專利名稱：造血干細胞和治療新生血管性眼部疾病的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從骨髓衍生的分離的哺乳動物譜系負性造血干細胞(Lin-HSC)。本發(fā)明還涉及通過將Lin-HSC和轉染的Lin-HSC施用到視網(wǎng)膜來治療眼血管疾病。
背景技術：
與年齡相關的黃斑退行性改變(ARMD)和糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)是工業(yè)化國家中的人視力喪失的最主要原因，同時還有視網(wǎng)膜新生血管形成異常的原因。因為視網(wǎng)膜由界限清楚的神經(jīng)元層、神經(jīng)膠質層和血管元件層組成，相對較小的疾病例如在血管增生或水腫中出現(xiàn)的疾病即可導致視覺功能的顯著喪失。遺傳性視網(wǎng)膜變性例如色素性視網(wǎng)膜炎(RP)，也與血管異常例如微動脈狹窄和血管性萎縮相關。雖然在鑒別具有促進和抑制血管生成作用的因子方面取得了顯著進步，但目前還沒有特別有效的治療眼部血管疾病的治療方法。
多年以來，已知干細胞種群存在于正常成年人的循環(huán)和骨髓中。不同亞種群的干細胞隨著造血譜系正性(Lin+)或非-造血的、譜系負性(Lin-)譜系而略有區(qū)別。此外，譜系負性造血干細胞(HSC)種群近期顯示其包含有能夠在體外和體內形成血管的內皮祖細胞(EPC)(Asahara et al.Science 275，964-7(1997))。這些細胞可以參與正常和病理狀態(tài)引起的血管發(fā)生(參見Lyden et al.Nat.Med.7，1194-201(2001)；Kalka et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，3422-7(2000)；和Kocher etal.Nat.Med.7，430-6(2001))，還可以分化為多種非內皮細胞類型包括肝細胞(參見Lagasse et al.Nat.Med.6，1229-34(2000))、小膠質細胞(參見Priller et al.Nat.Med.7，1356-61(2002))、心肌細胞(參見Orlic et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98，10344-9(2001))和上皮細胞(參見Lyden et al.Nat.Med.7，1194-201(2001))。雖然在一些血管發(fā)生的實驗模型中已經(jīng)應用了這些細胞，但EPC對于新血管系統(tǒng)的靶向作用機理仍是未知的，而且也沒有建立能夠有效地增加對特定血管系統(tǒng)有益的細胞數(shù)量的策略。
發(fā)明概述本發(fā)明提供從骨髓衍生的分離的哺乳動物譜系負性造血干細胞群(Lin-HSC)，其包括對活性視網(wǎng)膜星形膠質細胞具有選擇性靶向作用的內皮祖細胞(EPC；也稱作內皮前體細胞)。至少約50％分離的本發(fā)明Lin-HSC群細胞具有CD31和c-kit細胞標記物。
本發(fā)明的譜系負性HSC群中的EPC廣泛地滲入發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管，并且還穩(wěn)定地滲入眼部新血管系統(tǒng)。本發(fā)明分離的譜系負性HSC群可用于治療和穩(wěn)定正在變性的哺乳動物視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。在本發(fā)明的分離的Lin-HSC群的一個具體的實施例中，細胞被一種治療上有效的基因轉染。轉染的細胞對于新血管系統(tǒng)具有選擇性的靶向作用，能夠在不影響已生成的血管的情況下通過以細胞為基礎的基因療法形式抑制新血管的形成。本發(fā)明的分離的譜系負性HSC群細胞，已經(jīng)被一種編碼抑制血管生成的肽的基因轉染，有益于調節(jié)諸如ARMD、DR和與血管系統(tǒng)異常有關的某些視網(wǎng)膜變性的疾病中的異常血管生長。
使用本發(fā)明的分離的Lin-HSC群治療眼部疾病的一個特別的優(yōu)點是對眼睛玻璃體具有血管營養(yǎng)和神經(jīng)營養(yǎng)拯救作用，用Lin-HSC玻璃體內治療眼部觀察到了此現(xiàn)象。使用本發(fā)明的Lin-HSC治療可以保護視網(wǎng)膜神經(jīng)元和光感受器，維持眼睛的視覺功能。
本發(fā)明還提供了一種分離譜系負性造血干細胞群的方法，該譜系造血干細胞群包含源自骨髓尤其是成年人骨髓的內皮祖細胞。
附圖的簡要描述

圖1(a和b)描述了正在發(fā)育的小鼠視網(wǎng)膜示意圖。(a)初級叢的發(fā)育、(b)視網(wǎng)膜血管形成的第二階段。GCL，神經(jīng)節(jié)細胞層；IPL，內叢層；INL，內核層；OPL，外叢層；ONL，外核層；RPE，視網(wǎng)膜色素上皮；ON，視神經(jīng)；P，外周。
圖1c描述了骨髓衍生的Lin+HSC和Lin-HSC分離的細胞的流動細胞計數(shù)特征。最上面一行非抗體標記細胞的打點圖分布，其中R1確定陽性PE-染色的可計量門控區(qū)域；R2指示GFP-陽性的；中間一行Lin-HSC(C57B/6)細胞；最下面一行Lin+HSC(C57B/6)細胞，每一個細胞系用Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE-軛合的抗體進行標記。Tie-2數(shù)據(jù)得自Tie-2-GFP小鼠。百分數(shù)指示陽性-標記的細胞占Lin+HSC或Lin-HSC群總數(shù)的百分比。
圖2描述了Lin-HSC細胞移植入發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜中。(a)在注射后四天(P6)時以玻璃體內的方式注入的eGFP+Lin-HSC細胞附著在視網(wǎng)膜上并產(chǎn)生分化；(b)在用膠原IV抗體(星狀物代表血管系統(tǒng)的頂部)染色血管系統(tǒng)前，先建立Lin-HSC(B6.129S7-Gtrosa26小鼠，用β-gal抗體染色)本身；(c)在注射后四天(P6)時大多數(shù)Lin+HSC細胞(eGFP+)沒有產(chǎn)生分化；(d)在注射后四天(P6)時腸系膜的eGFP+鼠EC；(e)將Lin-HSCs(eGFP+)注射入成年小鼠眼睛；(f)GFAP-GFP轉基因小鼠體內eGFP+Lin-HSCs(箭頭)的低倍數(shù)放大沿著預存的星形細胞模板尋靶并產(chǎn)生分化；(g)Lin-細胞(eGFP)和下面的星形細胞(箭頭)之間的締合的高倍數(shù)放大；(h)非注射的GFAP-GFP轉基因對照；(i)注射后四天(P6)，eGFP+Lin-HSC細胞向未來的深叢區(qū)域移動，并產(chǎn)生分化。左側的圖形捕捉了在整裝視網(wǎng)膜中的Lin-HSC細胞活性；右側的圖形指示Lin-細胞(箭頭)在視網(wǎng)膜(頂部是玻璃體面，下部是鞏膜面)中的位置；(j)使用α-CD31-PE和α-GFP-alexa 488抗體進行雙重標記。注射后七天，注入的Lin-HSCs(eGFP，紅色)滲入血管系統(tǒng)(CD31)中。箭頭指示滲入面積；(k)注射14天后源自血管的eGFP+Lin-HSC細胞(P17)；(l和m)羅丹明-葡聚糖的心臟內注射表明在初級(l)和深叢(m)中血管是完整的和功能健全的。
圖3(a和b)顯示eGFP+Lin-HSC細胞對于由激光(a)和機械性(b)誘導的成年人視網(wǎng)膜損傷(星號指示受損傷的位置)造成的神經(jīng)膠質過多(由GFAP表達-星形膠質細胞所指明的，左邊的圖像)具有靶向性。右邊的圖像是高倍數(shù)放大，表明Lin-HSCs和星形膠質細胞的緊密關聯(lián)性。標度條＝20μM。
圖4說明Lin-HSC細胞拯救了視網(wǎng)膜變性的小鼠的血管。將注射后27天的(a-d)視網(wǎng)膜(P33)用膠原IV染色；(a)和(b)，注射了Lin+HSC細胞(Balb/c)的視網(wǎng)膜顯示血管系統(tǒng)與正常FVB小鼠的沒有差異；(c)和(d)注射了Lin-HSCs(Balb/c)的視網(wǎng)膜顯示出豐富的類似于野生型小鼠的血管網(wǎng)狀結構；(a)和(c)，整個視網(wǎng)膜的冰凍切片(頂部是玻璃體面，下部是鞏膜面)，使用DAPI染色；(b)和(d)，視網(wǎng)膜總量的深叢；(e)條形圖說明了在注入了Lin-HSC細胞的視網(wǎng)膜(n＝6)中形成的深血管叢血管分布的增加。深視網(wǎng)膜血管化作用的程度通過計算每幅圖像中血管的全長來確定。對Lin+HSC、Lin-HSC或對照視網(wǎng)膜的血管的平均全長/高功率場(以微米表示)進行比較；(f)比較注入來自rd/rd小鼠的Lin-HSC(R，右眼)或Lin+HSC(L，左眼)細胞后深血管叢的長度。比較六只獨立的小鼠，列出結果(一種顏色代表一只小鼠)；(g)和(h)當注射到P15眼睛中時，Lin-HSC細胞(Balb/c)還拯救了rd/rd-血管系統(tǒng)。列出了注射Lin-HSC(G)或Lin+HSC(H)細胞的視網(wǎng)膜(注射后一個月)的中間體和深血管叢。
圖5描述了小鼠視網(wǎng)膜組織的顯微照片(a)使用eGFP+Lin-HSCs(綠色)注射后五天(P11)，視網(wǎng)膜整裝切片(rd/rd小鼠)的深層；(b)和(c)在P6時接受了Balb/c Lin-細胞(A)或Lin+HSC細胞(B)注射的Tie-2-GFP(rd/rd)小鼠的P60視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。使用CD31抗體將血管系統(tǒng)染色(紅色)，只有內源性上皮細胞出現(xiàn)了綠色。箭頭指示使用CD31但沒有使用GFP染色的血管；(d)注射了Lin-HSC的視網(wǎng)膜和對照視網(wǎng)膜的α-SIMA染色。
圖6顯示T2-TrpRS-轉染的Lin-HSCs抑制小鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的發(fā)育。(a)在氨基末端帶有一個Igk信號序列的人TrpRS、T2-TrpRS和T2-TrpRS的圖示；(b)注射了T2-TrpRS轉染的Lin-細胞的視網(wǎng)膜在體內表達T2-TrpRS蛋白。1，在E.coli中產(chǎn)生的重組體T2-TrpRS；2，在E.coli中產(chǎn)生的重組體T2-TrpRS；3，在E.coli中產(chǎn)生的重組體T2-TrpRS；4，對照視網(wǎng)膜；5，注射了Lin-HSC+pSecTag2A的視網(wǎng)膜(只有載體)；6，注射了Lin-HSC+pKLe135(在pSecTag中的Igk-T2-TrpRS)的視網(wǎng)膜。(a)，內源性TrpRS b、重組體T2-TrpRS c、注射了Lin-HSC的T2-TrpRS的視網(wǎng)膜)；(c-f)，注射后7天接受了注射的視網(wǎng)膜的代表性初級(表面的)和中級(深部)叢；(c)和(d)，注射了空質粒-轉染的Lin-HSC的眼睛正常發(fā)育；(e)和(f)，大多數(shù)接受了T2-TrpRS-轉染的Lin-HSC注射的眼睛顯示出深叢抑制作用；(c)和(e)，初級(表面的)叢；(d)和(f)，次級(深部)叢)。在F中觀察到的血管的微弱輪廓是在(e)中顯示的血管主要網(wǎng)狀結構的“血—流”圖像。
圖7顯示了編碼His6-標記的T2-TrpRS、SEQ ID NO1的DNA序列。
圖8顯示了His6-標記的T2-TrpRS、SEQ ID NO2的氨基酸序列。
圖9說明注射了本發(fā)明Lin-HSC和Lin+HSC(對照組)的小鼠眼睛視網(wǎng)膜的顯微照片和視網(wǎng)膜電圖(ERG)。
圖10描述了使用Lin-HSC處理的rd/rd小鼠眼睛的中間體(Int.)和深血管層顯示神經(jīng)元拯救(y-軸)和血管拯救(x-軸)之間的相關性的統(tǒng)計學曲線。
圖11描述了使用Lin+HSC處理的rd/rd小鼠眼睛顯示在神經(jīng)元拯救(y-軸)和血管拯救(x-軸)之間無相關性的統(tǒng)計學曲線。
圖12是使用Lin-HSC處理(黑條)的rd/rd小鼠眼睛和未處理(白條)的rd/rd小鼠眼睛在注射后1個月(1M)、2個月(2M)和6個月(6M)的時間點時以任意相對單位表示的血管長度(y-軸)的條形圖。
圖13包括3個條形圖，它們是注射后1個月(1M)、2個月(2M)和6個月(6M)時rd/rd小鼠外部神經(jīng)層(ONR)的細胞核數(shù)量，表明使用Lin-HSC處理(黑條)的眼睛相對于使用Lin+HSC處理(亮條)的對照組的細胞核數(shù)目有顯著增加。
圖14描述了個體rd/rd小鼠外部神經(jīng)層細胞核數(shù)目的圖，比較了在注射后1個月(1M)、2個月(2M)和6個月(6M)的時間點時右眼(R，使用Lin-HSC處理)和左眼(L，使用Lin+HSC處理)；圖中的每一條線用以比較個體小鼠的眼睛。
優(yōu)選實施方案的詳述本發(fā)明提供了一種分離的、哺乳動物骨髓衍生的譜系負性造血干細胞群，其包括內皮祖細胞。本發(fā)明分離的Lin-HSC群優(yōu)選包括HSC，其中至少50％的細胞包括CD31和c-kit細胞標記物抗原。在一個優(yōu)選的實施方案中，至少約70％的HSC細胞包括CD31標記物，更優(yōu)選約81％的細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，至少約65％的細胞包括c-kit細胞標記物，更優(yōu)選約70％的細胞。
在本發(fā)明的分離的Lin-HSC群的一個特別優(yōu)選的實施方案中，約50％至約85％的細胞包括CD31標記物，約70％至約75％的細胞包括c-kit標記物，約4％至約8％的細胞包括Sca-1標記物，約2％至約4％的細胞包括Flk-1/KDR標記物。
本發(fā)明的分離的Lin-HSC群還可包含不多于約1％的含有Tie-2抗原標記物的細胞。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明分離的Lin-HSC群來自于鼠或人的骨髓，優(yōu)選來自人的骨髓。
當將本發(fā)明的分離的Lin-HSC群以玻璃體內的方式注射入分離的細胞的哺乳動物種的眼睛中時，其選擇性地靶向和滲入視網(wǎng)膜的新血管系統(tǒng)中。
本發(fā)明的分離的Lin-HSC群包含EPC細胞，其分化為上皮細胞，并且在視網(wǎng)膜內產(chǎn)生血管結構。具體地說，本發(fā)明的Lin-HSC組合物用于治療視網(wǎng)膜新生血管性和視網(wǎng)膜血管性變性疾病，可用于修復視網(wǎng)膜血管損傷。
本發(fā)明還提供了一種治療患者眼部疾病的方法，包括從患者骨髓中分離出包含內皮祖細胞的譜系負性造血干細胞群，將能夠阻斷疾病的足夠量的分離的干細胞從玻璃體內注射入患者的眼睛。這種方法可用于治療眼部疾病諸如視網(wǎng)膜變性疾病、視網(wǎng)膜血管變性疾病、局部缺血性視網(wǎng)膜病變、血管出血、血管滲漏和脈絡膜病變。這些疾病的實例包括與年齡相關的黃斑退行性改變(ARMD)、糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)、假性眼組織胞漿菌病(POHS)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)、鐮刀狀細胞性貧血和色素性視網(wǎng)膜炎，以及視網(wǎng)膜損傷。
注射入眼睛的干細胞的數(shù)量足以阻斷患者眼部的疾病狀態(tài)。例如，細胞數(shù)目可有效地修復患者眼部的視網(wǎng)膜損傷，穩(wěn)定視網(wǎng)膜新生血管系統(tǒng)、使視網(wǎng)膜新生血管系統(tǒng)發(fā)育成熟、預防或修復血管滲漏和血管出血。
本發(fā)明的分離的Lin-HSC群中的細胞可被有治療作用的基因轉染，例如在以細胞為基礎的對眼睛的基因治療中使用的編碼抗血管生成蛋白的基因。
轉染的細胞可以包括任何對于治療視網(wǎng)膜疾病有用的基因。優(yōu)選地，本發(fā)明的Lin-HSC群中的轉染細胞包括編碼抗血管生成肽、蛋白質、或蛋白質片段例如TrpRS、或抗血管生成片段例如T1和T2片段的基因。共同擁有、共同待審的美國專利申請序號10/080,839詳細描述了這些內容，該專利申請的內容在此處引用作為參考。
本發(fā)明還提供了一種分離包括內皮祖細胞的來自骨髓的譜系負性造血干細胞群的方法。該方法包括以下步驟(a)采集哺乳動物的骨髓；(b)從該骨髓中分離多數(shù)的單核細胞；(c)使用生物素軛合的針對CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119的譜系系列抗體標記多數(shù)該單核細胞；和(d)從該多數(shù)單核細胞中除去對于CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119來說是譜系正性的單核細胞，以提供一個包含內皮祖細胞在內的譜系負性造血干細胞群。
本發(fā)明還提供治療眼部血管生成疾病的方法，通過以玻璃體內的方式給眼睛注射本發(fā)明的轉染的Lin-HSC組合物。這些轉染的Lin-HSC組合物包括被有治療作用的基因轉染的Lin-HSC，例如編碼抗-血管造影基因產(chǎn)物的基因。
優(yōu)選地，至少約1×105個Lin-HSC細胞或轉染的Lin-HSC細胞是通過向有視網(wǎng)膜變性性疾病的眼睛進行玻璃體內注射而使用的。注射細胞的數(shù)量可以根據(jù)視網(wǎng)膜變性的嚴重性、患者的年齡以及其他對于治療視網(wǎng)膜疾病領域的普通技術人員而言顯而易見的因素決定。Lin-HSC可以在一定時間內單劑量給藥或多劑量給藥，由負責治療的醫(yī)生決定。
本發(fā)明的Lin-HSC群用于治療包括視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)障礙或退化的視網(wǎng)膜損傷和視網(wǎng)膜缺損。
本發(fā)明的轉染Lin-HSC群可用于遞送治療性基因到達視網(wǎng)膜，特別是到達視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。
在本發(fā)明基因遞送方法的一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的Lin-HSC群中的細胞被一個編碼抗血管生成肽的基因轉染，抗血管生成肽例如抗血管生成的色氨酸RNA合成酶(TrpRS)片段。特別優(yōu)選的TrpRS片段包括TrpRS的T1和T2片段。本發(fā)明的編碼抗血管生成肽的Lin-HSC組合物中的轉染細胞用于治療涉及異常血管發(fā)育的視網(wǎng)膜疾病，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病以及類似的疾病。
方法實施例1.細胞的分離和濃縮；Lin-HSC群A和B的制備一般程序所有的體內評價均符合有關保護和使用實驗動物的NIH規(guī)定，所有的評價操作均由Scripps Research Institute(TSRI，La Jolla，CA)動物保護和使用委員會批準。從B6.129S7-Gtrosa26、Tie-2GFP、ACTbEGFP、FVB/NJ(rd/rd小鼠)或Balb/cBYJ成年小鼠(The Jackson Laboratory，ME)中采集骨髓細胞。
接著使用HISTOPAQUE聚合蔗糖梯度(Sigma，St.Louis，MO)通過密度梯度分離法分離得到單核細胞，單核細胞使用生物素軛合的譜系系列抗體(CD45、CD3、Ly-6G、CD11、TER-119，Pharmingen，San Diego，CA)標記用于Lin-選擇。分離出譜系正性(Lin+)細胞，使用一種磁性分離裝置(AUTOMACSTM分離器，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)將其從Lin-HSC中移開。利用一種FACSTMCalibur流式細胞測定器(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)對得到的包含內皮祖細胞的Lin-HSC群進行進一步定性，使用的抗體為PE-軛合的-Sca-1、c-kit、KDR和CD31(Pharmingen，San Diego，CA)。Tie-2-GFP骨髓細胞用于表征Tie-2。
為了收集成年鼠的上皮細胞，通過外科手術移除ACTbEGFP小鼠的腸系膜組織，放置在膠原酶中(Worthington，Lakewood，NJ)以消化該組織，然后使用45μm過濾器進行過濾。收集濾過物，使用內皮細胞生長培養(yǎng)基(Clonetics，SanDiego，CA)進行培養(yǎng)。觀察形態(tài)學鵝卵石樣外觀、使用CD31mAb(Pharmingen)染色、檢查培養(yǎng)物在MATRIGELTM基質(Beckton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)中管狀結構的形成以確定內皮性狀。
Lin-HSC群A通過上文所述的一般程序從ACTbEGFP小鼠中采集骨髓細胞。通過FACS流式細胞儀表征Lin-HSC細胞的CD31、c-kit、Sca-1、Flk-1、和Tie-2細胞表面抗原標記。結果顯示在圖1c中。約81％的Lin-HSC顯示出CD31標記物，約70.5％的Lin-HSC顯示出c-kit標記物，約4％的Lin-HSC顯示出Sca-1標記物，約2.2％的Lin-HSC顯示出Flk-1標記物，約0.91％的Lin-HSC顯示出Tie-2標記物。相反，從這些骨髓細胞中分離的Lin+HSC的細胞標記物特性顯著不同(也就是，CD3137.4％；c-kit20％；Sca-12.8％；Flk-0.05％)。
Lin-HSC群B通過上文所述的一般程序從BalbC、ACTbEGFP和C3H小鼠中采集骨髓細胞。分析Lin-HSC細胞是否存在細胞表面標記(Sca1、KDR、cKit、CD34、CD31和不同的整聯(lián)蛋白α1、α2、α3、α4、α5、α6、αM、αV、αX、αIIb、β1、β4、β3、β4、β5和β7)。結果列于表1中。
表1.Lin-HSC群B的特征
實施例2.細胞的玻璃體內給藥使用精致的刀片制造出一個眼瞼的裂隙，暴露P2至P6眼球。使用一個33-號(Hamilton，Reno，NV)針頭的注射器在玻璃體內注射本發(fā)明的譜系負性HSC群A(在約0.5μl至約1μl細胞培養(yǎng)基中有大約105個細胞)。
實施例3.EPC轉染依照生產(chǎn)商的說明書利用FuGENETM6轉染試劑(Roche，Indianapolis，IN)用編碼TrpRS的T2片段、也封入了His6標記的DNA(SEQ ID NO1，圖7)轉染Lin-HSC(群A)。將來自Lin-HSC組合物的細胞(每ml大約106個細胞)懸浮在包含干細胞因子(PeproTech，Rocky Hill，NJ)的opti-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。加入DNA(約1μg)和FuGENE試劑(約3μl)的混合物，將混合物在37℃下培養(yǎng)約18小時。培養(yǎng)后，洗滌并收集細胞。經(jīng)由FACS分析確定，系統(tǒng)轉染率大約為17％。使用蛋白質印跡法確認T2產(chǎn)物。His6-標記的T2-TrpRS氨基酸序列如SEQ ID NO2，圖8所示。
實施例4.免疫組織化學和共聚焦分析在不同時間點收集視網(wǎng)膜，將其制備為用于整裝或冰凍切片。對于整裝切片，使用4％多聚甲醛固定視網(wǎng)膜，在室溫下在50％胎牛血清(FBS)和20％正常山羊血清中封閉一小時。利用初級抗體處理視網(wǎng)膜，使用次級抗體對其進行檢測。使用的初級抗體是抗-膠原IV(Chemicon，Temecula，CA，anti-β-gal(Promega，Madison，WI)、抗-GFAP(Dako Cytomation，Carpenteria，CA)、抗-α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA，Dako Cytomation)。使用的次級抗體與Alexa 488或594熒光標記(分子探針，Eugene，OR)連接。使用MRC1024共聚焦顯微鏡(Bio-Rad，Hercules，CA)獲取圖像。利用LASERSHARP軟件(Bio-Rad)創(chuàng)造三維圖像用于檢查整裝視網(wǎng)膜中血管發(fā)育的三個不同的層面。利用共聚焦顯微鏡區(qū)分出的GFP(eGFP)增強的小鼠和GFAP/wtGFP小鼠之間GFP像素強度的差別來產(chǎn)生三維圖像。
實施例5.體內視網(wǎng)膜血管生成定量分析對于T2-TrpRS分析，從三維圖像中重建初級叢和深叢。初級叢被分作兩類正常發(fā)育或停止的血管發(fā)育。深度血管發(fā)育抑制的種類根據(jù)血管抑制百分率進行分析，包括下述標準深叢形成完全抑制被標記為“完全的”，正常的血管發(fā)育(包括抑制小于25％)被標記為“正常的”，其余的被標記為“部分的”。對于rd/rd小鼠的拯救數(shù)據(jù)，使用10x透鏡獲得每個整裝視網(wǎng)膜中深叢的四個分離的區(qū)域。計算每幅圖像的血管系統(tǒng)的全長、總結并進行組間比較。為了獲得準確的信息，將Lin-HSC注射入一只眼睛中，而將Lin+HSC注射入同一只鼠的另一只眼睛中。非-注射的對照視網(wǎng)膜取自同一窩動物。
實施例6.成年人視網(wǎng)膜損傷模型利用二極管激光器(150mW，1秒，50mm)或用一個27號注射針頭機械刺穿視網(wǎng)膜來制造激光和瘢痕模型。在受傷后五天，利用玻璃體內注射方法注射細胞。五天后采集眼睛。
實施例7.視網(wǎng)膜再生的神經(jīng)營養(yǎng)拯救成人骨髓衍生的譜系造血干細胞(Lin-HSC)在視網(wǎng)膜變性小鼠模型中具有血管營養(yǎng)和神經(jīng)營養(yǎng)拯救作用。在10天齡小鼠的右眼玻璃體內注射約0.5ml包含約105本發(fā)明的Lin-HSC，2個月后評估視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)和神經(jīng)元層核的數(shù)量。給同一只鼠的左眼注射大約同樣數(shù)量的Lin+HSC作為對照，進行同樣的評估。如圖9.所示，在Lin-HSC處理的眼睛中視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)表現(xiàn)為近似正常，內核層近似正常，外核層(ONL)有約3至4層的神經(jīng)核。相反，相反一側的Lin+HSC處理的眼睛有一個顯著地萎縮的中間視網(wǎng)膜血管層，一個完全萎縮的外層視網(wǎng)膜血管層；內核層顯著地萎縮，外核層則完全失去。在小鼠3和小鼠5中戲劇性地說明了這一點。在小鼠1中沒有產(chǎn)生拯救作用，而且大約15％的注射小鼠均是這種情況。
當利用視網(wǎng)膜電圖(ERG)評價視覺功能時，同時觀測到正性ERG的恢復和血管、神經(jīng)元的拯救(小鼠3和5)。沒有血管和神經(jīng)元拯救時(小鼠1)則觀測不到正性ERG。圖10.所示的回歸分析曲線說明了本發(fā)明Lin-HSC產(chǎn)生的rd/rd小鼠血管和神經(jīng)元拯救之間的相關性。對于中間體血管系統(tǒng)類型(r＝0.45)和深血管系統(tǒng)(r＝0.67)觀測到神經(jīng)元(y-axis)和血管(x-axis)修復之間的相關性。
圖11.說明了在Lin+HSC產(chǎn)生的血管和神經(jīng)元拯救之間缺乏任何統(tǒng)計學上的顯著相關性。將血管拯救定量化并將數(shù)據(jù)列于圖12.中。圖12.顯示了在注射后1個月(1M)、2個月(2M)和6個月(6M)時小鼠的數(shù)據(jù)，說明使用本發(fā)明Lin-HSC處理的眼睛中的血管長度(黑色柱)與同一只小鼠的沒有處理的眼睛中的血管長度(白色柱)相比有顯著增加，特別是在注射后1個月和2個月時。在注射Lin-HSC或Lin+HSC約兩個月后通過計數(shù)內核層和外核層的細胞核數(shù)量，對神經(jīng)營養(yǎng)治療作用定量化。結果列于圖13.和14.中。
結果鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育；眼睛血管生成的模型小鼠眼睛提供了一種公認的用于研究哺乳動物視網(wǎng)膜血管發(fā)育，例如人視網(wǎng)膜血管發(fā)育的模型。在鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)發(fā)育期間，局部缺血—導致的視網(wǎng)膜血管的發(fā)育與星形膠質細胞緊密聯(lián)系。神經(jīng)膠質成分沿著神經(jīng)節(jié)細胞層從視神經(jīng)盤移動至妊娠晚期人類胎兒或新生嚙齒動物的視網(wǎng)膜上，并呈放射狀傳播。當鼠類視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)發(fā)育時，上皮細胞利用已建立的星形細胞模板測定視網(wǎng)膜血管模式(見圖1a和b)。圖1(a和b)描述了鼠視網(wǎng)膜發(fā)育示意圖。圖1a描述了與星形膠質細胞模板(亮線)重疊的初級叢(圖左上方的暗線部分)的發(fā)育，圖1b描述了視網(wǎng)膜血管形成的第二階段。在此圖中，GCL代表神經(jīng)節(jié)細胞層、IPL代表內部血管網(wǎng)狀組織層、INL代表內核層、OPL代表外部血管網(wǎng)狀組織層、ONL代表外核層、RPE代表視網(wǎng)膜色素上皮、ON代表視神經(jīng)，而P代表外周。
出生時，視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)事實上是不存在的。在出生后的第14天(P14)視網(wǎng)膜發(fā)育出復合的視網(wǎng)膜血管初級(表面的)層和次級(深度)層，與視覺起始相一致。開始時，輻射狀視乳頭周圍血管向著外周神經(jīng)在預存的星形細胞網(wǎng)狀結構之上呈放射狀生長，變?yōu)橥ㄟ^毛細管叢形成進行性地互相連接。這些血管經(jīng)過P10(圖1a)在神經(jīng)纖維內作為單細胞層生長。在P7-P8之間，側副支開始從初級叢萌芽，穿透視網(wǎng)膜至外部叢狀層，在那里形成次級或深度視網(wǎng)膜叢。P21，整個網(wǎng)狀結構經(jīng)歷了廣泛地改造，在內核層的內表面形成第三級或中間體叢(圖1b)。
由于若干理由，新生的鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)生模型可用于研究在眼睛的血管發(fā)生期間HSC的作用。在這個生理學相關的模型中，在內源性血管出現(xiàn)之前產(chǎn)生大量的星形細胞模板，在新生血管產(chǎn)生過程中允許對細胞-細胞靶向作用進行評估。此外，已知連貫的、重現(xiàn)性的新生視網(wǎng)膜血管過程是受缺氧驅動的，在這一方面與許多的視網(wǎng)膜疾病相似，其中局部缺血扮演了重要角色。
源自骨髓的內皮祖細胞(EPC)的富集雖然在HSC制劑中發(fā)現(xiàn)的EPC群上已對細胞表面標記表達進行了廣泛的評估，但是確定的專一性地鑒別EPC的標記仍然很少。為了富集EPC，造血譜系標記正性細胞(Lin+)，即B淋巴細胞(CD45)、T淋巴細胞(CD3)、粒細胞(Ly-6G)、單核細胞(CD11)和紅細胞(TER-119)，均從骨髓單核細胞中耗盡了。使用Sca-1抗原進一步富集EPC。在玻璃體內注射相同數(shù)量的Lin-Sca-1+細胞或Lin-細胞后而獲得一個對照結果，兩組之間沒有檢測到有任何區(qū)別。事實上，當僅注射Lin-Sca-1+細胞時，觀察到遠大得多的對發(fā)育中的血管的滲入。
基于功能性分析富集本發(fā)明的Lin-HSC以獲取EPC。此外，Lin+HSC群與Lin-HSC群的功能性表現(xiàn)十分不同。還對通常用于鑒別每一部分的EPC(以之前報告的體外特征研究為基礎)的抗原表位進行評估。雖然這些標記中沒有一個與Lin-部分唯一地聯(lián)系，然而與Lin+HSC部分相比較，Lin-HSC中所有的標記都增高了約70-1800％(圖1c)。圖1c說明了骨髓衍生的Lin+HSC和Lin-HSC分離的細胞的流動細胞計數(shù)特征。圖1c的最上面一行顯示非抗體標記的細胞的造血干細胞打點圖分布。R1確定了陽性PE-染色的可計量門控區(qū)域；R2指示了GFP-0陽性的。Lin-HSC的打點圖顯示于中間行，最下面一行顯示了Lin+HSC的打點圖。將C57B/6細胞用Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE-軛合的抗體進行標記。Tie-2數(shù)據(jù)得自Tie-2-GFP小鼠。打點圖角上的百分數(shù)指示陽性-標記的細胞占Lin+HSC或Lin-HSC群總數(shù)的百分比。有趣的是，公認的EPC標記例如FIk-1/KDR、Tie-2和Sca-1表達很差，因此沒有用于進一步的分級。
在玻璃體內注射的HSC Lin-細胞包含EPC，其對星形膠質細胞具有靶向作用并滲入發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)為了測定玻璃體內注射的Lin-HSC是否能夠靶向視網(wǎng)膜的特定的細胞類型，利用星型細胞模板并參與視網(wǎng)膜的血管發(fā)生，將來自本發(fā)明的Lin-HSC組合物的大約105個細胞或分離自成年(GFP或LacZ轉基因)小鼠骨髓的Lin+HSC細胞(對照，大約105個細胞)注入出生后2天(P2)的小鼠眼睛中。注射4天后(P6)，得自GFP或LacZ轉基因小鼠的本發(fā)明Lin-HSC組合物的許多細胞附著在視網(wǎng)膜上，并且具有上皮細胞的特征性的伸長的外觀(圖2a)。圖2說明了Lin-細胞移入發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜。如圖2a所示，在注射4天后(P6)在玻璃體內注射的eGFP+Lin-HSC附著在視網(wǎng)膜上，并產(chǎn)生分化。
在視網(wǎng)膜的許多區(qū)域，以一定的樣式配置表達GFP的細胞，與隱晦的星形細胞相一致并且與血管相似。在內源性、發(fā)育中的血管網(wǎng)狀結構之前觀測到這些熒光細胞(圖2b)。相反，只有少量的Lin+HSC(圖2c)或成年小鼠腸系膜上皮細胞(圖2d)附著在視網(wǎng)膜的表面。為了確定來自注射的Lin-HSC組合物的細胞是否也能夠附著在含有已建立的血管的視網(wǎng)膜上，我們向成年小鼠的眼睛中注射Lin-HSC組合物。有趣的是，沒有觀察到細胞附著在視網(wǎng)膜上，或滲入已建立的正常視網(wǎng)膜的血管中(圖2e)。這表明本發(fā)明的Lin-HSC組合物不能破裂正常發(fā)育的血管系統(tǒng)，也不會引發(fā)正常發(fā)育的視網(wǎng)膜中的異常血管化作用。
為了確定本發(fā)明的注射的Lin-HSC組合物和視網(wǎng)膜星形細胞之間的關系，使用轉基因小鼠，其表達膠質細胞原纖維酸性蛋白(GFAP，星形細胞的標記物)和啟動子驅動的綠色熒光蛋白(GFP)。對注射了來自eGFP轉基因小鼠的Lin-HSC的GFAP-GFP轉基因小鼠視網(wǎng)膜進行檢查，表明注入的eGFP EPC和現(xiàn)存的星形細胞的共定位(圖2f-h，箭頭)。觀察到eGFP+Lin-HSC的過程與隱晦的星形細胞網(wǎng)狀結構相一致(箭頭，圖2g)。對這些眼睛的檢查表明注入的標記的細胞只附著到星形細胞上；在P6小鼠的視網(wǎng)膜中，其中視網(wǎng)膜外周沒有內源性血管，觀察到注入的細胞附著在這些還沒有血管化的區(qū)域中的星形細胞上。令人吃驚的是，在視網(wǎng)膜深層中的精確的位置上觀察到注入的、標記的細胞，此處正常的視網(wǎng)膜血管接著發(fā)育(圖2i，箭頭)。
為了確定本發(fā)明的注射的Lin-HSC是否穩(wěn)定地滲入發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，在隨后的幾個時間點檢測視網(wǎng)膜血管。早在P9(注射后7天)時，Lin-HSC滲入CD31+結構(圖2j)中。截止到P16(注射后14天)時，細胞已經(jīng)廣泛地滲入視網(wǎng)膜的血管樣結構中(圖2k)。當在處死動物前在血管內注射羅丹明—葡聚糖(鑒別功能性視網(wǎng)膜血管)時，大多數(shù)Lin-HSC與伸展的血管排成一線(圖21)。觀察到標記的細胞分布的兩個樣式(1)在一個樣式中，細胞沿著未標記的上皮細胞之間的血管散布；(2)另一個樣式顯示血管完全由標記的細胞組成。注入的細胞也滲入深血管叢的血管中(圖2m)。雖然Lin-HSC-衍生的EPC對新生性血管系統(tǒng)的零星地滲入以前曾有報道，然而這卻是首次報道血管網(wǎng)狀結構全部由這些細胞組成。這表明來自玻璃體內注射的骨髓衍生的本發(fā)明的Lin-HSC群的細胞能夠有效地滲入形成視網(wǎng)膜血管叢的任何一層中。
當至多在玻璃體內注射后5或10天檢查時，非-視網(wǎng)膜組織(例如腦、肝、心臟、肺、骨髓)的組織學檢查表明不存在任何GFP正性細胞。這說明Lin-HSC組分中的細胞亞群選擇性地靶向視網(wǎng)膜星形細胞，穩(wěn)定地滲入發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。既然這些細胞具有很多上皮細胞的特征(與視網(wǎng)膜星形細胞聯(lián)合、伸長形態(tài)、穩(wěn)定地滲入伸展的血管中并且不出現(xiàn)在血管外位置)，這些細胞代表EPC出現(xiàn)在Lin-HSC群中。定向的星形細胞與在許多缺氧性視網(wǎng)膜病中觀察到的是同一類型；已知神經(jīng)膠質細胞是在DR或視網(wǎng)膜損傷的其他形式中觀察到的新生血管植物體的主要成分。在活性神經(jīng)膠質增生和局部缺血-誘導的新生血管形成條件下，活性星形細胞增生，產(chǎn)生細胞因子，正調節(jié)GFAP，與在許多哺乳動物種包括人的新生視網(wǎng)膜血管模板結構中觀察到的相似。
為了測試本發(fā)明的Lin-HSC組合物在成年鼠的眼中是否像其在新生鼠眼中一樣對活性星形細胞具有靶向作用，將Lin-HSC細胞注射入視網(wǎng)膜被光凝固(圖3a)或針尖(圖3b)損傷的成年鼠眼睛中。在兩個模型中，只有在受損傷部位附近觀察到明顯被GFAP染色的細胞(圖3a和b)。來自注入的Lin-HSC組合物的細胞定位在受損傷部位，保持與GFAP-正性星形細胞的特異性聯(lián)系(圖3a和b)。在這些位置，還觀察到Lin-HSC細胞轉移至視網(wǎng)膜的更深層，其水平與在深度視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的新生形成期間觀察到的相類似(沒有給出數(shù)據(jù))。視網(wǎng)膜的未受損部位不包含Lin-HSC細胞，這與將Lin-HSC注入正常未受損成年鼠視網(wǎng)膜中時觀察到的結果相同(圖2e)。這些數(shù)據(jù)表明Lin-HSC組合物在具有神經(jīng)膠質增生的受損傷成年鼠視網(wǎng)膜以及血管化作用的新生視網(wǎng)膜中對活性神經(jīng)膠質細胞具有選擇性的靶向作用。
在玻璃體內注射的Lin-HSC能夠拯救和穩(wěn)定變性的血管系統(tǒng)因為在玻璃體內注射的Lin-HSC組合物對星形膠質細胞具有靶向作用并且能夠滲入正常的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，那么在與神經(jīng)膠質增生和血管變性相關的局部缺血或變性的視網(wǎng)膜疾病中這些細胞也能夠穩(wěn)定變性的血管系統(tǒng)。出生后一個月的rd/rd小鼠是顯示光感受器和視網(wǎng)膜血管層深度變性的視網(wǎng)膜變性模型。在這些小鼠中視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)正常發(fā)育直到P16，在這一時間點更深的血管叢開始退化；到P30時，絕大多數(shù)小鼠的深度和中間叢幾乎完全變性。
為了確定HSC是否能夠拯救退化的血管，在P6時在rd/rd小鼠玻璃體內注射Lin+或Lin-HSC(來自Balb/c鼠)。到P33時，注射Lin+細胞后，最深視網(wǎng)膜層的血管幾乎完全不存在(圖4a和b)。相反，在P33時大多數(shù)Lin-HSC注射的視網(wǎng)膜具有一個幾乎正常的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，其有三個平行、良好成形的血管層(圖4a和4d)。這種作用的定量化表明注射Lin-的rd/rd小鼠眼睛深血管叢中血管的平均長度幾乎是未治療或Lin+細胞治療的眼睛的三倍(圖4e)。令人吃驚的是，注射rd/rd成年小鼠(FVB/N)骨髓衍生的Lin-HSC組合物也拯救了變性的rd/rd新生小鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)(圖4f)。在rd/rd小鼠出生后2-3周觀察到眼睛血管系統(tǒng)的變性。晚至P15時注射Lin-HSC也能夠部分穩(wěn)定rd/rd小鼠的變性的血管系統(tǒng)至少一個月(圖4g和4h)。
注入幼齡rd/rd小鼠(例如P2)中的Lin-HSC組合物也可滲入發(fā)育中的表面血管系統(tǒng)。至P11時，觀察到這些細胞移至深血管叢，并形成與在野生型外部視網(wǎng)膜血管層觀察到的相同的圖像(圖5a)。為了更加清楚地描述來自注射的Lin-HSC組合物的細胞滲入、穩(wěn)定和變性rd/rd小鼠的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的方式，將衍生自Balb/c小鼠的Lin-HSC組合物注射入Tie-2-GFP FVB小鼠的眼睛中。FVB小鼠具有rd/rd小鼠基因型，因為它們表達融合蛋白Tie-2-GFP，所有的內源性血管都是發(fā)熒光的。
當將Lin-HSC組合物中非標記的細胞注射入新生Tie-2-GFP FVB小鼠的眼睛并隨后即滲入發(fā)育中的血管系統(tǒng)中時，內源性Tie-2-GFP標記的血管中應當有非標記裂隙，這些裂隙對應于注射的滲入的非標記Lin-HSC。然后以其他的血管標記(例如CD-31)染色后，描繪全部的血管，允許測定非內源性上皮細胞是否是血管系統(tǒng)的一部分。在注射兩個月后，在注射了Lin-HSC組合物的眼睛視網(wǎng)膜中觀察到CD31-陽性、Tie-2-GFP陰性的血管(圖5b)。有趣的是，大多數(shù)拯救的血管包括Tie-2-GFP陽性細胞(圖5c)。不管是否有血管拯救，通過染色平滑肌肌動蛋白測定的周皮細胞的分布不因注射Lin-HSC而改變(圖5d)。這些數(shù)據(jù)清楚地表明在玻璃體內注射的本發(fā)明Lin-HSC組合物在有遺傳性缺陷的小鼠內轉移至視網(wǎng)膜，參與正常的視網(wǎng)膜血管的形式，穩(wěn)定內源性的變性中的血管系統(tǒng)。
由從Lin-Hsc轉染的細胞造成的視網(wǎng)膜血管發(fā)生的抑制大多數(shù)視網(wǎng)膜血管疾病涉及異常的血管增殖而不是變性。對星形細胞具有靶向作用的轉基因細胞可用于傳遞抗血管生成蛋白和抑制血管發(fā)生。使用T2-色氨酰-tRNA合成酶(T2-TrpRS)對來自Lin-HSC組合物的細胞進行轉染。T2-TrpRS是可有效抑制視網(wǎng)膜血管發(fā)生的TrpRS的一個43kD片段(圖6a)。關于P12，在P2上注射對照質粒轉染的Lin-HSC組合物(無T2-TrpRS基因)的眼睛視網(wǎng)膜有正常的初級(圖6c)和次級(圖6d)網(wǎng)膜血管叢。當將T2-TrpRS轉染的本發(fā)明的Lin-HSC組合物注射入P2眼睛中并在10天后進行評價時，主要的網(wǎng)狀結構產(chǎn)生顯著異常(圖6e)并且深視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的形成幾乎完全被抑制(圖6f)。幾乎沒有觀察到這些眼睛中的血管被血管之間的大裂隙明顯減弱。T2-TrpRS-分泌型Lin-HSC細胞引起的抑制程度列于表2中。
T2-TrpRS由Lin-HSC組合物中的細胞在體外產(chǎn)生和分泌，在將這些轉染的細胞注射入玻璃體內之后，在視網(wǎng)膜中觀察到一個30kD的T2-TrpRS片段(圖6b)。這種30kD的片段僅在注射轉染的本發(fā)明Lin-HSC的視網(wǎng)膜中能夠觀察到，與重組體或體外合成的蛋白相比，這種表觀分子量的降低可能是由于體內T2-TrpRS的加工或降解而引起的。這些數(shù)據(jù)表明Lin-HSC組合物可被用于通過活性星形細胞的靶向作用傳遞功能性的活性基因例如表達血管生成抑制分子的基因，至視網(wǎng)膜的血管系統(tǒng)。雖然觀察到的血管生成抑制作用可能是由于細胞介導的活性引起的，但這是很不可能的，因為使用相同的、但是非-T2-轉染的Lin-HSC組合物治療的眼睛具有正常的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。
表2.T2-TrpRS-分泌型Lin-HSC細胞的血管抑制作用
在玻璃體內注射的Lin-HSC組合物定位至視網(wǎng)膜星形細胞、滲入血管，可用于治療多種視網(wǎng)膜性疾病。雖然注射的HSC組合物中的大多數(shù)細胞附著在星形細胞模板上，但是少數(shù)細胞移動至視網(wǎng)膜，靶向深血管網(wǎng)狀結構隨后進行發(fā)育所在區(qū)域。即使在出生后42天之前，在此區(qū)域雖然沒有觀察到GFAP-陽性星形細胞，但是也不排除GFAP-陰性神經(jīng)膠質細胞已經(jīng)存在而為Lin-HSC定位提供信號的可能性。以前的研究顯示許多疾病與活性神經(jīng)膠質增生相關。在DR中，尤其是，神經(jīng)膠質細胞及其細胞外基質與病理學血管發(fā)生相關。
既然來自注射的Lin-HSC組合物中的細胞特異性地附著在表達GFAP的神經(jīng)膠質細胞上，不管損傷類型是什么，本發(fā)明的Lin-HSC組合物都可用于靶向視網(wǎng)膜中的預—血管生成傷口。例如，在局部缺血性視網(wǎng)膜病如糖尿病中，新生血管形成是一種對于組織缺氧的響應。通過Lin-HSC組合物對于病理性新生血管形成位置的靶向作用，發(fā)育中的新生性血管系統(tǒng)可被穩(wěn)定用以預防新生性血管系統(tǒng)異常例如出血或水腫(與DR相關的視覺喪失的原因)，還可能減輕本來刺激新生血管形成的組織缺氧。異常的血管可被修復為正常狀態(tài)。此外，血管生成抑制蛋白如T2-TrpRS可利用轉染的Lin-HSC組合物和激光誘導的星形細胞激活作用而被傳遞至病理性血管發(fā)生的位置。既然激光光凝術在臨床眼科學中是常規(guī)使用的方法，這種方法可應用于治療多種視網(wǎng)膜疾病。雖然這種以細胞為基礎的方法已經(jīng)在癌癥治療中進行了研究，但是由于在眼球內注射使將大量細胞傳遞至疾病部位成為可能，這種方法在治療眼部疾病中的應用將會帶來更大的益處。
使用Lin-HSC的神經(jīng)營養(yǎng)性和血管營養(yǎng)性拯救MACS用于從上文所述的增強的綠色熒光蛋白(eGFP)、C3H(rd/rd)、FVB(rd/rd)小鼠的骨髓中分離Lin-HSC。將包含來自這些小鼠的EPC的Lin-HSC以玻璃體內的方式注射入P6 C3H或FVB小鼠的眼睛中。在注射后的不同時間點(1個月、2個月和6個月)收集視網(wǎng)膜。在用CD31抗體染色后利用掃描激光共焦顯微鏡和在用DAPI核染色后利用視網(wǎng)膜組織學對血管系統(tǒng)進行分析。在不同時間點對視網(wǎng)膜mRNA進行微點陣基因表達分析用于鑒別在此作用中可能涉及的基因。
截止到P21時，rd/rd小鼠眼睛的神經(jīng)感覺視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)均產(chǎn)生嚴重變性。使用Lin-HSC處理的rd/rd小鼠眼睛在P6時視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)仍然正常，并保持長達6個月；在所有的時間點(1M、2M和6M)，與對照組相比較，深層和中間層均有顯著改善(見圖12)。此外，我們觀察到與使用Lin+HSC處理的對照眼睛相比較，使用Lin-HSC處理的視網(wǎng)膜還更厚(1M，1.2-倍；2M，1.3-倍；6M，1.4-倍)，并且在外核層含有更多數(shù)量的細胞(1M，2.2-倍；2M，3.7-倍；6M，5.7-倍)。相對于“對照”(未處理的或非-Lin-處理的)rd/rd小鼠視網(wǎng)膜，對“拯救的”(例如，Lin-HSC)的大規(guī)模的基因組分析表明編碼sHSPs(小熱休克蛋白)和與血管、神經(jīng)治療相關的特定生長因子的基因顯著上調，所述生長因子包括列于表3的因子。
本發(fā)明的骨髓衍生的Lin-HSC顯著而重復性地誘導了正常血管的維護，在rd/rd小鼠中極大地增加了光感受器和其他的神經(jīng)細胞層。這種神經(jīng)營養(yǎng)性拯救作用與小熱休克蛋白和生長因子的顯著增量調節(jié)相關，因此，對于目前尚不能治療的視網(wǎng)膜變性疾病提供了治療方法的思路。
表3.在注射Lin-HSC的小鼠視網(wǎng)膜中增量調節(jié)的基因
晶體蛋白基因
討論譜系定型造血細胞的標記用于負性選擇包含EPC的骨髓-衍生的Lin-HSC群。雖然可用作EPC的骨髓-衍生的Lin-HSC亞群不是由通常使用的細胞表面標記表征的，但發(fā)育中或受損傷的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中這些細胞的行為完全不同于對于Lin+和成體上皮細胞群所觀察到的結果。使用標記如Sca-1進行的進一步HSC的亞分級表明Lin-Sca1+細胞沒有顯示出與單獨使用Lin-HSC細胞有任何的實質性差別。這些細胞對視網(wǎng)膜血管發(fā)生的位置具有選擇性的靶向作用，并參與新血管的形成。
遺傳性視網(wǎng)膜變性性疾病經(jīng)常伴隨視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的損耗。對這類疾病的有效治療要求恢復功能與維護復雜的組織結構。雖然最近的一些研究探索了以細胞為基礎的營養(yǎng)因子或干細胞自身傳遞的用途，但二者的某種結合仍可能是必需的。例如，使用生長因子療法治療視網(wǎng)膜變性性疾病導致血管不能調節(jié)的過度生長，造成了正常視網(wǎng)膜組織結構的嚴重性破裂。使用神經(jīng)或視網(wǎng)膜干細胞治療視網(wǎng)膜變性性疾病可以重建神經(jīng)元功能，但功能性血管系統(tǒng)對于維持視網(wǎng)膜的功能性完整也是必須的。本發(fā)明的Lin-HSC組合物的細胞對rd/rd小鼠視網(wǎng)膜血管的滲入在不破裂視網(wǎng)膜結構的情況下穩(wěn)定了變性的血管系統(tǒng)。當向P15rd/rd小鼠中注射細胞時也可觀察到這種拯救作用。由于血管變性在P16時開始，這種觀察擴展了有效的Lin-HSC治療的治療范圍。在注射了本發(fā)明Lin-HSC的眼睛中保護了視網(wǎng)膜神經(jīng)元和光感受器，維護了視覺功能。
本發(fā)明的Lin-HSC組合物包括EPC群，其可通過對活性星形細胞的靶向作用而促進血管發(fā)生、滲入已建立的沒有破裂視網(wǎng)膜結構的模板中。本發(fā)明Lin-HSC還提供了一種令人吃驚的對于患有視網(wǎng)膜變性的眼睛具有長期的神經(jīng)營養(yǎng)性的拯救作用。此外，包含EPC的遺傳性修飾的自體固有的Lin-HSC在長時間內可被移入局部缺血或異常血管化的眼睛中，穩(wěn)定地滲入新血管中，連續(xù)地局部性地遞送治療分子。這種在生理學有意義的劑量范圍內表達藥理學因子的基因的局部遞送代表了一種新的用于治療目前還不能被治療的眼部疾病的新范例。
序列表<110>The Scripps Research InstituteFriedlander，MartinOtani，AtsushiDaSilva，Karen<120>造血干細胞和治療新生血管性眼部疾病的方法<130>TSRI-900.1<150>60/467051<151>2003-05-02<150>60/398522<151>2002-07-25<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>4742<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>編碼His-標記的人類T2-TrpRS的DNA<400>1tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac 3360
tatagggaga ccacaacggt ttccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga 3420tatacatatg agtgcaaaag gcatagacta cgataagctc attgttcggt ttggaagtag 3480taaaattgac aaagagctaa taaaccgaat agagagagcc accggccaaa gaccacacca 3540cttcctgcgc agaggcatct tcttctcaca cagagatatg aatcaggttc ttgatgccta 3600tgaaaataag aagccatttt atctgtacac gggccggggc ccctcttctg aagcaatgca 3660tgtaggtcac ctcattccat ttattttcac aaagtggctc caggatgtat ttaacgtgcc 3720cttggtcatc cagatgacgg atgacgagaa gtatctgtgg aaggacctga ccctggacca 3780ggcctatggc gatgctgttg agaatgccaa ggacatcatc gcctgtggct ttgacatcaa 3840caagactttc atattctctg acctggacta catggggatg agctcaggtt tctacaaaaa 3900tgtggtgaag attcaaaagc atgttacctt caaccaagtg aaaggcattt tcggcttcac 3960tgacagcgac tgcattggga agatcagttt tcctgccatc caggctgctc cctccttcag 4020caactcattc ccacagatct tccgagacag gacggatatc cagtgcctta tcccatgtgc 4080cattgaccag gatccttact ttagaatgac aagggacgtc gcccccagga tcggctatcc 4140taaaccagcc ctgttgcact ccaccttctt cccagccctg cagggcgccc agaccaaaat 4200gagtgccagc gacccaaact cctccatctt cctcaccgac acggccaagc agatcaaaac 4260caaggtcaat aagcatgcgt tttctggagg gagagacacc atcgaggagc acaggcagtt 4320tgggggcaac tgtgatgtgg acgtgtcttt catgtacctg accttcttcc tcgaggacga 4380cgacaagctc gagcagatca ggaaggatta caccagcgga gccatgctca ccggtgagct 4440caagaaggca ctcatagagg ttctgcagcc cttgatcgca gagcaccagg cccggcgcaa 4500ggaggtcacg gatgagatag tgaaagagtt catgactccc cggaagctgt ccttcgactt 4560tcagaagctt gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa 4620caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc 4680ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg 4740at4742<210>2<211>392<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>His-標記的人類T2-TrpRS<400>2Met Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly1 5 10 15Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr20 25 30Gly Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His35 40 45Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe50 55 60Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly65 70 75 80
His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn85 90 95Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys100 105 110Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys115 120 125Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser130 135 140Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val145 150 155 160Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly165 170 175Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln180 185 190Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg195 200 205Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr210 215 220Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro225 230 235 240Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr245 250 255Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr260 265 270Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly275 280 285Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val290 295 300Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys305 310 315 320Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly325 330 335Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu340 345 350His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe355 360 365Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln Lys Leu Ala Ala Ala370 375 380Leu Glu His His His His His His385 390
權利要求
1.一種包括內皮祖細胞的分離的哺乳動物骨髓衍生的譜系負性造血干細胞群，其中至少約50％的所述細胞包括細胞標記物CD31和c-kit。
2.如權利要求1所述的分離的干細胞群，其中至少約75％的所述細胞包括細胞標記物CD31。
3.如權利要求1所述的分離的干細胞群，其中至少約65％的所述細胞包括細胞標記物c-kit。
4.一種包括內皮祖細胞的分離的哺乳動物骨髓衍生的譜系負性造血干細胞群，其中至少約80％的所述細胞包括CD31細胞標記物，至少約70％的所述細胞包括c-kit細胞標記物。
5.如權利要求1所述的分離的干細胞群，其中所述細胞是鼠細胞。
6.如權利要求1所述的分離的干細胞群，其中所述細胞是人類細胞。
7.如權利要求1所述的分離的干細胞群，其中不多于約8％的所述細胞還包括細胞標記物Sca-1，并且不多于約4％的所述細胞還包括細胞標記物Flk-1/KDR。
8.如權利要求7所述的分離的干細胞群，其中不多于約1％的所述細胞包括Tie-2細胞標記物。
9.一種包括內皮祖細胞的分離的哺乳動物骨髓衍生的譜系負性造血干細胞群，其中約50％至約80％的所述細胞包括CD31標記物，約70％至約75％的所述細胞包括c-kit標記物，約4％至約8％的所述細胞包括Sca-1標記物，并且約2％至約4％的所述細胞包括Flk-1/KDR標記物。
10.如權利要求1所述的分離的干細胞群，還包括細胞培養(yǎng)基。
11.如權利要求10所述的分離的干細胞群，其中干細胞衍生自哺乳動物骨髓。
12.如權利要求10所述的分離的干細胞群，其中干細胞衍生自人類骨髓。
13.一種分離包括內皮祖細胞的骨髓衍生的譜系負性造血干細胞的方法，包括下述步驟(a)采集哺乳動物的骨髓；(b)從該骨髓中分離多數(shù)的單核細胞；(c)使用生物素軛合的針對CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119的譜系系列抗體標記多數(shù)單核細胞；和(d)從該多數(shù)單核細胞中除去對于CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119來說是譜系正性的單核細胞，以提供一個包含內皮祖細胞在內的譜系負性造血干細胞群。
14.如權利要求13所述的方法，其中所述的哺乳動物是成年哺乳動物。
15.如權利要求13所述的方法，其中所述的哺乳動物是小鼠。
16.如權利要求13所述的方法，其中所述的哺乳動物是人類。
17.如權利要求13所述的方法，其中至少約50％的譜系負性造血干細胞群包括CD31和c-kit細胞標記物。
18.如權利要求13所述的方法，其中譜系負性造血干細胞群包括能靶向受損傷的成年視網(wǎng)膜的神經(jīng)膠質富集區(qū)域的內皮祖細胞。
19.一種分離的哺乳動物骨髓衍生的譜系負性造血干細胞群，其是通過權利要求13的方法制備的。
20.如權利要求19所述的分離的干細胞群，其中至少約50％的所述細胞包括細胞標記物CD31和c-kit。
21.如權利要求19所述的分離的干細胞群，其中至少約75％的所述細胞包括細胞標記物CD31。
22.如權利要求19所述的分離的干細胞群，其中至少約65％的所述細胞包括細胞標記物c-kit。
23.如權利要求19所述的分離的干細胞群，其中至少約80％的所述細胞包括CD31細胞標記物，至少約70％的所述細胞包括c-kit細胞標記物。
24.如權利要求23所述的分離的干細胞群，其中不多于約8％的所述細胞還包括細胞標記物Sca-1，并且不多于約4％的所述細胞還包括細胞標記物Flk-1/KDR。
25.如權利要求24所述的分離的干細胞群，其中不多于約1％的所述細胞包括Tie-2細胞標記物。
26.如權利要求19所述的分離的干細胞群，其中約50％至約85％的所述細胞包括CD31細胞標記物，約70％至約75％的所述細胞包括c-kit細胞標記物，約4％至約8％的所述細胞包括Sca-1細胞標記物，并且約2％至約4％的所述細胞包括Flk-1/KDR細胞標記物。
27.如權利要求19所述的分離的干細胞群，其中所述細胞是鼠細胞。
28.如權利要求19所述的分離的干細胞群，其中所述細胞是人類細胞。
29.一種增強哺乳動物視網(wǎng)膜新生血管化的方法，包括將權利要求1所述的譜系負性造血干細胞以玻璃體內的方式注射到需要視網(wǎng)膜新生血管化的哺乳動物的眼睛中，其中干細胞衍生自哺乳動物的骨髓，該哺乳動物與需要將細胞注射到眼睛中的哺乳動物的種類相同。
30.如權利要求29所述的方法，其中所述哺乳動物是鼠。
31.如權利要求29所述的方法，其中所述哺乳動物是人類。
32.一種治療患者眼部疾病的方法，包括從患者的骨髓分離出包括內皮祖細胞的譜系負性造血干細胞群，并且將分離的干細胞以足以阻斷疾病的數(shù)量以玻璃體內的方式注射到患者的一只眼睛中。
33.如權利要求32所述的方法，其中干細胞的數(shù)量可有效地修復患者眼睛中的視網(wǎng)膜損傷。
34.如權利要求32所述的方法，其中干細胞的數(shù)量可有效地穩(wěn)定患者眼睛的視網(wǎng)膜新生血管系統(tǒng)。
35.如權利要求32所述的方法，其中干細胞的數(shù)量可有效地使患者眼睛視網(wǎng)膜新生血管系統(tǒng)發(fā)育成熟。
36.如權利要求32所述的方法，其中譜系負性造血干細胞群通過下述方法分離(a)采集哺乳動物的骨髓；(b)從該骨髓中分離多數(shù)的單核細胞；(c)使用生物素軛合的針對CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119的譜系系列抗體標記多數(shù)單核細胞；和(d)從該多數(shù)單核細胞中除去對于CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119來說是譜系正性的單核細胞，以提供一個包含內皮祖細胞在內的譜系負性造血干細胞群。
37.如權利要求36所述的方法，其中至少約50％分離的譜系負性造血干細胞群包括細胞標記物CD31和c-kit。
38.如權利要求32所述的方法，其中所述疾病是視網(wǎng)膜變性疾病。
39.如權利要求32所述的方法，其中所述疾病是視網(wǎng)膜血管變性疾病。
40.如權利要求32所述的方法，其中所述疾病是局部缺血性視網(wǎng)膜病。
41.如權利要求32所述的方法，其中所述疾病是血管出血。
42.如權利要求32所述的方法，其中所述疾病是血管滲漏。
43.如權利要求32所述的方法，其中所述疾病是脈絡膜病變。
44.如權利要求32所述的方法，其中所述疾病是與年齡相關的黃斑退行性改變。
45.如權利要求32所述的方法，其中所述疾病是糖尿病性視網(wǎng)膜病。
46.如權利要求32所述的方法，其中所述疾病是假性眼組織胞漿菌病。
47.如權利要求32所述的方法，其中所述疾病是早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病。
48.如權利要求32所述的方法，其中所述疾病是鐮刀狀細胞性貧血。
49.如權利要求32所述的方法，其中所述疾病是色素性視網(wǎng)膜炎。
50.一種轉染的譜系負性造血干細胞群，包括使用編碼有治療作用的肽的基因轉染的如權利要求1所述的干細胞群。
51.如權利要求50所述的轉染的干細胞群，其中所述的有治療作用的肽是抗血管生成肽。
52.如權利要求51所述的轉染的干細胞群，其中所述的抗血管生成肽是蛋白質片段。
53.如權利要求52所述的轉染的干細胞群，其中所述的蛋白質片段是TrpRS的抗血管生成片段。
54.如權利要求53所述的轉染的干細胞群，其中所述的TrpRS的片段是T2-TrpRS。
55.一種在需要抑制視網(wǎng)膜血管生成的患者眼睛中抑制視網(wǎng)膜血管生成的方法，包括將權利要求49所述的轉染的干細胞群以玻璃體內的方式注射到患者的眼睛中。
56.如權利要求55所述的方法，其中轉染的譜系負性造血干細胞群是通過下述步驟制備的(a)采集哺乳動物的骨髓；(b)從該骨髓中分離多數(shù)的單核細胞；(c)使用生物素軛合的針對CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119的譜系系列抗體標記多數(shù)單核細胞；和(d)從該多數(shù)單核細胞中除去對于CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119來說是譜系正性的單核細胞，以提供一個包含內皮祖細胞在內的譜系負性造血干細胞群。
57.如權利要求56所述的方法，其中至少約50％分離的譜系負性造血干細胞群包括細胞標記物CD31和c-kit。
58.一種遞送轉基因至患者的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的方法，包括將轉染的衍生自骨髓的譜系負性造血干細胞群以玻璃體內的方式注射到患者的眼睛中，其中干細胞群已經(jīng)用有治療作用的基因轉染。
59.如權利要求58所述的方法，其中轉染的譜系負性造血干細胞通過以下步驟制備(a)采集哺乳動物的骨髓；(b)從該骨髓中分離多數(shù)的單核細胞；(c)使用生物素軛合的針對CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119的譜系系列抗體標記多數(shù)單核細胞；和(d)從該多數(shù)單核細胞中除去對于CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119來說是譜系正性的單核細胞，以提供一個包含內皮祖細胞在內的譜系負性造血干細胞群。
60.如權利要求59所述的方法，其中至少約50％分離的譜系負性造血干細胞群包括細胞標記物CD31和c-kit。
61.如權利要求58所述的方法，其中所述的基因可用于抑制視網(wǎng)膜新生血管化。
62.一種在患有視網(wǎng)膜變性性疾病的哺乳動物視網(wǎng)膜中誘導神經(jīng)營養(yǎng)性拯救的方法，包括對哺乳動物的患病的眼睛施用能夠誘導神經(jīng)營養(yǎng)性拯救數(shù)量的細胞，所述細胞來自分離的哺乳動物骨髓衍生的包含內皮祖細胞的譜系負性造血干細胞群；其中至少約50％的干細胞包括細胞標記物CD31和c-kit。
63.如權利要求62所述的方法，其中所述的干細胞群是通過下述步驟分離的(a)采集哺乳動物的骨髓；(b)從該骨髓中分離多數(shù)的單核細胞；(c)使用生物素軛合的針對CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119的譜系系列抗體標記多數(shù)單核細胞；和(d)從該多數(shù)單核細胞中除去對于CD45、CD3、Ly-6G、CD11和TER-119來說是譜系正性的單核細胞，以提供一個包含內皮祖細胞在內的譜系負性造血干細胞群。
64.如權利要求62所述的方法，其中所述哺乳動物是人類。
65.權利要求62所述的方法，其中細胞通過玻璃體內注射方式給藥。
全文摘要
分離的哺乳動物骨髓衍生的譜系負性造血干細胞群(Lin HSC)包括能形成視網(wǎng)膜血管的內皮祖細胞(EPC)。在分離的Lin HSC群中至少約50％的細胞包括CD31和c－kit的細胞表面標記物。不多于約8％的細胞包括Sca－1細胞標記，不多于約4％的細胞包括Flk－1/KDR標記。本發(fā)明的分離的Lin HSC群可用于治療眼部血管疾病。還提供了已經(jīng)用有治療作用的基因轉染的分離的Lin HSC群，對于以細胞為基礎的基因療法該LinHSC群可用于將基因傳遞至眼中。
文檔編號A61P27/02GK1688196SQ03817735
公開日2005年10月26日 申請日期2003年7月25日 優(yōu)先權日2002年7月25日
發(fā)明者M·弗里蘭德, A·奧塔尼, K·達西爾瓦 申請人:斯克里普斯研究學院