagccg actgtgaccg tcccccgaag660cgcagccaga acggcatggg caaggatgac cactacctgc tggagttccc gacttttcca720gatggccacg actataagtt tgactcgaag aaacccaagg aagacccggg cccagcgagg780gtcatctata cttatcccaa caaggtgttt tgcggcattg tggcccatca gcgggggaat840cagggagact tgagactgtg ttctcattag 870<210>2<211>289
<212>PRT<213>Human immunodeficiency virus+Homo sapiens+Aspergillus fumigatus<400>2Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Tyr Gly Arg1 5 10 15Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Gly Ser Met Asp Asp Gln His Asp20 25 30Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met Leu Gly Arg Arg Pro Gly35 40 45Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser50 55 60Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe65 70 75 80Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu Thr Val Thr Ser Gln85 90 95Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Pro Pro Lys10 105 110Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Gln Ala Leu115 120 125Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Thr Ser Gly Ser Ala Thr Trp Thr130 135 140
Cys Ile Asn Gln Gln Leu Asn Pro Lys Thr Asn Lys Trp Glu Asp Lys145 150 155 160Arg Leu Leu Tyr Ser Gln Ala Lys Ala Glu Ser Asn Ser His His Ala165 170 175Pro Leu Ser Asp Gly Lys Thr Gly Ser Ser Tyr Pro His Trp Phe Thr180 185 190Asn Gly Tyr Asp Gly Asn Gly Lys Leu Ile Lys Gly Arg Thr Pro Ile195 200 205Lys Phe Gly Lys Ala Asp Cys Asp Arg Pro Pro Lys Arg Ser Gln Asn210 215 220Gly Met Gly Lys Asp Asp His Tyr Leu Leu Glu Phe Pro Thr Phe Pro225 230 235 240Asp Gly His Asp Tyr Lys Phe Asp Ser Lys Lys Pro Lys Glu Asp Pro245 250 255Gly Pro Ala Arg Val Ile Tyr Thr Tyr Pro Asn Lys Val Phe Cys Gly260 265 270Ile Val Ala His Gln Arg Gly Asn Gln Gly Asp Leu Arg Leu Cys Ser275 280 285His<210>3<211>1044
<212>DNA<213>Human immunodeiiciency virus+Homo sapiens+Aspergillus fumigatus<400>3atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatctggtt acggtcgtaa aaagcgtcgc 60cagcgtcgcc gcggatctat ggatgaccag cacgacctta tctccaacaa tgagcaactg 120cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac 180acaggctttt ccatcctggt gactctgctc ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc 240ctgtaccagc agcagggccg gctggacaaa ctgacagtca cctcccagaa cttgcagctg 300gagaacctgc gcatgaaact tcccaagcct cccaagcctg tgagcaagat gcgcatggcc 360accccgctgc tgatgcaggc gctgcccatg ggagccctgc cccaggggac tagtggatct 420caatacacgc tcccacccct cccctacccc tacgatgccc tccaacccta catctcccaa 480cagatcatgg agctgcacca caaaaagcac catcaaacct acgtcaatgg cctgaatgcc 540gcactcgagg cgcagaagaa agcggcggaa gccaccgacg tccccaagct cgtctccgtg 600cagcaagcga tcaaattcaa cggcgggggg cacatcaacc attccctctt ctggaagaat 660ctggccccgg agaaatccgg gggtggcaag atcgatcagg caccggtcct caaagcagcc 720atcgagcagc gttggggatc cttcgataag ttcaaggatg ctttcaacac gaccctgctg 780ggcattcagg gcagcggatg gggttggtta gtgaccgacg gacccaaggg aaagctagac 840attaccacaa cccacgacca ggatccggtg accggggcgg cccccgtctt tggggtggat 900atgtgggagc atgcttacta ccttcagtac ttgaacgaca aagcctcgta tgccaagggc 960atctggaacg tgatcaactg ggctgaagcg gagaatcggt acatagcggg tgacaagggt 1020ggacacccat tcatgaagct gtag1044
<210>4<211>347<212>PRT<213>Human immunodeficiency virus+Homo sapiens+Aspergillus fumigatus<400>4Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Tyr Gly Arg1 5 10 15Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ser Met Asp Asp Gln His Asp20 25 30Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met Leu Gly Arg Arg Pro Gly35 40 45Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser50 55 60Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe65 70 75 80Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu Thr Val Thr Ser Gln85 90 95Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Pro Pro Lys100 105 110Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Gln Ala Leu115 120 125
Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Thr Ser Gly Ser Gln Tyr Thr Leu130 135 140Pro Pro Leu Pro Tyr Pro Tyr Asp Ala Leu Gln Pro Tyr Ile Ser Gln145 150 155 160Gln Ile Met Glu Leu His His Lys Lys His His Gln Thr Tyr Val Asn165 170 175Gly Leu Asn Ala Ala Leu Glu Ala Gln Lys Lys Ala Ala Glu Ala Thr180 185 190Asp Val Pro Lys Leu Val Ser Val Gln Gln Ala Ile Lys Fhe Asn Gly195 200 205Gly Gly His Ile Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ala Pro Glu210 215 220Lys Ser Gly Gly Gly Lys Ile Asp Gln Ala Pro Val Leu Lys Ala Ala225 230 235 240Ile Glu Gln Arg Trp Gly Ser Phe Asp Lys Phe Lys Asp Ala Phe Asn245 250 255Thr Thr Leu Leu Gly Ile Gln Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu Val Thr260 265 270Asp Gly Pro Lys Gly Lys Leu Asp Ile Thr Thr Thr His Asp Gln Asp275 280 285Pro Val Thr Gly Ala Ala Pro Val Phe Gly Val Asp Met Trp Glu His290 295 300
Ala Tyr Tyr Leu Gln Tyr Leu Asn Asp Lys Ala Ser Tyr Ala Lys Gly305 310 315 320Ile Trp Asn Val Ile Asn Trp Ala Glu Ala Glu Asc Arg Tyr Ile Ala325 330 335Gly Asp Lys Gly Gly His Pro Phe Met Lys Leu340 345<210>5<211>903<212>DNA<213>Human immunodeficiency virus+Homo sapiens+Betula verrucosa<400>5atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatctggtt acggbcgtaa aaagcgtcgc60cagcgtcgcc gtggatctat ggatgaccag cacgacctta tctccaacaa tgagcaactg120cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac180acaggctttt ccatcctggt gactctgctc ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc240ctgtaccagc agcagggccg gctggacaaa ctgacagtca cctcccagaa cttgcagctg300gagaacctgc gcatgaaact tcccaagcct cccaagcctg tgagcaagat gcgcatggcc360accccgctgc tgatgcaggc gctgcccatg ggagccctgc cccaggggac tagtggatcc420atgggtgttt tcaactacga aaccgaaacc acctccgtta tcccggctgc tcgtctgttc480aaggccttca tcctggacgg tgacaacctg ttccctaagg ttgctccgca ggctatctcc540tccgttgaaa acatcgaagg taacggtggc ccgggtacca tcaagaaaat ctccttcccg600gaaggtttcc catttaaata cgtaaaagac cgtgttgacg aagttgacca caccaacttc660
aaatacaact actccgttat cgaaggtggt ccaattggtg acaccctgga aaaaatctcc720aacgaaatca aaatcgtggc aaccccggac ggtggttcca tccttaagat ctccaacaaa780taccacacca aaggtgacca cgaagttaaa gctgaacagg ttaaagcttc gaaagaaatg840ggtgaaaccc tgctgcgtgc tgttgaatcc tacctgctgg ctcactccga tgcatacaac900taa 903<210>6<211>300<212>PRT<213>Human immunodeficiency virus+Homo sapiens+Betula verrucosa<400>6Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Tyr Gly Arg1 5 10 15Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ser Met Asp Asp Gln His Asp20 25 30Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met Leu Gly Arg Arg Pro Gly35 40 45Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser50 55 60Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe65 70 75 80
Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu Thr Val Tnr Ser Gln85 90 95Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Pro Pro Lys100 105 110Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Gln Ala Leu115 120 125Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Thr Ser Gly Ser Met Gly Val Phe130 135 140Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala Ala Arg Leu Phe145 150 155 160Lys Ala Phe Tle Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro Lys Val Ala Pro165 170 175Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly180 185 190Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro Phe Lys Tyr Val195 200 205Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe Lys Tyr Asn Tyr210 215 220Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu Lys Ile Ser225 230 235 240Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly Ser Ile Leu Ly5245 250 255
Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu Val Lys Ala Glu260 265 270Gln Val Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu Leu Arg Ala Val275 280 285Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn290 295 300<210>7<211>1089<212>DNA<213>Human immunodeficiency virus+Homo sapiens+Dermatophagoidespteronyssinus<400>7atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatctggtt acggtcgtaa aaagcgtcgc 60cagcgtcgcc gtggatctat ggatgaccag cacgacctta tctccaacaa tgagcaactg 120cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac 180acaggctttt ccatcctggt gactctgctc ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc 240ctgtaccagc agcagggccg gctggacaaa ctgacagtca cctcccagaa cttgcagctg 300gagaacctgc gcatgaaact tcccaagcct cccaagcctg tgagcaagat gcgcacggcc 360accccgctgc tgatgcaggc gctgcccatg ggagccctgc cccaggggac tagtggatcc 420actaacgcat gtagtatcaa tggaaatgct ccagctgaaa tcgatttgcg acaaatgcga 480actgtcactc ccattcgtat gcaaggaggc tgtggttcat gttgggcttt ctctggtggt 540gccgcaactg aatcagctta tttggctcac cgtaatcaat cattggatct tgctgaacaa 600
gaattagtcg attgtgcttc ccaacacggt tgtcatggtg ataccattcc acgtggtatt 660gaatacatcc aacataatgg tgtcgtccaa gaaagctact atcgatacgt tgcacgagaa 720caatcatgcc gacgaccaaa tgcacaacgt ttcggtatct caaactattg ccaaatttac 780ccaccaaatg caaacaaaat tcgtgaagct ttggctcaaa cccacagcgc tattgccgtc 840attattggca tcaaagattt agacgcattc cgtcattatg atggccgaac aatcattcaa 900cgcgataatg gttaccaacc aaactatcac gctgtcaaca ttgttggtta cagtaacgca 960caaggtgtcg attattggat cgtacgaaac agttgggata ccaattgggg tgataatggt 1020tacggttatt ttgctgccaa catcgatttg atgatgattg aagaatatcc atatgttgtc 1080attctctaa 1089<210>8<211>362<212>PRT<213>Human immunodeficieney virus+Homo sapiens+Dermatophagoidespteronyssinus<400>8Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Tyr Gly Arg1 5 10 15Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ser Met Asp Asp Gln His Asp20 25 30Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met Leu Gly Arg Arg Pro Gly35 40 45
Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser50 55 60Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe65 70 75 80Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu Thr Val Thr Ser Gln85 90 95Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Pro Pro Lys100 105 110Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Gln Ala Leu115 120 125Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Thr Ser Gly Set Thr Asn Ala Cys130 135 140Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gln Met Arg145 150 155 160Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala165 170 175Phe Ser Gly Gly Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg Asn180 185 190Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln195 200 205His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln210 215 220
His Asr Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg Glu225 230 235 240Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr245 250 255Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu Ala260 265 270Gln Thr His Ser Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile Lys Asp Leu Asp275 280 285Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln Arg Asp Asn Gly290 295 300Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val Gly Tyr Ser Asn Ala305310 315 320Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp325 330 335Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met340 345 350Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val Ile Leu355 360<210>9<211>39<212>DNA<213>Human immunodeficiency virus
<400>9ggttacggtc gtaaaaagcg tcgccagcgt cgccgcgga 39<210>10<211>13<212>PRT<213>Human immunodeficiency virus<400>10Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly1 5 10<210>11<211>429<212>DNA<213>Homo sapiens<400>11atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatctggtt acggtcgtaa aaagcgtcgc 60cagcgtcgcc gtggatctat ggatgaccag cacgacctta tctccaacaa tgagcaactg 120cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac 180acaggctttt ccatcctggt gactctgctc ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc 240ctgtaccagc agcagggccg gctggacaaa ctgacagtca cctcccagaa cttgcagctg 300gagaacctgc gcatgaaact tcccaagcct cccaagcctg tgagcaagat gcgcatggcc 360
accccgctgc tgatgcaggc gctgcccatg ggagccctgc cccaggggac tagtctgcag420aagcttaat429<210>12<211>143<212>PRT<213>Homo sapiens<400>12Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Tyr Gly Arg1 5 10 15Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ser Met Asp Asp Gln His Asp20 25 30Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met Leu Gly Arg Arg Pro Gly35 40 45Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser50 55 60Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe65 70 75 80Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu Thr Val Thr Ser Gln85 90 95Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Pro Pro Ly5100 105 110
Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Gln Ala Leu115 120 125Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Thr Ser Leu Gln Lys Leu Asn130 135 140<210>13<211>450<212>DNA<213>Aspergillius fumigatus<400>13gcgacctgga catgcatcaa ccaacagctg aatcccaaga caaacaaatg ggaagacaag60cggcttctat acagtcaagc caaagccgaa agcaactccc accacgcacc tctttccgac120ggcaagaccg gtagcagcta cccgcactgg ttcactaacg gctacgacgg gaatggcaag180ctcatcaagg gtcgcacgcc catcaaattc ggaaaagccg actgtgaccg tcccccgaag240cacagccaga acggcatggg caaggatgac cactacctgc tggagttccc gacttttcca300gatggccacg actataagtt tgactcgaag aaacccaagg aagacccggg cccagcgagg360gtcatctata cttatcccaa caaggtgttt tgcggcattg tggcccatca gcgggggaat420cagggagact tgagactgtg ttctcattag 450<210>14<211>149<212>PRT
<213>Aspergillus fumigatus<400>14Ala Thr Trp Thr Cys Ile Asn Gln Gln Leu Asn Pro Lys Thr Asn Lys1 5 10 15Trp Glu Asp Lys Arg Leu Leu Tyr Ser Gln Ala Lys Ala Glu Ser Asn20 25 30Ser His His Ala Pro Leu Ser Asp Gly Lys Thr Gly Ser Ser Tyr Pro35 40 45His Trp Phe Thr Asn Gly Tyr Asp Gly Asn Gly Lys Leu Ile Lys Gly50 55 60Arg Thr Pro Ile Lys Phe Gly Lys Ala Asp Cys Asp Arg Pro Pro Lys65 70 75 80His Ser Gln Asn Gly Met Gly Lys Asp Asp His Tyr Leu Leu Glu Phe85 90 95Pro Thr Phe Pro Asp Gly His Asp Tyr Lys Phe Asp Ser Lys Lys Pro100 105 110Lys Glu Asp Pro Gly Pro Ala Arg Val Ile Tyr Thr Tyr Pro Asn Lys115 120 125Val Phe Cys Gly Ile Val Ala His Gln Arg Gly Asn Gln Gly Asp Leu130 135 140Arg Leu Cys Ser His145
<210>15<211>633<212>DNA<213>Aspergillus fumigatus<400>15atgtcacagc aatacacgct cccacccctc ccctacccct acgatgccct ccaaccctac 60atctcccaac agatcatgga gctgcaccac aaaaagcacc atcaaaccta cgtcaatggc 120ctgaatgccg cactcgaggc gcagaagaaa gcggcggaag ccaccgacgt ccccaagctc 180gtctccgtgc agcaagcgat caaattcaac ggcggggggc acatcaacca ttccctcttc 240tggaagaatc tggccccgga gaaatccggg ggtggcaaga tcgatcaggc accggtcctc 300aaagcagcca tcgagcagcg ttggggatcc ttcgataagt tcaaggatgc tttcaacacg 360accctgctgg gcattcaggg cagcggatgg ggttggttag tgaccgacgg acccaaggga 420aagctagaca ttaccacaac ccacgaccag gatccggtga ccggggcggc ccccgtcttt 480ggggtggata tgtgggagca tgcttactac cttcagtact tgaacgacaa agcctcgtat 540gccaagggca tctggaacgt gatcaactgg gctgaagcgg agaatcggta catagcgggt 600gacaagggtg gacacccatt catgaagctg tag 633<210>16<211>210<212>PRT<213>Aspergillus fumigatus
<400>16Met Ser Gln Gln Tyr Thr Leu Pro Pro Leu Pro Tyr Pro Tyr Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Pro Tyr Ile Ser Gln Gln lle Met Glu Leu His His Lys Lys20 25 30His His Gln Thr Tyr Val Asn Gly Leu Asn Ala Ala Leu Glu Ala Gln35 40 45Lys Lys Ala Ala Glu Ala Thr Asp Val Pro Lys Leu Val Ser Val Gln50 55 60Gln Ala Ile Lys Phe Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His Ser Leu Phe65 70 75 80Trp Lys Asn Leu Ala Pro Glu Lys Ser Gly Gly Gly Lys Ile Asp Gln85 90 95Ala Pro Val Leu Lys Ala Ala Ile Glu Gln Arg Trp Gly Ser Phe Asp100 105 110Lys Phe Lys Asp Ala Phe Asn Thr Thr Leu Leu Gly Ile Gln Gly Ser115 120 125Gly Trp Gly Trp Leu Val Thr Asp Gly Pro Lys Gly Lys Leu Asp Ile130 135 140Thr Thr Thr His Asp Gln Asp Pro Val Thr Gly Ala Ala Pro Val Phe145 150 155 160
Gly Val Asp Met Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Gln Tyr Leu Asn Asp155 170 175Lys Ala Ser Tyr Ala Lys Gly Ile Trp Asn Val Ile Asn Trp Ala Glu180 185 190Ala Glu Asn Arg Tyr Ile Ala Gly Asp Lys Gly Gly His Pro Phe Met195 200 205Lys Leu210<210>17<211>519<212>DNA<213>Betula verrucosa<400>17atgegaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatccatgg gtgttttcaa ctacgaaacc60gaaaccacct ccgttatccc ggctgctcgt ctgttcaagg ccttcatcct ggacggtgac120aacctgttcc ctaaggttgc tccgcaggct atctcctccg ttgaaaacat cgaaggtaac180ggtggcccgg gtaccatcaa gaaaatctcc ttcccggaag gtttcccatt taaatacgta240aaagaccgtg ttgacgaagt tgaccacacc aacttcaaat acaactactc cgttatcgaa300ggtggtccaa ttggtgacac cctggaaaaa atctccaacg aaatcaaaat cgtggcaacc360ccggacggtg gttccatcct taagatctcc aacaaatacc acaccaaagg tgaccacgaa420gttaaagctg aacaggttaa agcttcgaaa gaaatgggtg aaaccctgct gcgtgctgtt480gaatcctacc tgctggctca ctccgatgca tacaactaa 519
<210>18<211>172<212>PRT<213>Betula verrucosa<400>18Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Met Gly Val Phe1 5 10 15Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala Ala Arg Leu Phe20 25 30Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro Lys Val Ala Pro35 40 45Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly50 55 60Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro Phe Lys Tyr Val65 70 75 80Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe Lys Tyr Asn Tyr85 90 95Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu Lys Ile Ser100 105 110Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly Ser Ile Leu Lys115 120 125
Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu Val Lys Ala Glu130 135 140Gln Val Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu Leu Arg Ala Val145 150 155 160Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn165 170<210>19<211>1099<212>DNA<213>Dermatophagoides pteronyssinus<400>19gaattccttt ttttttcttt ctctctctaa aatctaaaat ccatccaaca tgaaaattgt60tttggccatc gcctcattgt tggcattgag cgctgtttat gctcgtccat catcgatcaa120aacttttgaa gaatacaaaa aagccttcaa caaaagttat gctaccttcg aagatgaaga180agctgcccgt aaaaactttt tggaatcagt aaaatatgtt caatcaaatg gaggtgccat240caaccatttg tccgatttgt cgttggatga attcaaaaac cgatttttga tgagtgcaga300agcttttgaa cacctcaaaa ctcaattcga tttgaatgct gaaactaacg cctgcagtat360caatggaaat gctccagctg aaatcgattt gcgacaaatg cgaactgtca ctcccattcg420tatgcaagga ggctgtggtt catgttgggc tttctctggt gttgccgcaa ctgaatcagc480ttatttggct taccgtaatc aatcattgga tcttgctgaa caagaattag tcgattgtgc540ttcccaacac ggttgtcatg gtgataccat tccacgtggt attgaataca tccaacataa600
tggtgtcgtc caagaaagct actatcgata cgttgcacga gaacaatcat gccgacgacc660aaatgcacaa cgtttcggta tctcaaacte ttgccaaatt tacccaccaa atgtaaacaa720aattcgtgaa gctttggctc aaacccacag cgctattgcc gtcattattg gcatcaaaga780tttagacgca ttccgtcatt atgatggccg aacaatcatt caacgcgata atggttacca840accaaactat cacgctgtca acattgttgg ttacagtaac gcacaaggtg tcgattattg900gatcgtacga aacagttggg ataccaattg gggtgataat ggttacggtt attttgctgc960caacatcgat ttgatgatga ttgaagaata tccatatgtt gtcattctct aaacaaaaag1020acaatttctt atatgattgt cactaattta tttaaaatca aaatttttag aaaatgaata1080aattcattca caaaaatta 1099<210>20<211>320<212>PRT<213>Dermatophagoides pteronyssinus<400>20Met Lys Ile Val Leu Ala Ile Ala Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ala Val1 510 15Tyr Ala Arg Pro Ser Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Tyr Lys Lys Ala20 25 30Phe Asn Lys Ser Tyr Ala Thr Phe Glu Asp Glu Glu Ala Ala Arg Lys35 40 45
Asn Phe Leu Glu Ser Val Lys Tyr Val Gln Ser Asn Gly Gly Ala Ile50 55 60Asn His Leu Ser Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg Phe Leu65 70 75 80Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu His Leu Lys Thr Gln Phe Asp Leu Asn85 90 95Ala Glu Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile100 105 110Asp Leu Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly115 120 125Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala130 135 140Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu145 150 155 160Val Asp Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg165 170 175Gly Ile Glu Tyr Ile Gln His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr180 185 190Arg Tyr Val Ala Arg Glu Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg195 200 205Phe Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Val Asn Lys210 215 220
Ile Arg Glu Ala Leu Ala Gln Thr His Ser Ala Ile Ala Val Ile Ile225 230 235 240Gly Ile Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile245 250 255Ile Gln Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile260 265 270Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn275 280 285Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala290 295 300Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val Ile Leu305 310 315 320
權(quán)利要求
1.一種模塊化抗原轉(zhuǎn)運(yùn)分子(MAT分子)，其至少由至少一種轉(zhuǎn)運(yùn)模塊、至少一種導(dǎo)向模塊和至少一種抗原模塊組成，其中a)所述轉(zhuǎn)運(yùn)模塊是一種引起MAT分子自細(xì)胞外空間轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)部的分子單元，b)所述導(dǎo)向模塊是一種引起MAT分子在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至參與抗原加工或抗原加載于MHC分子的細(xì)胞器的分子單元，以及c)所述抗原模塊是一種至少由一種抗原組成的且在個(gè)體中決定由MAT分子所調(diào)變的免疫應(yīng)答的特異性的分子單元。
2.權(quán)利要求1的MAT分子，其中至少一種轉(zhuǎn)運(yùn)模塊包含以下序列的至少一種或以下序列的至少一種功能性部分序列HIV tat、antennapedia、VP22、長(zhǎng)度為4至20個(gè)氨基酸的聚精氨酸或聚賴氨酸序列、或前述各項(xiàng)的反向序列，其中所述模塊通過(guò)修飾其序列可使其轉(zhuǎn)運(yùn)效率升高或降低，且其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)模塊位于所述MAT分子的N端、C端或內(nèi)部。
3.權(quán)利要求1或2的MAT分子，其中至少一種導(dǎo)向模塊包含以下序列或結(jié)構(gòu)的一種或以下序列的至少一種功能性部分序列MHC恒定鏈(IiP33、IiP41、IiP35、IiP43)、MHC IIβ鏈、甘露糖-6-磷酸受體、膜結(jié)合型免疫球蛋白(mIg)、HLA-DMβ鏈、LAMP-1、LAMP-2、LAMP-3、Limp1、CD63、CD82、CD1b、或前述各項(xiàng)的反向序列，或一種甘露糖-6-磷酸結(jié)構(gòu)，其中所述模塊優(yōu)選地通過(guò)修飾其序列使其導(dǎo)向效率升高或降低，且其中所述導(dǎo)向模塊位于所述MAT分子的N端、C端或內(nèi)部。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的MAT分子，其中至少一種抗原模塊是一種蛋白質(zhì)、核酸、糖結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)或另一種抗原，且其中所述抗原模塊位于所述MAT分子的N端、C端或內(nèi)部，或被引入導(dǎo)向模塊、轉(zhuǎn)運(yùn)模塊或標(biāo)記模塊的內(nèi)部，且其中所述抗原可在適當(dāng)?shù)那闆r下通過(guò)采用組合方法而產(chǎn)生。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的MAT分子，其中額外存在至少一種標(biāo)記模塊，其中所述標(biāo)記模塊用于分離和/或檢測(cè)所述MAT分子，且其中所述標(biāo)記模塊位于所述MAT分子的N端、C端或內(nèi)部。
6.權(quán)利要求5的MAT分子，其中至少一種標(biāo)記模塊選自由具有4-6個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基的His標(biāo)記、Myc標(biāo)記、FLAG標(biāo)記、HA標(biāo)記、Strep標(biāo)記、Xpress標(biāo)記、S標(biāo)記、CBD標(biāo)記、GST標(biāo)記、HSV標(biāo)記、T7標(biāo)記、A蛋白標(biāo)記、V5標(biāo)記、殼多糖結(jié)合標(biāo)記、麥芽糖結(jié)合標(biāo)記、鈣調(diào)蛋白結(jié)合標(biāo)記和生物素基團(tuán)組成的組。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的MAT分子，其中各個(gè)模塊通過(guò)共價(jià)鍵和/或非共價(jià)鍵彼此偶聯(lián)，其中非共價(jià)鍵可通過(guò)以下各種相互作用中的一或多種而產(chǎn)生a)蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用b)核酸/蛋白質(zhì)相互作用c)核酸/核酸相互作用d)糖/凝集素相互作用e)受體/配體相互作用f)抗原/抗體相互作用g)半抗原/抗體相互作用h)Spiegelmer/相互作用i)鏈霉抗生物素蛋白/生物素相互作用j)抗生物素蛋白/生物素相互作用k)A蛋白/抗體相互作用l)G蛋白/抗體相互作用m)L蛋白/抗體相互作用n)組氨酸肽/鎳螯合相互作用o)谷胱甘肽/谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶相互作用p)麥芽糖/麥芽糖結(jié)合蛋白相互作用q)殼多糖/殼多糖結(jié)合蛋白相互作用且其中共價(jià)連接的模塊可通過(guò)一間隔模塊連接在一起。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的MAT分子，其包含以下構(gòu)件中的至少一種a)氨基酸D異構(gòu)體b)修飾的氨基酸D異構(gòu)體c)氨基酸L異構(gòu)體d)修飾的氨基酸L異構(gòu)體e)具有胍基的構(gòu)件f)有脒基的構(gòu)件g)肽模擬物h)N-甲基氨基酸i)少見(jiàn)氨基酸j)Spiegelmers。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的MAT分子，其中各個(gè)模塊中的氨基酸序列部分與權(quán)利要求2、3和6中任一項(xiàng)所示的序列之一具有大于70％、優(yōu)選地大于80％、優(yōu)選地大于90％、優(yōu)選地大于95％的相同性。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的MAT分子，其中至少a)轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的拷貝數(shù)大于1和/或b)導(dǎo)向模塊的拷貝數(shù)大于1和/或c)抗原模塊的拷貝數(shù)大于1和/或d)標(biāo)記模塊的拷貝數(shù)大于1和/或e)間隔模塊的拷貝數(shù)大于1。
11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的MAT分子，其全部或部分地由環(huán)狀和/或分枝狀和/或樹(shù)形排列的模塊構(gòu)成。
12.一種用于制備權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的MAT分子的方法，其特征在于首先制備、表征和保持所述MAT分子的各個(gè)模塊，其特征還在于將這些模塊以模塊化系統(tǒng)的方式進(jìn)行組合以產(chǎn)生一種MAT分子，其中a)可利用不同的導(dǎo)向模塊，并為具體設(shè)定的用途選擇至少一種合適的導(dǎo)向模塊，和/或b)可利用不同的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊，并為具體設(shè)定的用途選擇至少一種合適的轉(zhuǎn)運(yùn)模塊，和/或c)可利用不同的抗原模塊，并為具體設(shè)定的用途選擇至少一種合適的抗原模塊，和d)將選定的模塊根據(jù)其分子特性、根據(jù)彼此的親和性、根據(jù)反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)或根據(jù)選定的反應(yīng)條件進(jìn)行裝配并組合，以產(chǎn)生一種非共價(jià)連接的或產(chǎn)生一種共價(jià)連接的MAT分子。
13.一種核酸，其編碼權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的MAT分子。
14.一種載體，其包含至少一種權(quán)利要求13的核酸序列以及優(yōu)選地至少一種以下元件一種功能性連接于權(quán)利要求13的核酸的啟動(dòng)子、一種抗生素抗性基因、一種抗真菌劑抗性基因。
15.一種原代細(xì)胞或細(xì)胞系，其包含至少一種權(quán)利要求14的載體或權(quán)利要求13的核酸。
16.一種小泡，特別是一種外來(lái)體、Deoxosome或脂質(zhì)體，其包含至少一種權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的MAT分子、權(quán)利要求13的核酸或權(quán)利要求14的載體。
17.權(quán)利要求13的核酸、權(quán)利要求14的載體或權(quán)利要求15的細(xì)胞用于制備權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的重組MAT分子的用途。
18.免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，其特征在于能夠識(shí)別權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的MAT分子，優(yōu)選地通過(guò)對(duì)人或動(dòng)物個(gè)體進(jìn)行免疫而獲得。
19.權(quán)利要求18的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，a)其融合于至少一種另外的蛋白質(zhì)，特別是毒素、蛋白酶、激酶、磷酸酶、脂肪酶、核酸酶，或b)其共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)于具有藥理學(xué)活性的物質(zhì)，特別是用于治療惡性疾病和感染性疾病的物質(zhì)，或c)其共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)于適合用于發(fā)現(xiàn)在生物體或細(xì)胞中與之相偶聯(lián)的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的物質(zhì)。
20.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的MAT分子、權(quán)利要求13的核酸或權(quán)利要求18或19的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段在成像方法中的用途。
21.鑒別抑制或刺激MHC分子進(jìn)行的抗原呈遞的物質(zhì)的方法，其中a)產(chǎn)生一MAT分子文庫(kù)，所述文庫(kù)包含具有多種不同抗原模塊的MAT分子，并b)使所述MAT分子文庫(kù)在T淋巴細(xì)胞激活分析中與抗原呈遞細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞相接觸，并c)鑒別引起T細(xì)胞激活降低的MAT分子，和/或d)鑒別引起T細(xì)胞激活增強(qiáng)的MAT分子。
22.鑒別給定抗原的特異性表位的方法，其中a)產(chǎn)生一種MAT分子文庫(kù)，所述文庫(kù)包含具有多種不同抗原模塊的MAT分子，并b)使抗原呈遞細(xì)胞和特異于待研究的抗原的T淋巴細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞激活分析中與MAT分子的一種均一變體或與MAT分子的多種不同變體相接觸，并c)鑒別引起T細(xì)胞激活增強(qiáng)的MAT分子。
23.體外培養(yǎng)的人或動(dòng)物個(gè)體的細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)過(guò)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的MAT分子、權(quán)利要求13的核酸、權(quán)利要求14的載體或權(quán)利要求16的小泡的處理，且因此所述細(xì)胞的抗原呈遞已經(jīng)被調(diào)變。
24.一種藥物、疫苗或診斷劑，其包含權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的MAT分子和/或權(quán)利要求18的免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段和/或權(quán)利要求19的免疫球蛋白融合蛋白和/或權(quán)利要求13或14的核酸和/或權(quán)利要求16的小泡和/或權(quán)利要求15或23的細(xì)胞。
25.權(quán)利要求24的藥物、疫苗或診斷劑，其額外包含至少一種以下組分和/或其他藥物學(xué)可接受的賦形劑和添加劑a)生理鹽水b)藥物學(xué)可接受的佐劑c)藥物學(xué)可接受的緩沖物質(zhì)d)藥物學(xué)可接受的運(yùn)載蛋白e)藥物學(xué)可接受的防腐劑f)藥物學(xué)可接受的著色劑。
26.權(quán)利要求24或25的藥物、疫苗或診斷劑，其特征在于該產(chǎn)品被設(shè)計(jì)為用于皮下注射、淋巴結(jié)內(nèi)注射或用于通過(guò)粘膜施用，特別是通過(guò)消化道或呼吸系統(tǒng)的粘膜施用。
27.權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)的藥物或診斷劑，特征在于其目的在于a)用于預(yù)防和/或b)用于降低或增強(qiáng)免疫反應(yīng)和/或c)用于治療自身免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)、風(fēng)濕性疾病、器官移植的排異反應(yīng)、由病毒、細(xì)菌或真核生物病原體引起的感染性疾病、和/或惡性疾病。
28.一種通過(guò)用權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的MAT分子、權(quán)利要求13或14的核酸、權(quán)利要求16的小泡或權(quán)利要求15或23的細(xì)胞免疫個(gè)體而獲得抗體的方法，其中所述接受免疫的個(gè)體是哺乳動(dòng)物，特別是人、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、兔、山羊、綿羊或驢，或者是鳥(niǎo)類，特別是雞，或者是其他適于獲得抗體的動(dòng)物。
29.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的MAT分子、權(quán)利要求13或14的核酸、權(quán)利要求15的細(xì)胞系或原代細(xì)胞、權(quán)利要求16的小泡、權(quán)利要求18或19的抗體、抗體片段或抗體融合蛋白、或權(quán)利要求23的細(xì)胞在生產(chǎn)藥物、診斷劑或疫苗中的用途。
全文摘要
通過(guò)添加一種新研發(fā)的模塊化抗原轉(zhuǎn)運(yùn)分子(MAT分子)及其他相關(guān)的手段，能夠以導(dǎo)向性方式有效地調(diào)變個(gè)體的免疫系統(tǒng)。該MAT分子含有一種轉(zhuǎn)運(yùn)模塊，其將MAT分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)部；一種主動(dòng)型細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)向模塊，其引起MAT分子在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)參與抗原加工的細(xì)胞器；以及一種抗原模塊，其決定由MAT分子所調(diào)變的免疫應(yīng)答的特異性。任選地，該MAT分子可含有其他模塊例如標(biāo)記模塊和間隔模塊。本發(fā)明包含這種新的MAT分子、用該MAT分子產(chǎn)生的抗體和以該MAT分子產(chǎn)生的治療劑和診斷劑。本發(fā)明還包含所述MAT分子、抗體、治療劑和診斷劑的用途。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1738901SQ200380101255
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2003年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月11日
發(fā)明者諾貝特·蘭平, 克拉默瑞·雷托, 扎比內(nèi)·弗呂克格爾, 伊莎貝爾·戴格爾 申請(qǐng)人:伊姆維申股份有限公司