專利名稱：前眼部相關(guān)細(xì)胞片、三維結(jié)構(gòu)體、及它們的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的前眼部相關(guān)細(xì)胞片、三維結(jié)構(gòu)體、及它們的制造方法和使用它們的治療方法。
背景技術(shù)：
隨著醫(yī)療技術(shù)的顯著發(fā)展，近年來，用他人的器官替換難以治療的器官的器官移植得到了普遍化。成為移植對象的器官十分多樣，包括皮膚、角膜、腎臟、肝臟、心臟等，并且術(shù)后的療程也變得格外良好，因此已被確立為醫(yī)療的一種技術(shù)。作為一個(gè)例子舉出角膜移植，約40年前在日本也設(shè)立了角膜銀行并開始了移植工作。但是，由于捐獻(xiàn)者人數(shù)很少，相對僅國內(nèi)每年需要角膜移植的患者就有約2萬人來說，實(shí)際上能夠進(jìn)行移植治療的患者只有其1/10，約2000人左右?，F(xiàn)在的情況是盡管角膜移植的技術(shù)已被大致確立，但由于角膜捐獻(xiàn)不足的問題，所以需要尋找下一種醫(yī)療技術(shù)。
基于這樣的背景，從過去開始，將人工替代物和培養(yǎng)細(xì)胞使之組織化而成的移植物直接移植的技術(shù)受到關(guān)注。其代表性的例子可以舉出人工皮膚和培養(yǎng)皮膚。在這里，使用合成高分子的人工皮膚具有產(chǎn)生排斥反應(yīng)等的可能性，不宜作為移植用皮膚。另一方面，由于培養(yǎng)皮膚是將患者本人的部分正常皮膚培養(yǎng)到所希望的大小，因此使用它不需擔(dān)心排斥反應(yīng)等，可以說是最自然的掩蔽劑。
一直以來，這樣的細(xì)胞培養(yǎng)是在玻璃表面上或在經(jīng)過種種處理的合成高分子的表面上進(jìn)行的。例如，經(jīng)過如γ射線照射、硅涂布等表面處理的各種聚苯乙烯材質(zhì)的容器等作為細(xì)胞培養(yǎng)用容器得到普及。使用這樣的細(xì)胞培養(yǎng)用容器培養(yǎng)、增殖的細(xì)胞，通過用胰島素之類的蛋白分解酶或化學(xué)藥品進(jìn)行處理，而從容器表面被剝離、回收。
但是，實(shí)施如上所述的化學(xué)藥品處理來回收增殖的細(xì)胞時(shí)，處理工程繁雜，混入雜質(zhì)的可能性大，并且增殖的細(xì)胞經(jīng)過化學(xué)處理而轉(zhuǎn)化或受到損傷，細(xì)胞原有的機(jī)能受到損害，具有如上等缺點(diǎn)。為了克服上述缺點(diǎn)，至今有若干技術(shù)被提案。
日本專利特公平2-23191號公報(bào)中記載了可以移植角蛋白組織的膜的制造方法，其特征為，在角蛋白組織的膜可以在容器表面上形成的條件下，在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)源自人新生兒的角化表皮細(xì)胞，使用酶來剝離角蛋白組織的膜。具體而言，公開了這樣的技術(shù)將3T3細(xì)胞作為飼養(yǎng)層使其增殖、多層化，使用作為蛋白質(zhì)分解酶的分散劑來回收細(xì)胞片。但是，該公報(bào)中所記載的方法具有如下缺點(diǎn)(1)分散劑源自菌，所回收的細(xì)胞片必須充分地洗凈。
(2)所培養(yǎng)的每種細(xì)胞其分散劑處理?xiàng)l件都不同，必須對該處理熟練。
(3)通過分散劑處理來培養(yǎng)的表皮細(xì)胞在病理學(xué)上被活化。
(4)通過分散劑處理，胞外基質(zhì)被分解。
(5)因此移植了該細(xì)胞片的患處易受感染。
然而，作為本發(fā)明對象的角膜上皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、以及結(jié)膜上皮細(xì)胞等的前眼部相關(guān)細(xì)胞，其細(xì)胞/細(xì)胞間的結(jié)合不如皮膚細(xì)胞強(qiáng)，即使使用上述分散劑，培養(yǎng)后也無法作為整張細(xì)胞片進(jìn)行剝離、回收。
為了解決該課題，最近提出，在除去了海綿層和上皮層的羊膜上培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞或結(jié)膜上皮細(xì)胞、并使之組織化，連同該羊膜一起作為移植用細(xì)胞片的技術(shù)(日本專利特開2001-161353號)。由于羊膜具有充分的膜強(qiáng)度，并且不具有抗原性，因此作為移植用細(xì)胞片的支持體比較合適，但是羊膜這種東西原先并不在眼內(nèi)，為了更精密地構(gòu)筑眼內(nèi)組織，還是希望制造僅用眼內(nèi)的細(xì)胞就具有充分強(qiáng)度的細(xì)胞片。
本發(fā)明以解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的問題為目標(biāo)來進(jìn)行。即，本發(fā)明的目的在于提供可以以保持細(xì)胞與細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)、以及細(xì)胞與基材間的基底膜類蛋白質(zhì)的狀態(tài)進(jìn)行回收的結(jié)構(gòu)缺陷少的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體。另外，本發(fā)明的目的在于提供一種不必使用分散劑等酶來進(jìn)行處理，而可以通過改變環(huán)境溫度，將所培養(yǎng)、增殖的細(xì)胞容易地并且以作為整張細(xì)胞片具有充分強(qiáng)度的狀態(tài)從支持體表面剝離、回收的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人們?yōu)榱私鉀Q上述課題，從各種角度加以探討，進(jìn)行了研究開發(fā)。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在用溫度響應(yīng)性聚合物覆蓋基材表面的細(xì)胞培養(yǎng)支持體上培養(yǎng)前眼部相關(guān)細(xì)胞，并根據(jù)需要使培養(yǎng)細(xì)胞層多層化，之后，使培養(yǎng)液溫度在上限臨界溶解溫度以上或在下限臨界溶解溫度以下，將所培養(yǎng)的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體緊密貼合于高分子膜上，將其連同高分子膜一起剝離，由此可以得到結(jié)構(gòu)缺陷少的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體。本發(fā)明基于上述認(rèn)識得以完成。
即，本發(fā)明提供可以以保持細(xì)胞與細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)、以及細(xì)胞與基材間的基底膜類蛋白質(zhì)的狀態(tài)回收的結(jié)構(gòu)缺陷少的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體。
另外，本發(fā)明提供前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體的制造方法，其特征為，在用相對于水的上限或下限臨界溶解溫度為0～80℃的溫度響應(yīng)性聚合物覆蓋基材表面而成的細(xì)胞培養(yǎng)支持體上培養(yǎng)細(xì)胞，根據(jù)需要按照常規(guī)方法使培養(yǎng)細(xì)胞層多層化，之后，(1)使培養(yǎng)液溫度在上限臨界溶解溫度以上或在下限臨界溶解溫度以下，(2)將所培養(yǎng)的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體緊密貼合于高分子膜上，(3)將其連同高分子膜一起剝離。
并且，本發(fā)明提供三維結(jié)構(gòu)體的制造方法，其特征為，將用上述制造法得到的緊密貼合于高分子膜上的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體再次附著在細(xì)胞培養(yǎng)支持體、用溫度響應(yīng)性聚合物覆蓋表面而成的細(xì)胞培養(yǎng)支持體、高分子膜、或其它細(xì)胞片等上，之后將緊貼著的高分子膜剝掉，通過重復(fù)上述操作來進(jìn)行多層化。
并且，本發(fā)明提供用于治療缺傷和/或創(chuàng)傷達(dá)到深部的組織的上述前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體。
另外，本發(fā)明提供一種治療方法，其特征為，對缺損和/或創(chuàng)傷達(dá)到深部的組織，移植上述前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體。
本發(fā)明還提供不僅在醫(yī)療領(lǐng)域，作為用于評價(jià)化學(xué)物質(zhì)、毒物或藥品的安全性的細(xì)胞而有用的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體。
具體實(shí)施例方式
作為在本發(fā)明的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體的制造中適合使用的細(xì)胞可以列舉角膜上皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)膜上皮細(xì)胞等、及上皮干細(xì)胞，其種類不受任何限制。本發(fā)明中，所謂前眼部相關(guān)細(xì)胞片是表示如上所述在活體中形成前眼部的各種細(xì)胞在培養(yǎng)支持體上以單層狀被培養(yǎng)，之后從支持體剝離的細(xì)胞片；所謂其三維結(jié)構(gòu)體是表示其各種表皮培養(yǎng)細(xì)胞片單獨(dú)或以組合的狀態(tài)被多層化而成的細(xì)胞片。
本發(fā)明的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體在培養(yǎng)時(shí)不受以分散劑、胰島素等為代表的蛋白質(zhì)分解酶的損傷。因此，從基材剝離的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體，保持細(xì)胞與細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)缺陷很少，并且強(qiáng)度高。由此，例如將所得到的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體以移植等為目標(biāo)而使用的情況下，由于本發(fā)明的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體具有充分的強(qiáng)度，所以患處與外部完全隔離。另外，本發(fā)明的細(xì)胞片，在培養(yǎng)時(shí)所形成的細(xì)胞與基材間的基底膜類蛋白質(zhì)也不會受到酶的破壞。因此，移植時(shí)能良好地與患處組織粘結(jié)，能夠?qū)嵤┬柿己玫闹委?。對以上事?shí)進(jìn)行具體說明，在使用胰島素等常用的蛋白質(zhì)分解酶時(shí)，細(xì)胞與細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)、以及細(xì)胞與基材間的基底膜類蛋白質(zhì)幾乎無法保持，因而，細(xì)胞成為各自分開的狀態(tài)被剝離。其中，關(guān)于作為蛋白質(zhì)分解酶的分散劑，已知以這樣的狀態(tài)被剝離，即，對細(xì)胞與基材間的基底膜類蛋白質(zhì)等破壞掉大部分、而對橋粒結(jié)構(gòu)保持10～60％，所得到的細(xì)胞片強(qiáng)度很弱。相對于此，本發(fā)明的細(xì)胞片，是橋粒結(jié)構(gòu)、基底膜類蛋白質(zhì)皆殘留80％或80％以上狀態(tài)的細(xì)胞片，可以得到前述的種種效果。
如上所示，本發(fā)明的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體細(xì)胞兼具細(xì)胞與細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)和細(xì)胞與基材間的基底膜類蛋白質(zhì)兩者，而且是高強(qiáng)度的細(xì)胞片，利用先有技術(shù)是完全無法得到的細(xì)胞片。
在細(xì)胞培養(yǎng)支持體中，用于覆蓋基材的溫度響應(yīng)性聚合物，其在水溶液中的上限臨界溶解溫度或下限臨界溶解溫度在0～80℃，更優(yōu)選在20℃～50℃。上限臨界溶解溫度或下限臨界溶解溫度若超過80℃，細(xì)胞就有死亡的可能性，因此不優(yōu)選。另外，上限臨界溶解溫度或下限臨界溶解溫度若低于0℃，通常細(xì)胞的增殖速度極度降低，或細(xì)胞會死亡，因此也不優(yōu)選。
本發(fā)明中使用的溫度響應(yīng)性聚合物可以是均聚物或共聚物的任一類。這樣的聚合物可以列舉例如日本專利特開平2-211865號公報(bào)中記載的聚合物。具體而言，例如，由以下的單體單獨(dú)聚合或者共聚得到。所使用的單體，可以列舉例如(甲基)丙烯酰胺化合物、N-(或者N，N-二)烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物、或者乙烯醚衍生物，對于共聚物，可以使用其中任意兩種或兩種以上。另外，也可以使用與上述單體以外的單體類的共聚，聚合物之間的接枝或共聚，或者聚合物、共聚物的混合物。另外，也可以在不損害聚合物原有性質(zhì)的范圍內(nèi)進(jìn)行交聯(lián)。
作為被實(shí)施覆蓋的基材，從通常用于培養(yǎng)細(xì)胞的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、有機(jī)玻璃等化合物開始，到通常能夠賦予形態(tài)的物質(zhì)，例如上述之外的高分子化合物、陶瓷類等全都可以使用。
溫度響應(yīng)性聚合物向支持體的覆蓋方法不受特別的限制，例如，可以按照日本專利特開平2-211865號公報(bào)中記載的方法進(jìn)行。即，可以對基材和上述單體或高分子，利用電子束照射(EB)、γ射線照射、紫外線照射、等離子處理、電暈處理、有機(jī)聚合反應(yīng)的任意種，或者利用涂布、混煉等物理吸附等進(jìn)行所述覆蓋。
本發(fā)明中所示的支持體材料，其特征為，表面有兩個(gè)區(qū)域覆蓋有溫度響應(yīng)性高分子的A區(qū)域，以及由(1)覆蓋有與細(xì)胞親和性低的高分子的區(qū)域，(2)覆蓋有與A區(qū)域不同量的溫度響應(yīng)性高分子的區(qū)域，(3)覆蓋有對與A區(qū)域不同的溫度響應(yīng)的高分子的區(qū)域，中的任意一個(gè)，或者(1)～(3)的任意2個(gè)或3個(gè)的組合構(gòu)成的B區(qū)域這兩個(gè)區(qū)域。
其制造方法，只要是最終具有上述結(jié)構(gòu)就不受任何限制，例如，可以列舉單獨(dú)或同時(shí)使用以下方法的方法①在基材表面全部上首先制作B區(qū)域，然后遮住最終要成為B區(qū)域的部分后追加A區(qū)域的方法，或者相反先制成A再追加B的方法；②預(yù)先覆蓋A、B兩層，用超聲波或掃描型儀器削去某一層的方法；③將覆蓋物質(zhì)平版印刷的方法等。
覆蓋區(qū)域的形態(tài)沒有任何限制，從上部觀察，可以舉出例如①由線和空白構(gòu)成的圖案、②水滴狀的圖案、③格子狀的圖案、其它特殊形狀的圖案、或者混合有上述形狀的狀態(tài)的圖案，而不受任何限制，不過考慮到眼內(nèi)各組織的狀態(tài)，優(yōu)選②中的圓形圖案。
覆蓋區(qū)域的大小沒有任何限制，不過考慮到眼內(nèi)各組織的大小、以及所培養(yǎng)的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體在剝離時(shí)的收縮，以圓形圖案使用其圓內(nèi)的細(xì)胞的時(shí)候，該圓的直徑在5cm或5cm以下，優(yōu)選在3cm或3cm以下，更優(yōu)選在2cm或2cm以下。使用圓的外側(cè)的時(shí)候，該圓的直徑在1mm或1mm以下，優(yōu)選在3mm或3mm以下，更優(yōu)選在5mm或5mm以下。
溫度響應(yīng)性高分子的覆蓋量最好是0.3～6.0μg/cm2的范圍，優(yōu)選0.5～3.5μg/cm2，更優(yōu)選0.8～3.0μg/cm2。覆蓋量少于0.2μg/cm2時(shí)，即使給與刺激，該高分子上的細(xì)胞也難以剝離，操作效率變得非常差，不優(yōu)選。相反，覆蓋量在6.0μg/cm2以上時(shí)，細(xì)胞難以附著在該區(qū)域，難以充分附著細(xì)胞。
本發(fā)明中的與細(xì)胞親和性低的高分子，只要是不使細(xì)胞附著的高分子就不受任何限制，例如，可以列舉聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇、纖維素等親水性高分子，或者硅酮高分子、氟高分子等的強(qiáng)疏水性高分子等。
本發(fā)明中，細(xì)胞的培養(yǎng)是在如上所述地制造的細(xì)胞培養(yǎng)支持體(例如，細(xì)胞培養(yǎng)皿)上進(jìn)行的。覆蓋在基材表面上的前述聚合物具有上限臨界溶解溫度時(shí)，培養(yǎng)基的溫度在該溫度以下，而覆蓋在基材表面上的前述聚合物具有下限臨界溶解溫度時(shí)，培養(yǎng)基的溫度在該溫度以上，除此之外，培養(yǎng)基的溫度不受特別的限制。但是，在導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞無法增殖的低溫區(qū)域、或?qū)е屡囵B(yǎng)細(xì)胞死亡的高溫區(qū)域中的培養(yǎng)顯然是不合適的。溫度以外的培養(yǎng)條件只要按照常規(guī)方法就可以，不受特別的限制。例如，對于使用的培養(yǎng)基，可以是添加有公知的胎牛血清(FCS)等血清的培養(yǎng)基，另外也可以是不添加這類血清的無血清培養(yǎng)基。
本發(fā)明的方法中，按照前述方法，根據(jù)前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體的使用目的來設(shè)定培養(yǎng)時(shí)間就可以。所培養(yǎng)的細(xì)胞從支持體材料剝離回收時(shí)，將所培養(yǎng)的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體緊密貼合在高分子膜上，通過將附著有細(xì)胞的支持體材料的溫度調(diào)節(jié)到支持體基材的覆蓋聚合物的上限臨界溶解溫度以上或者下限臨界溶解溫度以下，可以連同高分子膜一起進(jìn)行剝離。另外，細(xì)胞片的剝離可以在培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液中進(jìn)行，也可以在其它等滲液中進(jìn)行，可以適應(yīng)目的進(jìn)行選擇。緊密貼合前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體時(shí)所使用的高分子膜，可以列舉例如聚二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯、聚乙烯、纖維素及其衍生物、幾丁質(zhì)(chitin)、殼聚糖(chitosan)、膠原蛋白、烏拉坦(urethane)等。
本發(fā)明中的三維結(jié)構(gòu)體的制造方法不受特別的限定，例如，可以列舉通常所知的3T3細(xì)胞作為飼養(yǎng)層進(jìn)行增殖、多層化的方法，或者利用上述緊貼在高分子膜上的表皮培養(yǎng)細(xì)胞片制造的方法等。具體而言，可以例示如下方法(1)將與高分子膜緊密貼合的細(xì)胞片附著在細(xì)胞培養(yǎng)支持體上，之后加入培養(yǎng)基，將高分子膜剝離細(xì)胞片，然后附著其它與高分子膜緊密貼合的細(xì)胞片，通過重復(fù)這些操作，使細(xì)胞片多層化的方法。
(2)將與高分子膜緊密貼合的細(xì)胞片翻轉(zhuǎn)，以高分子膜一側(cè)固定于細(xì)胞培養(yǎng)支持體上，在細(xì)胞片一側(cè)附著其它的細(xì)胞片，之后加入培養(yǎng)基，將高分子膜剝離細(xì)胞片，然后附著其它細(xì)胞片，重復(fù)上述操作，使細(xì)胞片多層化。
(3)將與高分子膜緊密貼合的細(xì)胞片彼此之間以細(xì)胞片一側(cè)緊密貼合的方法。
(4)將與高分子膜緊密貼合的細(xì)胞片接觸到活體的患處，使細(xì)胞片附著于活體組織上之后，剝掉高分子膜，再重疊其它的細(xì)胞片的方法。
本發(fā)明中的三維結(jié)構(gòu)體，不一定是僅由角膜上皮細(xì)胞形成。例如，也可以在由角膜上皮細(xì)胞形成的細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體上，疊加進(jìn)行同樣的操作制造的角膜內(nèi)皮細(xì)胞片和/或結(jié)膜上皮細(xì)胞片。在使三維結(jié)構(gòu)體更加接近活體內(nèi)的前眼部組織的方面，這種技術(shù)極為有效。
為了達(dá)到高收獲率地剝離、回收前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體的目的，可以單獨(dú)使用或者同時(shí)使用下述方法或者輕敲或者晃動細(xì)胞培養(yǎng)支持體的方法，或用移液器攪拌培養(yǎng)基的方法等。另外，根據(jù)需要也可以用等滲液等沖洗培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行剝離回收。
根據(jù)上述方法得到的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體，與以往的方法得到的產(chǎn)品相比，不論在剝離性方面，還是在非侵襲性方面，都極為優(yōu)良，強(qiáng)烈期待其在移植用角膜等的臨床應(yīng)用。特別是，本發(fā)明的前眼部相關(guān)細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)體與以往的移植細(xì)胞片不同，由于保持了基底膜類蛋白質(zhì)，所以即使在移植時(shí)較深地切削患處組織，也能成活?？梢哉J(rèn)為，這是可以提高患處的治療效率、進(jìn)一步可以減輕患者負(fù)擔(dān)的極其有效的技術(shù)。另外，本發(fā)明的方法中所使用的細(xì)胞培養(yǎng)支持體可以重復(fù)使用。
實(shí)施例以下基于本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明，但這些實(shí)施例對本發(fā)明沒有任何限定。
實(shí)施例1、2在市售的聚苯乙烯制細(xì)胞培養(yǎng)皿(ベクトン·デイツキンソン·ラブウエア(Becton Dickinson Labware)公司制、フアルコン(FALCON)3001佩氏培養(yǎng)皿(Petri dish)(直徑3.5cm))上，涂布0.10ml40％(實(shí)施例1)、50％(實(shí)施例2)N-異丙基丙烯酰胺單體的異丙醇溶液。在該涂布面上蓋上帶有一個(gè)2cm直徑的孔的直徑3.5cm的金屬制掩模后，保持原狀地照射0.25MGy強(qiáng)度的電子束，將聚N-異丙基丙烯酰胺(PIPAAm)在培養(yǎng)皿表面上固定成圓形(島狀部分。掩模下的部分沒有受到電子束成為什么都沒有覆蓋的海部分。)。然后剝下該金屬制掩模，涂布0.10ml20％的異丙醇溶液。然后，這次僅在該圓形部分放上直徑2cm的圓形金屬制掩模，保持原狀地照射0.25MGy強(qiáng)度的電子束，在圓形PIPAAm層的外側(cè)固定化聚丙烯酰胺。照射后取下金屬制掩模，用離子交換水洗凈培養(yǎng)皿，除去殘余的單體和未與培養(yǎng)皿結(jié)合的PIPAAm，在凈化臺內(nèi)干燥，用環(huán)氧乙烷氣體滅菌，得到細(xì)胞培養(yǎng)支持體材料。在這里，島部分的PIPAAm的覆蓋量，根據(jù)在不使用掩模以外與上面完全相同的條件下制造的細(xì)胞培養(yǎng)支持體材料求得。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該條件下，溫度響應(yīng)性高分子在基材表面分別覆蓋1.6μg/cm2(實(shí)施例1)、2.2μg/cm2(實(shí)施例2)。在得到的細(xì)胞培養(yǎng)支持體材料上，通過常規(guī)方法培養(yǎng)正常兔角膜上皮細(xì)胞(使用培養(yǎng)基コルネパツク(クラボウ(株)制)、37℃、5％CO2下)。其結(jié)果，角膜上皮細(xì)胞在兩種細(xì)胞培養(yǎng)支持體材料上都僅在中心部的圓形部分正常地附著、增殖。培養(yǎng)14日后，在所培養(yǎng)的細(xì)胞的上面覆蓋直徑2cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜，輕輕地吸去培養(yǎng)基，通過連同細(xì)胞培養(yǎng)支持體材料一起在20℃培養(yǎng)30分鐘后冷卻，兩種細(xì)胞培養(yǎng)支持體材料上的細(xì)胞皆連同覆蓋在其上的膜一起剝離。所覆蓋的膜都可以很容易地從兩種細(xì)胞片剝下來。并且，剝離下來的細(xì)胞片保持細(xì)胞與細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)、以及細(xì)胞與基材間的基底膜類蛋白質(zhì)，且作為整張細(xì)胞片具有充分的強(qiáng)度。
另外，上述各實(shí)施例中，“低溫處理”是在20℃下培養(yǎng)30分鐘的條件下進(jìn)行，本發(fā)明中的“低溫處理”不限于這一溫度和時(shí)間。本發(fā)明中的“低溫處理”優(yōu)選的溫度條件在0℃～30℃，優(yōu)選的處理時(shí)間為2分鐘～1小時(shí)。
實(shí)施例3在實(shí)施例1的細(xì)胞培養(yǎng)支持體上，除將培養(yǎng)基換成含有絲裂霉素C的常用的保綠培養(yǎng)基(green′smedia)(DMEM+AB(用于制造飼養(yǎng)層)、用于源自人新生兒的角化表皮細(xì)胞)之外，用同樣的方法培養(yǎng)正常兔角膜上皮細(xì)胞。其結(jié)果，培養(yǎng)支持體材料上的角膜上皮細(xì)胞僅在中心部的圓形部分正常地附著、增殖，并且多層化。培養(yǎng)16天后，連同細(xì)胞培養(yǎng)支持體材料一起在20℃培養(yǎng)30分鐘并冷卻，從而剝離多層化角膜上皮細(xì)胞。所剝離的多層化角膜上皮細(xì)胞(三維結(jié)構(gòu)體)是圓形的，保持了細(xì)胞與細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)、以及細(xì)胞與基材間的基底膜類蛋白質(zhì)，作為整張細(xì)胞片具有充分的強(qiáng)度。
比較例1、2除了將制造實(shí)施例1的細(xì)胞培養(yǎng)支持體時(shí)的單體溶液濃度分別變成5％(比較例1)、60％(比較例2)以外，與實(shí)施例1同樣地制造細(xì)胞培養(yǎng)支持體材料。得到的細(xì)胞培養(yǎng)支持體上的覆蓋量分別為0.1μg/cm2(比較例1)、6.2μg/cm2(比較例2)。之后，按照與實(shí)施例1同樣的操作，嘗試培養(yǎng)、剝離正常兔角膜上皮細(xì)胞。其結(jié)果，比較例1的支持體上的細(xì)胞即使進(jìn)行低溫處理也難以剝離，相反，在比較例2的支持體上難以附著細(xì)胞，難以使細(xì)胞充分增殖，兩者的細(xì)胞培養(yǎng)支持體作為培養(yǎng)基材全都不能令人滿意。
實(shí)施例4按照常規(guī)方法從兔角膜回收角膜內(nèi)皮細(xì)胞。在實(shí)施例1的接合了聚異丙基丙烯酰胺(PIPAAm)的培養(yǎng)皿上以2×106cells/cm2的細(xì)胞密度進(jìn)行接種，按照常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)(使用培養(yǎng)基含10％胎牛血清的DMEM、37℃、5％CO2下)。其結(jié)果，該角膜內(nèi)皮細(xì)胞也僅在中心部的圓形部分正常地附著、增殖。10天后，在確認(rèn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞成為鋪滿狀態(tài)之后，與實(shí)施例1同樣地在所培養(yǎng)的細(xì)胞上覆蓋直徑2cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜，輕輕地吸去培養(yǎng)基，連同細(xì)胞培養(yǎng)支持體材料一起在20℃培養(yǎng)30分鐘并冷卻，從而將細(xì)胞與覆蓋在其上的膜一起剝離。所覆蓋的膜可以很容易地從細(xì)胞片剝下來。并且，剝離下來的細(xì)胞片保持細(xì)胞與細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)、以及細(xì)胞與基材間的基底膜類蛋白質(zhì)，作為整張細(xì)胞片具有充分的強(qiáng)度。
實(shí)施例5在實(shí)施例2的細(xì)胞培養(yǎng)支持體材料的制造方法中，首先，將直徑2cm的圓形金屬制掩模放置于培養(yǎng)皿的中心，在周圍固定PIPAAm，然后覆蓋開有直徑2cm的圓形孔的金屬制掩模，從而制造在中心部固定了聚丙烯酰胺的細(xì)胞培養(yǎng)支持體材料(與實(shí)施例1的內(nèi)側(cè)高分子層和外側(cè)高分子層剛好相反)?？淄鈧?cè)的PIPAAm的覆蓋量為2.1μg/cm2。然后，按照常規(guī)方法從兔眼回收結(jié)膜上皮細(xì)胞。在前面的接合了高分子的培養(yǎng)皿上以2×105cells/cm2的細(xì)胞密度進(jìn)行接種，按照常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)(使用培養(yǎng)基含10％胎牛血清的MEM、37℃、5％CO2下)。其結(jié)果，被接種的結(jié)膜上皮細(xì)胞僅在中心部分的周圍正常地附著、增殖。10天后，在確認(rèn)結(jié)膜上皮細(xì)胞成為鋪滿狀態(tài)之后，與實(shí)施例1同樣地在所培養(yǎng)的細(xì)胞上覆蓋聚二氟乙烯(PVDF)膜，輕輕地吸去培養(yǎng)基，連同細(xì)胞培養(yǎng)支持體材料一起在20℃培養(yǎng)30分鐘并冷卻，從而將細(xì)胞和覆蓋在其上的膜一起剝離。所覆蓋的膜可以很容易地從細(xì)胞片剝下來。并且，剝離下來的結(jié)膜上皮細(xì)胞片保持了細(xì)胞與細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)、以及細(xì)胞與基材間的基底膜類蛋白質(zhì)，作為整張細(xì)胞片具有充分的強(qiáng)度。
實(shí)施例6對不經(jīng)冷卻而輕輕地除去培養(yǎng)基的實(shí)施例2的培養(yǎng)皿上的角膜上皮細(xì)胞片，立即重疊實(shí)施例1中剝離下來的角膜上皮細(xì)胞片。之后，輕輕地加入實(shí)施例3中使用的培養(yǎng)基，剝?nèi)ゾo密貼合的高分子膜。以該狀態(tài)培養(yǎng)2天，從而得到角膜上皮細(xì)胞的多層化細(xì)胞片(三維結(jié)構(gòu)體)。所得到的角膜上皮細(xì)胞的多層化細(xì)胞片通過與實(shí)施例3同樣地實(shí)施低溫處理，從支持體表面剝離。被剝離的角膜上皮細(xì)胞的多層化細(xì)胞片(三維結(jié)構(gòu)體)，作為整張細(xì)胞片具有充分的強(qiáng)度。
實(shí)施例7對不經(jīng)冷卻而輕輕地除去培養(yǎng)基的實(shí)施例4的培養(yǎng)皿上的角膜內(nèi)皮細(xì)胞片，立即重疊實(shí)施例3中剝離下來的角膜上皮細(xì)胞的多層化細(xì)胞片。之后，輕輕地加入實(shí)施例3中使用的培養(yǎng)基，剝?nèi)ゾo密貼合的高分子膜。以該狀態(tài)培養(yǎng)2天，得到具有角膜內(nèi)皮細(xì)胞層的角膜上皮細(xì)胞的多層化細(xì)胞片(三維結(jié)構(gòu)體)。得到的角膜上皮細(xì)胞的多層化細(xì)胞片通過與實(shí)施例3同樣地實(shí)施低溫處理，從支持體表面剝離。剝離下來的三維結(jié)構(gòu)體保持了細(xì)胞與細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)、以及細(xì)胞與基材間的基底膜類蛋白質(zhì)，作為整張細(xì)胞片具有充分的強(qiáng)度。
實(shí)施例8對不經(jīng)冷卻而輕輕地除去培養(yǎng)基的實(shí)施例4的培養(yǎng)皿上的角膜內(nèi)皮細(xì)胞片，首先加入含有5％IV膠原蛋白的培養(yǎng)基(除含有膠原蛋白以外，與實(shí)施例4的培養(yǎng)基同樣的培養(yǎng)基)，按照原樣靜置20分鐘。之后，再次不經(jīng)冷卻而輕輕地除去培養(yǎng)基。對殘留在培養(yǎng)皿上的角膜內(nèi)皮細(xì)胞片，立即重疊實(shí)施例3中剝離的角膜上皮細(xì)胞的多層化細(xì)胞片。之后，輕輕地加入實(shí)施例3中使用的培養(yǎng)基，剝?nèi)ゾo密貼合的高分子膜。以該狀態(tài)培養(yǎng)2天，得到具有角膜內(nèi)皮細(xì)胞層的角膜上皮細(xì)胞的多層化細(xì)胞片(三維結(jié)構(gòu)體)。得到的角膜上皮細(xì)胞的多層化細(xì)胞片通過與實(shí)施例3同樣地實(shí)施低溫處理，從支持體表面剝離。剝離下來的三維結(jié)構(gòu)體作為整張細(xì)胞片具有充分的強(qiáng)度。
實(shí)施例9對不經(jīng)冷卻而輕輕地除去培養(yǎng)基的實(shí)施例5的培養(yǎng)皿上的開有孔的結(jié)膜上皮細(xì)胞片，立即放置實(shí)施例7中剝離的具有角膜內(nèi)皮細(xì)胞層的角膜上皮細(xì)胞的多層化細(xì)胞片(三維結(jié)構(gòu)體)，并使其部分重疊。之后，輕輕地加入實(shí)施例3中使用的培養(yǎng)基，剝?nèi)ゾo密貼合的高分子膜。以該狀態(tài)培養(yǎng)2天，得到附著有結(jié)膜上皮細(xì)胞片、且具有角膜內(nèi)皮細(xì)胞層的角膜上皮細(xì)胞多層化細(xì)胞片(三維結(jié)構(gòu)體)。得到的三維結(jié)構(gòu)體通過與實(shí)施例3同樣地實(shí)施低溫處理，從支持體表面剝離。剝離下來的三維結(jié)構(gòu)體作為整張細(xì)胞片具有充分的強(qiáng)度。
實(shí)施例10按照常規(guī)方法，將實(shí)施例3中得到的角膜上皮細(xì)胞的多層化細(xì)胞片(三維結(jié)構(gòu)體)移植給角膜上皮細(xì)胞部分缺損的兔子。此時(shí)，直接將角膜上皮細(xì)胞的多層化細(xì)胞片縫合在創(chuàng)傷部位。大約3周后拆線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)角膜上皮細(xì)胞的多層化細(xì)胞片在眼球上良好地成活。
根據(jù)以上結(jié)果，使用本技術(shù)可以僅用原先位于眼內(nèi)的細(xì)胞來制成具有充分強(qiáng)度的細(xì)胞片。這一事實(shí)就治療的效率化、由此減輕患者的負(fù)擔(dān)，并且構(gòu)筑更精密的組織方面來說，可以認(rèn)為是一種極其有效的技術(shù)。
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性本發(fā)明的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體，不會像用分散劑處理的情況那樣分解上皮粘附素(E-cadherin)、層粘連蛋白5(laminin5)，并且結(jié)構(gòu)缺陷極少，強(qiáng)烈地期待其在皮膚移植等的臨床應(yīng)用。因而，本發(fā)明是在細(xì)胞工學(xué)、醫(yī)用工學(xué)等的醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域極為有用的發(fā)明。
權(quán)利要求
1.前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體，該前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體結(jié)構(gòu)缺陷少，保持了細(xì)胞與細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)、以及細(xì)胞與基材間的基底膜類蛋白質(zhì)，以作為整張細(xì)胞片具有充分強(qiáng)度的狀態(tài)被回收。
2.根據(jù)權(quán)利要求1記載的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體，該前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體未經(jīng)蛋白質(zhì)分解酶處理而從基材剝離。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2記載的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體，其特征為，所述前眼部相關(guān)細(xì)胞是角膜上皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)膜上皮細(xì)胞以及上皮干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3的任意一項(xiàng)記載的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體，所述三維結(jié)構(gòu)體是將角膜上皮細(xì)胞進(jìn)行多層化培養(yǎng)而成的三維結(jié)構(gòu)體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～3的任意一項(xiàng)記載的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體，所述三維結(jié)構(gòu)體是至少由角膜上皮細(xì)胞片或其多層化物與角膜內(nèi)皮細(xì)胞組合而成的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～3的任意一項(xiàng)記載的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體，所述三維結(jié)構(gòu)體是在權(quán)利要求5的三維結(jié)構(gòu)體上進(jìn)一步組合結(jié)膜上皮細(xì)胞而成的。
7.前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體的制造方法，其特征為，在用相對于水的上限或下限臨界溶解溫度為0～80℃的溫度響應(yīng)性高分子覆蓋基材表面而成的細(xì)胞培養(yǎng)支持體上培養(yǎng)細(xì)胞，根據(jù)需要按照常規(guī)方法使培養(yǎng)細(xì)胞層多層化，之后，(1)使培養(yǎng)液溫度在上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，進(jìn)一步根據(jù)需要，(2)將所培養(yǎng)的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或其多層化細(xì)胞片緊密貼合于高分子膜上，(3)將其連同高分子膜一起剝離。
8.根據(jù)權(quán)利要求7記載的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體的制造方法，其特征為，使用表面具有兩個(gè)區(qū)域的細(xì)胞培養(yǎng)支持體，該兩個(gè)區(qū)域是覆蓋有溫度響應(yīng)性高分子的A區(qū)域，以及由(1)覆蓋有與細(xì)胞親和性低的高分子的區(qū)域，(2)覆蓋有與A區(qū)域不同量的溫度響應(yīng)性高分子的區(qū)域，(3)覆蓋有對與A區(qū)域不同的溫度響應(yīng)的高分子的區(qū)域，中的任意一個(gè)，或者(1)～(3)中的任意2個(gè)或3個(gè)的組合構(gòu)成的B區(qū)域。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8記載的三維結(jié)構(gòu)體的制造方法，其包括將權(quán)利要求7中得到的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體，再次附著到細(xì)胞培養(yǎng)支持體、用溫度響應(yīng)性聚合物覆蓋表面的細(xì)胞培養(yǎng)支持體、高分子膜等上進(jìn)行疊加，或者將權(quán)利要求7中得到的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體的一部分或全部附著到其它細(xì)胞片等上進(jìn)行疊加。
10.根據(jù)權(quán)利要求7～9的任意一項(xiàng)記載的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體的制造方法，所述剝離是未經(jīng)蛋白質(zhì)分解酶處理的。
11.根據(jù)權(quán)利要求7～9的任意一項(xiàng)記載的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體的制造方法，所述溫度響應(yīng)性聚合物是聚(N-異丙基丙烯酰胺)。
12.根據(jù)權(quán)利要求7～9的任意一項(xiàng)記載的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體的制造方法，所述高分子膜是經(jīng)親水化處理的聚二氟乙烯。
13.根據(jù)權(quán)利要求7～9的任意一項(xiàng)記載的三維結(jié)構(gòu)體的制造方法，所述其它細(xì)胞片由角膜上皮細(xì)胞片及其多層化細(xì)胞片、角膜內(nèi)皮細(xì)胞片、以及結(jié)膜上皮細(xì)胞片，以及根據(jù)權(quán)利要求4記載的制造方法制造的三維結(jié)構(gòu)體中的一種或兩種或兩種以上構(gòu)成。
14.按照權(quán)利要求7～13的任意一項(xiàng)記載的方法制造的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體。
15.根據(jù)權(quán)利要求1～6、及14的任意一項(xiàng)記載的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體，其用于治療前眼部組織的一部分或全部損傷或缺損的患處。
16.一種治療方法，其特征為，對前眼部組織的一部分或全部損傷或缺損的患處，移植權(quán)利要求1～6、及14的任意一項(xiàng)記載的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體。
全文摘要
本發(fā)明提供前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)缺陷少，以保持細(xì)胞與細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)、以及細(xì)胞與基材間的基底膜類蛋白質(zhì)的狀態(tài)被回收。在用相對于水的上限或下限臨界溶解溫度為0～80℃的溫度響應(yīng)性聚合物覆蓋基材表面而成的細(xì)胞培養(yǎng)支持體上培養(yǎng)細(xì)胞，根據(jù)需要使培養(yǎng)細(xì)胞層多層化，之后，(1)使培養(yǎng)液溫度在上限臨界溶解溫度以上或在下限臨界溶解溫度以下，根據(jù)需要，(2)將所培養(yǎng)的前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體緊密貼合在高分子膜上，(3)將其連同高分子膜一起剝離，由此制造前眼部相關(guān)細(xì)胞片或三維結(jié)構(gòu)體。
文檔編號A61F9/007GK1742081SQ0382593
公開日2006年3月1日 申請日期2003年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月6日
發(fā)明者大和雅之, 岡野光夫 申請人:賽爾斯德株式會社