專利名稱：調(diào)節(jié)caspase活化的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物和人類與動物細(xì)胞的死亡機(jī)制。具體地說，其涉及能夠抑制各種因素所導(dǎo)致的凋亡性細(xì)胞死亡的肽。本發(fā)明描述了具有這種活性的肽和產(chǎn)生及使用所述肽的方法。
背景技術(shù)：
凋亡是參與正常細(xì)胞發(fā)育和惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的細(xì)胞死亡的有效形式。凋亡機(jī)制涉及由各種類型藥物、細(xì)胞因子和生長因子、氧脅迫、輻射、衰老、自身免疫病和器官移植中的免疫排斥所導(dǎo)致的生物事件。最近對凋亡的研究表明激素、細(xì)胞因子、生長因子缺失、化療藥物、離子輻射、免疫性病癥、AIDS、癌癥和衰老所誘導(dǎo)的各種類型凋亡采用共同的分子機(jī)制(Nagata，(1997)Cell 88，355-365)。
caspase蛋白酶的級聯(lián)活化是凋亡誘導(dǎo)中的基本點(diǎn)(Cohen，et al.(1997)Biochem.J，3261-16)。描述了兩種不同類型的凋亡信號傳導(dǎo)。受體依賴的凋亡引發(fā)初期包括特異性配體對適當(dāng)死亡受體的活化，所述特異性配體如TNF或FasL，其是目前研究最多的凋亡誘導(dǎo)劑(Wallach et al.(1997).FEBSLetters，41096-106)?；罨瘯r(shí)，細(xì)胞表面死亡受體Fas(CD95)或TNFR1與胞質(zhì)銜接蛋白質(zhì)(FADD、MORT、RIP、TRADD)結(jié)合，募集caspase-8，以活化白介素-1-β-轉(zhuǎn)化酶ICE/CED-3家族蛋白酶(caspase)級聯(lián)，然后活化半胱氨酸蛋白酶中的CPP32/caspase-3亞家族，其成員以潛伏前體precaspase形式出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中(Enari，et al.(1996)Nature 380723-726)。非受體依賴型的凋亡通常包括非常重要的細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的機(jī)制，其需要形成細(xì)胞色素c、dATP、Apaf 1和procaspase-9的三級復(fù)合體，通過自我蛋白酶解和同源二聚化導(dǎo)致后者的活化，以及隨后的caspase級聯(lián)活化(Liu et al.(1996)Cell，86147-157；Pan et.al.，(1998)FEBSLetters，426151-154；Slee et al.，(1999)J Cell Biol.，144281-292)。
因此影響對凋亡的生物控制的試劑在各種臨床適應(yīng)癥中具有潛在的治療性用途。已使用各種植物來源的凋亡抑制劑來篩選經(jīng)常伴隨化療、輻射、免疫性病癥或AIDS的病理性病癥。這些添加物通常含有碳水化合物、脂肪和植物蛋白水解物、凝集素和磷脂(US6004579，Barr等)。有效的凋亡調(diào)節(jié)劑可以用來治療癌癥患者，以控制細(xì)胞因子治療、化療或放療。凋亡機(jī)制在各種類型的免疫性病癥中起作用，所述病癥如自身免疫性惡性腫瘤、器官移植或過敏反應(yīng)中的免疫排斥或人免疫缺陷病毒的病毒感染。
α-胎蛋白(AFP)是腫瘤相關(guān)的胎兒糖蛋白，其表現(xiàn)出各種生物活性，包括細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、未成熟細(xì)胞的分化、活化的免疫細(xì)胞的免疫抑制、凋亡的腫瘤特異性誘導(dǎo)和對各種因素介導(dǎo)的凋亡信號的調(diào)節(jié)，以及對各種基因表達(dá)的調(diào)節(jié)(Deutsch，(1991)Adv.Cancer Res.，56253-312；Mizejewsky，(1997)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，215333-362)。已經(jīng)有多項(xiàng)證據(jù)報(bào)道了下列物質(zhì)的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)活性，包括抑制活性各物種全長AFP分子(Semenkova et al.，(1997)Tumor Biology，18261-274；Semeniuk et al，(1995)Ad Exper. Med. Biol.，383255-269；Sonnenschein et al.，(1980)J Natl Cancer Inst.，641141-1146；Soto et al.，(1980)Proc.Natl Acad. Sci USA，772084-2087；Jacobson et al.，(1999)Cancer Research，50415-420)、其蛋白酶解片段(Dudich et al.，(1999)Biochemistry，3810406-10414)或重組結(jié)構(gòu)域(Festin et al.，(1999)Biochim.Biophys.Acta，1427307-314)和合成肽(Mesfin et al.，(2000)Biochim.Biophys.Acta，150133-43；Mizejewsky，et al.，(1996)Mol. Cell. Endocr.，11815-23(1996))。各研究者都已開始尋找AFP分子中負(fù)責(zé)其多種活性的功能性活化位點(diǎn)的定位。已經(jīng)成功進(jìn)行了花生四烯酸和雌二醇結(jié)合位點(diǎn)的定位(Deutsch，(1991)Adv. Cancer Res.，56253-312；Mizejewski，(1997)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，215333-362；Nishi et al.，(1993)TumorBiol.14234-243)。
最近表明，AFP通過引發(fā)凋亡發(fā)揮其腫瘤抑制活性，所述凋亡通過caspase-3的活化，不依賴于Fas/FasL和TNF/TNFR信號傳導(dǎo)(Dudich et al.，(1999)Eur.J Biochem.2661-13；Semenkova et al.，(1997)Tumor Biology，18261-274；Dudich et al.(1998)Tumor Biology，1930-40)。近10年來，已經(jīng)報(bào)道了AFP介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞生長抑制的多項(xiàng)證據(jù)，但是尚未鑒定到AFP分子中負(fù)責(zé)凋亡信號傳導(dǎo)的活性位點(diǎn)。
已經(jīng)報(bào)道了人AFP的DNA和氨基酸序列(Morinaga，et.al.，″Primary structures ofhuman alpha-fetoprotein and its mRNA″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，804604-4608(1983))。與E2結(jié)合位點(diǎn)相對應(yīng)的合成肽表現(xiàn)出具有腫瘤抑制活性(US專利US5674842；10/1997 Mizejewsky；US5707963，07/1998 Mizejewsky)。各種生物活性蛋白質(zhì)都具有和AFP同源的序列(Mizejewsky，(1993)BioEssays，15427-432；Mizejewsky，(1997)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，215333-362)。已經(jīng)鑒定到了AFP和參與凋亡信號傳導(dǎo)的各種蛋白質(zhì)如Bcl2、TNFR1、Fas等的可靠同源性(Mizejewsky，(2001)Proc.Soc.Exp.Biol.Med)。WO 9835981 Al(Economou，J等，1998)描述了使用66種AFP肽序列對于免疫癌癥是有用的。其中一種肽A20是CRGDVLDCL，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)其正好包括AFP活性位點(diǎn)的一部分。但是，沒有發(fā)現(xiàn)CRGDVLDCL的特殊效應(yīng)，本發(fā)明仍然第一個(gè)鑒定到AFP中的一個(gè)假定生物活性位點(diǎn)。另外，本發(fā)明的肽包括一個(gè)額外的半胱氨酸殘基，其能夠形成鏈內(nèi)二硫鍵，比CRGDVLDCL產(chǎn)生明顯更高的生物活性。
一個(gè)重要的整合素結(jié)合位點(diǎn)是三肽Arg-Gly-Asp，其存在于各種整合素配體中。整合素是介導(dǎo)細(xì)胞-基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的異源二聚化糖蛋白，在細(xì)胞分化、免疫識別、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移性病灶的生長過程中具有作用。已經(jīng)在整合素亞基中鑒定到了Arg-Gly-Asp序列的接觸部分(參見Pasqualini，et al.″A peptide isolated from phagedisplay libraries is a structural and functional mimic of an Arg-Gly-Asp-binding site onintegrins.″J Cell Biol.(1995)1301189-1196)。將含Arg-Gly-Asp基序的合成肽用作整合素-配體相互作用的抑制劑(D′Souza et al.(1988)Science，24291-93)。已經(jīng)報(bào)道含Arg-Gly-Asp基序的合成肽能夠指導(dǎo)caspase-3活化(Bukley，et al.(1999)Nature，397534-539)。AFP在其分子中含有Arg-Gly-Asp(RGD)序列，該序列位于結(jié)構(gòu)域II中的第253-255位。根據(jù)本發(fā)明，RGD序列是參與凋亡信號傳導(dǎo)的AFP功能活性位點(diǎn)的一部分。
本發(fā)明描述了AFP分子中負(fù)責(zé)凋亡信號傳導(dǎo)的最小部分。小肽或其他小半抗原是用作藥物的重要調(diào)控因子，因?yàn)樗鼈兡軌蛟隗w外合成，且它們不產(chǎn)生中和性抗體。借助F-MOC固相化學(xué)，產(chǎn)生了含6-10個(gè)殘基的肽。還合成了與人白蛋白(HAS)同源序列相對應(yīng)的類似肽。在培養(yǎng)中的完整細(xì)胞中評價(jià)所有肽的生長調(diào)節(jié)活性，還測試了其直接誘導(dǎo)無細(xì)胞胞質(zhì)提取物中caspase活化的能力。另外，還分析了這些肽調(diào)節(jié)完整細(xì)胞中AFP和抗-Fas細(xì)胞毒性Mab CH-11誘導(dǎo)的凋亡的能力，和影響無細(xì)胞體系中細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的caspase活化的能力。


圖1所示為生物活性二聚化肽的示意圖(單體為apocyclin-A；*Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*)。
圖2說明多聚環(huán)9-肽apocyclin-A(*Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*)對AFP誘導(dǎo)的凋亡的抑制。微滴定孔中的U-937細(xì)胞用各種劑量的apocyclin-A處理15分鐘，然后向每個(gè)孔中加入3μM的純?nèi)薃FP。24h孵育后，通過[3H]-胸苷摻入分析法評價(jià)細(xì)胞增殖。
圖3說明多聚環(huán)9-肽apocyclin-A(*Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*)對U-937細(xì)胞中細(xì)胞毒性抗Fas單克隆抗體CH-11誘導(dǎo)的凋亡的影響。細(xì)胞用500μM的apocyclin-A處理15分鐘，然后向每個(gè)孔中加入各劑量的細(xì)胞毒性抗Fas MabCH-11(Immunotech Ltd)。16h孵育后，通過[3H]-胸苷摻入分析法評價(jià)細(xì)胞增殖。
圖4說明線性6-肽Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp(RGDVLD)和His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu(HGDLLE)對AFP介導(dǎo)的U-937細(xì)胞生長抑制的影響。細(xì)胞用各劑量的肽處理15分鐘，然后向每個(gè)孔中加入3μM的純?nèi)薃FP。24h孵育后，通過[3H]-胸苷摻入分析法評價(jià)細(xì)胞增殖。
圖5說明環(huán)單體9-肽*Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*(*CGRGDVLDC*)對AFP介導(dǎo)的人成髓細(xì)胞瘤細(xì)胞系U-937的生長抑制的影響。細(xì)胞用各劑量的肽處理15分鐘，然后向每個(gè)孔中加入3μM的純?nèi)薃FP。24h孵育后，通過[3H]-胸苷摻入分析法評價(jià)細(xì)胞增殖。
圖6說明環(huán)9-肽apocyclin-A(*CCRGDVLDC*)增強(qiáng)無細(xì)胞胞質(zhì)提取物中由低劑量內(nèi)源性Cyt c誘導(dǎo)的ATP依賴性pro-caspase-3活化。U937細(xì)胞的細(xì)胞提取物與各劑量的apocyclin-A與1 mM dATP一起孵育40分鐘。無添加物的提取物作為對照。通過切割熒光底物DEVD-AFC來評價(jià)Caspase-3的活化。
圖7說明人AFP對無細(xì)胞體系中細(xì)胞色素c介導(dǎo)的caspase活化的協(xié)同增強(qiáng)。(A)AFP在dATP的存在下誘導(dǎo)無細(xì)胞胞質(zhì)提取物中caspase-3的活化。各份HepG2來源的胞質(zhì)提取物(25μg蛋白質(zhì))在dATP(1mM)的存在下，用AFP(7μM)處理不同的時(shí)間間隔，或用相同劑量的HAS處理作為對照，然后分析DEVDase活性。(B)在亞最佳(suboptimal)劑量的外源性細(xì)胞色素c的存在下，HepG2細(xì)胞的胞質(zhì)提取物中AFP介導(dǎo)的caspase-3活化的協(xié)同增強(qiáng)。各份HepG2來源的胞質(zhì)提取物(25μg蛋白質(zhì))在dATP(1mM)的存在下，用AFP(10μM)、細(xì)胞色素c(0.2μM)或相同劑量的兩種化合物的組合處理不同的時(shí)間間隔，然后分析DEVDase活性。(C)AFP差異性影響無細(xì)胞胞質(zhì)提取物中由各劑量細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的caspase-3的活化。各份S100胞質(zhì)提取物(25μg蛋白質(zhì))在dATP(1mM)的存在下，用AFP(7μM)處理30分鐘，然后分析DEVDase活性。示出了四個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
圖8說明高劑量(165nM)內(nèi)源性細(xì)胞色素c(A)和低劑量(110nM)內(nèi)源性細(xì)胞色素c(B)條件下，肽apocyclin-A*CCRGDVLDC*、CGRGDVLDC、*CCHGDLLEC*、RGDVLD和HGDLLE對HepG2細(xì)胞的無細(xì)胞胞質(zhì)提取物中dATP依賴性Cyt c誘導(dǎo)的caspase活化的影響。加入細(xì)胞色素c之前15分鐘，向細(xì)胞提取物中加入濃度為750μM的肽。通過切割caspase-3特異性的熒光底物DEVD-AMC來監(jiān)測Caspase活化。
圖9說明環(huán)化多聚9-肽apocyclin-A(*CCRGDVLDC*)消除細(xì)胞色素c/AFP介導(dǎo)的無細(xì)胞體系中的caspase-3活化。各份HepG2來源的胞質(zhì)提取物用750μM的apocyclin-A預(yù)處理15分鐘，然后在1mM dATP的存在下，用10μMAFP和/或110nM(A)或80nM(B)細(xì)胞色素c處理40分鐘。通過切割caspase-3特異性的熒光底物DEVD-AMC來監(jiān)測Caspase活化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主題是提供能夠調(diào)節(jié)凋亡性細(xì)胞死亡的肽，具體是人工合成的多聚環(huán)肽。更具體地，其涉及人α-胎蛋白(AFP)或白蛋白分子上負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡的原始氨基酸序列。
AFP是腫瘤相關(guān)的胎兒糖蛋白，其表現(xiàn)出各種生物活性，包括細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、未成熟細(xì)胞的分化、活化的免疫細(xì)胞的免疫抑制、凋亡的腫瘤特異性誘導(dǎo)和對各種因素多介導(dǎo)的凋亡信號的調(diào)節(jié)，以及對各種基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。最近表明AFP可以通過直接或間接活化完整細(xì)胞和無細(xì)胞體系中的caspase-3來誘導(dǎo)腫瘤選擇性凋亡(Dudichet al.，1999，J Eur.Biochem.266，750-761)。根據(jù)本發(fā)明，在AFP和白蛋白中發(fā)現(xiàn)了具有這種效應(yīng)的活性位點(diǎn)。模擬了形成活性位點(diǎn)的肽，篩選了大量合成的天然和非天然肽的生物活性。
根據(jù)本發(fā)明的肽可以用于抑制依賴于細(xì)胞色素c介導(dǎo)的caspase級聯(lián)活化的各種類型細(xì)胞死亡，例如，由氧脅迫、藥物、細(xì)胞因子、Fas配體、α-胎蛋白誘導(dǎo)的凋亡。所述肽可用于防止培養(yǎng)細(xì)胞中的凋亡，增加器官移植的器官保持(preservation)，預(yù)防免疫性自身免疫病癥和病毒感染所誘導(dǎo)的免疫缺陷綜合征、化療和放療后的細(xì)胞毒副作用。還提供了肽的氨基酸序列，以及生產(chǎn)和使用所述肽的方法。最有效的肽結(jié)構(gòu)是具有剛性分子形式的合成肽，如 本發(fā)明著手使用理論和實(shí)驗(yàn)方法來確定AFP分子中負(fù)責(zé)引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性位點(diǎn)。假設(shè)模擬活性位點(diǎn)的活性肽可以直接在完整的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，在無細(xì)胞體系中引發(fā)caspase-3活化，或調(diào)節(jié)凋亡信號，如AFP和或其他凋亡因子如抗Fas抗體或細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡信號。令人驚奇的是，合成環(huán)肽*Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*(這里稱作apocyclin-A)模擬了AFP分子的一部分，與幾種caspase具有可靠的同源性，似乎具有生物活性。apocyclin-A中氨基酸的一系列分解和置換是為了鑒定功能上重要的氨基酸。還合成了apocyclin-A相關(guān)的許多肽。測試了所有肽影響培養(yǎng)物中腫瘤細(xì)胞存活的能力和影響無細(xì)胞胞質(zhì)裂解物中caspase活化的能力。下一步肽測試是為了研究肽影響完整細(xì)胞中AFP、抗Fas抗體誘導(dǎo)的凋亡的能力，和調(diào)節(jié)無細(xì)胞體系中Cyt c介導(dǎo)的caspase活化的能力。結(jié)果表明對應(yīng)于AFP序列251-259的9-肽apocyclin-A完全消除了體外腫瘤細(xì)胞中AFP介導(dǎo)的凋亡，明顯調(diào)節(jié)了無細(xì)胞胞質(zhì)提取物中Cyt-c和AFP介導(dǎo)的caspase活化。更具體地，在無細(xì)胞體系中，apocyclin-A明顯增強(qiáng)低劑量細(xì)胞色素c介導(dǎo)的caspase活化，降低高劑量細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的效應(yīng)。
較短的6-肽p25在無細(xì)胞體系中部分保留這種活性，但是在完整細(xì)胞中沒有這種活性。還表明，AFP來源的肽在調(diào)節(jié)細(xì)胞提取物中Cyt c介導(dǎo)的caspase活化方面表現(xiàn)出相互拮抗。觀察到9-肽apocyclin-A中度支持低劑量Cyt c介導(dǎo)的效應(yīng)，顯著抑制高劑量外源性或內(nèi)源性細(xì)胞色素c引發(fā)的caspase活化。這些數(shù)據(jù)表明AFP-來源的9-肽apocyclin-A是AFP中負(fù)責(zé)同參與凋亡信號傳導(dǎo)的未知胞質(zhì)分子特異性結(jié)合的最小部分。所限定的該肽結(jié)構(gòu)和其人工特征說明其可以是能夠在體外和體內(nèi)用作各種凋亡因子的藥物的活性組分。這種肽的應(yīng)用包括防止培養(yǎng)細(xì)胞中的凋亡，預(yù)防同種異體移植的免疫排斥和自身免疫反應(yīng)的方法，避免肝臟膿毒性休克和細(xì)胞因子治療等誘導(dǎo)的凋亡的方法。
本文所用的氨基酸的縮寫如下表所示

為了尋找AFP分子中負(fù)責(zé)凋亡信號傳導(dǎo)的最小部分，通過F-MOC固相化學(xué)生成了含6-10個(gè)殘基的肽。還合成了與人血清白蛋白(HAS)的同源序列相對應(yīng)的類似肽。評價(jià)所有的肽在培養(yǎng)物完整細(xì)胞中的生長調(diào)節(jié)活性，還測試了它們直接影響無細(xì)胞胞質(zhì)提取物中caspase活化的能力。另外，測試了肽調(diào)節(jié)完整細(xì)胞中AFP和抗Fas細(xì)胞毒性Mabs CH-11誘導(dǎo)的凋亡的能力，和影響無細(xì)胞體系中cyt c誘導(dǎo)的caspase活化的能力。通過F-MOC固相化學(xué)生成了含對應(yīng)于人α-胎蛋白中251-259序列的Arg-Gly-Asp(RGD)的人工環(huán)肽*CCRGDVLDC*(星號表示潛在的二硫鍵)、Cys252替換為Gly的同源性環(huán)肽*CGRGDVLDC*和對應(yīng)于殘基253-258的線性肽RGDVLD。還合成了來自人血清白蛋白的同源性環(huán)肽*CCHGDLLEC*、*CGHGDLLEC*和線性肽HGDLLE，用作功能性對照。還認(rèn)識到僅含序列RCD的肽明顯不同于本發(fā)明中的肽。
來自AFP*CCRGDVLDC*(本文為apocyclin-A)的含RGD的多聚環(huán)肽能夠消除體外腫瘤細(xì)胞中的凋亡。結(jié)果表明，apocyclin-A完全消除人成髓細(xì)胞瘤U937細(xì)胞中AFP誘導(dǎo)的凋亡，顯著抑制抗Fas抗體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。還評價(jià)了AFP來源的肽apocyclin-A和線性6-肽RGDVLD影響無細(xì)胞體系中Cyt c和AFP誘導(dǎo)的caspase活化的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)apocyclin-A顯著增強(qiáng)低劑量內(nèi)源性或外源性Cyt c誘導(dǎo)的dATP依賴性caspase活化，實(shí)際上完全消除高凋亡活性劑量的Cyt c誘導(dǎo)的caspase活化。還表明apocyclin-A消除HepG2細(xì)胞的無細(xì)胞胞質(zhì)提取物中AFP誘導(dǎo)的Cyt c/dATP依賴的caspase-3活化。線性AFP-來源的6-肽RGDVLD在完整細(xì)胞中不表現(xiàn)出凋亡調(diào)節(jié)活性，但是能夠消除無細(xì)胞體系中Cyt c/AFP介導(dǎo)的caspase活化。
產(chǎn)生抗生物活性蛋白質(zhì)如受體的特定功能性位點(diǎn)的抗體以阻斷它們的方法是公知和常用的方法。這種抗體產(chǎn)生恰好與受體位點(diǎn)相配合(fit)的Fab單位結(jié)構(gòu)。另一方面，可以制備抗個(gè)體基因型(anti-idiotypic)抗體，以與第一次制備的Fab單位相配合。因此抗個(gè)體基因型抗體與受體的活性位點(diǎn)類似。根據(jù)本發(fā)明，AFP和白蛋白含有特異的活性位點(diǎn)，其與引發(fā)細(xì)胞死亡周期的受體配合，阻斷它們。因此，在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，AFP/白蛋白的特定部分具有阻斷引發(fā)位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。因此，針對AFP和/或白蛋白活性位點(diǎn)的抗個(gè)體基因型抗體含有能阻斷細(xì)胞死亡受體之分子的必要結(jié)構(gòu)信息。通過常規(guī)的X射線結(jié)晶和/或從序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)模擬可以顯示出這種3-D結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的基本實(shí)施方案是發(fā)現(xiàn)了哺乳動物中兩個(gè)重要且豐富的蛋白質(zhì)，即AFP和白蛋白中的凋亡活性位點(diǎn)。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，形成了一系列分子結(jié)構(gòu)以阻斷哺乳動物細(xì)胞中的細(xì)胞死亡引發(fā)受體。受試分子是肽，因?yàn)樗鼈円子诤铣?，但可以理解的是，可以在合成的或天然的化合物基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)其他分子。同樣，也可以在其他分子，尤其是非免疫原性的載體分子上構(gòu)建分子結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的主要實(shí)際結(jié)果是來自AFP的環(huán)肽*CCRGDVLDC*(apocyclin-A)，其含有兩個(gè)功能性活性位點(diǎn)RGD和DVLD。兩種序列都直接參與caspase活性和凋亡的調(diào)節(jié)。含RGD的蛋白質(zhì)或肽已知參與同整合素分子的相互作用，可以用于抑制影響細(xì)胞增殖和凋亡的分子內(nèi)接觸。apocyclin-A和含RGD的其他肽的不同在于環(huán)化形式的該位點(diǎn)的多聚化表象。這能夠通過RGD序列的多聚化表象增強(qiáng)總體效應(yīng)。
序列DVLD位于apocyclin-A中的RGD之后，是caspase-3、-7和-2的公知切割位點(diǎn)。因此，它具有caspase底物的典型結(jié)構(gòu)DXXD(Thornberry，N.A.，et al.，(2000)Methods in Enzymology，v.322，pp.100)。在apocyclin-A中，該位點(diǎn)可以作為肽底物與caspase-3的活性位點(diǎn)結(jié)合。類似活性也可以賦予整個(gè)AFP分子，但是這將需要構(gòu)象改變，使暴露相應(yīng)位點(diǎn)，以顯示凋亡調(diào)節(jié)活性(Semenkova et al.，(2003)Eur.J.Biochem.270，in press)。
可以通過底物樣氨基酸序列的存在來解釋apocyclin-A抑制無細(xì)胞體系中caspase-3活性的能力，所述底物樣氨基酸序列能夠結(jié)合并阻斷相應(yīng)caspase的活性位點(diǎn)。另外，apocyclin-A的DVLD位點(diǎn)類似于典型四肽caspase-3抑制劑DEVD-cho，可以通過破壞XIAP和加工的caspase-3之間的相互作用，選擇性地促進(jìn)caspase-3從凋亡體(apoptosome)復(fù)合物中的釋放(Bratton，S.B.，et al.，(2001)EMBO J5，998)。
apocyclin-A的獨(dú)特特征是其環(huán)狀結(jié)構(gòu)，該環(huán)狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生底物序列的多聚表象，通過同時(shí)與參與凋亡信號傳導(dǎo)的不同分子相互作用增強(qiáng)總體效應(yīng)。
通過非限制性的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例1肽合成根據(jù)肽合成的常用方法，使用430A型合成儀；Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA來合成肽。環(huán)肽主要從暴露于大氣氧的水溶液中的線性肽自發(fā)形成，通過HPLC、使用肽的常用程序來純化。
1.對應(yīng)于人AFP中251-259氨基酸序列的環(huán)多聚9-肽*Cys-*Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*，*CCRGDVLDC*(星號表示潛在的二硫鍵)，本文稱作apocyclin-A。第二個(gè)半胱氨酸，Cys252，能夠在兩個(gè)鄰近的環(huán)單體肽之間形成S-S鍵。單體環(huán)肽的分子量為983Da。apocyclin-A肽由兩個(gè)或多個(gè)(少于5個(gè))環(huán)狀的、對應(yīng)于序列*Cys-*Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*的9-肽結(jié)構(gòu)組成。
2.環(huán)狀單體肽*Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*(星號表示潛在的二硫鍵)對應(yīng)于人AFP中的251-259氨基酸，具有Cys252向Gly的單一氨基酸替換，以避免單體間形成S-S鍵所致的肽多聚化。單體環(huán)狀9-肽的分子量是937Da。
3.來自AFP、對應(yīng)于序列253-259的線性肽，Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp(253-259)，單體環(huán)肽的分子量為674Da。
4.來自HAS(人血清白蛋白)的環(huán)肽，*Cys-Cys-His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu-Cys*，*CCHGDLLEC*(M.wt992)；5.來自HAS的環(huán)肽，*Cys-Gly-His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu-Cys*，*CGHGDLLEC*(M.wt946)。在該肽中，Cys252為Gly所取代。
6.來自HAS的線性肽，p26His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu，HGDLLE(M.wt683)。
試劑熒光肽底物DEVD-AMC和LEHD-AFC來自Alexis Biochemicals(San Diego，USA)。牛心臟細(xì)胞色素c(Cyt c)、三磷酸腺苷(dATP)和其他試劑都來自SigmaChemical Co.。人AFP如文獻(xiàn)所述通過離子交換、親和與凝膠過濾層析分離自cord血清(Dudich et al.，(1999)Biochemistry，3810406-10414)。用抗人AFP和成人血清蛋白的單特異性抗體通過PAGE和Rochet電泳確定AFP純度，結(jié)果表明不低于99.8％。
制備無細(xì)胞提取物人肝癌細(xì)胞HepG2和人成單核細(xì)胞瘤細(xì)胞系U937來源于美國典型培養(yǎng)物收藏中心(American Type Culture Collection)。通過在低滲提取緩沖液中裂解細(xì)胞來制備細(xì)胞提取物。為了獲得胞質(zhì)S-100級分，將細(xì)胞裂解物以100,000×g離心1h。提取物直接使用，或凍于-70℃?zhèn)溆谩?br> 無細(xì)胞反應(yīng)無細(xì)胞反應(yīng)通常在13-μl的反應(yīng)體積中進(jìn)行。通過加入各劑量的牛心臟細(xì)胞色素c和/或純化的人AFP，在1mM dATP的存在下誘導(dǎo)凋亡。對于13-μl規(guī)模的反應(yīng)，10μl細(xì)胞提取物(～2-4mg/ml，通過Bradford分析測定)加入1μl dATP、1μl Cyt c和/或反應(yīng)緩沖液中的AFP溶液，以接受必要終濃度的試劑。為了評價(jià)肽的活性，向細(xì)胞提取物中加入各劑量的溶解于反應(yīng)緩沖液的肽和1mM dATP。為了測定肽調(diào)節(jié)Cyt c和AFP的凋亡效應(yīng)的能力，在加入Cyt c和AFP之前10分鐘加入肽。對照樣品與等體積的不含試劑添加物的緩沖液(3μl)一起孵育。為了引發(fā)凋亡，將提取物于37℃孵育40分鐘。
測定caspase活性在caspase活化反應(yīng)結(jié)束時(shí)，各份提取物(5μl)添加熒光底物DEVD-AMC(3mM)，然后于37℃孵育一定的時(shí)間間隔(0.5-1h)。通過加入2.0ml的冰冷的、0.2mMpH7.5磷酸鈉緩沖液稀釋來終止反應(yīng)，然后用Perkin Elmer MPF-44A(λexc＝365nm；λem＝440nm)熒光儀測定熒光。對于每個(gè)樣品，熒光強(qiáng)度根據(jù)胞質(zhì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行校正。caspase活化表示為校正的樣品熒光強(qiáng)度和對照樣品測定的相應(yīng)值之間的比例。
誘導(dǎo)凋亡U937細(xì)胞以4×103細(xì)胞/孔的密度鋪到平底96孔板(Costar)的完全培養(yǎng)基中，在試劑加入之前孵育2h。然后將細(xì)胞用溶解于PBS的各劑量AFP處理24h，然后評價(jià)增殖。如所描述的用細(xì)胞毒性IgM抗Fas抗體CH-11對細(xì)胞進(jìn)行處理。U937細(xì)胞用50μg/ml的CH-11抗體處理18h。然后，細(xì)胞不經(jīng)處理或用試劑處理足夠的時(shí)間間隔，最后4h的培養(yǎng)物進(jìn)行[3H]-胸苷(1Ci/mmol/孔)摻入分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為三次重復(fù)的培養(yǎng)物中[3H]-胸苷摻入占培養(yǎng)基對照的[3H]-胸苷摻入的百分比。不加添加物培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照。
分析肽活性為了評價(jià)肽的生長調(diào)節(jié)活性，各劑量的肽加入到細(xì)胞中24h，然后評價(jià)細(xì)胞的增殖、細(xì)胞存活力和DNA片段化。為了測定肽調(diào)節(jié)其他因子誘導(dǎo)的凋亡的能力，Jurkat細(xì)胞用20ng/ml的CH-11抗體處理，不加ActD；Ragi細(xì)胞用經(jīng)20ng/ml CH-11抗體而處理的Jurkat細(xì)胞中的CH-11處理，不加ActD；Raji細(xì)胞在0.5μg/ml ActD的存在下用CH-11處理18h。為了用TNF-α誘導(dǎo)凋亡，細(xì)胞(Jurkat、MCF7或U937)用25ng/ml的細(xì)胞因子處理24h，然后如上所述評價(jià)增殖或存活力。HepG2細(xì)胞在加入TNF之前預(yù)先用新鮮的培養(yǎng)基洗滌，以除去內(nèi)源性的生長因子。
實(shí)施例2 鑒定人AFP中負(fù)責(zé)凋亡信號傳導(dǎo)的含RGD的caspase-3特異性活性位點(diǎn)為了測定AFP分子中功能上重要的氨基酸，我們測定了人AFP和caspase-3與caspase-1的序列的氨基酸同源性，構(gòu)建了假定活性位點(diǎn)的肽類似物。比對研究下列序列casp-2 QNKPKMFFIQACRGDETDRGV:::::
casp-1 KDKPKVIIIQACRGDSPGVVW:::::
casp-3 TGKPKLFIIQACRGTELDCGI:::. :::
HuAFP VLDVAHVHEHCCRGDVLDCLQDGEKIMSYICSQQDTLSNKITECCKLTTLERGQCIIHAE299: :. :: :: ::.: : : . ::: .::..: :. :::::. :: :
HSAVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVE294從比對可以看出，AFP和caspase-1與caspase-3的酶活性位點(diǎn)具有一定的同源性。caspase-1與caspase-2的酶活性位點(diǎn)含有RGD基序，其位于具有催化活性的Cys殘基之前。效應(yīng)caspase-3與caspase-7在該位置上具有TGT基序，而Cys殘基的位置恰好與AFP分子和casp-3、casp-7一致?？紤]到AFP在Cys252和Cys259之間具有鏈內(nèi)二硫鍵(Morinaga，et al.，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，804604-4608)，我們假設(shè)AFP分鐘上caspase樣活性位點(diǎn)位于殘基Cys252-Cys259之間的某位置。必須提到的是，casp-3、-7和-8也具有RGD基序，但是它們定位于催化活性位置之外(Bukley，et al.，(1999)Nature，397534-539)。肽結(jié)構(gòu)中所含的游離半胱氨酸Cys258明顯能夠在兩個(gè)相鄰的肽之間形成鏈間二硫鍵(圖1)。為了證明AFP分子的Cys252-Cys259環(huán)中功能上重要的氨基酸的存在，我們構(gòu)建了假定活性位點(diǎn)的肽類似物結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)行對照，還合成了來自HAS的同源肽。
實(shí)施例3 來自AFP apocyclin-A的環(huán)肽消除U937細(xì)胞中AFP誘導(dǎo)的凋亡之前發(fā)表的數(shù)據(jù)表明不同來源的AFP(胚胎或來源于肝瘤細(xì)胞系HepG2的培養(yǎng)物培養(yǎng)基)可以誘導(dǎo)各種腫瘤細(xì)胞系的生長抑制和劑量依賴性的程序性細(xì)胞死亡，其特征在于典型的凋亡特征，如明顯的生長抑制、細(xì)胞毒性和DNA片段化(Dudich et al.，(1998)Tumor Biol.1930-40)。為了確定AFP分子上負(fù)責(zé)凋亡信號傳導(dǎo)的活性位點(diǎn)的可能定位，我們測試了各AFP來源的肽阻斷這種效應(yīng)的能力。圖2說明AFP來源的肽apocyclin-A完全消除U-937細(xì)胞中AFP誘導(dǎo)的凋亡。另外，與培養(yǎng)基對照相比，用apocyclin-A(1mM)對U-937細(xì)胞進(jìn)行15-分鐘的預(yù)處理誘導(dǎo)15％的增殖刺激。這意味著24小時(shí)培養(yǎng)過程中apocyclin-A還消除細(xì)胞的自發(fā)性凋亡。
實(shí)施例4 apocyclin-A顯著抑制U-937細(xì)胞中抗Fas抗體誘導(dǎo)的凋亡為了測試AFP特異性，我們測試了apocyclin-A是否影響其他因子影響的凋亡。通過各劑量的細(xì)胞毒性IgM抗Fas單克隆抗體CH-11誘導(dǎo)U-937細(xì)胞的凋亡。圖3說明0.5mM的apocyclin-A通過消除約50％的總效應(yīng)而顯著抑制抗Fas抗體介導(dǎo)的凋亡。apocyclin-A的濃度增加至1mM，更顯著地抑制抗Fas誘導(dǎo)的凋亡。已知參與各種類型凋亡的細(xì)胞內(nèi)通路對于多數(shù)凋亡性因子來說都是通用的。我們的數(shù)據(jù)表明apocyclin-A對抗AFP依賴的和Fas依賴的凋亡信號傳導(dǎo)通路，這是通過與兩種因子引發(fā)凋亡中所涉及的某種通用受體相互作用實(shí)現(xiàn)的。
實(shí)施例5 確定AFP分子的活性位點(diǎn)中功能上重要的氨基酸a)AFP來源的肽設(shè)計(jì)了Cys252替換為Gly的環(huán)肽*CGRGDVLDC*和6-肽RGDVLD，以確定功能性活性位點(diǎn)序列中負(fù)責(zé)凋亡信號傳導(dǎo)的功能上重要的氨基酸。圖4說明*CGRGDVLDC*對U937-細(xì)胞中AFP介導(dǎo)的凋亡的影響。該肽不能消除AFP介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。對于RGDVLD也獲得的相同的結(jié)果(圖4)。這些數(shù)據(jù)表明Cys252是功能上重要的氨基酸，其替換為Gly完全取消了該肽與整個(gè)AFP分子的凋亡活性相互作用的能力。較短的肽RGDVLD也不能調(diào)節(jié)AFP介導(dǎo)的凋亡，說明了環(huán)肽結(jié)構(gòu)對于形成凋亡活性位點(diǎn)的必要性。
B)HAS來源的肽已知白蛋白和AFP具有可靠的同源性(Morinaga，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，804604-4608)。還發(fā)現(xiàn)了假定活性位點(diǎn)區(qū)域中類型肽apocyclin-A的同源物。我們從HAS序列設(shè)計(jì)了下列肽環(huán)肽*CCHGDLLEC*、*CGHGDLLEC*(Cys向Gly的單一替換)和線性6-肽HGDLLE。同樣如上所述，我們也測試了這些肽影響完整細(xì)胞中AFP誘導(dǎo)的凋亡的能力(表1)。圖5說明*CCHGDLLEC*具有類似apocyclin-A的活性，消除U-937細(xì)胞中AFP介導(dǎo)的凋亡。HGDLLE和*CGHGDLLEC*不影響細(xì)胞對AFP的應(yīng)答。
表1.AFP來源的和HAS來源肽對U-937細(xì)胞的細(xì)胞生長和AFP誘導(dǎo)的凋亡的影響

*環(huán)肽1)劑量1mM的肽對U-937細(xì)胞增殖的直接效應(yīng)，以占不具有添加物的對照的％表示。
實(shí)施例6 apocyclin-A與低亞最佳劑量內(nèi)源性細(xì)胞色素c協(xié)同誘導(dǎo)無細(xì)胞體系中的caspase活化為了確定apocyclin-A是否與AFP分子作用類似，支持無細(xì)胞體系中的caspase活化，我們建立了如上所述相同無細(xì)胞體系，只是不用AFP，而使用環(huán)肽apocyclin-A。圖8說明在低亞劑量內(nèi)源性細(xì)胞色素c和dATP的存在下，apocyclin-A協(xié)同增強(qiáng)無細(xì)胞體系中的總caspase-3活性。不加入dATP，apocyclin-A不能在相同的實(shí)驗(yàn)條件下誘導(dǎo)DEVD-ase活性。在“沉默(silent)”無細(xì)胞體系中，對完整的AFP也觀察到了相同的效應(yīng)。這些數(shù)據(jù)表明我們能夠鑒定到AFP和白蛋白中負(fù)責(zé)其凋亡促進(jìn)活性的活性位點(diǎn)。
實(shí)施例7 apocyclin-A與低亞最佳劑量內(nèi)源性細(xì)胞色素c和dATP協(xié)同誘導(dǎo)胞質(zhì)細(xì)胞提取物中的caspase-3活化我們還測試了AFP誘導(dǎo)無細(xì)胞體系中caspase活性的能力。向S100胞質(zhì)提取物中加入AFP引發(fā)dATP依賴的caspase-3特異性的DEVDase活性的誘導(dǎo)，DEVDase活性逐漸增加至少2h(圖7A)。作為對照，將等量的人血清白蛋白(HAS)加入到相同的無細(xì)胞體系中，其在DEVDase活性水平上沒有影響。單獨(dú)的dATP也能導(dǎo)致低程度的DEVDase活性，明顯是由于制劑中小量內(nèi)源性Cyt c的存在。在不存在dATP的條件下，AFP根本不誘導(dǎo)任何的caspase活化。為了測定AFP是否直接誘導(dǎo)胞質(zhì)細(xì)胞提取物中的caspase活性，或它是否需要基礎(chǔ)水平的cyt-c的存在，在向具有不可檢測水平的內(nèi)源性細(xì)胞色素c的“沉默”胞質(zhì)提取物中加入外源性cyt-c之后，我們驗(yàn)證了DEVDase活性。圖7B說明在這種類型的胞質(zhì)裂解物中檢測不到DEVDase活性，即使在dATP和低亞最佳劑量的cyt-c的存在下處理2小時(shí)后也是如此。但是，在相同的反應(yīng)體系中加入AFP(7μM)引發(fā)caspase的活化過程，以時(shí)間依賴性的方式逐漸增加。
實(shí)施例8 apocyclin-A取消無細(xì)胞體系中Cyt c/dATP介導(dǎo)的caspase活化圖8說明apocyclin-A對caspase-3活化的影響由各劑量的細(xì)胞色素c和AFP介導(dǎo)。高劑量的肽(750μM)顯著(50-70％)抑制高劑量內(nèi)源性細(xì)胞色素c所誘導(dǎo)的caspase活化(圖8A)。用細(xì)胞色素c/AFP聯(lián)合處理胞質(zhì)級分導(dǎo)致總DEVDase活性的顯著增強(qiáng)(圖8，A和B)。apocyclin-A的加入抑制Cyt c/AFP介導(dǎo)的caspase活化的60-80％。這些數(shù)據(jù)說明apocyclin-A通過消除cyt c單獨(dú)或與AFP組合誘導(dǎo)的總caspase活化，在無細(xì)胞體系中以與完整AFP分子相反的方式起作用。因此，apocyclin-A是AFP分子上負(fù)責(zé)其凋亡活性和凋亡體組裝體成員相互作用的序列。
實(shí)施例9 AFP來源的肽或HAS來源的肽對無細(xì)胞胞質(zhì)提取物中dATP依賴性Cyt c介導(dǎo)的caspase活化的影響為了測試各種肽影響無細(xì)胞體系中外源性細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的caspase活化的能力，我們使用了HepG2細(xì)胞的胞質(zhì)細(xì)胞提取物。將各份細(xì)胞提取物用750μM的肽預(yù)處理15分鐘，然后向反應(yīng)混合物中引入各劑量的細(xì)胞色素c，以誘導(dǎo)caspase活化。對照提取物和dATP孵育，不加肽和細(xì)胞色素c，但是它不表現(xiàn)出任何的caspase活性。從圖9A可見，來自AFP的肽，9-肽apocyclin-A和6-肽RGDVLD和來自HAS的6-肽HGDLLE誘導(dǎo)對高劑量細(xì)胞色素c介導(dǎo)的caspase活化的顯著抑制。另一方面，具有單一氨基酸替換的環(huán)狀單體9-mer肽*CGRGDVLDC*和來自HAS的環(huán)狀單體肽*CCHGDLLEC*在完整細(xì)胞或無細(xì)胞體系中都不表現(xiàn)出抑制凋亡的活性。因此，最有效的肽apocyclin-A模擬AFP的活性為點(diǎn)，負(fù)責(zé)凋亡信號傳導(dǎo)。對低劑量細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的caspase活化獲得了明顯不同的效果。圖9B說明在第劑量細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的caspase活化方面，apocyclin-A產(chǎn)生與全長AFP分子的相同刺激。肽*CGRGDVLDC*和*CCHGDLLEC*對低劑量細(xì)胞色素c活性沒有影響，但是RGDVLD和HGDLLE表現(xiàn)出顯著消除細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的caspase活化。
表2概括了表征無細(xì)胞胞質(zhì)提取物中肽活性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

*環(huán)肽實(shí)施例10 制備針對AFP生物活性位點(diǎn)的抗個(gè)體基因型抗體
BALB/cA小鼠用于免疫、細(xì)胞融合和產(chǎn)生腹水液體。20只小鼠每只免疫高度純化的、用完全弗氏佐劑乳化的人AFP(40μg)。以2周的間隔用相同量的不完全弗氏佐劑中乳化的AFP對小鼠加強(qiáng)免疫。選擇對人AFP具有最高應(yīng)答性的小鼠，向其尾部靜脈注射含50μl弗氏不完全佐劑的100μlAFP溶液中的80μg AFP。3天后，制備脾細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤NS-1細(xì)胞混合，然后在含F(xiàn)CS的KC培養(yǎng)基中用PEG處理，融合細(xì)胞生長在含F(xiàn)CS的HAT培養(yǎng)基中，然后在HT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用兔多克隆抗體作為固化捕獲抗體，Eu標(biāo)記的抗人抗體作為監(jiān)測抗體進(jìn)行TR-FIA分析，測試雜交瘤產(chǎn)生抗體的能力(對于技術(shù)細(xì)節(jié)和試劑，參見論文Peuravuori，H and Korpela，T.et al.，Clin.Chem.1993，39，pp.847-848)。在產(chǎn)生抗體的克隆中，棄除對肽*CCRGDVLDC*和其環(huán)狀形式的加入不敏感的那些克隆。表現(xiàn)出良好應(yīng)答性的克隆生長至足夠?qū)胍栽谛∈笾挟a(chǎn)生腹水液體。制備腹水液體，從中純化抗AFP單克隆抗體。通過常見的公知方法對純化的抗體進(jìn)行蛋白酶解，以從選定的克隆獲得純的Fab片段(對于技術(shù)，參見Muronetz and Korpela，J. Chromatogr.2003，790，pp.53-66)。如上所述對Fab蛋白進(jìn)行與AFP類似的加工，以獲得抗Fab片段的單特異性抗體。通過對AFP活性位點(diǎn)肽的敏感性，從克隆中篩選出那些針對AFP活性位點(diǎn)的抗個(gè)體基因型抗體?？梢曰就ㄟ^上述抗AFP的相同技術(shù)，制備針對人白蛋白中序列位置246-254處的活性位點(diǎn)的抗個(gè)體基因型抗體。
權(quán)利要求
1.抗個(gè)體基因型抗體的識別位點(diǎn)的分子結(jié)構(gòu)，所述抗個(gè)體基因型抗體的識別位點(diǎn)針對人α-胎蛋白或人血清白蛋白中的凋亡活性位點(diǎn)，所述凋亡活性位點(diǎn)位于所述人α-胎蛋白中氨基酸殘基251-259處，或人血清白蛋白中氨基酸殘基246-254處。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的人α-胎蛋白或白蛋白的活性位點(diǎn)的肽結(jié)構(gòu)，其具有通式CCRGDVLDnXmY或CCHGDLLEnXmY，其中X是任意疏水性氨基酸，Y是任意親水性氨基酸，指數(shù)n是1、2或3，指數(shù)m是1、2或3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的線性肽結(jié)構(gòu)，在肽的N端具有0、1或3個(gè)旁側(cè)半胱氨酸殘基，和在肽的C端具有0、1、2或3個(gè)旁側(cè)半胱氨酸殘基。
4.權(quán)利要求3的多聚或環(huán)化的肽結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的肽結(jié)構(gòu)，其特征在于相同分子中同時(shí)存在RGD和DXXD序列，其中X指任意疏水性氨基酸殘基，R、G和D分別指Arg、Gly和Asp。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的七肽，其中序列RGD中的D是序列DXXD共用的。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的肽序列，其中通式中的X指V、L或W，或其任意組合，Y指D、E或G。
8.C*C*RGDVLDC*的線性、聚合或環(huán)化結(jié)構(gòu)，其中星號殘基表示可能的二硫鍵的位置。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的線性、聚合或環(huán)化肽，結(jié)構(gòu)為C*C*HGDLLEC*，其中星號氨基酸殘基表示可能的二硫鍵的位置。
10.權(quán)利要求2-9之一的肽用于阻斷人和動物細(xì)胞中凋亡調(diào)節(jié)通路的用途。
11.權(quán)利要求2-9之一的肽用于增加器官或細(xì)胞移植中器官或細(xì)胞保持的用途。
12.權(quán)利要求2-9之一的肽用于預(yù)防自身免疫病和病毒感染所致免疫缺陷綜合征的用途。
13.權(quán)利要求2-9之一的肽用于降低化療或放療后細(xì)胞毒效應(yīng)的用途。
14.權(quán)利要求2-9之一的肽用于抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、非特異性藥物誘導(dǎo)的凋亡或氧脅迫介導(dǎo)的凋亡的用途。
15.權(quán)利要求2-9之一的肽用于防止為科研或技術(shù)目的而制備的培養(yǎng)細(xì)胞凋亡的用途。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的任意分子結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)的特征在于其結(jié)合到針對所述抗個(gè)體基因型抗體中Fab片段的分子識別位點(diǎn)而制備的抗體中的能力。
全文摘要
本發(fā)明提供了能夠調(diào)節(jié)凋亡性細(xì)胞死亡的小分子結(jié)構(gòu)。更具體地，該結(jié)構(gòu)涉及哺乳動物α－胎蛋白(AFP)和白蛋白的凋亡活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。模擬活性位點(diǎn)的肽包含兩種序列Arg－Gly－Asp和Asp－X－X－Asp，其中X為任意氨基酸。對導(dǎo)致各種生物活性來說，這些序列需要存在于同一分子中。該肽可以通過抑制細(xì)胞色素c介導(dǎo)的caspase活化來阻斷凋亡通路。因此，該肽可用于抑制氧脅迫、藥物、細(xì)胞因子、Fas配體、α－胎蛋白誘導(dǎo)的凋亡效應(yīng)，用于防止培養(yǎng)的細(xì)胞中、器官移植中、免疫性自身免疫病和病毒感染所致免疫缺陷綜合征中的凋亡，或用于降低化療和放療后的細(xì)胞毒副作用。
文檔編號A61P37/00GK1703428SQ200380101165
公開日2005年11月30日 申請日期2003年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月9日
發(fā)明者埃琳娜·伊萬諾夫娜·杜迪奇, 利迪婭·尼古拉耶芙娜·謝緬科夫安, 伊戈?duì)枴ぞS亞切斯拉沃維奇·杜迪奇, 愛德華·鮑里索維奇·塔圖洛夫, 德米特里·利沃維奇·祖博夫, 蒂莫·卡萊維·科爾佩拉 申請人:比奧西斯特瑪股份公司