專利名稱：前藥、其作為醫(yī)藥的應(yīng)用及其制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種前藥，其可以利用在藥物的靶標(biāo)部位和副作用表現(xiàn)的部位之間的酶活性有差異的酶，從而降低藥物的副作用。
背景技術(shù)：
大量結(jié)合有所說的糖基取代基的前藥已被研究。其主要目的是增加難溶性母體化合物的溶解度，以及基于葡萄糖苷酸結(jié)合體(conjugate)的類似物，實現(xiàn)無毒化。尤其是，后者要利用生物體的代謝功能。即，以癌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞中的β-葡萄糖苷酸酶和β-葡萄糖苷酶的活性增加的報告為基礎(chǔ)，基于使母體化合物只在患處表達(dá)，發(fā)揮功效的同時，降低不希望的副作用的想法，設(shè)計了前藥。以下對這些進(jìn)行詳細(xì)說明。
在腫瘤組織處，包括β-葡萄糖苷酸酶在內(nèi)的幾種葡萄糖苷酶的活性增高的研究報告已見發(fā)表(Fishman，Science 105，646-647，1947；Fishman andAnlyan，Cancer Res.7，808-814，1947；Bollet等，J.Clin.Invest.38，451，1959)。關(guān)于其它的疾病，已有報道表明在哮喘患者中，由肺泡巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞所釋放的β-葡萄糖苷酸酶使肺泡灌洗液(BALF)中的β-葡萄糖苷酸酶的活性有增高的傾向(Tonnel等，Lancet 8339，1406-1408，1983；Murray等，N.Engl.J.Med.315，800-804，1986)，此外，也有報道表明β-葡萄糖苷酸酶和N-乙酰-D-氨基葡萄糖酶活性在風(fēng)濕患者的滑液中增高(Stephens等，J.Rheumatol.2，393-400，1975)，AIDS患者的血清中的β-葡萄糖苷酸酶的活性比健康人高(Saha等，Clin.Chim.Acta.199，311-316，1991)，這些報道教導(dǎo)了在各種疾病中葡萄糖苷酶的活性增高或被排放到細(xì)胞外。其中，尤其引入注意的酶是β-葡萄糖苷酸酶，該酶是水解β-葡萄糖苷酸，催化釋放D-葡萄糖苷酸的反應(yīng)的酶，有報道表明在肝臟、肺、脾臟、腎臟等的大范圍的臟器或巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞中存在(Hayashi，J.Histochem.Cytochem.15，83-92，1967；Conchie等，Biochem.J.71，318-325，1959)。
在癌癥的化學(xué)治療中，減輕對腫瘤以外的正常組織或正常細(xì)胞的毒性是重要的課題。為解決該問題，雖然已開發(fā)了大量特異作用于腫瘤組織的抗癌劑，但是副作用的減輕都沒有達(dá)到所期的程度。
De Duve注意到在腫瘤組織含有葡萄糖苷酶的溶酶體中的水解酶，提出了利用抗癌劑的前藥的化學(xué)療法概念，該前藥通過這些水解酶和其它酶而水解活化為抗癌劑(Biological approaches to cancer chemotheraph，101-112，Academic press，Inc.，1961)。Connors和Whisson，通過小鼠實驗，顯示了抗癌劑苯胺芥子氣的抗癌作用和腫瘤細(xì)胞的β-葡萄糖苷酸酶的活性高度相關(guān)(Nature 210 866-867，1966)。Sweeney等也發(fā)表學(xué)說指出抗癌劑霉酚酸的作用機(jī)制是，霉酚酸在臟器被葡萄糖苷酸結(jié)合，并在腫瘤組織在β-葡萄糖苷酸酶的作用下水解成為活化形式的霉酚酸，從而發(fā)揮抗癌作用(Cancer Res.31，477-478，1971)。Young等基于抗癌劑苯胺芥子氣和霉酚酸的情況一樣，在體內(nèi)結(jié)合葡萄糖醛酸，并在腫瘤組織發(fā)生水解，從而發(fā)揮抗癌作用的假說，對癌癥患者進(jìn)行了臨床試驗，但是未發(fā)現(xiàn)抗癌作用和腫瘤組織的酶活性之間有足夠的相關(guān)性(Cancer 38，1887-1895，1976)。Baba等報告使用小鼠乳腺癌模型，靜脈給予抗癌劑5-氟尿嘧啶的葡萄糖苷酸衍生物，顯示了抑制作用(Gann69，283-284，1978)。
然而，總的來說，這些抗癌劑的糖衍生物前藥，由于在靶標(biāo)部位的水解不充分，因而在臨床上難以取得滿意結(jié)果。
接著，提議了預(yù)先給予腫瘤特異性抗體和各種酶結(jié)合得到的產(chǎn)物，并使用在該酶的作用下裂解變成為活性體的前藥的方法。這被稱為ADEPT(抗體指導(dǎo)的酶前藥療法，Antibody-directed enzyme prodrug therapy)，并進(jìn)行了大量的研究開發(fā)，然而，由于存在外源性抗體-酶復(fù)合物具有免疫抗原性、前藥在生物體內(nèi)活化不充分的問題，該方法并未獲得成功。
于是，Bosslet等(Br.J.Cancer 65，234-238，1992)嘗試了為使施于癌細(xì)胞的具有抗癌劑-糖衍生物結(jié)構(gòu)的前藥有效水解，不是直接將糖結(jié)合在抗癌劑上，而是通過間隔序列(spacer)合成化合物，從而發(fā)明結(jié)合有酶的免疫抗原性低的融合蛋白，以期改善上述問題。該過程中，研究者發(fā)現(xiàn)了單獨(dú)使用葡萄糖苷酶間隔序列衍生物就可發(fā)揮充分效果的衍生物，公開了應(yīng)用于抗癌劑以外的抗炎癥劑、免疫抑制劑、鈣拮抗劑、交感神經(jīng)激動劑等的作為前藥的葡萄糖苷酶間隔序列藥物結(jié)構(gòu)(美國(美國專利)5621002(family patent(同族專利)歐洲(歐洲專利申請公開)642799，特開平7-149667)，美國5935995(同族專利EP 795334，特開平10-1495)，美國5955100(同族專利EP 595133，特開平6-293665))。
特開平6-293665中記載“化合物通過酶的作用而活化，該酶在健康人中主要存在于細(xì)胞內(nèi)，但在上述病理生理條件下也局部存在于細(xì)胞外”，“本發(fā)明的前藥尤其可應(yīng)用于存在有激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞及血小板的所有非腫瘤性疾病。在激活狀態(tài)下，上述細(xì)胞主要分泌可以位點特異性活化本發(fā)明前藥的細(xì)胞內(nèi)酶?！薄?br> 此外，還描述了基于在以抗腫瘤劑作為活性藥的情況下，該引用例的物質(zhì)不僅在腫瘤模型上被確認(rèn)，而且在多種炎癥模型中也得到確認(rèn)，進(jìn)而推定和在腫瘤中的一樣，在所有炎癥細(xì)胞相關(guān)的疾病中也都可確認(rèn)。
其所例示的情況延及“細(xì)胞增殖抑制劑，代謝拮抗劑，插入DNA的物質(zhì)，拓?fù)洚悩?gòu)酶I+II阻礙劑，烷化劑，核糖體滅活劑，酪氨酸磷酸激酶抑制劑，分化誘導(dǎo)劑，激素，激素激動劑，激素拮抗劑，改變對細(xì)胞增殖抑制劑的多效耐受性的物質(zhì)，鈣調(diào)素抑制劑，蛋白激酶C抑制劑，P-糖蛋白抑制劑，己糖激酶抑制劑，P-谷氨酰半胱氨酸合成酶或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶抑制劑，超氧化物歧化酶抑制劑，增殖關(guān)聯(lián)蛋白抑制劑，具有免疫抑制作用的物質(zhì)，免疫抑制劑，具有抗炎作用的物質(zhì)，非甾體類抗炎物質(zhì)，抗風(fēng)濕藥物，甾體，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用的物質(zhì)，有機(jī)酸衍生物、鎮(zhèn)痛劑、局部麻醉藥、抗心律不齊劑、鈣拮抗劑、抗組胺劑、磷酸二酯酶抑制劑、副交感神經(jīng)激動劑、交感神經(jīng)激動劑、具有水解酶抑制作用的物質(zhì)?！奔矗疽美那八庪m然顯示了可能對炎癥細(xì)胞相關(guān)的所有藥物都起作用，但是對于實際上哪種藥物起作用，哪種藥物不起作用，并未給出指標(biāo)。
實施例中，僅僅顯示了抗癌藥阿霉素、氮芥子氣和奎寧的抗腫瘤作用、阿霉素糖衍生物的抗炎作用以及急性毒性的測定，如上，盡管舉出了大量的治療藥物，但是并未記載顯示抗癌藥以外的藥物的具體藥效藥理作用的實施例，可以認(rèn)為實際有效性并未得到確認(rèn)。例如，盡管目前為止已進(jìn)行了大量關(guān)于甾體的糖衍生物的研究，但是，如Sugai等(WO95/09177)所指出的那樣，由于存在其安全性問題，以及在靶器官之外酶的水解作用導(dǎo)致的向活化體的轉(zhuǎn)換所出現(xiàn)的副作用的問題，因而開發(fā)處于困境。盡管對阿霉素已進(jìn)行了長期研究，在歐洲目前仍處于臨床前階段，臨床還未完成。
另外，作為癌癥之外的應(yīng)用，使用上述甾體的配糖體的前藥的研究很早就已開始，目的在對減輕副作用展開研究。Merck公司的研究人員在1962、1964、1966年揭示了甾體的配糖體衍生物有減輕甾體的腎萎縮、體重減輕、骨質(zhì)疏松癥、白血球數(shù)減少等副作用的可能性(GB1015396，GB1059548，US3185682，Hirschmann等，J.Am.Chem.Soc.86，3903-3904，1964)。但是，甾體的配糖體前藥的穩(wěn)定性極差，在靶組織之外配糖體鍵斷裂，產(chǎn)生副作用的問題已清楚，并且Sugai等(WO95/09177)也嘗試了通過保護(hù)糖的羥基來提高穩(wěn)定性，減少副作用。但是，目前還未達(dá)到臨床上的成功。由于甾體可在極微量下發(fā)揮作用，并且在生物體內(nèi)的許多組織具有多種生理作用，因而，可以說是即使進(jìn)行配糖體前藥化，也難以達(dá)到副作用減輕的藥物。
此外，F(xiàn)riend等注意到腸內(nèi)細(xì)菌所具有的葡萄糖苷酶，研究了具有甾體的糖衍生物結(jié)構(gòu)的前藥，該甾體作為潰瘍性大腸炎的治療藥會有產(chǎn)生副作用的問題(EP 123485，(同族專利特表昭60-501105；J.Med.Chem.27，261-266，1984；J.Med.Chem.28，51-57，1985；Pharmaceutical Res.10，1553-1562，1993)。但是，這些嘗試目前為止還未顯示出臨床上的成功。
如上述，利用以β-葡萄糖苷酸酶為首的生物體內(nèi)的酶的被稱為藥物-糖衍生物的前藥的開發(fā)很久以來就嘗試了，然而，其現(xiàn)狀是仍未和臨床上的成果結(jié)合。
作為患者數(shù)眾多的呼吸器官疾病之一的哮喘的治療方法，以目前的指導(dǎo)原則，推崇將長時間作用型β2激動劑和吸入甾體并用的療法。
支氣管擴(kuò)張劑β2激動劑的開發(fā)歷史是，由起初發(fā)現(xiàn)的作用于β1和β2兩種受體的β激動劑發(fā)展為以沙丁胺醇為代表的短時間作用型的第二代β2選擇性激動劑，進(jìn)而發(fā)展為以沙美特羅代表的第三代長時間作用型β2激動劑。短時間作用型β2激動劑，雖然是在哮喘加重時的治療和運(yùn)動誘發(fā)性支氣管痙攣的預(yù)防中應(yīng)該使用的藥物，但是卻在哮喘患者身上出現(xiàn)包含血液鉀濃度降低、血壓變化、心率增加、QT延長、骨骼肌震顫等原因不明的突發(fā)死亡的多種副作用?？梢哉J(rèn)為這些副作用尤其是因使用過度所致的(Burgraff等，Thorax56，567-569，2001；Bennett等，Thorax 49，771-774，1994；Rave，Respir.Med.95，21-25，2001)。

發(fā)明內(nèi)容
如上，可進(jìn)一步降低β2激動劑的心率增加、血壓變化的副作用的藥物的開發(fā)被認(rèn)為是臨床上非常重要的課題。一般說來短時間作用型β2激動劑作為吸入藥比作為口服藥使用的情況多。這些盡管是局部給藥，也出現(xiàn)上述副作用。
本發(fā)明的目的在于減輕如β2激動劑這樣的藥物發(fā)揮藥效的靶標(biāo)部位和出現(xiàn)副作用的部位不同的藥物的副作用。
如在現(xiàn)有技術(shù)欄中所說明的，先前技術(shù)都是在癌癥或炎癥組織等中利用增高的酶活性而轉(zhuǎn)變?yōu)槠浠钚泽w的前藥。而本發(fā)明是利用組織或臟器中的酶活性中，即使在正常狀態(tài)下臟器間也存在的酶活性差異的前藥。
本發(fā)明人研究了關(guān)于11-乙基-7，9-二羥基-10，11-二氫二苯并[b，f]慮平(11-ethyl-7，9-dihydroxy-10，11-di-hydrobenzo[b，f]thiepin)的葡萄糖苷酸結(jié)合體。該化合物口服后，在肝臟迅速進(jìn)行葡萄糖苷酸結(jié)合，在血液中大于等于99％以葡萄糖苷酸結(jié)合體存在。但是，其在藥理上的為靶組織的肺中，顯示出了藥理活性。研究結(jié)果表明該化合物的葡萄糖苷酸結(jié)合體在肺中脫去葡萄糖苷酸結(jié)合，由此推定在β-葡萄糖苷酸酶的作用下脫去結(jié)合而得到的母體化合物顯示出活性。(在實施例后作為參考例1詳細(xì)記載。)但是，未見關(guān)于β-葡萄糖苷酸酶活性的所在部位在各臟器或細(xì)胞水平的詳細(xì)研究報告。于是，在確認(rèn)了支氣管中的β-葡萄糖苷酸酶的所在部位后，如圖1所示發(fā)現(xiàn)其存在于細(xì)支氣管的上皮細(xì)胞(圖1中染為黑色的是β-葡萄糖苷酸酶)。(詳細(xì)試驗方法在實施例后作為參考例2記載。)。這樣，β-葡萄糖苷酸酶存在于特定部位的發(fā)現(xiàn)就成為本發(fā)明的基礎(chǔ)。
進(jìn)而，調(diào)查了β-葡萄糖苷酸酶在生物體的什么樣的臟器中大量含有。尤其是考慮到減輕β2激動劑對心臟、血壓的副作用的情況下，在各臟器之中對在肺和心臟中的β-葡萄糖苷酸酶的活性進(jìn)行調(diào)查被認(rèn)為在β2激動劑的葡萄糖苷酸前藥化中是極其重要的，測定了豚鼠的各臟器中的β-葡萄糖苷酸酶的活性。此時，假定為實際哮喘狀態(tài)，通過使用哮喘的動物模型，也對哮喘狀態(tài)時的β-葡萄糖苷酸酶的活性進(jìn)行了比較。即，抗原致敏豚鼠、非致敏豚鼠以及以抗原致敏豚鼠以抗原刺激引起休克時的各臟器中的β-葡萄糖苷酸酶活性進(jìn)行了比較。其結(jié)果示于圖2。(詳細(xì)試驗方法在實施例后以參考例3記載)。
如圖2中肺的結(jié)果所表明的那樣，可以知道炎癥狀態(tài)所致的酶活性增高是非常少的，正常狀態(tài)下存在的酶活性在每個組織差別很大。此外，還確認(rèn)了在β2激動劑表現(xiàn)副作用的部位的心臟，酶活性低。進(jìn)而，在確認(rèn)了在心臟是否有β-葡萄糖苷酸酶所在部位之后，如圖3所示，完全沒有看出有顯示β-葡萄糖苷酸酶活性的陽性圖像(圖3中的箭頭所表示的黑色部分，顯示蘇木精所染的細(xì)胞核染色圖像)。(詳細(xì)的試驗方法在實施例后以參考例4記載。)據(jù)報道培養(yǎng)的上皮細(xì)胞在培養(yǎng)基中釋放出構(gòu)成性β-葡萄糖苷酸酶(Scaggiante等，Exp.Cell Res.195，194-198，1991)。同樣地，據(jù)報道培養(yǎng)的人肺巨噬細(xì)胞也在培養(yǎng)基中釋放構(gòu)成性β-葡萄糖苷酸酶(Triggiani等，The J.Immunol.164，4908-4915，2000)。因此，為使β-葡萄糖苷酸酶在細(xì)胞外表現(xiàn)活性，并不一定需要由炎癥或細(xì)胞損傷中釋放，單在組織局部存在多高濃度的β-葡萄糖苷酸酶被認(rèn)為是重要的。若從此觀點進(jìn)行細(xì)胞組織學(xué)上的考察，可以說肺的細(xì)支氣管上皮細(xì)胞周圍的β-葡萄糖苷酸酶是具有驚人的局部活性的部位。
本發(fā)明人，基于上述知識，合成了將β2激動劑預(yù)先葡萄糖苷酸結(jié)合化所得到的化合物，通過吸入該葡萄糖苷酸結(jié)合體，在大量存在于肺細(xì)支氣管部位的β-葡萄糖苷酸酶的作用下，脫去結(jié)合，從而在局部發(fā)揮支氣管擴(kuò)張作用，即使一部分到達(dá)心臟，由于心臟幾乎沒有β-葡萄糖苷酸酶，因而，幾乎未發(fā)現(xiàn)β2激動劑特有的副作用，實際上在合成β2激動劑的葡萄糖苷酸結(jié)合體后，在常用的抗原誘發(fā)型豚鼠哮喘模型中，吸入給予后，顯示了完全的氣管收縮抑制作用，接著使用大鼠，對心率、血壓的副作用的調(diào)查結(jié)果表明完全沒有影響，由此，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供式(1)所示的化合物或其生理上可接受的鹽。
R-藥物 (1)(式中，R表示可被酶切斷的取代基，該酶是在藥物的靶標(biāo)部位和表現(xiàn)副作用部位的活性存在差異的酶；藥物是在酶的作用下切斷取代基而被活化的藥物)此外，本發(fā)明提供式(2)所示的化合物或其生理上可接受的鹽。
R’-藥物(2)(式中，R’表示可被β-葡萄糖苷酸酶切斷的取代基，該β-葡萄糖苷酸酶是在呼吸器官活性高，而在心臟活性低的酶；藥物表示在酶的作用下切斷取代基而被活化的呼吸器官用藥物)進(jìn)而，本發(fā)明提供藥物組合物，該組合物同時含有有效量的式(1)或式(2)化合物以及制藥上適當(dāng)?shù)那疑韺W(xué)上能允許的賦形劑、添加劑、和/或其它活性化合物及助劑。
另外，本發(fā)明提供式(1)或式(2)所示的化合物或其生理學(xué)上能允許的鹽在制造藥物組合物中的應(yīng)用，其中，該藥物組合物是利用在藥物的靶標(biāo)部位和表現(xiàn)副作用的部位之間存在酶活性差異的酶的前藥，其只在靶標(biāo)部位發(fā)揮效果。
此外，本發(fā)明還提供含有以糖為取代基的β2激動劑的制造方法，其包括在丙酮、乙腈、二噁烷、四氫呋喃的任何一種溶劑中，在堿共存下，使帶有羥基的β2激動劑和糖鹵代物衍生物反應(yīng)，然后在堿水解作用下將其脫保護(hù)。
此外，本發(fā)明還提供帶有以糖為取代基的β2激動劑的制造方法，其包括在具有多個羥基的β2激動劑和含有堿基的混合物中添加鹵化的芐基衍生物，選擇性的保護(hù)羥基，然后進(jìn)行糖基化，將其中間體堿水解后，進(jìn)行加氫。
上式(2)所示的本發(fā)明的化合物，在經(jīng)吸入法給藥的情況下，在肺細(xì)支氣管上皮細(xì)胞被切斷得到的活化型是直接作用于支氣管平滑肌，發(fā)揮藥效的藥物，不用通過白血球等的炎癥產(chǎn)生的細(xì)胞的活化所致的β-葡萄糖苷酸酶活性增高，而主要是利用來自上皮細(xì)胞的β-葡萄糖苷酸酶活性而被切斷的前藥。
因此，本發(fā)明也可以提供呼吸器官疾病的治療方法，其包括給予需要治療呼吸器官疾病的患者有效量的式(2)所示的化合物或其生理學(xué)上能允許的鹽。
R’-藥物(2)(式中，R’表示可被β-葡萄糖苷酸酶切斷的取代基，該β-葡萄糖苷酸酶是在呼吸器官活性高，而在心臟活性低的酶；藥物表示在酶的作用下切斷取代基而被活化的呼吸器官用藥物)在該治療方法中，作為呼吸器官用藥物，例如支氣管擴(kuò)張劑、β2激動劑等，具體可舉出，沙丁胺醇(salbutamol)、沙美特羅(salmeterol)、馬布特羅(mabuterol)、克倫特羅(clenbuterol)、吡布特羅(pirbuterol)、美喘清(procaterol)、非諾特羅(fenoterol)、氯丁喘胺(tulobuterol)、福莫特羅(formoterol)、海索那林(hexoprenaline)、特布他林(terbuta-line)、喘速寧(trimetoquinol)、氯喘通(chlorprenaline)、間羥異丙腎上腺素(orciprenaline)、甲氧苯丙甲胺(methoxy-phenamine)、甲基麻黃堿(methylephedrine)、麻黃堿(ephedrine)、異丙腎上腺素(isoprenaline)等。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方式是，具有羥基尤其是酚羥基的β2激動劑的O-葡萄糖苷酸構(gòu)成的呼吸器官用前藥。例如，3-O-(β-D-葡萄糖苷酸基)沙丁胺醇、3-O-(β-D-葡萄糖苷酸基)沙美特羅、3-O-(β-D-葡萄糖苷酸基)吡布特羅、3-O-(β-D-葡萄糖苷酸基)非諾特羅、3-O-(β-D-葡萄糖苷酸基)氯丁喘胺、4-O-(β-D-葡萄糖苷酸基)福莫特羅、3或4-O-(β-D-葡萄糖苷酸基)異丙喘寧、3-O-(β-D-葡萄糖苷酸基)特布他林、6或7-O-(β-D-葡萄糖苷酸基)喘速寧、3-O-(β-D-葡萄糖苷酸基)間羥異丙腎上腺素、3或4-O-(β-D-葡萄糖苷酸基)異丙腎上腺素、8-O-(β-D-葡萄糖苷酸基)美喘清等。
在背景技術(shù)部分所說明的現(xiàn)有技術(shù)中，如果不進(jìn)行在藥物和葡萄糖苷酸中間插入間隔序列等的操作的話，在腫瘤細(xì)胞就不能有效利用β-葡萄糖苷酸酶將藥物的葡萄糖苷酸結(jié)合體切斷成藥物和葡萄糖苷酸，而本發(fā)明證明了，不用插入這樣的間隔序列，就可在肺的細(xì)支氣管的局部將吸入的藥物的葡萄糖苷酸結(jié)合體有效切斷。
本發(fā)明并非是利用腫瘤組織或炎癥組織增高的β-葡萄糖苷酸酶活性，而是通過發(fā)現(xiàn)在正常狀態(tài)下具有非常高的β-葡萄糖苷酸酶活性的組織，完成了發(fā)明。由于在細(xì)支氣管的上皮細(xì)胞存在高β-葡萄糖苷酸酶活性，可以認(rèn)為在為有效切斷而插入空間序列并非是必須的，但是為在前藥合成方面簡單和安全等，可以插入任意適當(dāng)?shù)目臻g序列。將這樣的空間序列插入式(1)的R和藥物中間得到的化合物，或?qū)⑦@樣的空間序列插入式(2)的R’和藥物中間得到的化合物都包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。


圖1是顯示在豚鼠肺細(xì)支氣管上皮上，β-葡萄糖苷酸酶以非常大的量局部存在的顯微鏡照片(倍率100倍)；圖2是顯示豚鼠的各臟器中的β-葡萄糖苷酸酶活性的圖；圖3是顯示豚鼠心臟中未發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酸酶活性的顯微鏡照片(倍率50倍)；圖4是顯示沙丁胺醇葡萄糖苷酸對豚鼠的抗原誘發(fā)性器官收縮反應(yīng)的抑制作用的圖；圖5是顯示異丙腎上腺素葡萄糖苷酸對豚鼠的抗原誘發(fā)性器官收縮反應(yīng)的抑制作用的圖；圖6是顯示沙丁胺醇葡萄糖苷酸對血壓和心率的影響的圖；圖7是顯示異丙腎上腺素葡萄糖苷酸對血壓和心率的影響的圖。
具體實施例方式
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)中所示的利用在癌組織或炎癥組織中增高的酶活性或利用腸內(nèi)細(xì)菌所具有的酶活性的技術(shù)不同，是利用靶標(biāo)部位和副作用表現(xiàn)部位間的酶活性差異的前藥。
因此，本發(fā)明中藥物必須是靶標(biāo)部位和副作用表現(xiàn)部位不同的藥物。尤其優(yōu)選副作用表現(xiàn)部位特定、被限定的藥物。成為其靶標(biāo)部位和副作用表現(xiàn)部位的受體存在的部位被限定的各種受體激動劑、阻斷劑可以成為本發(fā)明的對象藥物。此外，由于需要結(jié)合可被酶切斷的取代基，優(yōu)選具有與此相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)的藥物。例如，結(jié)合可被β-葡萄糖苷酸酶切斷的糖的情況下，優(yōu)選具有羥基、氨基、羧基、巰基的化合物。尤其是從作為物質(zhì)的穩(wěn)定性、容易被葡萄糖苷酸酶切斷的方面考慮，具有羥基的化合物是適合的，具有酚羥基的藥物最為適合。β2激動劑大多具有羥基、尤其是酚羥基結(jié)構(gòu)，它們作為本發(fā)明的藥物是適合的。
藥物的靶標(biāo)部位指的是藥物發(fā)揮藥效的細(xì)胞、組織、臟器、器官等。此外，副作用表現(xiàn)部位指的是藥物發(fā)揮不好效果的細(xì)胞、組織、臟器、器官等。
本發(fā)明中呼吸器官指的是氣管和肺。
靶標(biāo)部位是呼吸器官的時候，本發(fā)明的藥物是針對支氣管哮喘、小兒哮喘、慢性支氣管炎、急性支氣管炎、肺炎、肺氣腫、肺結(jié)核等疾病的治療藥物。
副作用表現(xiàn)部位是心臟的時候，本發(fā)明的藥物，和β2激動劑一樣，以心臟以外的器官作為靶標(biāo)器官，是在心臟表現(xiàn)副作用的藥物。
本發(fā)明中，支器官擴(kuò)張劑是通過吸入等，直接或間接作用于支氣管平滑肌的藥物。在支氣管中，β-葡萄糖苷酸酶局部存在于細(xì)支氣管的上皮細(xì)胞等，當(dāng)藥物在此處被游離時，由于平滑肌位于上皮細(xì)胞的正下方，因而可以有效的作用于平滑肌。
本發(fā)明中，作為β2激動劑，代表性的可以舉出沙丁胺醇、沙美特羅、馬布特羅、克倫特羅、吡布特羅、美喘清、非諾特羅、氯丁喘胺、福莫特羅、海索那林、特布他林、喘速寧、氯喘通、間羥異丙腎上腺素、甲氧苯丙甲胺、甲基麻黃堿、麻黃堿、異丙腎上腺素等，然而并不限于它們的衍生物，還可以是具有β2作用的藥物。
作為本發(fā)明的酶，例如可以舉出，β-葡萄糖苷酸酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶、N-乙酰-D-氨基半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、果糖苷酶和芳基硫酸酯酶。呼吸器官用藥的時候，尤其優(yōu)選β-葡萄糖苷酸酶。
酶為上述葡萄糖苷酶的時候，本發(fā)明中的單糖，例如是選自D-葡萄糖苷酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、N-乙酰-D-氨基半乳糖、D-甘露糖、L-果糖等的糖，寡糖例如是由上述2～5個單糖構(gòu)成，并且它們相互之間以α-或β-O-葡萄糖苷鍵結(jié)合而成。通常，單糖和藥物之間的鍵是α-或β-葡萄糖苷鍵。酶是β-葡萄糖苷酸酶的時候，優(yōu)選β-葡萄糖苷酸鍵。
本發(fā)明中，取代基指的是可在酶的作用下被切斷的糖殘基、硫酸基。例如酶是葡萄糖苷酶的時候，作為可被酶切斷的糖殘基，例如可以舉出，葡萄糖苷酸基、吡喃葡萄糖基、吡喃半乳糖基、乙酰-葡萄糖戊基(glucosamyl)、乙酰-吡喃半乳糖基、乙酰-吡喃基、吡喃甘露糖基、吡喃果糖基等。
不將藥物和取代基直接結(jié)合，如J.Med.Chem.2000，43，475所示的那樣，以β-葡萄糖苷酸作為誘發(fā)子(trigger)通過間隔序列和藥物結(jié)合是可能的。間隔序列是存在于藥物和取代基之間的結(jié)構(gòu)。優(yōu)選在靶標(biāo)器官被化學(xué)或酶性切斷，快速表達(dá)母體化合物的間隔序列。此時，優(yōu)選被非選擇性切斷的間隔序列，使用單純以水解等被切斷的間隔序列。
本發(fā)明中，由于酶活性高的靶標(biāo)器官被選擇，即使不使用間隔序列，如實施例所示在靶標(biāo)組織藥物可充分被游離。因此，盡管間隔序列不是必要的，但是依賴于選擇的藥物、器官和酶，有時使用間隔序列是有利的。
通過插入間隔序列，以酶切斷變得容易，或者是在由于立體障礙取代基反應(yīng)性低的情況下，空間序列對于可容易地轉(zhuǎn)變?yōu)槟阁w等的效果是可以考慮的。但是，有必要預(yù)先明了空間序列及其代謝物的毒性等的藥理性質(zhì)。
作為空間序列，如酯、氨基甲酰，其化學(xué)上穩(wěn)定的同時，最終在靶標(biāo)酶的作用下分解，母體化合物快速表達(dá)的序列很久以來就被廣泛應(yīng)用(H.Bundgaard Ed.，Design of Prodrugs，p.262-269，1985，Elsevier)。根據(jù)不同的藥物，可以使用(美國專利5621002(同族專利EP 642799，特開平7-149667)，美國專利5935995(同族專利EP 795334，特開平10-1495)，美國專利5955100(同族專利EP 595133，特開平6-293665)等中公開的空間序列。
作為糖或空間序列的結(jié)合位置，在主要以β作用藥為例時，可以考慮酚基、亞氨基或氨基。將糖部分或硫酸基直接或間接地結(jié)合在這些取代基上作為形成前藥的標(biāo)志。
作為本發(fā)明的化合物的具體例子，例如可舉出，3-O-(β-D-葡萄糖苷酸)-沙丁胺醇、4-O-(β-D-葡萄糖苷酸)-異丙腎上腺素、異丙腎上腺素-4-O-硫酸等。前兩者的制備方法示于實施例中。后者通過異丙腎上腺素和三氧化硫·三甲基胺絡(luò)合物的反應(yīng)制得。
本發(fā)明的前藥優(yōu)選通過局部給予使用。這樣，靶標(biāo)和副作用表現(xiàn)部位以外的部位受到酶活性的影響的可能性變低，成為更有效的前藥。呼吸器官用藥的情況下，優(yōu)選作為吸入用的藥物組合物使用。
將本發(fā)明的前藥作為吸入劑使用時，作為該吸入劑用添加劑，可以是一般吸入用藥物組合物中使用的任何添加劑，例如可以使用，噴射劑、固體賦形劑、液狀賦形劑、結(jié)合劑、潤滑劑、矯味劑、保存劑、穩(wěn)定劑、懸濁劑、分散劑、溶液劑、張力調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)整劑、可溶化劑等。作為噴射劑，可以使用液化氣體噴射劑、壓縮氣體等。此外，本發(fā)明的藥物組合物中，可以含有本發(fā)明前藥以外的醫(yī)藥成分作為活性成分。
本發(fā)明的藥物組合物中，前藥的含有量，盡管根據(jù)藥物、對象疾病、對象患者的年齡、性別、疾病的狀態(tài)等有所差異，但是通常相對于藥物組合物全體，是約0.01～99.9重量％，優(yōu)選是約0.1～50重量％，進(jìn)而優(yōu)選是約0.5～20重量％左右。吸入劑用添加劑等的各種添加劑的含量，盡管根據(jù)對象疾病、對象患者的年齡、性別、疾病的癥狀等有所差異，但是通常相對于藥物組合物全體，是約0.1～99重量％、優(yōu)選是約10～99重量％，進(jìn)而優(yōu)選是約50～99重量％左右，尤其優(yōu)選是約70～99重量％左右。
本發(fā)明的藥物組合物作為吸入劑使用時，可以使用公知的方法，制成粉末吸入劑、吸入用懸濁劑、吸入用溶液或膠囊狀吸入劑，用時使用適當(dāng)?shù)奈肫?，尤其?yōu)選使用粉末狀吸入劑。進(jìn)而，本發(fā)明的藥物組合物可以作為氣霧劑使用。
使用本發(fā)明的藥物組合物時，作為適用時使用的器具，可以使用市售的吸入器，例如，VENTOLIN ROTACAPS(Glaxo公司)、SPENHALER(注冊商標(biāo)，藤沢藥品工業(yè)(株))、INTAL SPINCAPS(Fisons公司)、ATROVENT ANDBEROTEC INHALETTEN(Boehringer Ingelheim公司)、FORADIL(Ciba公司)、BENTODISKS(Glaxo公司)、Pavlyzer(注冊商標(biāo)，帝人(株))、BRICANYLTURBUHALER(Astra公司)、MIAT INSUFFLATOR等。
本發(fā)明的前藥，只是結(jié)合糖等通常在體內(nèi)可安全代謝的基團(tuán)作為取代基，因而，其毒性比藥物本身的毒性變大的可能性低。由于適用于局部給予，以最小有效量給予就可以，能夠避免全身大量給予。因而，即使兒童也可以安全服用。尤其是，作為吸入劑或氣霧劑時，可以發(fā)揮顯著的局部作用效果。
靜脈給予、肌內(nèi)給予等情況下，與不給前藥而直接給予藥物本身的情況相比，安全性極大提高自不必說。例如，哮喘發(fā)作的緊急情況下，需要靜脈給予β2激動劑，此時由于心臟處的葡萄糖苷酸酶的活性低，在心臟處的β2激動劑的副作用與給予藥物本身的情況比較，顯著降低。
本發(fā)明的藥物組合物的給藥量，根據(jù)藥物、對象疾病、年齡、體重、癥狀、給藥途經(jīng)、給藥次數(shù)等有所差異，例如，在β2激動劑的情況下，發(fā)揮和制成前藥以前的活性藥物的給藥量幾乎相等的效果。
作為本發(fā)明的前藥的制造方法，有有機(jī)化學(xué)上的糖基化和酶的糖基化。例如，通過以Koenigs-Knorr反應(yīng)為代表的糖基化反應(yīng)(Advances inCarbohydrate Chem.And Biochem.，57，207，2001，Academic Press)，使羥基被保護(hù)了的糖衍生物形成糖苷鍵，然后通過脫保護(hù)得到所要的前藥。
按照酶法(KISO TO RINSHOU，30，2403，1996)，通過糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-糖衍生物的組合，得到同樣結(jié)果。
實施例通過實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明不受這些實施例的限制。
實施例1沙丁胺醇葡萄糖苷酸(3-O-(β-D-葡萄糖苷酸基)-沙丁胺醇)(實施例1的化合物)的制造 (1)2-(4-甲氧基芐氧基)-5-(2-(N-叔丁胺基)-1-(4-甲氧基芐氧基)乙基)芐基醇的制備在-78℃，向沙丁胺醇1.466g，NaI 25mg，THF 5mL的混合物中一點點地加入NaH 250mg。在0℃攪拌15分鐘后，在-78℃添加p-甲氧基苯甲基氯1.125g，然后在室溫攪拌16小時。向反應(yīng)混合物中加入丙酮，過濾、濃縮后，利用色譜柱得到目的物1.20g(59％)。
NMR(CDCl3)1.19(9H，s)，2.60(2H，m)，2.62(2H，m)，3.53(1H，d，J＝10Hz)，3.81(6H，s)，3.88(1H，d，J＝10Hz)，3.93(1H，m)，4.60-4.70(2H，m)，4.99(1H，s)，7.2-7.8(11H，m)(2)苷化及脫保護(hù)向2-(4-甲氧基芐氧基)-5-(2-(N-叔丁胺基)-1-(4-甲氧基芐氧基)乙基)芐基醇1.04g，乙酰溴葡萄糖苷酸甲酯(溴-2，3，4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖苷酸甲酯)1.50g，碳酸銀1.577g，MS4A1.577g中加入二氯甲烷4mL，在室溫下攪拌一晚。以Celite過濾反應(yīng)液，濃縮后，用色譜柱分離，得到粗生成物1.68g(82％)。將其以甲醇-THF(5mL，2∶3)溶解，加入20％NaOH(2.59mL)，室溫攪拌1小時。通過TLC(AcOEt/n-Hex＝1/2)確認(rèn)反應(yīng)后，在冰冷卻下以醋酸中和。加入Pd-C(100mg)，進(jìn)行加氫(室溫，一晚)。過濾反應(yīng)液后，濃縮，用LH-20色譜柱分離得到目的產(chǎn)物(實施例1的化合物)138mg(12％)。
NMR(DMSO-d6)1.25(9H，s)，2.80-2.94(2H，m)，3.05-3.35(4H，m)，4.25(1H，m)，4.60(1H，m)，4.76(1H，d，J＝10Hz)，4.78(1H，d，J＝8.8Hz)，6.80(1H，d，J＝8.2Hz)，7.12(1H，dd，J＝8.2Hz&1.6Hz)，7.44(1H，d，J＝1.6Hz)IR(KBr，cm-1)3402，2980，1617，1509，1406，1276，1200，1118，1074實施例2異丙腎上腺素葡萄糖苷酸(4-O-(葡萄糖苷酸基)-異丙腎上腺素)(實施例2的化合物)的制造 向異丙腎上腺素鹽酸鹽1.00g，1N-NaOH(4.00mL)的混合物中，在0℃，逐漸加入乙酰溴葡萄糖苷酸甲酯(溴-2，3，4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖苷酸甲酯)1.28g溶解在丙酮4.16mL得到的溶液，然后于室溫靜置。一邊不斷加入1N-NaOH(2.46mL)使pH保持在7附近，于室溫反應(yīng)2天。濃縮后，加入20％NaOH(2mL)，于室溫攪拌30分鐘。冷卻后，小心加入醋酸，使溶液成酸性，用HP-20柱分離后，再用HL-20柱分離，得到實施例2的化合物。產(chǎn)量為81mg(5.2％)。
NMR(DMSO-d6)1.22(6H，d，J＝6.5Hz)，2.82-2.96(2H，m)，3.05-3.35(4H，m)，3.30(1H，m)，4.70(1H，brs)，4.70(1H，m)，6.80-7.50(3H，m)
IR(KBr，cm-1)3402，1617，1509，1400，1287，1068實施例33-(β-D-葡糖苷酸氧)甲基-4-羥基-α-{[(4-甲氧基-α-甲基苯乙基)氨基]甲基}芐醇 采用和實施例1一樣的制備方法，得到標(biāo)記化合物。
NMR(DMSO-d6)0.90(3H，d，J＝6.2Hz)，2.82-2.96(2H，m)，3.05-3.35(4H，m)，3.30(1H，m)，3.71(3H，S)，4.45(1H，m)，4.47(1H，m)，6.60-7.30(7H，m)實施例4《β2激動劑葡萄糖苷酸的藥理活性》1.試驗方法為調(diào)查β2激動劑沙丁胺醇及異丙腎上腺素的支氣管擴(kuò)張作用，使用以卵清蛋白致敏的豚鼠哮喘模型。試驗依照Konzett和Rssler的方法實施(Arch.Exp.Pathol.Pharmakol.，195，71-75，1940)。
<致敏>
致敏開始第1及8天，肌內(nèi)給予豚鼠雙足卵清蛋白500μg/0.5mL，腹腔給予每只豚鼠百日咳疫苗1.5×105cell/mL/只，主動致敏。致敏開始第15天，于背部皮下給予卵清蛋白10及100μg/部位，檢驗致敏狀態(tài)。僅將皮下致敏6小時后在致敏檢驗中呈陽性的動物用于試驗。
<給予方法>
被檢物質(zhì)，通過將超聲波噴霧器的霧化量調(diào)為最小，霧化藥液，產(chǎn)生氣霧劑，然后將氣霧劑導(dǎo)入暴露室(M.I.P.S.公司)，使用空氣泵(SPP-3GA，TECHNO TAKATSUKI公司)，以3L/min吸入，以卵清蛋白刺激的40分鐘前，豚鼠吸入被檢物質(zhì)10分鐘。
<氣管內(nèi)壓測定>
致敏開始第19～23日，以苯妥英鈉(50mg/kg，i.p.)麻醉。實施氣管內(nèi)插管。借助氣管內(nèi)插管，連接人工呼吸機(jī)，在人工呼吸(換氣量10mL/kg，換氣次數(shù)50次/分)下，通過連接到氣管插管的壓力差換能器(Validyne，GouldElectronics)，在記錄儀(WT-645G，日本光電株式會社)記錄氣管內(nèi)壓。氣道內(nèi)壓測定一直持續(xù)到卵清蛋白給予10分鐘后。接著，實施左右頸總動靜脈插管。通過左側(cè)插管，以1mL/kg的容量靜脈給予加拉明(1mg/mL)，確認(rèn)自主呼吸消失。然后，靜脈給予卵清蛋白(300μg/mL)，刺激抗原抗體反應(yīng)。氣管內(nèi)壓測定點為刺激前，卵清蛋白刺激后1、3、5、7及10分鐘。氣管內(nèi)壓的增加率以百分率表示，即，刺激后各測定時間的測定值減去刺激前的測定值后與各測定時間的最大閉塞的比率。
<試驗材料>
使用沙丁胺醇葡萄糖苷酸、異丙腎上腺素葡萄糖苷酸作為被檢物質(zhì)。沙丁胺醇為白色粉末，異丙腎上腺素葡萄糖苷酸為棕褐色晶體，都在-80℃避光保存。分別使用沙丁胺醇硫酸鹽(以后，以沙丁胺醇表示)和異丙腎上腺素鹽酸鹽(以后，以腎上腺素表示)作為對照物質(zhì)。沙丁胺醇和異丙腎上腺素都為白色粉末，都在室溫避光保存。使用前稱取必要量的被檢物質(zhì)和對照物質(zhì)，以生理鹽水溶液(大塚制藥工廠株式會社，批號，1D78，1E84)，進(jìn)行配制。被檢物質(zhì)和對照物質(zhì)的溶液的濃度，以摩爾濃度計，相等。所有溶液在室溫大致穩(wěn)定24小時。
沙丁胺醇葡萄糖苷酸和異丙腎上腺素葡萄糖苷酸在配制后30分鐘以內(nèi)使用。此外，使用卵清蛋白(OVA，Sigma Chemical Company，批號120K7001)、加拉明(gallamine triethiodide，Sigma Chemical Company，批號76H1106)、苯妥英鈉(東京化成株式會社，批號GI01)、百日咳疫苗(和光純藥工業(yè)株式會社，批號SEK7880)、以及生理鹽水溶液(株式會社 大塚制藥工廠，批號1D78，1E84)。
各試樣組的構(gòu)成示于表1。
表1

<統(tǒng)計學(xué)的分析處理方法>
得到的試驗結(jié)果，氣管內(nèi)壓以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。顯著性測定，2組間比較的情況下，進(jìn)行無對應(yīng)的Student’s t檢驗。多組比較的情況下，進(jìn)行Dunnett’s多重檢驗。顯著水平都為5％。各被檢物質(zhì)對氣管抵抗增加的抑制率，以對照組的抑制率為0％時，計算為相對于對照組的抑制率。
2.結(jié)果沙丁胺醇及沙丁胺醇葡萄糖苷酸對抗原誘發(fā)的即時型哮喘反應(yīng)的影響的檢驗結(jié)果示于圖4。如方法中所述的一樣，結(jié)果以相對于抗原卵清蛋白給予前(pre)氣管內(nèi)壓的增加率表示。而且，圖中的前(pre)指的是給予加拉明，使得自主張力消失，氣道穩(wěn)定的時間點，意味著卵清蛋白給予開始之前的約5～10分鐘。通過靜脈給予卵清蛋白刺激抗原抗體反應(yīng)的對照組的豚鼠，抗原刺激1分鐘后，氣管內(nèi)壓迅速上升，3分鐘后顯示最大約增加44％。以0.05％濃度吸入沙丁胺醇的組，顯示抗原刺激3分鐘后增加率約為3％，大大抑制氣管內(nèi)壓的增高。這與對照組比較，顯示約92％的顯著抑制。另一方面，以0.072％濃度吸入沙丁胺醇的組，也一樣顯示3分鐘后增加率約為20％，大大抑制氣管內(nèi)壓的增高。這與對照組比較，顯示56％的顯著抑制。
另一方面，異丙腎上腺素及異丙腎上腺素葡萄糖苷酸對抗原誘發(fā)的即時型哮喘反應(yīng)的影響的檢驗結(jié)果示于圖5。試驗條件、結(jié)果的表示方法和沙丁胺醇一樣。以0.1％濃度吸入異丙腎上腺素的組，顯示抗原刺激3分鐘后增加率約為12％，大大抑制氣管內(nèi)壓的增高。這與對照組比較，顯示約73％的顯著抑制。另一方面，以0.157％濃度吸入異丙腎上腺素的組，也一樣顯示3分鐘后增加率約為10％，大大抑制氣管內(nèi)壓的增高。這與對照組比較，顯示77％的顯著抑制。
以上表明，通過吸入給予沙丁胺醇葡萄糖苷酸和異丙腎上腺素葡萄糖苷酸，可以顯著抑制豚鼠的即時型哮喘反應(yīng)。由本結(jié)果和細(xì)支氣管上皮組織處存在很強(qiáng)的β-葡萄糖苷酶活性的結(jié)果(圖1)可以認(rèn)為，沙丁胺醇葡萄糖苷酸及異丙腎上腺素葡萄糖苷酸，通過吸入給予進(jìn)入氣管，在肺的細(xì)支氣管周圍在β-葡萄糖苷酸酶的作用下，水解，變換為活性體沙丁胺醇和異丙腎上腺素，進(jìn)而發(fā)揮抗哮喘作用。
實施例5《β2激動劑葡萄糖苷酸對副作用的影響》使用β2激動劑異丙腎上腺素和沙丁胺醇作為藥物，確認(rèn)這些β2激動劑及其葡萄糖苷酸對心臟的影響。
1.試驗方法試驗使用CrjCD(SD)大鼠，每組6只。
<血壓及心律的測定>
以氧氣、一氧化氮和異氟醚的混合氣體麻醉，進(jìn)行手術(shù)，將盛滿含有肝素(100U/mL)的生理鹽水溶液的聚乙烯管(PE50，Becton Dickinson)的一端插入頸總動脈后留在該處，將另一端通過頸背部連接在設(shè)置于暴露用小室的上部的套管上(Instec公司制)。該套管通過聚乙烯管連接在壓力換能器上(P23XL，Gould Electronics)。并且，從背部到套管的聚乙烯管的周圍通過金屬彈簧，以防止動物造成的損傷。
藥物的給予是通過制作暴露用小室，在小室內(nèi)使大鼠在血壓測定用套管留置于頸總動脈的狀態(tài)下進(jìn)行全身吸入暴露。該方法是全身吸入暴露中常用的方法。
來自壓力換能器(P23XL，Gould Electronics)的信號被導(dǎo)入壓力處理信號調(diào)節(jié)裝置(Gould Electronics)，記錄在熱排列記錄儀上(RS3400，GouldElectronics)。血壓和心律從給予開始前到給予結(jié)束后20分鐘，連續(xù)記錄。給予開始是在動物醒后1小時之后，測定參數(shù)穩(wěn)定后實施。
<試驗材料>
被檢物質(zhì)和實施例3一樣配制。
各試樣組的構(gòu)成示于表2。
表2

<統(tǒng)計學(xué)的分析處理方法>
各組代表值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(S.E.)表示。各組平均值，以Tukey的多重比較檢驗進(jìn)行顯著性檢驗。顯著標(biāo)準(zhǔn)是5％。
2.結(jié)果沙丁胺醇和沙丁胺醇葡萄糖苷酸對心臟機(jī)能、尤其是血壓/心律的影響的檢驗結(jié)果示于圖6。而且，圖中的前(pre)指的是剛要開始藥物吸入給予前。從沙丁胺醇吸入給予剛結(jié)束起，確認(rèn)血壓降低以及心律數(shù)增加。吸入結(jié)束后，顯示五分鐘后血壓降低到75mmHg，這比吸入前約低26％。此外，關(guān)于心律數(shù)，也確認(rèn)了同樣的傾向，顯示5分鐘后最大約增加36％。經(jīng)時測定的30分鐘內(nèi)最大血壓的降低率和心律增加率分別是27％和39％。這樣對血壓和心律的顯著影響就變得清楚了。與此相反，以沙丁胺醇葡萄糖苷酸進(jìn)行相同試驗的結(jié)果則和對照組(吸入生理鹽水)一樣，完全沒有觀察到影響。
另一方面，異丙腎上腺素也和沙丁胺醇一樣，從剛吸入給予后開始，就觀察到血壓的降低和心律數(shù)的增高，吸入結(jié)束后，顯示5分鐘后血壓降低到72mmHg，這比處理前約降低27％。此外，關(guān)于心律數(shù)也觀察到同樣的傾向，顯示5分鐘后約增加49％(圖7)。在經(jīng)時測定的30分鐘內(nèi)最大血壓降低率和心律增加率分別為28％和50％。這樣，吸入異丙腎上腺素對血壓及心律數(shù)的顯著影響就變得清楚了。與此相反，以異丙腎上腺素葡萄糖苷酸進(jìn)行相同試驗的結(jié)果則和對照組一樣，完全沒有觀察到影響。已知異丙腎上腺素尤其具有β1作用，對心臟的副作用強(qiáng)。本發(fā)明顯示，通過使用β2激動劑葡萄糖苷酸，完全消除β2激動劑所具有的對心臟的影響成為可能。這些結(jié)果闡明沙丁胺醇和異丙腎上腺素的葡萄糖苷酸使沙丁胺醇和異丙腎上腺素對血壓/心律的影響的壓重副作用消失。
參考例1使用屬于β-激動劑的沙丁胺醇、異丙腎上腺素作為實施例，說明本專利，但該概念并不是實施例中所示的兩個化合物，其它結(jié)構(gòu)完全不同的化合物中也有同樣的傾向，即，提示了被葡萄糖苷酸化的藥物能表現(xiàn)出在靶標(biāo)組織被水解的活性的例子。
11-乙基-7，9-二羥基-10，11-二氫二苯[b，f]慮平是在使用平滑肌的體內(nèi)收縮抑制試驗中顯示效果的化合物。對以高濃度KCl或氯化氨甲酰膽堿誘導(dǎo)的豬氣管平滑肌標(biāo)本的平滑肌收縮的抑制的IC50＝5μM左右。經(jīng)口給予本化合物的情況下，以10mg/kg的劑量，在即時型哮喘模型上顯示了對氣管收縮的抑制作用(和實施例3一樣的實驗體系)。此后，開始了有關(guān)本化合物的代謝的探討，發(fā)現(xiàn)本化合物經(jīng)口給予后，被吸收并快速進(jìn)行葡萄糖苷酸結(jié)合。在小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猴子上，給藥后的血中分析的結(jié)果是，在所有的動物種類中，葡萄糖苷酸結(jié)合體大于等于99％。由此結(jié)果，考慮到結(jié)合體可能存在活性，因而合成O-葡萄糖苷酸。合成的O-葡萄糖苷酸在使用上述體內(nèi)平滑肌的收縮抑制試驗中，未顯示一點效果。另一方面，使用上述豚鼠致敏模型，觀察了靜脈給予O-葡萄糖苷酸的效果后，可以確認(rèn)其對氣管收縮的抑制作用。推測這是由于靜脈內(nèi)給予的O-葡萄糖苷酸在到達(dá)肺組織后，被水解變回未變化體，從而顯示了對氣管收縮的抑制作用。
如此，β-激動劑即使是完全不同的結(jié)構(gòu)，也可觀察到同樣的結(jié)果，強(qiáng)烈顯示了葡萄糖苷酸結(jié)合化的化合物在肺部被分解而表現(xiàn)活性的可能性。
以下，針對“發(fā)明公開”欄中所說明的圖1、2、3，進(jìn)行詳細(xì)說明。
參考例2《圖1肺中的β-葡萄糖苷酸酶的局部所在》使用酶組織化學(xué)方法，分析肺及心臟中的β-葡萄糖苷酸酶的局部存在。
1.試驗方法制成豚鼠肺的組織標(biāo)本，依據(jù)Fishman等的方法(J.Histo.Cytochem.12，298-305，1964)，使用相對于β-葡萄糖苷酸酶的底物萘酚AS-BIβ-葡萄糖苷酸，進(jìn)行活體染色。將取出的心臟以4％多聚甲醛溶液固定，利用低溫保持器將其制成4-6μm的冷凍切片。底物液的制備如下在1.2mL的0.05M碳酸氫鈉溶液中加入萘酚AS-BIβ-葡萄糖苷酸28mg，溶解后，再加入0.2N醋酸/醋酸鈉緩沖液(pH5)直至溶液總體積為100mL。染色液的制備如下在4％的亞硝酸鈉溶液0.3mL中加入副品紅液0.3mL，重氮化，然后在該液中加入底物液10mL，調(diào)整pH為5.2后，加入蒸餾水混合使溶液總體積為20mL，最后，以濾紙過濾進(jìn)行調(diào)整。將染色液加到切片上，37℃反應(yīng)2小時。反應(yīng)后，按照通常方法，洗凈、脫水并封片。
2.結(jié)果制作肺的冷凍切片，利用β-葡萄糖苷酸酶的活性對組織進(jìn)行活性染色后的結(jié)果示于圖1(倍率100倍)。圖1中A～C顯示如下細(xì)胞。
A肺的細(xì)支氣管上皮細(xì)胞B平滑肌細(xì)胞C肺泡巨噬細(xì)胞如圖1所示，在肺的細(xì)支氣管上皮細(xì)胞(圖中A所示的區(qū)域)和肺泡巨噬細(xì)胞(圖中的C)中觀察到強(qiáng)的陽性圖像(染為黑色的部分顯示β-葡萄糖苷酸酶的活性)。
肺泡巨噬細(xì)胞的β-葡萄糖苷酸酶的活性高已有報道(Hayashi，J.Histochem.Cytochem.15，83-92，1967；Barry和Robinson，Histochem.J.1，505-515，1969)，但是并沒有β-葡萄糖苷酸酶局部存在于構(gòu)成細(xì)支氣管的上皮細(xì)胞的報道。顯示β-葡萄糖苷酸酶在與肺的細(xì)支氣管外部接觸的區(qū)域大量表達(dá)。
這暗示了與肺的β-葡萄糖苷酸酶活性最相關(guān)的細(xì)胞群不是炎癥類細(xì)胞，而是細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的可能性。
參考例3《圖2關(guān)于各臟器中的β-葡萄糖苷酸酶活性的探討》以調(diào)查各臟器中的β-葡萄糖苷酸酶活性程度和哮喘模型動物的該酶活性的變化為目的，制成被確立為即時型哮喘模型的致敏豚鼠，與未致敏豚鼠的各臟器的酶活性進(jìn)行比較。此外，在致敏豚鼠上，對抗原刺激的個體和為刺激的個體中的酶活性也進(jìn)行了比較。
1.試驗方法<致敏>
在致敏開始的第1及8天，在6周齡的StdHartley系雄性豚鼠的兩足肌內(nèi)給予卵清蛋白(OVA)500μg/0.5mL，通過腹腔給予百日咳疫苗1.5×105cell/mL/只，進(jìn)行主動致敏。
<抗原刺激>
在初次致敏后的第19-23天，使致敏豚鼠吸入5分鐘的2％OVA溶液，誘導(dǎo)抗原刺激。刺激后，4小時后回收各臟器。
<β-葡萄糖苷酸酶活性的測定>
從未致敏豚鼠組、致敏豚鼠組、致敏豚鼠的抗原刺激組這3組(2只/組)，取出各臟器，加入生理鹽水50倍體積，勻漿，以12000rpm，10min，4℃低溫離心分離后，取上清作為樣品。各樣品中的β-葡萄糖苷酸酶的活性測定如下依照常規(guī)方法，以p-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷酸為底物，采用在405nm處對游離的p-硝基苯進(jìn)行比色定量的方法測定(Haeberlin等，PharmaceuticalRes，10，1553-1562，1993)。各樣品中的蛋白濃度使用市售的試劑盒測定。在各臟器中的β-葡萄糖苷酸酶的比活性，以每lmg蛋白，1分鐘游離的反應(yīng)物質(zhì)的量表示。各臟器的比活性以平均值表示。
2.結(jié)果未致敏豚鼠組、致敏豚鼠組、致敏豚鼠的抗原刺激組等3組的各臟器中的β-葡萄糖苷酸酶的活性示于圖2。未致敏豚鼠組的各臟器的β-葡萄糖苷酸酶活性分別是，肺(15nmol/mg/min)、肝臟(20.7nmol/mg/min)、脾臟(14.2nmol/mg/min)，顯示了高值；心臟(1.9nmol/mg/min)、腦(2.6nmol/mg/min)、肌肉(1.2nmol/mg/min)，顯示了低值。該結(jié)果和此前報道的大鼠及小鼠等的各臟器中的酶活性的報道顯示了一樣的傾向(Conchie等，Biochem，J.71，318-325，1959；Johnson等，Biochemical Genetics 24，891-909，1986；Hoogerbrugge等，Transplantation 43，609-614，1987)。
另一方面，在致敏豚鼠組中，與未致敏豚鼠組的酶活性比較，未觀察到各臟器的酶活性差異。該結(jié)果揭示，在致敏狀態(tài)下，各臟器中的酶活性沒有影響，和未致敏的情況一樣。而且，在抗原刺激的致敏豚鼠組中，各臟器的酶活性和未致敏豚鼠組、抗原未刺激致敏豚鼠組比較，未觀察到顯著差異。
由這些結(jié)果確認(rèn)，肺是β-葡萄糖苷酸酶活性非常高的組織，肺組織中的β-葡萄糖苷酸酶在抗原致敏的哮喘模型上為增加。
參考例4《圖3心臟中的β-葡萄糖苷酸酶的局部所在》1.試驗方法試驗方法和《圖1肺中的β-葡萄糖苷酸酶的局部所在》中記述的一樣。但以蘇木精的細(xì)胞核染色作為對比染色。
2.結(jié)果制作心臟的冷凍切片，利用β-葡萄糖苷酸酶活性對組織進(jìn)行活性染色的結(jié)果示于圖3(倍率50倍)。圖3中箭頭顯示被蘇木精染色的細(xì)胞的細(xì)胞核。如圖3所示，在豚鼠的心臟切片中，未觀察到顯示β-葡萄糖苷酸酶活性的陽性圖像。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明可以提供利用藥物的靶標(biāo)部位和表現(xiàn)副作用的部位之間存在的酶活性差異，使藥物對非靶標(biāo)器官的副作用能夠降低的前藥?？梢蕴峁π呐K不表現(xiàn)副作用的β2激動劑。進(jìn)而，本發(fā)明使得使用以往的β作用藥受到限制的患有心臟疾病的患者能夠安心使用β作用藥。
權(quán)利要求
1.以式(1)表示的化合物或其生理學(xué)上可允許的鹽，R-藥物(1)式中，R表示在藥物的靶標(biāo)部位和副作用表現(xiàn)部位的活性存在差異的酶的作用下被切斷的取代基；藥物是通過在酶的作用下取代基被切斷而被活化的藥物。
2.以式(2)表示的化合物或其生理學(xué)上可允許的鹽，R’-藥物(2)式中，R’表示在β-葡萄糖苷酸酶的作用下被切斷的取代基，該酶在呼吸器官活性高，而在心臟活性低；藥物表示在酶的作用下取代基被切斷而被活化的呼吸器官用藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，靶標(biāo)部位是呼吸器官。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，副作用表現(xiàn)的部位是心臟。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中，藥物是支氣管擴(kuò)張劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中，藥物是β2激動劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中，藥物是結(jié)構(gòu)中具有羥基的β2激動劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中，藥物選自沙丁胺醇、沙美特羅、馬布特羅、克倫特羅、吡布特羅、美喘清、非諾特羅、氯丁喘胺、福莫特羅、海索那林、特布他林、喘速寧、氯喘通、間羥異丙腎上腺素、甲氧苯丙甲胺、甲基麻黃堿、麻黃堿、異丙腎上腺素任一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，酶是糖苷酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，酶是β-葡萄糖苷酸酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中，取代基是單糖或寡糖的糖基。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中，取代基是葡萄糖苷酸基。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的化合物，其中，葡萄糖苷酸基和藥物之間的結(jié)合是β鍵。
14.藥物組合物，其一同含有有效量的權(quán)利要求1或2所述的化合物和制藥上適當(dāng)?shù)那疑韺W(xué)上可允許的賦形劑、添加劑、和/或其它的活性化合物以及輔助劑。
15.局部給予用藥物組合物，其一同含有有效量的權(quán)利要求1或2所述的化合物和制藥上適當(dāng)?shù)那疑韺W(xué)上可允許的賦形劑、添加劑、和/或其它的活性化合物以及輔助劑。
16.吸入用藥物組合物，其一同含有有效量的權(quán)利要求1或2所述的化合物和制藥上適當(dāng)?shù)那疑韺W(xué)上可允許的賦形劑、添加劑、以和/或其它的活性化合物以及輔助劑。
17.式(1)所表示的化合物或其生理學(xué)上可允許的鹽在制造藥物組合物中的用途，該藥物組合物是利用在藥物的靶標(biāo)部位和副作用表現(xiàn)部位的酶活性存在差異的酶的前藥，其只在靶標(biāo)部位表現(xiàn)效果，R-藥物(1)式中，R表示在藥物的靶標(biāo)部位和副作用表現(xiàn)部位的活性存在差異的酶的作用下，被切斷的取代基；藥物是通過在酶的作用下取代基被切斷而被活化的藥物。
18.式(2)所表示的化合物或其生理學(xué)上可允許的鹽在制造藥物組合物中的用途，該藥物組合物是利用在藥物的靶標(biāo)部位和副作用表現(xiàn)部位的酶活性存在差異的酶的前藥，其只在靶標(biāo)部位表現(xiàn)效果，R’-藥物(2)式中，R’表示在β-葡萄糖苷酸酶的作用下被切斷的取代基，該酶在呼吸器官活性高，而在心臟活性低；藥物表示在酶的作用下取代基被切斷而被活化的呼吸器官用藥物。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中，靶標(biāo)部位是呼吸器官。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中，副作用表現(xiàn)的部位是心臟。
21.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的用途，其中，藥物是支氣管擴(kuò)張劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的用途，其中，藥物是β2激動劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的用途，其中，藥物是結(jié)構(gòu)中具有羥基的β2激動劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的用途，其中，藥物選自沙丁胺醇、沙美特羅、馬布特羅、克倫特羅、吡布特羅、美喘清、非諾特羅、氯丁喘胺、福莫特羅、海索那林、特布他林、喘速寧、氯喘通、間羥異丙腎上腺素、甲氧苯丙甲胺、甲基麻黃堿、麻黃堿、異丙腎上腺素任一種。
25.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中，酶是糖苷酶。
26.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中，酶是β-葡萄糖苷酸酶。
27.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的用途，其中，取代基是糖基。
28.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的用途，其中，取代基是葡萄糖苷酸基。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的用途，其中，葡萄糖苷酸基和藥物之間的結(jié)合是β鍵。
30.含有糖取代基的β2激動劑的制造方法，其包括在丙酮、乙腈、二噁烷、四氫呋喃的任何一種溶劑中，在堿共存下，使帶有羥基的β2激動劑和糖鹵代物衍生物反應(yīng)，然后在堿水解作用下將其脫保護(hù)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的制造方法，其中，堿是氫氧化鈉、氫氧化鉀中的任一種。
32.含有糖取代基的β2激動劑的制造方法，其包括在含有具有多個羥基的β2激動劑和堿的混合物中，加入鹵化的芐基衍生物，選擇性保護(hù)羥基后，糖基化，堿水解該中間體后，加氫。
全文摘要
具有利用藥物的靶標(biāo)部位和副作用表現(xiàn)的部位之間酶活性存在差異的酶，在該酶作用下被切斷的取代基，并且通過切斷該取代基而被活化的前藥?？煞謩e舉出，作為藥物的靶標(biāo)部位，例如，呼吸器官；作為副作用表現(xiàn)的部位，例如，心臟?？煞謩e舉出，支氣管擴(kuò)張劑作為藥物的例子；糖苷酶(例如，β－葡萄糖苷酶)作為酶的例子。進(jìn)而，取代基，例如是單糖或寡糖構(gòu)成的糖基。通過利用上述酶，產(chǎn)生效果的靶標(biāo)部位和表現(xiàn)副作用的部位不同的該類型藥物的副作用的降低成為可能。
文檔編號A61P11/06GK1671724SQ0381781
公開日2005年9月21日 申請日期2003年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月20日
發(fā)明者山下伸也, 竹尾仁良, 沖田高明 申請人:日本水產(chǎn)株式會社