專利名稱：功能性生物制劑的滅菌、穩(wěn)定和保存的制作方法
參照相關(guān)申請本申請要求享有2002年6月7日申請的美國在先專利申請60/387,177的權(quán)益，該專利申請的內(nèi)容在此引入作為參考。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)的一般領(lǐng)域，特別涉及通過輻射來保存功能性生物材料、生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子，例如，但是不限于血紅蛋白(包含在或獨(dú)立于紅細(xì)胞)，抗體，細(xì)胞因子，包括組成的或非組成的成分的血液成分，蛋白質(zhì)或其他細(xì)胞成分，完整的人和動物組織，和起抗原作用的材料來檢測敏感性和脫敏，和免疫接種。
許多年以來，生物材料已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)、診斷用途和試驗(yàn)的或化學(xué)的方法中。這些材料通常具有生物學(xué)活性，意味著它們具有與它們在原始生物體或植物中所具有的相同或相似的結(jié)構(gòu)的，酶學(xué)的或其他的分子功能，以致它們可以被用作診斷的、預(yù)防的和治療的試劑。盡管生物材料非常有用，使用它們具有一定風(fēng)險。這些材料會被從病毒到細(xì)菌等的各種生物污染物污染。如果這些污染物被傳播給人或動物，將會引起嚴(yán)重的健康問題。這些污染物還可能降低功效或甚至破壞其所污染的材料。
有許多用于檢測和篩選生物材料中的生物污染物或病原體的方法，但是這些篩選操作存在缺陷。這些方法并不總是可靠的，而且是昂貴的，并且僅能夠檢測非常特定的污染物。降低大量污染物的危害將會更加有效。許多技術(shù)已經(jīng)被用于降低污染物的危害，包括熱處理、化學(xué)溶劑和輻射。已經(jīng)證明熱處理會對產(chǎn)品的生物學(xué)活性產(chǎn)生副作用，降低產(chǎn)品的功效?；瘜W(xué)溶劑、消毒劑和抗菌劑已經(jīng)被用于降低污染發(fā)生的概率，特別是包裝后和使用之前的細(xì)菌增生的可能性。當(dāng)與人接觸時，這些溶劑和試劑是有害的，通常在應(yīng)用于人之前必須將它們從產(chǎn)品中去除。
輻射處理是另一種滅菌產(chǎn)品的方法。對于減少大量的生物學(xué)污染物，特別是包括細(xì)菌和病毒時，輻射處理是非常有效的。本領(lǐng)域的公開出版物表明，輻射滅菌的技術(shù)是非常靈活的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用包括所用的射線類型、含氧量、pH、輻射率、溫度、溶劑、穩(wěn)定劑等的特定標(biāo)準(zhǔn)，以改變產(chǎn)品對輻射的反應(yīng)。但是，迄今開發(fā)輻射處理方法中的絕大部分工作集中在滅活污染物的方法上，并提供在結(jié)構(gòu)功能和生物學(xué)功能上基本未被改變的生物材料。這種滅菌和穩(wěn)定的產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)是具有功能的，意味著它們具有與在原始生物體或植物中相同或相似的結(jié)構(gòu)的，酶學(xué)的或其他分子功能，使得它們可以被用作診斷的、預(yù)防的和治療的試劑。
A.血液和血液成分現(xiàn)有技術(shù)的缺陷在于用于醫(yī)學(xué)用途的血液和血液成分的制備方面。大量的各種損傷和醫(yī)學(xué)操作需要施用全血或各種血液成分。并不是每位患者都需要全血，實(shí)際上，全部血液成分的存在會導(dǎo)致醫(yī)學(xué)問題。分離的血液部分可以在最適合確保其在輸血時的生物學(xué)活性的那些特殊條件下存儲。例如，當(dāng)在處理中心采集供體血液時，并通過各種方法分離和存儲紅細(xì)胞。這種細(xì)胞可以在檸檬酸-磷酸-葡萄糖中4℃存儲5周，通常被包裝的紅細(xì)胞單位具有200-300ml的體積，并且紅細(xì)胞比容值(表示為細(xì)胞體積(corpuscular volume)百分比)為約70-90％。紅細(xì)胞還可以用甘油處理，然后在-30到-196℃下冷凍保存，在甘油溶液中存儲長達(dá)7年，但是必須持續(xù)在低溫下冷凍使得紅細(xì)胞存活到用于輸血。這兩種方法都要求極其小心地保持存儲溫度，以避免紅細(xì)胞的期望生物學(xué)活性被破壞，按照美國血庫標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會，一般認(rèn)為，至少70％的輸注紅細(xì)胞能夠存活24h是用于輸血操作的可接受水平。
一種已知的用于存儲紅細(xì)胞的方法是冷凍(凍干)紅細(xì)胞，這種細(xì)胞在室溫存儲的時間延長，并且用于哺乳動物時容易再生。當(dāng)RBC已經(jīng)按照許多已有的方法凍干時，例如在水溶液或磷酸緩沖鹽水(PBS)中，再生細(xì)胞被破壞，使得其不能代謝，并且細(xì)胞的血紅蛋白不能攜帶氧氣。戊二酸固定被凍干和再生的紅細(xì)胞主要應(yīng)用于凝集分析。
已知可以進(jìn)行低劑量γ射線輻射血液來預(yù)防輸血相關(guān)的移植物抗宿主疾病。當(dāng)給易患病的受體輸入供體淋巴細(xì)胞時，發(fā)生移植物抗宿主疾病(GVHD)。這些供體淋巴細(xì)胞增生并損害靶器官，特別是骨髓、皮膚、肝臟和胃腸道，最終將會導(dǎo)致死亡。最早認(rèn)為這種疾病是對接受全血輻射的患者進(jìn)行子宮內(nèi)灌注和給受體進(jìn)行同種異源骨髓移植時發(fā)生的綜合癥。GVHD還出現(xiàn)在其他免疫功能缺陷的患者中，輸入細(xì)胞血液產(chǎn)品或者少數(shù)情況下為移植器官使得這些患者暴露于供體的淋巴細(xì)胞中。最后，最經(jīng)常報道的與輸血相關(guān)的GVHD(TA-GVHD)的情況是免疫完善的血液受體，這些血液來自生物學(xué)相關(guān)的或HLA相同的供體。引發(fā)TA-GVHD的產(chǎn)品包括未被輻射的全血、包裝紅細(xì)胞、血小板、粒細(xì)胞和鮮新的未冷凍的血漿。不包括脫甘油的被冷凍的紅細(xì)胞、鮮新的冷凍血漿和冷凍沉淀物。
一般認(rèn)為，在此討論的術(shù)語“血液產(chǎn)品”可以并通常包括全血(及其部分)、血小板和/或紅細(xì)胞。如在此所用的術(shù)語“白細(xì)胞”是用于包括常見類型的白細(xì)胞，包括單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和任何存在于血液中的除了紅細(xì)胞和血小板之外的其他細(xì)胞。此外，基本上“無細(xì)胞”的血液產(chǎn)品可以含有一些白細(xì)胞。目前，用γ射線輻射血液產(chǎn)品是已知的唯一能夠防止輸血相關(guān)的GVBD的方法。最常見的輻射源是鈷-60和銫-137。絕大多數(shù)血液中心采用不小于15Gy的25Gy的常規(guī)劑量的這些同位素，輻射血袋的任意區(qū)域來滅活輸液所用的細(xì)胞產(chǎn)品中的淋巴細(xì)胞。
困擾輸血應(yīng)用的許多問題之一是導(dǎo)致感染性疾病的因子的傳播。由于病原生物體存在于全血的不同部分中，輸血后的疾病的危險性隨著所用的血液產(chǎn)品或組分不同而變化。一些制備用于人、獸醫(yī)或試驗(yàn)用途的產(chǎn)品可能含有不期望的和潛在的危險污染物，如病毒、細(xì)菌、酵母、霉菌、支原體和寄生蟲。大量這種感染性因子在臨床上是及其重要的，其中這些因子不僅對受體患者是危險的，而且還危及內(nèi)科醫(yī)生，以及處理血液和血液產(chǎn)品的其他醫(yī)院工作人員。因此，在使用這種產(chǎn)品之前確定其中不含污染物是非常重要的。這對于將該產(chǎn)品直接施用給患者是極其重要的，例如在輸血、器官移植和其他形式的人類治療中。
B.抗體和起抗原作用的生物分子現(xiàn)有技術(shù)在抗體和作為抗原的生物分子的保存方面是不完善的。目前，抗體被廣泛用于診斷檢測。實(shí)際上，許多細(xì)菌學(xué)和病理學(xué)的診斷通過依賴于抗體與特定抗原反應(yīng)的檢測來實(shí)施。這種檢測包括簡單的用于測定血液類型的血細(xì)胞凝集試驗(yàn)到ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)檢測?？贵w在室溫存儲使得它們可以在野戰(zhàn)醫(yī)院迅速被使用，例如軍事作戰(zhàn)的醫(yī)院，可以在沒有建立實(shí)驗(yàn)室設(shè)施的地區(qū)實(shí)現(xiàn)精確、快速的診斷。目前，由于要求和需要冷藏，使得采用抗體制備物治療患者變得十分繁瑣。因此，抗體的制備、運(yùn)輸和存儲的費(fèi)用太高，而且常常超出成本限定(cost-prohibitive)。
C.用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用的組織和器官目前，冷凍保存是保存同種異體移植組織和用于移植的組織來源材料的主要手段。近來，已經(jīng)有大量的庫存骨骼和肌腱發(fā)生感染。通過輻射滅菌能夠防止細(xì)菌和病毒病原體的傳播。而且，輻射后在室溫存儲將極大地簡化同種異體移植組織及其衍生物，包括骨骼、膠原和非細(xì)胞真皮的制備、保存和使用。
先前，大多數(shù)方法涉及篩選或檢測由生物材料、生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子形成的產(chǎn)品中的特定污染物，而不是從產(chǎn)品中去除污染物。只是不使用被檢測為污染物陽性的產(chǎn)品。篩選方法的例子包括檢測來自血液供體的人血中的特定病毒。但是，這種方法并不總是可靠的。鑒于與假陰性結(jié)果相關(guān)的結(jié)論，降低了檢測的價值和準(zhǔn)確性。在某些情況下，假陰性結(jié)果會危及生命，例如，在獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的情況下，例如當(dāng)檢測人免疫缺陷病毒時(HIV)時。此外，在有些情況下，確定產(chǎn)品是否被污染即使不需要數(shù)月時間，也需要數(shù)周。
最近，人們致力于研究在使用生物材料、生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子之前去除或滅活其中的污染物的方法。這種方法包括熱處理、過濾、添加化學(xué)滅活劑和使用γ射線或其他射線處理。已經(jīng)充分證明，γ射線輻射對于破壞病毒和細(xì)菌是有效的。實(shí)際上，有位作者提出，γ射線輻射是用于降低和消除病毒含量的最有效方法。雖然已經(jīng)通過輻射滅菌生物材料，但是該材料在加工后通常被冷卻或冷凍存儲。通過基于滅菌的嚴(yán)格加熱來滅活病毒是不可取的，這種方法會破壞血液的功能成分、特別是紅細(xì)胞(erythrocyte)(紅細(xì)胞(red blood cell))和凝血細(xì)胞(血小板)和不穩(wěn)定的血漿蛋白。
鑒于上述內(nèi)容，需要提供一種滅菌含有生物材料、生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子的產(chǎn)品的方法，有效地去除生物污染物，并且同時不會對該產(chǎn)品產(chǎn)生副作用。不期望的生物污染物的例子包括病毒、細(xì)菌、酵母、霉菌、支原體和寄生蟲。因此，非常期望具有一種安全和經(jīng)濟(jì)的方法和設(shè)備，其能夠在將人的全血或血液產(chǎn)品輸入給受體之前去除其中的致病性病毒、微生物或寄生蟲，因此，防止受體被這些致病性因子感染。與此同時，適當(dāng)去除污染的血液將不會對必須處理這些體液的醫(yī)院工作人員造成日常的感染威脅。在存儲和處理供體血液和血液產(chǎn)品的血庫中，這種需求更加急切。同樣期望具有一種安全和經(jīng)濟(jì)的方法和設(shè)備，其能夠在將生物材料人或動物組織(如皮膚、骨骼、筋膜和肌腱)導(dǎo)入或移植到受體之前除去其中的致病性病毒、微生物或寄生蟲，從而防止受體感染這樣的疾病。因此，本發(fā)明滿足這些和其他的需要。
發(fā)明概述簡要而概括地說，本發(fā)明在于通過輻射來保存生物材料、功能性生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子。本發(fā)明還包括用于制備在環(huán)境溫度和室溫存儲，特別是不需要進(jìn)行輻射前的凍干(冷凍干燥)或輻射后冷凍或冷藏的產(chǎn)品的方法，該產(chǎn)品衍生自生物材料、生物化學(xué)實(shí)體、生物活性分子。更加特別地，本發(fā)明涉及滅活組合物中的潛在生物污染物(如病毒、細(xì)菌、酵母、霉菌、支原體和寄生蟲)，該組合物包括抗體、外周血液細(xì)胞(如，紅細(xì)胞和血小板)、從全血(如病毒感染的人的血液)中收集的血漿蛋白片段(如，白蛋白和凝血因子)、體液(包括但是不限于，尿液，腦脊液，羊水和滑液)、用于制備抗病毒疫苗的離體介質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)(例如，胎牛血清和牛血清)或者衍生自這種組合物的產(chǎn)品，和用于靜脈營養(yǎng)的糖、氨基酸、肽和脂肪的溶液。本發(fā)明還在于基于血液的蛋白質(zhì)和生物來源的蛋白質(zhì)，包括，但是不限于單克隆抗體、肉毒桿菌毒素和植物來源的蛋白質(zhì)、血紅蛋白(包含在和獨(dú)立于紅細(xì)胞)、抗體和疫苗。已有或潛在的污染不是評價本發(fā)明的先決條件。
迄今，輻射處理方法中的大部分工作集中在滅活污染物而提供結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能大部分未被改變的生物材料的方法上。本發(fā)明建立在已知的輻射處理方法上，表明輻射處理不僅在滅菌上是有效的，而且在保存生物材料、生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子的功能方面也是有效的，而不需要在輻射后顯著地控制滅菌產(chǎn)品的溫度。本發(fā)明獨(dú)特的保存和處理方法可使無菌產(chǎn)品在環(huán)境溫度保存，同時保持產(chǎn)品的生物活性的功效和作用機(jī)制。
從多個方面看，這是一個顯著進(jìn)步。最重要的是，可以在環(huán)境溫度保存被加工的材料，降低了如果沒有嚴(yán)格地遵循處理方法而破壞材料的功效的危險。在全世界的許多地方，冷藏甚至仍是一種奢侈。由于這些地方不能夠?qū)λ巹┖鸵呙绫３掷洳?，對它們采取常?guī)滅活，這極大地影響這些地方的公共健康。如果能夠在不發(fā)達(dá)地區(qū)提供能夠在環(huán)境溫度穩(wěn)定的疫苗或生物材料，這將會對這些地區(qū)的人類健康產(chǎn)生極大的影響。在環(huán)境溫度存儲還將給發(fā)達(dá)地區(qū)帶來極大影響，將會節(jié)約用于存儲的開支和運(yùn)輸費(fèi)用，在許多情況下將提供更加方便和容易使用的產(chǎn)品，并且使生產(chǎn)變得花費(fèi)更少。
應(yīng)用本發(fā)明的一種可能是制備用于醫(yī)學(xué)用途的血液和血液成分。本發(fā)明包括滅菌和存儲全血樣本或小部分生物來源的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)的方法，以便充分地減少或消除傳播傳染性疾病特別是病毒性疾病的危險，該結(jié)構(gòu)包括植物或動物來源的組成成分如細(xì)胞和組織。本發(fā)明還包括制備生物材料的方法，這種方法對于大部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)來說是低廉的和容易獲得的。這種方法可以保存生物材料，而不需要冷藏或會導(dǎo)致大量的額外費(fèi)用的其他處理。此外，本發(fā)明教導(dǎo)對生物蛋白質(zhì)進(jìn)行滅菌和穩(wěn)定，例如滅菌抗體和血液的其他化學(xué)成分，使得生物蛋白質(zhì)可以安全地存儲在室溫，并且在后來的使用中極大地降低細(xì)菌或特定的病毒污染的危險。
按照本發(fā)明的方法可以制備許多功能性生物材料。這種滅菌產(chǎn)品可以被用在用于預(yù)防或治療病癥或疾病的方法中，使得在將有效量的生物材料施用給患者之前，該生物材料可以存儲在環(huán)境溫度。類似地，由被輻射的生物材料、生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子形成的滅菌和穩(wěn)定的產(chǎn)品可以被納入到診斷檢測方法和試劑盒中，和作為成分用于工業(yè)和化學(xué)過程中。同樣地，也可以通過這種方法來滅菌和制備含有糖、氨基酸、肽和脂肪的營養(yǎng)液，以便存儲在室內(nèi)(環(huán)境)溫度。
本發(fā)明的方法包括輻射一種或多種生物材料、生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子的方法，來保存其功能，并且可以在或者接近環(huán)境溫度存儲得到的滅菌和穩(wěn)定的產(chǎn)品。適合用于本發(fā)明的功能性生物材料包括，但是不限于，血液或血液成分，例如紅細(xì)胞、白細(xì)胞，包括單核細(xì)胞、血小板、凝血因子、免疫球蛋白，包括單一的或多聚的免疫球蛋白。同樣適合的功能性生物材料包括，但是不限于，動物組織(包括哺乳動物和其他動物門的組織)，例如軟骨、骨髓(包括骨髓細(xì)胞懸浮液)，完整的或加工的韌帶、肌腱、神經(jīng)、骨骼(包括脫礦物質(zhì)的骨基質(zhì))、移植物、關(guān)節(jié)、股骨、股骨頭、牙齒、皮膚移植物、心臟瓣膜、角膜、動脈、靜脈、脂肪、糖、膠原(包括天然的、無纖維的(afibrillar)、聚合不全的(atelomeric)、可溶的和不可溶的、重組的和轉(zhuǎn)基因的、天然序列和修飾的序列)和器官(包括用于移植的器官，如心臟、肝臟、肺、腎臟、腸、胰腺、四肢和指趾)。
類似地，本發(fā)明可以被應(yīng)用于非細(xì)胞材料，例如蛋白質(zhì)(包括重組的和轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì))、蛋白質(zhì)材料、氨基酸、肽、糖、脂肪、酶(包括消化酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-葡糖苷酶和艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronodate-2-sulfatase))、抗原、骨髓、殼質(zhì)(chitin)及其衍生物(包括NO-羧基殼聚糖--NOCC)。本發(fā)明的方法和生成的產(chǎn)品的滅菌和穩(wěn)定包括通過經(jīng)受測定量到計(jì)算量的輻射來輻射生物材料、生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子，有效地降低病毒和細(xì)菌污染的危險，同時滅菌和穩(wěn)定生物材料。
在本發(fā)明中，輻射方法可以在各種溫度進(jìn)行，包括但是不限于，從室溫到非常低的溫度的范圍，包括液氮下的溫度。在極少情況下，在輻射的同時加熱目標(biāo)樣本是有利的。
結(jié)合附隨的附圖，從如下的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢將是顯而易見的。這些附圖作為實(shí)例闡明本發(fā)明的特征。
附圖簡介附

圖1描述所檢測的樣本的特征的表格。
附圖2描述有/無亞甲蘭時，Hct對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖3描述有/無亞甲蘭時，pO2對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖4描述有/無亞甲蘭時，O2SAT對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖5描述有/無亞甲蘭時，F(xiàn)O2Hb對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖6描述有/無亞甲蘭時，F(xiàn)MetHb對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖7描述有/無亞甲蘭時，F(xiàn)HHb對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖8描述有/無亞甲蘭時，Na對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖9描述有/無亞甲蘭時，WBC對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖10描述有/無亞甲蘭時，RBC對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖11描述有/無亞甲蘭時，HGB對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖12描述有/無亞甲蘭時，HCT對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖13描述有/無亞甲蘭時，MCV對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖14描述有/無亞甲蘭時，MCH對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖15描述有/無亞甲蘭時，PLT對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖16描述有/無亞甲蘭時，MCHC對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖17描述有/無亞甲蘭時，RDW對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖18描述有/無亞甲蘭時，MPV對應(yīng)于兆拉德(Mrad)的圖表。
附圖19是滴定板的照片，表示在按照本發(fā)明進(jìn)行輻射后4周仍保留生物學(xué)活性的抗體。
附圖20是滴定板的照片，表示在按照本發(fā)明進(jìn)行γ射線輻射并在室溫保存四周后的紅細(xì)胞的Wright染色。
附圖21是滴定板的一部分的照片，表示在按照本發(fā)明進(jìn)行輻射后4周仍保留生物學(xué)活性的抗體。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及用于滅菌和保存生物材料、生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子(生物制品)來減少其中的一種或多種潛在的生物污染物或病原體的水平的方法，例如病毒、細(xì)菌(包括細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，例如支原體、脲原體(ureaplasmas)、微型細(xì)菌(nanobacteria)、衣原體、立克次氏體)、酵母、霉菌、真菌、單細(xì)胞或多細(xì)胞寄生蟲，和/或朊病毒或者單獨(dú)地或聯(lián)合地引起可傳播的海綿狀腦病(TSE)的類似因子。存儲這種生物制品的現(xiàn)有方法通常包括在滅菌之前凍干生物制品和/或在滅菌后和在人體內(nèi)灌注或使用前冷藏該產(chǎn)品。先前公開的某些方法采用電離輻射，但是這種方法使用額外的添加劑和溶液與輻射結(jié)合。例如，有些試驗(yàn)?zāi)康脑谟谌コ准?xì)胞，一般采用不能有效地滅活細(xì)胞和血漿中的病毒的低劑量輻射。在現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)中沒有提及可以在輻射后將紅細(xì)胞存儲在室溫。本發(fā)明的方法不需要那些額外的溶液。大量試驗(yàn)表明，紅細(xì)胞不會被滅活已知致病性病毒所需的劑量所破壞。因此，本發(fā)明是一種在輸入前保存和滅菌血液的簡單方法和使該血液對受體來說更加安全的途經(jīng)。
本發(fā)明提供一種更加簡便的保存和存儲紅細(xì)胞同時提高該材料在輻射后的安全性的方法?，F(xiàn)有技術(shù)沒有提出可以在輻射后將紅細(xì)胞存儲在環(huán)境(如室內(nèi))溫度?，F(xiàn)有技術(shù)在輻射方法中還結(jié)合了其他的溶液。加入溶液可能是有益的，例如含有或不含鉀結(jié)合試劑的緩沖液，其彌補(bǔ)了鉀從紅細(xì)胞中滲出。血袋中的溶液可能還包括額外的葡萄糖，給紅細(xì)胞提供額外的能量來源。在它們基礎(chǔ)的存儲袋中，在合適的溶液環(huán)境中簡單輻射紅細(xì)胞適合于消除許多已知的病原體，使紅細(xì)胞可以在室溫存儲。
I污染物如在此所用，術(shù)語“生物學(xué)污染物或病原體”是用于指一種直接或間接地與生物材料接觸的污染物或病原體(單獨(dú)地或聯(lián)合)，可能對生物材料或其受體產(chǎn)生有害作用。這種生物污染物或病原體包括各種病毒、細(xì)菌(包括細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，例如支原體、脲原體、微型細(xì)菌、衣原體、立克次氏體)、酵母、霉菌、真菌、單細(xì)胞或多細(xì)胞寄生蟲，朊病毒，引起TSE的因子，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的存在于或感染生物材料、生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子的其他因子。生物污染物或病原體的其他例子包括，但是不限于如下病毒(例如人免疫缺陷病毒和其它逆轉(zhuǎn)錄病毒)、皰疹病毒、線狀病毒、環(huán)狀病毒(circoviruses)、副粘病毒、巨細(xì)胞病毒、肝炎病毒(包括甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒以及它們的變體)、痘病毒、披膜病毒(togaviruses)、EB病毒和微小病毒(parvoviruses)；細(xì)菌(包括支原體、脲原體、微型細(xì)菌、衣原體、立克次氏體)，例如埃希氏菌屬、桿菌屬、彎曲菌屬、鏈球菌屬、和葡萄球菌屬；寄生蟲，例如錐蟲屬和瘧疾寄生蟲，包括瘧原蟲屬各個種類；酵母；霉菌；和朊病毒，或者單獨(dú)或聯(lián)合地引起TSE，例如瘙癢癥(scripe)、苦魯病(kuru)、BSE(牛海綿狀腦病)、CJD(Creutzfeldt-Jakob病)、Gerstmann-Straeussler-Scheinkler綜合癥和致命的家族性失眠癥的類似因子。如在此所用，術(shù)語“活性生物污染物或病原體”用來指能夠單獨(dú)地或聯(lián)合其他因子在生物材料中和/或生物材料的受體中產(chǎn)生有害作用的生物污染物或病原體，其他因子如第二種生物污染物或病原體或天然蛋白質(zhì)(野生型或突變體)或抗體。
II生物制品A.生物材料如在此所用，術(shù)語“生物材料”用來指任何來自或得自活的生物體的物質(zhì)。生物材料的示例性例子包括，但是不限于，細(xì)胞、組織、血液、血液成分、蛋白質(zhì)(包括重組蛋白、轉(zhuǎn)基因蛋白和蛋白質(zhì)材料)、氨基酸、肽(包括所有的天然和合成的肽)、糖、脂肪、酶，包括消化酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-葡萄糖苷酶和艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)，免疫球蛋白(包括單一的免疫球蛋白(monoglobulin)和多聚免疫球蛋白(polyimmunoglobulin)、植物性藥材和食物。生物材料的優(yōu)選例子包括，但是不限于，韌帶、肌腱、神經(jīng)、骨骼(包括脫礦物質(zhì)的骨基質(zhì)、移植物、關(guān)節(jié)、股骨和股骨頭)、骨髓(包括完整的或加工過的骨髓細(xì)胞懸浮液)、牙齒、皮膚移植物、心臟瓣膜、軟骨、角膜、血管、器官(包括用于移植的器官，例如心臟、肝臟、肺、腎臟、腸、胰腺)、四肢、指趾、脂肪、糖、膠原(包括天然的、無纖維的、聚合不全的(atelomeric)、可溶的和不溶的，重組的和轉(zhuǎn)基因的，天然和修飾的序列)、酶、殼質(zhì)及其衍生物(包括NO-羧基殼聚糖″NOCC″)、干細(xì)胞、胰島細(xì)胞和其他用于移植的細(xì)胞(包括遺傳改變的細(xì)胞)、紅細(xì)胞、白細(xì)胞(包括單核細(xì)胞)和血小板。
1.血液迄今難以獲得的所需的是一種快速和安全的滅菌用于輸入的血液、血液成分和血液產(chǎn)品，同時保存輸入的組成成分和蛋白質(zhì)的重要功能的方法。輻射不僅提供一種用于制備安全性提高的輸入成分的方法，而且可以在室溫存儲以前被冷凍和冷藏的血液成分和全血。這種產(chǎn)品以及制備它們的方法可以通過在室溫進(jìn)行存儲，使血液和血液成分的供應(yīng)變得更加安全和更容易獲得，將是非常有益的。還可以預(yù)期，被輻射的血液和血液產(chǎn)品的保存限期將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過冷藏血液的期限。目前，大約20％的輸血單位在輸血前已經(jīng)過期。延長保存期限將可以利用目前被浪費(fèi)的那些過期的血液單位。因此，延長保存期限將會對增加血液供應(yīng)產(chǎn)生影響，以及引入這種新技術(shù)產(chǎn)生的其他有益影響。
本發(fā)明在于處理組織來去除生物污染物，以及更加特別地在于滅菌和存儲血液和血液成分。此外，本發(fā)明在于在輻射后將紅細(xì)胞存儲于室溫。本發(fā)明還允許在室溫運(yùn)送和存儲庫存血液。如在此所用，術(shù)語“血液成分”用來指從全血中分離的一種或多種成分，包括但是不限于，細(xì)胞血液成分(例如紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板)，血液蛋白(例如血液凝血因子、酶、白蛋白、血纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白原和免疫球蛋白)和液體血液成分(例如血漿、血漿蛋白部分″PPF″、冷凝蛋白、血漿部分、以及含有血漿的組合物)。如在此所用，術(shù)語“液體血液成分”用來指全血的一種或多種液體的非細(xì)胞成分，例如血漿(凝結(jié)前存在于人或動物的全血中的液體的非細(xì)胞部分)和血清(凝結(jié)后存在于人或動物的全血中的液體的非細(xì)胞部分)。
如在此所用，術(shù)語“細(xì)胞血液成分”用來指全血的一種或多種成分，包括細(xì)胞，例如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、干細(xì)胞和血小板。存活的紅細(xì)胞可以通過如下一個或多個特征來表征能夠合成ATP；細(xì)胞形態(tài)；P50值；氧基血紅素、高鐵血紅蛋白和半染色體數(shù)；MCV，MCH，和MCHC值；細(xì)胞酶活性；和體內(nèi)存活。因此，如果細(xì)胞被冷凍干燥然后再生和被滅活病毒，該細(xì)胞將會被破壞，使得細(xì)胞不能夠新陳代謝或合成ATP，或者危及細(xì)胞循環(huán)，進(jìn)而危及其在輸血治療中的效用。相反，被輻射的紅細(xì)胞在不需要核酸合成活性的情況下仍然可以從事生物化學(xué)功能。不同于大部分的其他哺乳動物細(xì)胞，紅細(xì)胞獨(dú)特地不具有細(xì)胞核，因此，紅細(xì)胞具有更多的抗性靶點(diǎn)，因?yàn)槟切┑鞍踪|(zhì)成分比該細(xì)胞的DNA小得多，從而更不可能被滅菌光束的輻射滅活，使得它們在輻射之后仍具有功能。
如在此所用，術(shù)語“血液蛋白”用來指一種或多種通常存在于全血中的蛋白質(zhì)。動物的血液蛋白的示例性例子包括，但是不限于，維生素K依賴的(例如因子VII和因子IX)和非維生素K依賴(例如因子VIII和血管性血友病因子(vonWillebrands factor)的凝血蛋白、白蛋白、脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、補(bǔ)體蛋白、球蛋白(例如免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和IgE)。優(yōu)選的一組血液蛋白包括因子I(纖維蛋白原)、因子II(凝血酶原)、因子III(組織因子)、因子V(促凝血球蛋白原)、因子VI(促凝血球蛋白)、因子VII(血清凝血酶原、血清前轉(zhuǎn)變素)、因子VIII(抗血友病因子A)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(St-P因子)、因子XI(血漿促凝血酶原激酶前體)、因子VII(哈格曼因子)、因子VIII(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原(protransglutamidase))、血管性血友病因子(vWF)、因子Ia、因子IIa、因子IIIa、因子Va、因子VIa、因子VIIa、因子VIIIa、因子IXa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa和因子XIIIa。其他優(yōu)選的血液蛋白群體包括存在于紅細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)(例如血紅蛋白)、各種生長因子和這些蛋白質(zhì)的衍生物。
血漿和血清(已經(jīng)形成凝塊后的液相)是血液的組成。存在大量蛋白質(zhì)和其他因子并且在廣泛的醫(yī)學(xué)應(yīng)用中是有價值的?？贵w存在于血漿和血清中。這些抗體可以被用于許多的應(yīng)用中來治療患者(當(dāng)為γ球蛋白、匯集的抗體的情況下)以及用于研究。本文詳細(xì)描述的保存紅細(xì)胞的方法還可以被應(yīng)用來制備抗體和其他蛋白質(zhì)，其中這種分離物被輻射來滅菌以便可以在室溫存儲。這可以廣泛在醫(yī)學(xué)條件下和實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用。這種技術(shù)可以被應(yīng)用于抗體，該抗體從人的血液或從其他動物血液或從來自制備抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物的組織培養(yǎng)液制備。這種技術(shù)還可以被用于制備在室溫存儲的滅菌病毒疫苗，從而極大地簡化疫苗的分發(fā)和施用。此外，紅細(xì)胞可以在室溫被處理和存儲，以用于紅細(xì)胞凝集血液分型檢測。
2.血液袋用于制備裝滅菌和穩(wěn)定的生物材料、生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子的袋子或其他容器的合適材料包括，但是不限于硅樹脂、塑料和箔。例如，可壓癟的、可透氧的硅樹脂袋子適合用于存儲被輻射的生物制品，例如滅菌的和穩(wěn)定的血液產(chǎn)品。使用這種袋子對于在輸血前將在輻射過程中形成的高鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化為氧基血紅素是重要的。富含氧氣的環(huán)境還有助于在低輻射總量下的輻射變得更有效。由多聚(乙烯乙酸乙烯酯)(E.V.A.)塑料制備的柔韌的、可壓癟的袋子可以從伊利諾斯州的Deerfield的Baxter Travenol Laboratories有限公司的Fenwal分公司購買到。
通常洗滌紅細(xì)胞來減少血液中的白細(xì)胞數(shù)量。白細(xì)胞會引起受體對該血液的免疫反應(yīng)。鑒于血液的細(xì)菌污染物的危險，這些洗滌操作將紅細(xì)胞的保存期限減少到24h。重新將存儲血液的袋子封口并進(jìn)行輻射將會極大地延長保存期限。目前，輻射后的保存期限的標(biāo)準(zhǔn)為從輻射時開始的28天或該單位的原始有效期，以先到期的為準(zhǔn)。這將極大地延長被洗滌的紅細(xì)胞的保存期限。
B.生物化學(xué)實(shí)體本發(fā)明在于通過輻射來保存功能性生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子，例如但是不限于，血紅蛋白(包含在或獨(dú)立于紅細(xì)胞)，抗體，肽(天然的和合成的)，疫苗和其他抗原。更加特別地，本發(fā)明涉及滅活包含從全血(如病毒感染的人的血液)、體液(包括但是不限于，尿液、脊髓、羊水和滑液)、用于制備抗病毒疫苗的離體介質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)(例如胎牛血清和牛血清)中收集的抗體、外周血液細(xì)胞(例如紅細(xì)胞和血小板)、血漿蛋白部分(例如白蛋白和凝血因子)的組合物或者衍生自這種組合物的產(chǎn)品中的潛在生物污染物(例如，病毒、細(xì)菌、酵母、霉菌、支原體和寄生蟲)。本發(fā)明還包括用于制備在室溫存儲的全血產(chǎn)品的方法。本發(fā)明還在于血液蛋白和生物來源的蛋白質(zhì)，包括但是不限于，肉毒桿菌毒素和植物來源的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，抗體、凝血因子、生長因子和其他生物來源的蛋白質(zhì)，包括完整的病毒或其部分，可以用上面描述的用于血液和血液成分的輻射技術(shù)來保存。高劑量的γ射線輻射將會滅活細(xì)菌和病毒，并且使被輻射的材料可以在室溫存儲。這極大地提高了具有重要意義的生物制備物的可用性，如當(dāng)前必須被冷藏的脊髓灰質(zhì)炎疫苗，需要冷藏對于極少擁有能存儲需要冷藏的疫苗的電冰箱的地區(qū)，如中非，來說是一種障礙。
C.生物活性分子如在此所用，術(shù)語“蛋白質(zhì)材料”用以指任何衍生自或來自活的生物體的材料，其包括至少一種蛋白質(zhì)或肽。蛋白質(zhì)材料可以是天然材料，處于其天然狀態(tài)或被加工/純化和/或衍生化，或者人工制備的材料，通過化學(xué)合成或重組/轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及，可選擇地，被加工/純化和/或衍生化來制備。示例性的蛋白質(zhì)材料的例子包括，但是不限于，從細(xì)胞培養(yǎng)物中制備的蛋白質(zhì)和肽、牛奶和其它乳制品；腹水；激素；生長因子；從動物組織或植物原料中提取或分離的材料(包括藥物例如胰島素)；血漿和血漿蛋白部分(包括鮮新的、冷凍的和凍干的)；纖維蛋白原及其衍生物(例如血纖蛋白、血纖蛋白I、血纖蛋白II、可溶性血纖蛋白、血纖蛋白單體和血纖蛋白密封劑產(chǎn)品)；全血；蛋白C；蛋白S；α-1抗胰蛋白酶(α-1蛋白酶抑制劑)；丁基-膽堿脂酶；抗凝血劑；鏈激酶；組織血漿酶原激活劑(tPA)；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；尿激酶；NEUPOGEN(filgrastim，一種粒細(xì)胞刺激因子)；抗凝血酶-3；α-半乳糖苷酶；艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；(胎)牛血清/馬血清；肉(meat)；免疫球蛋白(包括抗血清、單克隆抗體，多克隆抗體和遺傳工程的或制備的抗體)；白蛋白；α-球蛋白；β-球蛋白；γ-球蛋白；凝血蛋白；補(bǔ)體蛋白和干擾素。
III輻射如在此所用，術(shù)語“滅菌”用來指按照本發(fā)明降低存在于被處理的生物材料中的至少一種活性或潛在的活性生物污染物或病原體的水平。如在此所用，術(shù)語“輻射”用來指以足夠能量的輻射來殺死被輻射的生物材料中的至少某些成分。輻射的種類包括但是不限于，微粒的(亞原子顆粒流-例如中子、電子和質(zhì)子)；電磁的(在變化的電磁場產(chǎn)生-例如無線電波，可見光-單色的和多色的，不可見光，紅外線，紫外線，x-射線，γ射線及其它們的混合)；聲波和壓力波。這種輻射通常被描述為電離輻射(能夠在被輻射的材料中產(chǎn)生離子)-例如γ射線)，非離子輻射-如可見光。這種射線的來源是變化的，一般而言，特定輻射源的選擇不是嚴(yán)格的，只要在合適的時間內(nèi)產(chǎn)生足夠的輻射并且以適當(dāng)?shù)谋壤齺韺?shí)現(xiàn)滅菌。實(shí)際上，γ射線通常通過同位素鈷或銫來產(chǎn)生，而UV和X-射線分別通過能夠發(fā)出UV和X-射線的機(jī)器來產(chǎn)生。在稱作″電子束(e-beam)″輻射的方法中電子常常被用來滅菌材料，通過機(jī)器輻射該產(chǎn)品。單色和多色的可見光通過機(jī)器產(chǎn)生，實(shí)際上，包括了不可見光，例如紅外線和UV，它們由相同的或不同的機(jī)器產(chǎn)生。
本領(lǐng)域知曉，通過用射線以有效滅菌生物材料的比率，以足以有效滅菌生物材料并防止生物材料被損壞的時間來滅菌對輻射敏感的生物材料。參見美國專利公開2003/0012687A1(Macphee等)，系列號09/973,958，現(xiàn)為美國專利6,xxx,xxx，其內(nèi)容在此引入作為參考。然而，本發(fā)明建立在這些現(xiàn)有技術(shù)公開物上，并且描述首次知曉的滅菌和制備生物活性分子例如全血樣本的γ射線的用途，所述生物活性分子用作可以存儲在環(huán)境溫度的生物試劑。鑒于傳播感染性疾病如HIV、肝炎和其他病毒性疾病的危險，顯然需要采用一種安全、有效和低廉的方法。限制這種技術(shù)有用性的唯一明顯的因素是合適的生物活性分子(例如血液、血液成分、生物蛋白質(zhì)、疫苗、病毒和其他抗原)和鈷-60源或其他適合的射線源的可獲得性。本發(fā)明的方法的成本低廉，以及生物活性分子不含有病毒的特別是不含有HIV，將使之成為制備這種應(yīng)用于有各種需求的不同患者的生物活性分子的最具有吸引力的方法。由于按照本發(fā)明的該方法通?？梢栽诃h(huán)境溫度進(jìn)行，不需要在實(shí)施該方法之前冷卻、冷凍或化學(xué)處理含有生物活性分子的產(chǎn)品，從而避免了一些現(xiàn)有技術(shù)的方法中具有的額外處理步驟。
通過本發(fā)明的一種方法，延長呈遞γ射線的時間來充分地降低對含生物活性分子的產(chǎn)品的破壞。典型地，進(jìn)行不少于10h的輻射，優(yōu)選約20h-約40h，更加優(yōu)選為約20h-約30h。輻射速率在約0.5kGy/h-約3.0kGy/h的范圍內(nèi)，取決于被滅菌的產(chǎn)品以及輻射時間的長度。給予輻射的總量通常在約20kGy-約32kGy的范圍內(nèi)，這種水平被證明是有效降低污染物如病毒的輻射量。輻射量呈遞為4.0kGy/min達(dá)5min以及更長時間可以用于滅菌生物產(chǎn)品并保存功能，接著存儲在室溫。
通過γ射線輻射來保存生物活性分子(例如全血、血液成分、生物蛋白質(zhì)和病毒實(shí)體)具有許多優(yōu)點(diǎn)，使得可能在目前不能獲得這種生物活性分子的地區(qū)可能使用這些生物活性分子，例如小醫(yī)院、診所和全世界的發(fā)展中國家。被輻射的全血的制備是低廉的并且容易實(shí)施，僅需要基本材料和獲得鈷-60源。被輻射的全血可以在架子上室溫存儲，而不需要液氮或低溫冷凍設(shè)備中存儲。應(yīng)用被輻射的全血不需要進(jìn)行其他全血保存方法中的解凍、洗滌或再水合。
在本發(fā)明的一種方法中，含有生物活性分子的產(chǎn)品可以以含有優(yōu)選少于20％固體的形式被輻射。因此，某些產(chǎn)品可能在輻射前被稀釋。以稀釋的方式處理產(chǎn)品還可以減少產(chǎn)品在輻射過程中被降解。稀釋液的選擇取決于被輻射的產(chǎn)品的性質(zhì)。例如，當(dāng)輻射血細(xì)胞時，可以選擇生理上可接受的稀釋液，如檸檬酸磷酸葡萄糖。
本發(fā)明的方法可以用于處理對輻射敏感的有機(jī)產(chǎn)品。這種產(chǎn)品通過常規(guī)方法輻射時傾向于發(fā)生降解。但是，通過本發(fā)明的方法輻射敏感的產(chǎn)品將不會對該產(chǎn)品產(chǎn)生危害。該方法雖然不限于，但是通常被應(yīng)用于生物產(chǎn)品例如血液和血液成分。在活細(xì)胞(例如血液細(xì)胞)被輻射的情況下，可以加入清除劑來結(jié)合對細(xì)胞有毒的游離自由基和其他物質(zhì)。合適的清除劑包括，但是不限于，抗氧化劑、游離自由基清除劑和穩(wěn)定分子的配體。
本發(fā)明的其他方面可以通過輻射生物活性分子樣本足夠長的時間來提供滅菌劑量的輻射來實(shí)施。因此，這種劑量采用輻射量測定的常規(guī)和常用的參數(shù)來計(jì)算。足以實(shí)現(xiàn)滅菌的輻射劑量在本領(lǐng)域是已知的。洗滌對于實(shí)施本發(fā)明并不是必需的。
包括γ射線輻射劑量和呈遞該劑量來輻射紅細(xì)胞的方案的例子包括(i)被呈遞朝向容器的中心部分的輻射劑量應(yīng)當(dāng)為2500cGy，并且在任何其他位點(diǎn)的最小劑量應(yīng)當(dāng)為1500cGy；(ii)呈遞該劑量所需時間應(yīng)當(dāng)基于輻射源的輻射強(qiáng)度。輻射源的衰變應(yīng)當(dāng)按照生產(chǎn)商的介紹來計(jì)算。當(dāng)前，F(xiàn)DA建議每年校正銫-137源，而半年校正鈷-60。在標(biāo)準(zhǔn)的操作程序(SOP)中可以參考在用于輻射的操作者手冊中所包括的計(jì)算衰變的方法；(iii)SOP應(yīng)當(dāng)指明可以一次輻射的血液或血液成分單位的最大量。這是一個批量，應(yīng)當(dāng)按照裝置生產(chǎn)商的程序和基于公司確認(rèn)的數(shù)據(jù)來確定；和(iv)對于容器的任何部分的總輻射劑量不應(yīng)該超過5000cGy。
可選擇地，血液可以被暴露于30.0kGy的輻射劑量，以殺滅血液中的細(xì)菌、病毒和其他潛在的病原體，接著存儲在室溫。
IV實(shí)施例附圖1-21總結(jié)采用本發(fā)明的方法的實(shí)施方案對全血進(jìn)行實(shí)施的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。對于附圖1，得自血庫的血液用30kGy總劑量的γ射線輻射。在USP抗凝血劑檸檬酸磷酸葡萄糖腺嘌呤溶液(CPDA-1)血液包裝單位(BaxterHealthcare Corporation，Deerfield，IL)回收血液。存儲期滿后，在進(jìn)行輻射前在4℃保存一周。表中列舉了輻射前后的幾個血液特征。顯然在輻射后，pO2、HbO2和O2的飽和度顯著降低。表明血色素中鐵原子氧化狀態(tài)的MetHb(高鐵血紅蛋白)顯著地增加。該發(fā)現(xiàn)表明需要探索一種用于減少這些變化的方法，使得被輻射的血液在輸血后能夠更加容易地攜帶氧氣。
試驗(yàn)結(jié)果表明，按照本發(fā)明輻射全血的效果可見于附圖1。產(chǎn)生這些數(shù)據(jù)的用于試驗(yàn)的方案如下在5ml真空試管中，用DETA抗凝的鮮新采集的全血在室溫用γ射線以從0-50kGy的10kGy梯度的劑量輻射。半數(shù)試管作為配對試管的對照，其中加入0.01ml 1％的亞甲蘭溶液(10mg/ml)。在分析前，通過簡單地往含有亞甲蘭的試管通人氧氣來檢測是否高濃度地形成氧基血紅素。輻射后，在醫(yī)院的血液實(shí)驗(yàn)室中采用常規(guī)機(jī)器分析血液樣本。結(jié)果數(shù)值在附圖2-21中描述。
參照附圖2，該試驗(yàn)表明，在γ射線輻射全血后保持了血細(xì)胞比容，與本發(fā)明的教導(dǎo)一致。每個5ml的樣本試管加入0.01ml 1％(10mg/ml)的亞甲蘭溶液，與用于處理患者中的高鐵血紅蛋白血癥的1-2mg/kg的藥理學(xué)劑量相當(dāng)。如附圖3所示，部分氧氣的壓力曲線表明在含有亞甲蘭和暴露于氧氣條件下所進(jìn)行的輻射后，在樣本試管中有較高的PO2。參照附圖4，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在亞甲蘭處理的被輻射樣本中，血色素均具有一致的高(接近100％)氧飽和度。在無亞甲蘭的試管中，2和3兆拉德(Mrads)飽和度被認(rèn)為是由于血液在被制備來用于檢測時被激活而發(fā)生氧化。這表明暴露于氧氣的亞甲蘭處理的被輻射血液能夠結(jié)合氧氣。如附圖5所示，結(jié)合氧氣的血紅蛋白部分隨著輻射劑量升高而下降。
參照附圖6，該試驗(yàn)證明，提高輻射劑量與高鐵血紅蛋白含量的升高相關(guān)。相對于其他觀察值，包括上述附圖1中的那些數(shù)據(jù)，不含亞甲蘭的試管的MetHb含量出乎意料地低。類似地，如附圖7所示，在未添加亞甲蘭的試管中，溶血后的游離血紅蛋白部分更高。此外，血液樣本試管中的鈉濃度表現(xiàn)為一種相對的低鈉血癥。對照和含有亞甲蘭的樣本具有相似的數(shù)值(附圖8)。同樣地，如附圖9和10所示，白細(xì)胞數(shù)量和紅細(xì)胞數(shù)量不受輻射或亞甲蘭存在的顯著影響。
參照附圖11，該試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，以gm％表示的血紅蛋白的含量受輻射的影響。這被認(rèn)為反應(yīng)了從輻射誘導(dǎo)的變化產(chǎn)生的人為現(xiàn)象。其他附圖已經(jīng)表明了輻射后的巨紅細(xì)胞癥(macrocytosis)的血細(xì)胞比容升高，如在本文的某些樣本中所示(附圖12)。如附圖13所示，平均細(xì)胞體積(mean corpuscularvolume)似乎隨著輻射升高而變大，如其他附圖所顯示。附圖14和16表示在按照本發(fā)明進(jìn)行的試驗(yàn)中所測定的平均細(xì)胞血紅蛋白(mean corpuscularhemoglobin)和平均細(xì)胞血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobinconcentration)。該數(shù)據(jù)還表明紅細(xì)胞分布的寬度(附圖17)與某一點(diǎn)的例外不具有顯著的差別，該點(diǎn)表示某些種類的系統(tǒng)誤差。這些數(shù)據(jù)還證明血小板數(shù)量升高(附圖15)，可能是由于血液濃縮所致；然而，平均血小板體積在試驗(yàn)條件下沒有發(fā)生顯著變化(附圖18)。
采用適當(dāng)?shù)难簩W(xué)染色，在顯微鏡下檢查來自全血的輻射單位的樣本，在用30.0kGyγ射線輻射后，可以見到完整的紅細(xì)胞(附圖19)。生物化學(xué)分析表明，高鐵血紅蛋白血癥可以用醫(yī)學(xué)實(shí)踐中使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來逆轉(zhuǎn)。顯然，添加亞甲蘭和暴露于氧氣對于將存在于血紅蛋白的氧化態(tài)Fe+++轉(zhuǎn)化為通常存在于功能性血紅蛋白的Fe++是有益的。此外，硅樹脂血液袋可以在輸血前將氧氣擴(kuò)散到血液中并且添加到Fe++原子上，有助于這種轉(zhuǎn)化。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，來自HIV和肝炎陰性供體的全血可以在其即將過期的時候獲得。這種HIV感染的血液可以在冷卻到4℃保存，并用30kGyγ射線輻射，然后被運(yùn)輸和存儲在室溫更長時間。
在附圖20中，顯示抗A抗體能夠凝集A組紅細(xì)胞。對于該試驗(yàn)，抗A抗血清被分為兩個等分試樣。一份存儲在電冰箱中，另一份用30kGyγ射線輻射并在室溫存儲1個月。在本試驗(yàn)中，在含有A組細(xì)胞的圓底孔的生理鹽水中，用連續(xù)1∶2稀釋的抗體檢測兩種抗血清凝集A組細(xì)胞的能力。被冷藏的抗體的滴度為1∶80，存儲在室溫的被輻射抗體的滴度為1∶40。
雖然已經(jīng)闡明和描述本發(fā)明的特定形式，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明的精神和保護(hù)范圍時進(jìn)行的各種改進(jìn)是顯而易見的。更加特別地，顯然本發(fā)明并不限于保存特別敘述的生物材料、生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子，而且還應(yīng)用于保存任何合適的未特別指出的生物制品。同樣地，本發(fā)明不限于能夠?qū)崿F(xiàn)所公開的本發(fā)明的方法和產(chǎn)品的任何特定的醫(yī)學(xué)裝置結(jié)構(gòu)。因此，除非由附隨的權(quán)利要求限定，本發(fā)明是不被限定的。
權(quán)利要求
1.一種用于保存功能性生物材料的方法，包括提供功能性生物材料；輻射生物材料來保存其功能；和在第一種溫度存儲該生物材料。
2.權(quán)利要求1的方法，其中提供功能性生物材料包括提供選自紅細(xì)胞、白細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、凝血因子、免疫球蛋白、單一的球蛋白和多聚球蛋白的血液成分。
3.權(quán)利要求1的方法，其中提供功能性生物材料包括提供選自軟骨、骨髓、骨髓細(xì)胞懸浮液、韌帶、肌腱、神經(jīng)、骨骼、脫礦物質(zhì)的骨基質(zhì)、移植物、關(guān)節(jié)、股骨、股骨頭、牙齒、皮膚移植物、心臟瓣膜、角膜、動脈、靜脈、器官、糖類和膠原的動物組織。
4.權(quán)利要求1的方法，其中提供功能性生物材料包括提供選自蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)材料、酶、抗原、氨基酸、肽、糖、脂肪和骨髓的非細(xì)胞材料。
5.權(quán)利要求1的方法，其中輻射生物材料包括以足以滅菌該生物材料的量來輻射該生物材料。
6.權(quán)利要求1的方法，其中輻射生物材料包括以足以滅菌該生物材料的量來γ射線輻射該生物材料。
7.權(quán)利要求1的方法，其中輻射生物材料包括以足以滅活病毒的含量來輻射該生物材料。
8.權(quán)利要求1的方法，其中輻射生物材料包括以足以殺死細(xì)菌的含量來γ射線輻射該生物材料。
9.權(quán)利要求1的方法，其中輻射生物材料包括γ射線輻射該生物材料以達(dá)到總的30kGy暴露量。
10.權(quán)利要求1的方法，其中輻射生物材料包括以約0.5kGy/h到約4.0kGy/min的比率γ射線輻射該生物材料約5min到約40h。
11.權(quán)利要求1的方法，其中存儲生物材料包括使用前可以在室溫保存生物材料。
12.權(quán)利要求1的方法，其中存儲生物材料包括使用前可以在環(huán)境溫度保存生物材料。
13.權(quán)利要求1的方法，其中存儲生物材料包括維持生物材料在攝氏5℃到100℃之間的第一溫度。
14.權(quán)利要求1的方法，其中存儲生物材料包括維持生物材料在約10℃到約30℃之間的第一溫度。
15.權(quán)利要求1的方法，還包括在生物材料的輻射過程中控制生物材料的第二溫度。
16.權(quán)利要求1的方法，還包括在生物材料的輻射過程中維持生物材料的第二溫度在約10℃到約30℃之間。
17.一種用于保存功能性生物化學(xué)實(shí)體的方法，包括提供功能性生物化學(xué)實(shí)體；輻射生物化學(xué)實(shí)體來保存其功能；和在環(huán)境溫度存儲該生物化學(xué)實(shí)體。
18.權(quán)利要求17的方法，其中輻射生物化學(xué)實(shí)體包括以足以滅菌該生物化學(xué)實(shí)體的量來輻射該生物化學(xué)實(shí)體。
19.一種用于保存功能性生物活性分子的方法，包括提供功能性生物活性分子；輻射生物活性分子來保存其功能；和在室溫存儲該生物活性分子。
20.權(quán)利要求19的方法，其中輻射生物活性分子包括以足以滅菌該生物活性分子的量來輻射該生物活性分子。
21.按照權(quán)利要求1-16的任何一項(xiàng)的方法制備的功能性生物材料。
22.一種用于預(yù)防或治療一種病癥或疾病的方法，包括按照權(quán)利要求1-16的任何一項(xiàng)的方法提供生物材料；在環(huán)境溫度存儲該生物材料；和將有效量的生物材料施用給患者。
全文摘要
公開用于滅菌功能性生物材料、生物化學(xué)實(shí)體和生物活性分子以及在室溫保存它們的方法。生物污染物被顯著地降低滴度或被消除，但是本發(fā)明方法所滅菌和穩(wěn)定的產(chǎn)品仍然保存功能的完整性。這些材料主要是結(jié)構(gòu)功能性的，如骨骼，或者具有活性分子功能，當(dāng)為血紅蛋白和抗體的情況下。用于穩(wěn)定被滅菌的生物制品的處理方法包括改變材料的溫度、調(diào)控輻射劑量比例，優(yōu)化輻射時間，調(diào)控含氧量、使用穩(wěn)定劑、確定pH、包含特定溶劑和改變所使用的射線種類。如此處理的滅菌和穩(wěn)定的生物產(chǎn)品可以在室溫存儲，從而使之相對于凍干、常規(guī)冷凍和低溫保存的生物制品更加容易獲得和被使用。
文檔編號A61K35/16GK1665388SQ03815576
公開日2005年9月7日 申請日期2003年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月7日
發(fā)明者歐內(nèi)斯特·K·曼德斯, 克里斯琴·D·曼德斯 申請人:普羅米修斯生命科學(xué)公司