專利名稱：毒理學(xué)和劑量預(yù)測的動(dòng)物模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，其涉及來自一個(gè)物種的并允許通過在另一個(gè)物種宿主進(jìn)行體內(nèi)發(fā)育的胚胎組織的用途，以得到可用于評(píng)價(jià)某種試劑活性和毒性的具有成熟表型的組織。
背景技術(shù)：
動(dòng)物模型的使用對(duì)于新藥物的功效和安全性的正確評(píng)價(jià)是關(guān)鍵的。當(dāng)提交調(diào)查新藥申請(qǐng)(IND)時(shí)需要在兩種物種，通常是嚙齒類(兔、大鼠、小鼠、倉鼠、豚鼠等)和經(jīng)常地在靈長類上進(jìn)行試驗(yàn)。嚙齒類較便宜但是存在進(jìn)化上離人太遠(yuǎn)的問題而因此不足以反映人的生理學(xué)。對(duì)于功效和安全性研究確實(shí)存在這種問題。盡管對(duì)于所有小分子藥物這已經(jīng)是一個(gè)持久的問題，但是由于越來越多抗體進(jìn)入開發(fā)，該問題變得越發(fā)嚴(yán)重。
抗體識(shí)別氨基酸的離散序列并可以不僅對(duì)特定蛋白特異，而且對(duì)特定種類特異。例如，大鼠表皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)的抗體可識(shí)別大鼠EpCAM，但不識(shí)別小鼠或人EpCAM(Stephan等，Endocrinology 1405841-5854，1999)，對(duì)于抗人EpCAM抗體反之亦然。甚至大鼠、小鼠和人EpCAM的蛋白質(zhì)序列＞98％保守時(shí)也是這樣的。預(yù)計(jì)用于治療用途的大多數(shù)抗體都有一定程度的物種特異性。大多數(shù)將不與嚙齒類蛋白反應(yīng)，一些可能對(duì)該蛋白的人形式完全特異，并且不與相同蛋白的非人靈長類形式交叉反應(yīng)。
通常通過將人腫瘤來源的細(xì)胞系皮下注射到免疫缺陷大鼠或小鼠(nu/nu或SCID)以測試為癌癥治療開發(fā)的抗體的功效。因?yàn)閯?dòng)物的免疫系統(tǒng)不攻擊人細(xì)胞，人細(xì)胞可以長成人腫瘤。單克隆抗體對(duì)這些腫瘤的作用可以通過將人蛋白特異的單克隆抗體施用于小鼠，并且測量腫瘤的生長、縮小或死亡來研究。更少有地，腫瘤細(xì)胞可被植入腎被囊—一個(gè)血管較多的區(qū)域下，并允許在該位置生長。這些被稱為“異種移植模型”。
然而，這些異種移植模型不能良好地適應(yīng)進(jìn)行藥物安全評(píng)價(jià)，因?yàn)槭┯玫膯慰寺】贵w將不結(jié)合小鼠或大鼠蛋白并因此不能通過抗體-靶標(biāo)介導(dǎo)的機(jī)制損害嚙齒類宿主。通常，如果單克隆抗體與靈長類細(xì)胞交叉反應(yīng)，安全性研究必須在靈長類中進(jìn)行，或者等待來自I期人臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。如果有在比臨床試驗(yàn)更早的階段對(duì)這些抗體對(duì)正常的出生后或成人組織的毒性評(píng)價(jià)方法，那么其明顯將有極大的用途。
評(píng)價(jià)這種安全性的一種公知的途徑是使用免疫組織化學(xué)確定被抗體結(jié)合的各種人細(xì)胞或組織類型。然而，從抗體臨床試驗(yàn)熟知僅僅抗體結(jié)合不能預(yù)測安全性。一些單克隆抗體結(jié)合癌性組織但是不逆向影響它們的功能，即，不破壞癌性細(xì)胞或者不減少癌性細(xì)胞的增殖。見，例如，Lewis等Cancer Immunol Immunother 37255-263(1993)；Herlyn等J ImmunolMethods 73157-167(1984)；Fendly等Cancer Research 501550-1558(1990)；和Balzer等J Mol Med 77699-712(1999)。
此外，極難從正常的健康成人得到各種組織類型的組織，因此，難以確定抗體結(jié)合正常組織的效果或者評(píng)價(jià)抗體對(duì)正常組織的毒性。大多數(shù)使用人組織的研究使用尸體解剖時(shí)移出的組織。這些組織在質(zhì)量和疾病狀態(tài)上是多變的并且經(jīng)常已經(jīng)經(jīng)歷了主要變化。備選地，可以得到手術(shù)中移出的組織。因?yàn)槠浜突疾〗M織如癌相鄰，并且立即冷凍或者保存。這種手術(shù)移出的組織比尸體解剖組織更與活組織相關(guān)，但是因?yàn)槠浣咏疾〗M織和/或患者已經(jīng)經(jīng)歷的治療，該組織也可能與正常組織明顯不同。
允許同時(shí)直接比較試劑如單克隆抗體或其他蛋白質(zhì)或小分子藥物對(duì)人患病組織(例如腫瘤)和正常組織的作用的動(dòng)物模型在評(píng)估該試劑的毒性和功效中極其有價(jià)值。允許治療劑對(duì)不同于模型動(dòng)物的物種的劑量范圍評(píng)估的動(dòng)物模型對(duì)于設(shè)計(jì)用于支持IND提交的毒理學(xué)和其他研究目的也是非常有價(jià)值的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了具有成熟表型的正常組織和患病組織的非人動(dòng)物模型。該模型本身可用于確定多種試劑對(duì)正常和患病組織的作用(例如毒性)。
因此，一方面，本發(fā)明提供了通過(a)將從第一種動(dòng)物的未成熟細(xì)胞或祖細(xì)胞產(chǎn)生的未成熟目標(biāo)正常組織或正常組織重組體植入第二種非人脊椎動(dòng)物受體足以支持所述組織的生長和成熟的位置處；(b)允許第一種動(dòng)物的目標(biāo)正常組織發(fā)育成具有成熟表型的組織；(c)將第一種動(dòng)物的目標(biāo)患病組織或患病細(xì)胞植入非人脊椎動(dòng)物受體足以支持該患病組織生長的位置處；和(d)允許來自第一種動(dòng)物的目標(biāo)患病組織或患病細(xì)胞生長，從而產(chǎn)生具有來自第一種脊椎動(dòng)物的具有成熟表型的目標(biāo)正常組織和目標(biāo)患病組織的非人脊椎動(dòng)物模型的方法。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，來自第一種動(dòng)物的目標(biāo)正常組織和目標(biāo)患病組織都被植入到單個(gè)非人脊椎動(dòng)物的不同位置。在其他實(shí)施方案中，正常的和患病的目標(biāo)組織被植入到相同種或不同種的不同動(dòng)物中，這取決于想要的比較數(shù)據(jù)。優(yōu)選地，在該情況中，植入是平行地進(jìn)行，或者越接近同時(shí)越可行，更優(yōu)選地，在同一天進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，被植入的目標(biāo)正常組織和被植入的目標(biāo)患病組織為人來源的。
適于將它們的組織植入另一種動(dòng)物的脊椎動(dòng)物有許多并且以舉例的方式包括不用于限制哺乳動(dòng)物和其他脊椎動(dòng)物，尤其優(yōu)選的物種為小鼠、大鼠、鳥、兔、貓、狗、豬、綿羊、山羊、鹿、馬、牛、人和非人靈長類如狒狒、黑猩猩和猴。
選擇容納或接受用于植入的目標(biāo)組織的動(dòng)物優(yōu)選為免疫缺陷的非人脊椎動(dòng)物。適于發(fā)揮該功能的動(dòng)物有許多，并且以舉例且非限制的方式包括，哺乳動(dòng)物和非哺乳類脊椎動(dòng)物。尤其優(yōu)選的實(shí)施方案選自小鼠、大鼠、兔、蛙、鳥、貓、狗、豬、綿羊、山羊和非人靈長類。在一些實(shí)施方案中，非人靈長類為狒狒、黑猩猩或猴。根據(jù)本發(fā)明尤其優(yōu)選以接受和容納植入的非人脊椎動(dòng)物為免疫缺陷的嚙齒類(小鼠和大鼠)。
另一方面，本發(fā)明提供了存在于免疫缺陷的第二種非人受體或宿主動(dòng)物中的來自第一種脊椎動(dòng)物物種的目標(biāo)正常組織和/或患病組織的組織模型，其中目標(biāo)正常和/或患病第一物種組織為選自以下生物系統(tǒng)的組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦-大腦(含有神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)等的灰質(zhì)和白質(zhì))和腦-小腦、眼、腦干(腦橋、延髓、中腦)、脊髓；內(nèi)分泌系統(tǒng)腎上腺(皮質(zhì)和髓質(zhì))、卵巢、胰臟(胰島和外分泌胰腺)、甲狀旁腺、垂體(腺垂體和神經(jīng)垂體)、睪丸、甲狀腺(濾泡上皮、甲狀腺濾泡旁細(xì)胞、膠體，等)；乳腺乳腺(小葉、導(dǎo)管、肌上皮細(xì)胞，等)；造血系統(tǒng)脾臟、扁桃體、胸腺、骨髓(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞前體、巨核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞)、外周血細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、血紅細(xì)胞、血小板)；呼吸系統(tǒng)肺(支氣管、細(xì)支氣管、肺泡，等)；心血管系統(tǒng)心臟、血管(動(dòng)脈、靜脈等)；胃腸系統(tǒng)食道、胃(胃底)、小腸(回腸、空腸或十二指腸)、結(jié)腸、肝臟(肝三聯(lián)(portal triads)、肝細(xì)胞等)，唾液腺；泌尿生殖系統(tǒng)腎臟、泌尿器、膀胱、輸尿管、尿道、輸卵管、陰道、胎盤、前列腺、子宮、子宮頸；肌與骨骼系統(tǒng)骨骼??；皮膚皮膚(表皮、附器、真皮)；末梢神經(jīng)系統(tǒng)末梢神經(jīng)；間皮細(xì)胞來自胸壁、腹壁、心包或來自胃腸、心臟和/或肺樣品表面的襯細(xì)胞等。
在一些尤其優(yōu)選的方面，本發(fā)明為具有成熟表型的目標(biāo)正常人組織和患病的人組織的免疫缺陷小鼠或大鼠模型，其中正常人組織選自肺、前列腺、腎臟、胰臟、膀胱、皮膚、肝臟、心、結(jié)腸、十二指腸、胃、甲狀腺、唾液腺和胸腺。
另一方面，本發(fā)明提供了評(píng)估針對(duì)目標(biāo)患病組織的治療效果的方法，通過將所述治療應(yīng)用于具有至少一種有成熟表型的目標(biāo)正常組織和目標(biāo)患病組織的免疫缺陷非人脊椎動(dòng)物受體動(dòng)物，其中這些目標(biāo)組織來自與受體動(dòng)物不同的脊椎動(dòng)物物種。
在一些方面，本發(fā)明的動(dòng)物模型尤其用于評(píng)估將要應(yīng)用于患病組織如癌的候選治療，待應(yīng)用的候選治療為放射-、化學(xué)-、或放射藥學(xué)治療或放射-免疫治療。本發(fā)明的動(dòng)物模型也用于瘤或腫瘤的放射影象和轉(zhuǎn)移的研究。
在另一方面，本發(fā)明提供了通過將一種試劑施用于受體動(dòng)物，該受體動(dòng)物具有具成熟表型的來自供體動(dòng)物的目標(biāo)正常組織和目標(biāo)癌性組織的至少一種，并評(píng)定該試劑對(duì)正常和癌性目標(biāo)組織的毒性、有害或不利作用以確定對(duì)目標(biāo)組織有毒性的劑量的方法。
在另一方面，本發(fā)明提供了鑒定對(duì)目標(biāo)受感染的、患病或癌性細(xì)胞的毒性的程度大于正常細(xì)胞的試劑的方法，所述方法為通過將試劑施用于來自供體動(dòng)物的具有具成熟表型的目標(biāo)正常組織和受感染的、患病的或癌性目標(biāo)組織的免疫缺陷受體動(dòng)物，并鑒定減少受感染的、患病的或癌性目標(biāo)組織的生長或破壞這些組織的程度大于正常組織的試劑。
在另一方面，本發(fā)明提供了確定對(duì)患病細(xì)胞或癌性細(xì)胞的毒性程度大于正常細(xì)胞的試劑有效量的方法，所述方法為通過將試劑施用于具有成熟表型的來自供體動(dòng)物的目標(biāo)正常組織和癌性人組織的免疫缺陷受體動(dòng)物并確定對(duì)正常的和患病的或癌性目標(biāo)組織有效的試劑量。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了基于完整動(dòng)物的篩選測定法。在這些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括使用已經(jīng)接受本發(fā)明的目標(biāo)組織植入物或者其部分的非人宿主動(dòng)物，用于試驗(yàn)施用于所述動(dòng)物的治療的毒性、細(xì)胞抑制、抗微生物、消炎或其他治療性質(zhì)，或者測試此類治療在控制或抑制癌癥的發(fā)展、感染和/或疾病的活性。從而，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了篩選和鑒定或檢驗(yàn)治療、藥物或其他物質(zhì)對(duì)抗癌癥、感染和/或疾病的發(fā)展或在癌癥、感染和/或疾病的治療中的活性的方法，該方法包括對(duì)已經(jīng)接受根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)的目標(biāo)組織植入物的非人宿主動(dòng)物施用所述治療、藥物或其他相關(guān)物質(zhì)并檢測或記錄與不接受該治療、藥物或物質(zhì)的相應(yīng)動(dòng)物相比，在癌癥、感染和/或疾病的發(fā)展方面發(fā)生率的減少和死亡率的減少，或者檢測或記錄維持、恢復(fù)或提高機(jī)體功能的有效性。
附圖簡述

圖1顯示了當(dāng)來自正常胚胎器官的組織被置于免疫受損的裸小鼠(nu/nu)(第1、6、7、8圖片)或SCID小鼠(第2、3、4、5圖片)的腎被囊(第1、2、3、6、7和8圖片)或脂肪墊(第4和5圖片)并被允許發(fā)育成更成熟的表型時(shí)的結(jié)果。
圖2顯示了用于安全性/功效模型的成熟組織的結(jié)果。動(dòng)物的腎臟在圖中顯示。圖2的左邊顯示了LnCAP腫瘤，而右邊顯示正常組織。上面的圖片來自受處理的動(dòng)物而下面的圖片來自對(duì)照動(dòng)物。
圖3顯示了來自圖2中描述的實(shí)驗(yàn)的人前列腺和人結(jié)腸成熟組織的免疫組織化學(xué)。組織也用直接標(biāo)記的mPA6(抗人EpCAM)抗體染色。抗人EpCAM抗體mPA6不結(jié)合小鼠EpCAM。
圖4A和4B顯示了使用mPA7抗體的安全性/功效研究結(jié)果。該抗體結(jié)合人PA7抗體(CD46)，其存在于正常前列腺和胰臟上皮細(xì)胞和胰腺癌中。該抗體不識(shí)別小鼠相應(yīng)的抗原。
圖5顯示了兩種不同人組織重組體。膀胱上皮祖細(xì)胞系(hBLA)通過與胚胎膀胱間充質(zhì)細(xì)胞組合可被誘導(dǎo)形成成熟膀胱上皮(上面)。然而，相同細(xì)胞當(dāng)與精囊間充質(zhì)細(xì)胞組合時(shí)將形成成熟的前列腺上皮(下面)。箭頭指示陽性染色細(xì)胞。
圖6顯示了已經(jīng)在SCID小鼠中生長6個(gè)月的來自人正常胚胎器官的發(fā)育良好的人結(jié)腸、胰臟、心和前列腺組織。
圖7顯示了人和大鼠睪丸和肝臟嵌合組織，其中上皮部分來自胚胎祖細(xì)胞系，基質(zhì)部分來自胚胎大鼠間充質(zhì)細(xì)胞。這些組織被重組并允許發(fā)育4到10個(gè)月以得到成熟表型。
發(fā)明詳述我們描述了非人動(dòng)物模型，其中來自人或其他動(dòng)物物種，通常使用正常細(xì)胞系和解剖的大鼠或小鼠間充質(zhì)細(xì)胞得到的目標(biāo)正常胚胎組織或組織重組體被允許體內(nèi)經(jīng)歷發(fā)育成熟。所得模型可用于評(píng)定一種試劑對(duì)于正常和/或患病(例如，癌性)目標(biāo)組織的作用。該模型尤其有利地作為人模型，因?yàn)榇砀鞣N器官的正常成熟人組織是實(shí)驗(yàn)不容易得到的。從人祖細(xì)胞得到的人胚胎細(xì)胞和組織重組體的使用提供了對(duì)多種成熟人組織(否則不容易得到)的獲得。例如，人前列腺祖細(xì)胞可產(chǎn)生人導(dǎo)管、腺泡和胰島細(xì)胞。使用該非人動(dòng)物模型(即異種移植模型)，可以容易地在所有三種類型的成熟人胰臟細(xì)胞上評(píng)定治療性治療方案或試劑的效果。
類似地，我們描述了非人動(dòng)物模型，其中被允許經(jīng)歷體內(nèi)發(fā)育成熟的胚胎組織或組織重組體來自其他的非人脊椎動(dòng)物。
I.一般技術(shù)除非特別指出，本發(fā)明的實(shí)踐將使用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)是本領(lǐng)域中的技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中被詳盡解釋，如，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版(Sambrook等，1989)冷泉港出版社；寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)(M.J.Gait編輯，1984)；分子生物學(xué)方法(Methods inMolecular Biology)，Humana Press；細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Cell BiologyA Laboratory Notebook)(J.E.Cellis編輯，1998)Academic Press；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney編輯，1987)；細(xì)胞和組織培養(yǎng)入門(Introduction to Cell and Tissue Culture)(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；細(xì)胞和組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法(Cell and TissueCultureLaboratory Procedures)(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell編輯，1993-8)；J.Wiley和Sons；酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)(Academic Press，Inc.)；實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(Handbook of ExperimentalImmunology)(D.M.Weir和C.C.Blackwell編輯)；用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(J.M.Miller和M.P.Calos編輯，1987)；分子生物學(xué)最新技術(shù)(Current Protocols inMolecular Biology)(F.M.Ausubel等編輯，1987)；PCR聚合酶鏈反應(yīng)(PCRThe Polymerase Chain Reaction)(Mullis等編輯，1994)；免疫學(xué)最新方法(Current Protocols in Immunology)(J.E.Coligan等編輯，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons，1999)；免疫學(xué)(Immunobiology)(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；抗體(Antibodies)(P.Finch，1997)；抗體實(shí)踐方法(Antibodiesa practical approach)(D.Catty編輯，IRL Press，1988-1989)；單克隆抗體實(shí)踐方法(Monoclonalantibodiesa practical approach)(P.Shepherd和C.Dean編輯，OxfordUniversity Press，2000)；抗體使用實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Using antibodiesalaboratory manual)(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring HarborLaboratory Press，1999)；抗體(The Antibodies)(M.Zanetti和J.D.Capra等，Harwood Academic Publishers，1995)；和CancerPrinciples andPractice of Oncology(V.T.DeVita等編輯，J.B.Lippincott Company，1993)。
II.定義除非特別定義，此處所用的所有術(shù)語、符號(hào)和其他科學(xué)術(shù)語旨在具有本領(lǐng)域所屬于的領(lǐng)域中技術(shù)人員通常理解的意思。在一些情況中，具有通常理解的意思的術(shù)語在此處被定義用以澄清和/或易于參考，并且此處這些定義的包括不必被理解為代表與本領(lǐng)域中一般理解本質(zhì)上的不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)方法，如，例如，廣泛使用的在Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.中描述的克隆方法一般可較好地理解和使用此處描述或參考的技術(shù)和方法。如適當(dāng)，除非特別指出，通常按照生產(chǎn)商定義的方案和/或參數(shù)進(jìn)行涉及商業(yè)途徑可得到的試劑盒和試劑的使用的步驟。
“抗體”是能夠通過位于免疫球蛋白的可變區(qū)中的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)特異結(jié)合靶標(biāo)如糖、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等的免疫球蛋白分子。如此處所用的，該術(shù)語不僅包括任何同種型(IgA、IgG、IgE、IgD，或IgM)的完整的多克隆或單克隆抗體，而且包括其片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、含有抗體部分的融合蛋白、嵌合抗體(例如人源化抗體)，和含有所需特異性的抗原識(shí)別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其他經(jīng)修飾的構(gòu)型。
“單克隆抗體”指均一抗體群體，其中單克隆抗體由參與抗原的選擇性結(jié)合的氨基酸(天然存在的或非天然存在的)組成。單克隆抗體是高度特異的，抗單個(gè)抗原性位點(diǎn)。術(shù)語“單克隆抗體”不僅包括任何同種型(IgA、IgG、IgE、IgD，或IgM)的完整單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且包括其片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、含有抗體部分的融合蛋白、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆拉抗體和含有所需特異性的抗原識(shí)別位點(diǎn)且能夠結(jié)合抗原的免疫球蛋白分子的任何其他經(jīng)修飾構(gòu)型。這些片段和變體是本領(lǐng)域中熟知的，并且經(jīng)常被體外和體內(nèi)使用。該發(fā)明不用于限制抗體的來源或者其被產(chǎn)生的方式(例如通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，等等)。使用重組DNA方法或者通過合成方法如固相合成制備片段或類似物。
“小分子”指任一不從氨基酸制得并且分子量具有小于約5000道爾頓，優(yōu)選小于約2500道爾頓的物質(zhì)的組合物。
抗體或其他診斷或治療性治療、物質(zhì)或試劑的“有效量”或“足夠量”為該量足以實(shí)現(xiàn)有益的或想要的結(jié)果，包括得到診斷或預(yù)后信息，臨床結(jié)果如腫瘤(在癌癥中，例如，乳腺癌或前列腺癌)大小的縮小、阻止患病或癌性細(xì)胞的生長、減輕疾病的癥狀、提高患該疾病患者的生活質(zhì)量、減少需要治療該疾病的其他藥物的劑量、延緩疾病的惡化，和/或延長個(gè)體的存活。有效量可以在一次或多次施用中施用。為了本發(fā)明的目的，藥物、化合物或藥物組合物的有效量為足以直接或間接減少癌性或患病或受感染細(xì)胞的增殖(或破壞這些細(xì)胞)和/或延遲癌性細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)展或生長的量。
“試劑”為個(gè)體可被暴露于的任何成分，并且可包括但不限于抗體、小分子、蛋白質(zhì)、藥學(xué)化合物(例如，藥物)、家用化學(xué)品、工業(yè)化學(xué)品、環(huán)境化學(xué)品和其他化學(xué)品。可在本發(fā)明的動(dòng)物模型中試驗(yàn)的試劑包括但不限于免疫化療劑、細(xì)胞因子、化療劑和放射性藥物，還可包括內(nèi)部和外部放射活性劑以及放射標(biāo)記的肽。使用這些模型也可評(píng)價(jià)通過本領(lǐng)域熟知方法完成的基因療法。
許多化療劑是公知的。在本發(fā)明的實(shí)踐中使用中適宜的試劑可選自，但不限于，下面的別嘌醇鈉、多拉斯瓊甲磺酰鹽、帕米膦酸鈉、依替磷酸鈉、氟康唑、紅細(xì)胞生成素、鹽酸左咪唑、氨磷丁、鹽酸格雷西隆、亞葉酸鈣、沙格司亭、屈大麻酚、巰乙磺酸鈉、非格司亭(filgrastim)、鹽酸匹魯卡品、醋酸善得定、右丙亞胺、鹽酸奧丹西隆、奧丹西隆、白消安、碳鉑、順氯氨鉑、噻替派、鹽酸美法侖、美法侖、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、鹽酸氮芥、卡氯芥、環(huán)己亞硝脲、聚苯丙生20與卡莫司汀植入物、鏈脲霉素、鹽酸阿霉素、硫酸博來霉素、鹽酸柔紅霉素、更生霉素、檸檬酸柔紅霉素、鹽酸去甲柔毛霉素、plimycin、絲裂霉素、噴托他汀、米托蒽醌、戊柔比星、阿糖胞苷、氟達(dá)拉濱磷酸鹽、氟尿苷、克拉利平、氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、硫鳥苷、卡培他濱、甲基睪甾酮、尼魯米特、睪內(nèi)脂、比卡魯胺、氟利坦、阿那曲唑、檸檬酸托瑞米芬、他莫昔芬、雌氮芥磷酸鈉、乙炔雌二醇、雌二醇、酯化型雌激素、倍美力(結(jié)合型雌激素)、醋酸亮丙瑞林、醋酸性瑞林、醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、鹽酸左咪唑、阿地白介素、鹽酸伊立替康、達(dá)卡巴嗪、天冬酰胺酶、磷酸依托泊苷、鹽酸吉西他濱、司徒曼布、六甲密胺、鹽酸拓?fù)涮婵?、羥基脲、α干擾素-2b、米托坦、鹽酸甲基芐肼、去甲長春花堿、大腸桿菌L-天冬酰胺酶、歐文氏菌L-天冬酰胺酶、硫酸長春新堿、地尼白介素2(denileukin diftitox)、阿地白介素、利妥希瑪、α干擾素-2a、紫杉醇、多西紫杉、活卡介苗(膀胱內(nèi))、硫酸長春堿、依托泊苷、維甲酸、替尼泊苷、光敏鈉、氟尿嘧啶、倍他米松磷酸鈉和醋酸倍他米松、來曲唑、依托泊苷亞葉酸鈣、亞葉酸、亞葉酸鈣、5-氟尿嘧啶、阿霉素、環(huán)磷酰胺和順氯氨鉑。
另一方面，本發(fā)明提供了評(píng)價(jià)腫瘤或瘤的放射成象的方法，或者放射標(biāo)記的抗體治療的方法，其包括將放射標(biāo)記的腫瘤特異性抗體施用于本發(fā)明的動(dòng)物模型的步驟。放射標(biāo)記的抗體可以是單克隆或多克隆抗體，其含有放射標(biāo)記，優(yōu)選選自锝-99m、銦-111、磺-131、錸-186、錸-188、釤-153、镥-177、銅-64、鈧-47、釔-90的放射性標(biāo)記。特別優(yōu)選不危害抗體的免疫活性并且不在體內(nèi)分解的用治療性放射性核素如碘-131、錸-188、鈥-166、釤-153和鈧-47標(biāo)記的單克隆抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解其他放射性同位素是公知的，并且可適于特定應(yīng)用?？墒褂脝喂庾影l(fā)射計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(SPECT)、位置發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)、計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(CT)或磁共振成象(MRI)進(jìn)行放射成象。也考慮允許通過放射免疫成象定位癌轉(zhuǎn)移位置進(jìn)行更好解剖學(xué)定義的有關(guān)成象。
“個(gè)體”為脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。哺乳動(dòng)物包括，但不限于，農(nóng)場動(dòng)物、競技動(dòng)物、寵物、靈長類、小鼠和大鼠。
如此處所用的，“免疫缺陷的”指天生的、獲得性的或誘導(dǎo)的不能發(fā)生正常的免疫應(yīng)答。如在下面更詳細(xì)的描述的，使個(gè)體的免疫應(yīng)答水平降低到低于正常水平的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且它們?cè)诒景l(fā)明上下文中的使用是技術(shù)人員的普通技術(shù)。
如此處所用的，“治療”是得到有益的或想要的臨床結(jié)果的方法。為了本發(fā)明的目的，有益的或想要的臨床結(jié)果包括，但不限于，可檢測的或不可檢測的癥狀的減輕、疾病程度的減輕、疾病狀態(tài)的穩(wěn)定(即，不變壞)、疾病惡化的延遲或減慢、疾病狀態(tài)的改善或減輕，和緩解(部分或全部的)?！爸委煛币部梢灾概c如果不接受治療的預(yù)期的存活相比延長的存活。如此處所用的，術(shù)語“治療”包括預(yù)防。治療包括腫瘤或其他患病組織生長的停止，可檢測實(shí)體瘤或可檢測的受感染的或患病組織的衰退或消失，或腫瘤的轉(zhuǎn)移或受感染或患病組織擴(kuò)展的防止或減小?！皽p輕”疾病指疾病狀態(tài)的程度和/或不希望的臨床表現(xiàn)減弱和/或該疾病狀態(tài)惡化的時(shí)間過程被減慢或延長，如與已知對(duì)這些疾病參數(shù)有很小的或沒有效果的物質(zhì)相比的。
如此處所用的，本發(fā)明的模型對(duì)于一系列疾病和失調(diào)的評(píng)價(jià)是有價(jià)值的，這些疾病和失調(diào)包括通過實(shí)例但不限于貧血、惡性腫瘤、自身免疫失調(diào)、各種免疫功能失調(diào)和不足、病原性微生物的感染、糖尿病、多囊卵巢疾病、良性前列腺肥大、骨質(zhì)疏松癥、神經(jīng)變性疾病如ALS、阿爾茨海默氏疾病、帕金森疾病、肌營養(yǎng)不良、各種轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性失調(diào)如各種皮膚癌，包括黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、腎癌、肝癌、肺癌、腦癌和其他頭和頸癌癥，包括成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、淋巴瘤和白血病、心血管疾病、腎損傷和疾病，等。
在本發(fā)明的一些方面，動(dòng)物模型方便了導(dǎo)致個(gè)體生活質(zhì)量提高的治療方案的安全和有效劑量的確定，生活質(zhì)量的提高可通過惡心、嘔吐、胃口喪失、失眠、總體感覺下降、日常活動(dòng)減少、疲勞和抑郁的減少，而沒有增加其他不需要的副作用來測量。
在一些其他方面，本發(fā)明的動(dòng)物模型被用于支持臨床醫(yī)生和研究人員的診斷和預(yù)后確定。這通過將本發(fā)明的方法應(yīng)用于植入患者組織樣品的用途，或者用于來自患者樣品的物質(zhì)的用途以處理已經(jīng)植入的組織。植入的組織和組織處理方法和此處描述的相同，并且評(píng)定結(jié)果的方法是專業(yè)人員的常規(guī)技術(shù)。
III.成熟組織表型的動(dòng)物模型的產(chǎn)生可通過幾種不同方法產(chǎn)生成熟組織表型的動(dòng)物模型。受體動(dòng)物優(yōu)選為免疫缺陷動(dòng)物。不是免疫缺陷的動(dòng)物將對(duì)植入該動(dòng)物的來自其他物種的組織發(fā)動(dòng)不利的免疫應(yīng)答，所以，高度支持使用免疫缺陷動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該動(dòng)物為小鼠或大鼠?？赏ㄟ^遺傳育種(例如，nu/nu、SCID、RAG、米色小鼠或裸大鼠、無胸腺小鼠或大鼠，等)、遺傳操縱(例如，基因“敲除”技術(shù))，或者通過放射或化學(xué)免疫抑制動(dòng)物(例如，用免疫抑制劑如環(huán)孢菌素處理或用輻射或其他破壞免疫T細(xì)胞和/或B細(xì)胞的方法)獲得。
本發(fā)明優(yōu)選的動(dòng)物受試者是脊椎動(dòng)物。本發(fā)明尤其優(yōu)選的動(dòng)物受試者是哺乳動(dòng)物。術(shù)語“哺乳動(dòng)物”指屬于哺乳類的個(gè)體。本發(fā)明尤其用于人組織的應(yīng)用，盡管其也可以用于獸醫(yī)。
植入受體動(dòng)物的人和其他物種的目標(biāo)組織本質(zhì)上是不成熟的，并且可來自多種來源。一方面，人組織是來自人胚胎組織的非癌性的、非患病組織，即，正常組織，包括但不限于下面的生物系統(tǒng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦-大腦(含有神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)等的灰質(zhì)和白質(zhì))和腦-小腦、眼、腦干(腦橋、延髓、中腦)、脊髓；內(nèi)分泌系統(tǒng)腎上腺(皮質(zhì)和髓質(zhì))、卵巢、胰臟(胰島和外分泌胰腺)、甲狀旁腺、垂體(腺垂體和神經(jīng)垂體)、睪丸、甲狀腺(濾泡上皮、甲狀腺濾泡旁細(xì)胞、膠體，等)；乳腺乳腺(小葉、導(dǎo)管、肌上皮細(xì)胞，等)；造血的脾臟、扁桃體、胸腺、骨髓(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞前體、巨核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞)、外周血細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、血紅細(xì)胞、血小板)；呼吸系統(tǒng)肺(支氣管、細(xì)支氣管、肺泡，等)；心血管系統(tǒng)心臟、血管(動(dòng)脈、靜脈，等)；胃腸系統(tǒng)食道、胃(胃底)、小腸(回腸、空腸或十二指腸)、結(jié)腸、肝臟(肝三聯(lián)、肝細(xì)胞，等)，唾液腺；泌尿生殖系統(tǒng)腎臟、泌尿器、膀胱、輸尿管、尿道、輸卵管、陰道、胎盤、前列腺、子宮、子宮頸；肌與骨骼系統(tǒng)骨骼??；皮膚皮膚(表皮、附器、真皮)；末梢神經(jīng)系統(tǒng)末梢神經(jīng)；間皮細(xì)胞來自胸壁、腹壁、心包或來自胃腸、心臟和/或肺樣品表面的襯細(xì)胞等。
用于植入的尤其優(yōu)選的組織類型目前是肝臟、肺、前列腺、腎臟、胰臟、心臟、結(jié)腸、十二指腸和胸腺。胚胎組織可被切成足夠小的小塊以適合植入部位但是足夠大以含有原來組織的基質(zhì)和上皮成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，組織被切成10mm×10mm×10mm的尺寸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組織被切成5mm×5mm×5mm的尺寸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組織被切成1mm×1mm×1mm的尺寸?？赡苄枰獛追N重組體以代表來自含有許多不同細(xì)胞類型的大組織，如肺的所有不同細(xì)胞類型。兩塊或幾塊可被置于同一腎臟的被膜下。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，組織源為來自人胚胎組織的人祖細(xì)胞系，其被擴(kuò)增并與選擇用來促進(jìn)祖細(xì)胞分化和成熟成一種或多種成熟人細(xì)胞類型的大鼠或小鼠間充質(zhì)細(xì)胞重組以形成人/嚙齒動(dòng)物組織重組體。例如，這類組織重組體可以是如在美國專利號(hào)6,436,704中所描述的分離和生長的人胰臟祖細(xì)胞(hPED)、如在美國專利號(hào)6,416,999中描述的分離和生長的人放射狀膠質(zhì)祖細(xì)胞、在WO01/77303中描述的分離和生長的人卵巢祖細(xì)胞或如在待決專利申請(qǐng)PCT/US03/04547中描述的人膀胱祖細(xì)胞(hBLA)，所有這些文獻(xiàn)的教導(dǎo)在此處被特別并入作為參考。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，可與大鼠或小鼠間充質(zhì)細(xì)胞(例如)重組形成組織重組體的其他組織特異性人祖細(xì)胞的實(shí)例包括，但不限于，來自卵巢、膀胱、胰臟、肺、皮膚、腎、結(jié)腸、甲狀腺、肝臟、心臟、睪丸和前列腺的祖細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組織源可以是來自人間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞系。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組織源可以是與來自嚙齒類間充質(zhì)細(xì)胞組織或適宜的人間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞系重組的人祖細(xì)胞系(例如，與胰臟間充質(zhì)細(xì)胞(hPEM)組合的人胰臟祖細(xì)胞如hPED)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人細(xì)胞如Schwann細(xì)胞或神經(jīng)上皮細(xì)胞可以用于植入到免疫缺陷的動(dòng)物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，前面段的組織備選地來自其他非人脊椎動(dòng)物物種的祖細(xì)胞或者來自胚胎組織或適宜的細(xì)胞系。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，組織源可以是在膠原基質(zhì)或其他基質(zhì)材料(例如血漿凝血塊、EHS基質(zhì)、Matrigel，等)中生長的人或其他非人脊椎動(dòng)物細(xì)胞系。每種細(xì)胞類型被培養(yǎng)在經(jīng)設(shè)計(jì)以維持祖細(xì)胞表型的培養(yǎng)基中。如在美國專利6,436,704和美國專利6,416,999所描述的那樣制備細(xì)胞(1-3×106)并與適宜的間充質(zhì)細(xì)胞組合。
另一方面，目標(biāo)組織是受感染的、患病的和/或癌性的。例如，可以使用來自人腫瘤或其他患病組織的細(xì)胞系。這些細(xì)胞可從活檢或尸檢得到，從免疫缺陷的小鼠或大鼠攜帶的可植入的腫瘤或者從人腫瘤建立或體外轉(zhuǎn)化的永生細(xì)胞系得到。
一旦從目標(biāo)動(dòng)物得到正常的和/或癌性和/或受感染的和/或患病組織，就將目標(biāo)組織植入免疫缺陷的動(dòng)物?？芍踩攵喾N部位。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，組織或組織重組體被植入免疫缺陷動(dòng)物的腎被囊下面。對(duì)于人腫瘤的異種移植通常使用小鼠是本領(lǐng)域中公知的。在其他實(shí)施方案中，目標(biāo)組織或組織重組體被皮下植入脂肪墊，或者植入免疫動(dòng)物的其他部位從而目標(biāo)組織或組織重組體可以發(fā)育和成熟并且在長時(shí)間(例如，一個(gè)月后或更長時(shí)間)后定位。在另一實(shí)施方案中，含有表皮和間充質(zhì)細(xì)胞成分的組織被修整成1mm立方小塊并置于免疫缺陷動(dòng)物的腎被囊下面或者脂肪墊中。
一旦組織源被植入免疫缺陷小鼠，該組織被允許發(fā)育的時(shí)間為成熟所需要的時(shí)間，以成為成熟表型。該時(shí)間量可隨不同的組織而不同，為約2周到52周，優(yōu)選約4到36周，更優(yōu)選的約6到24周以達(dá)到希望的發(fā)育階段。通過將胚胎(發(fā)育10-24周)來源的組織植入并允許發(fā)育6到24周并觀察組織學(xué)和所得組織中特定的、已知的成熟標(biāo)志物的表達(dá)可確定希望的發(fā)育階段。一般，根據(jù)本發(fā)明的方法，正常組織的生長和成熟比癌性組織的生長需要更多時(shí)間。
在一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物有1-3個(gè)正常組織已經(jīng)被植入一個(gè)腎被囊下面并允許成熟。使用一種或多種試劑前約0-2周腫瘤細(xì)胞可被植入對(duì)側(cè)腎被囊中。正常組織可被允許在一個(gè)動(dòng)物中成熟，然后對(duì)該動(dòng)物實(shí)施安樂死并移出組織。成熟的組織可被切成兩個(gè)或多個(gè)相等的小塊并植入2個(gè)或多個(gè)受體動(dòng)物中以產(chǎn)生具有匹配的正常人組織塊的動(dòng)物。這是有用的，因?yàn)橐粋€(gè)動(dòng)物為對(duì)照，其他動(dòng)物被一種或多種試劑處理。這時(shí)可將腫瘤細(xì)胞植入對(duì)側(cè)腎被囊中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，僅僅正常組織被植入受體動(dòng)物中。這可用于檢驗(yàn)治療方案或治療劑(例如抗體)以確定其對(duì)各種正常組織的作用。在一些情況中，已知試劑(例如抗體)對(duì)癌性組織具有有害作用。僅僅具有正常組織的動(dòng)物模型可被用于確定一定劑量范圍內(nèi)的該試劑是否對(duì)其他正常組織具有有害作用。
II.試劑此處描述的動(dòng)物模型可用于評(píng)估多種試劑的作用，這些試劑包括但不限于，抗體、小分子、肽、擬肽(peptidomimetics)和蛋白質(zhì)。可使用的小分子包括合成的化學(xué)化合物，如為了FDA批準(zhǔn)而被檢驗(yàn)的藥物?？墒褂玫牡鞍踪|(zhì)包括，但不限于，合成肽和蛋白質(zhì)、重組蛋白質(zhì)和天然存在的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明治療劑的多種制劑可用于施用。在一些實(shí)施方案中，試劑可不經(jīng)稀釋使用。在另一些實(shí)施方案中，施用試劑和藥學(xué)上可接受的賦形劑，并且它們可以在各種制劑中。藥學(xué)上可接受的賦形劑是本領(lǐng)域公知的，并且是相對(duì)惰性的物質(zhì)，其方便了藥學(xué)上有效物質(zhì)的施用。例如，賦形劑可賦予形狀或一致性，或者作為稀釋劑。適宜的賦形劑包括但不限于穩(wěn)定劑、增濕劑和乳化劑、用以改變摩爾滲透壓濃度的鹽、封裝劑、緩沖劑和皮膚滲透增強(qiáng)劑。用于腸胃外和非腸胃外藥物遞送的賦形劑以及制劑在RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott，Williams & Wilkins，Publishing中闡明。
用于腸胃外施用的適宜制劑包括水可溶形式的活性化合物的水性溶液，例如水溶性鹽。此外，可施用活性化合物的懸浮液，根據(jù)需要為油狀注射懸浮液。適宜的親脂性溶劑或賦形劑包括脂肪油，例如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液粘性的物質(zhì)并包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。任選地，懸浮劑也可含有穩(wěn)定劑。脂質(zhì)體也可用于封裝該試劑以遞送到細(xì)胞中。
可制備根據(jù)本發(fā)明用于系統(tǒng)性施用的藥物制劑用于經(jīng)腸、腸胃外或局部施用。實(shí)際上，可以同時(shí)使用所有三種類型的制劑以實(shí)現(xiàn)活性成分的系統(tǒng)性施用。
經(jīng)口施用的適宜制劑包括硬或軟明膠膠囊、丸劑、片劑(包括包衣的片劑)、酏劑、懸浮劑、糖漿劑或其吸入和控釋形式。
可施用各種方法將試劑施用于動(dòng)物模型。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑被腹膜內(nèi)(i.p.)施用。其他方法包括，但不限于，經(jīng)口、皮下、靜脈內(nèi)、囊下施用、肌內(nèi)或直接施用到組織或腫瘤。可通過緩釋方法強(qiáng)化施用，這些緩釋方法包括使用固體制劑，如皮膚貼劑或丸劑或者封裝或包衣的形式，或者如果是液體，通過適宜的液體制劑或者使用體外或內(nèi)部維持的泵機(jī)制施用。
可通過各種方法確定將要施用的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過逐步增加試劑并能監(jiān)控效果來確定該試劑例如抗體的劑量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，技術(shù)人員使用文獻(xiàn)中描述的量作為劑量的起點(diǎn)并且使用高于和低于報(bào)導(dǎo)量的逐步增量確定效果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用的劑量反映個(gè)體(例如，人)如果進(jìn)行治療方案或者處于日常的每天暴露中將經(jīng)歷的生理量。
一般地，制備這些試劑以通過注射(例如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)，等)施用，盡管也可以使用其他形式施用(例如，經(jīng)口、粘膜，等)。因此，本發(fā)明的治療劑優(yōu)選與藥學(xué)上可接受的賦形劑如鹽水、林格液、右旋糖溶液等等組合。特定劑量方案，即，劑量、時(shí)間選擇和重復(fù)，將依賴于特定個(gè)體和該個(gè)體的病史。通常，可使用下面劑量的任一種施用至少約50mg/kg體重；至少約10mg/kg體重；至少約3mg/kg體重；至少約1mg/kg體重；至少約750μg/kg體重；至少約500μg/kg體重；至少約250μg/kg體重；至少約100μg/kg體重；至少約50μg/kg體重；至少約10μg/kg體重；至少約1μg/kg體重，或者更多。經(jīng)驗(yàn)考慮，如半壽期，通常將有助于劑量的確定。與人免疫系統(tǒng)相容的試劑，如人源化抗體或完整人抗體，可用于延長抗體的半壽期并防止該抗體被宿主的免疫系統(tǒng)攻擊。施用頻率可被確定并隨著療程而調(diào)整，并且基于減少癌性細(xì)胞的數(shù)目、保持癌性細(xì)胞的減少、減少癌性細(xì)胞的增殖，或者延遲癌轉(zhuǎn)移的發(fā)展。備選地，本發(fā)明試劑的持續(xù)連續(xù)釋放制劑可以是適宜的。實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放的多種制劑和設(shè)備是本領(lǐng)域公知的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定被給予1次或多次施用的個(gè)體中治療劑的劑量。個(gè)體被給予治療劑的遞增劑量。為了評(píng)定治療劑的功效，可以根據(jù)一些方法跟蹤特定癌癥的疾病狀態(tài)，這些方法如通過觸診或目測直接測量腫瘤的大小，通過X射線或其他成象技術(shù)間接測量腫瘤大小，通過直接的腫瘤活檢或腫瘤樣品的顯微鏡檢查更好地評(píng)定，測量間接的腫瘤標(biāo)記(例如，前列腺癌的PSA)、與腫瘤相關(guān)的疼痛、麻痹、言語、視力、呼吸和其他能力喪失的減少，胃口增加，或者如通過接受的試驗(yàn)所測量的生活質(zhì)量的提高或者存活的延長。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是劑量將根據(jù)個(gè)體、癌癥的類型、癌癥的階段、是否癌已經(jīng)開始轉(zhuǎn)移到個(gè)體中其他位置，以及過去的治療和所用的同時(shí)治療而變。
其他制劑包括本領(lǐng)域中公知的適宜的遞送形式，包括但不限于，載體如脂質(zhì)體。見，例如，Mahato等(1997)Pharm.Res.14853-859。脂質(zhì)體制劑包括，但不限于細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑、多層脂質(zhì)體和單層脂質(zhì)體。
在一些實(shí)施方案中，可存在一種以上的治療劑。這些組合物可含有一種或一種以上抗例如卵巢、肺、前列腺、胰臟、結(jié)腸或乳腺癌細(xì)胞的治療劑(可含有至少1種，至少2種，至少3種，至少4種，至少5種不同的治療劑)。治療劑的混合物(如它們通常在本領(lǐng)域中指出)可尤其用于治療更寬范圍的個(gè)體群體。
疾病的評(píng)定優(yōu)選使用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，如成象方法和監(jiān)控適宜的一種或多種標(biāo)志物，如在下面詳細(xì)討論的。
試劑施用的時(shí)間選擇將依賴于試劑的性質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑為抗體，其被以有效量施用以降低癌性細(xì)胞、癌性組織或腫瘤的生長。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定低濃度的多次施用對(duì)較高濃度的單次施用的功效而不用過多實(shí)驗(yàn)。
試劑可以施用一次或者每周注射1-7次或更多，持續(xù)幾周。劑量、施用方案和持續(xù)時(shí)間將通常反映顯示出在治療感染或疾病中有效。
III.功效/毒性模型的評(píng)估含有組織植入物或組織重組體的動(dòng)物模型被允許發(fā)育成部分或完全的成年正常成熟的組織表型。為了產(chǎn)生評(píng)定試劑效果(例如，毒性)的動(dòng)物模型，可以對(duì)一個(gè)腎被囊下面含有成熟目標(biāo)組織的這些動(dòng)物，將目標(biāo)患病的、受感染的或癌性細(xì)胞植入對(duì)側(cè)腎被囊(或者其他側(cè))下并用試劑(例如，單克隆抗體或其他藥物)處理。處理后，處死動(dòng)物并移出人患病的、受感染的或癌性的和正常的組織異種移植物，并對(duì)其進(jìn)行分析以評(píng)定藥物的效果。技術(shù)人員可通過監(jiān)控總體形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、壞死和凋亡的量、患病的、受感染的或癌性組織的大小和/或功能(例如，胰臟組織的胰島素分泌)或者正常和異常細(xì)胞功能的已知標(biāo)記物的存在與否來確定試劑對(duì)正常的和患病的、受感染的或癌性目標(biāo)組織的效果。例如，可用Ki67抗體染色以顯現(xiàn)組織中分裂細(xì)胞的數(shù)目(Grogan等Blood 752714-9，1988)。對(duì)于治療性抗體，可以使用動(dòng)物模型鑒定抗體和有效殺死癌性組織或減小腫瘤的大小而對(duì)相應(yīng)的正常組織或其他表達(dá)與抗體結(jié)合的抗原的正常組織作用很小或沒有作用的抗體劑量。
評(píng)定治療性治療方案對(duì)個(gè)體效果的方法將依賴于所治療的條件和治療方法而變，本領(lǐng)域中熟知一系列這些方法。作為闡明而不是限制，這些方法包括上面討論的那些方法，以及評(píng)定肥大、增生、程序性死亡、差別蛋白或類固醇分泌、代謝活性和形態(tài)改變的方法。
成熟組織也可用于通過用試劑系統(tǒng)性治療動(dòng)物然后測量目標(biāo)組織的功能，例如，“成熟”的人胰臟的人胰島素產(chǎn)生，來評(píng)定小分子藥物的功效和毒性。該動(dòng)物模型的另一個(gè)用途是功效模型，通過該模型，具有每個(gè)腎中不同成熟組織(正常的和患病的)的動(dòng)物被用于評(píng)定該試劑的長期治療(例如，數(shù)天到數(shù)月)的效果。
實(shí)施例實(shí)施例1非人動(dòng)物模型的產(chǎn)生將來自正常胚胎器官(結(jié)腸、心臟、腎、肝、肺、卵巢和輸卵管)的組織切成1mm立方小塊并置于裸小鼠(nu/nu)或SCID免疫受損的小鼠的腎被囊或脂肪墊中。這些組織留在動(dòng)物中6-40周以允許發(fā)育成成熟組織的時(shí)間。將動(dòng)物實(shí)施安樂死并移出組織并切片用于H&E染色和免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià)。
圖1顯示了一系列植入的結(jié)果，其中組織被允許成熟4個(gè)月。在該實(shí)施例中，對(duì)于“圖片”的所有參照見圖1。圖片1、2、3、6、7和8顯示腎被囊下的植入而圖片4和5顯示脂肪墊下的植入。圖片1、6、7和8顯示裸(nu/nu)小鼠中正常胚胎器官的植入，而圖片2、3、4和5顯示SCID小鼠中正常胚胎器官的植入。腎、心臟和肝臟組織當(dāng)置于腎被囊時(shí)發(fā)育失敗(圖片3)。腎組織當(dāng)置于腎被囊時(shí)不發(fā)育和成熟(未顯示)，但其在脂肪墊中發(fā)育(圖片4)。盡管心臟的1mm立方小塊在該實(shí)驗(yàn)中不發(fā)育(圖片5)，在另一組實(shí)驗(yàn)中，含有來自心耳和心室細(xì)胞的心臟組織長而薄(0.6×2mm)的小塊當(dāng)植入腎被囊7個(gè)月時(shí)存活下來并發(fā)育出脂肪組織和肌肉組織。圖6顯示在宿主小鼠中6個(gè)月后發(fā)育良好的結(jié)腸、胰臟、心臟和前列腺。切開的胚胎肝臟組織在脂肪墊或腎被囊植入部位都不發(fā)育(圖片5)。然而，使用人肝臟上皮祖細(xì)胞和大鼠胚胎精囊間充質(zhì)細(xì)胞(rSVM)的組織重組體分化成具有良好限定的結(jié)構(gòu)。與rSVM組合的睪丸上皮祖細(xì)胞發(fā)育成類似于生殖細(xì)胞缺陷的睪丸的管狀結(jié)構(gòu)，因?yàn)樽畛醯慕Y(jié)構(gòu)中不存在睪丸生殖干細(xì)胞(見圖7)。輸卵管發(fā)育是廣泛的(圖片8)而肺和卵巢(圖片6和7)成熟但是不具有和體內(nèi)組織相同的結(jié)構(gòu)發(fā)育。然而，已經(jīng)被允許體內(nèi)(腎被囊)發(fā)育7個(gè)月的肺組織發(fā)育成包括纖毛上皮細(xì)胞的成年細(xì)胞形態(tài)。因?yàn)槊庖呷毕菪∈蟮膲勖日Ｐ∈蟮亩?，這些長的發(fā)育時(shí)間可能需要將正常組織塊在發(fā)育5-6個(gè)月后移植到更年輕(例如6-10周)的動(dòng)物中。
實(shí)施例2用于安全性/功效模型的成熟組織將正常人前列腺和胰臟小塊置于腎被囊下并允許成熟6周。這時(shí)，人前列腺癌細(xì)胞(LnCAP)被置于相同動(dòng)物的對(duì)側(cè)腎被囊下并允許再生長一周。在植入LnCAP腫瘤后的第7天，通過腹膜內(nèi)注射將一只動(dòng)物用10μg/g PA6抗體(抗人EpCAM)處理。對(duì)照動(dòng)物用鹽水注射處理。兩周內(nèi)注射4次。在該時(shí)間末，對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂死并檢查腫瘤和正常組織異種移植物。動(dòng)物的腎臟在圖2中顯示。圖2的左邊顯示了LpCAP腫瘤而右邊顯示正常組織(在該動(dòng)物中共發(fā)育9周)。上面的圖片來自處理的動(dòng)物而下面的圖片來自對(duì)照動(dòng)物。其它處理的動(dòng)物含有正常結(jié)腸組織。
實(shí)施例3人前列腺和人結(jié)腸成熟組織的免疫組織化學(xué)來自實(shí)驗(yàn)的人前列腺和人結(jié)腸成熟組織的免疫組織化學(xué)在圖2中描述。盡管腫瘤受抗體處理的影響導(dǎo)致細(xì)胞死亡和出血，但是正常組織未受抗體影響(A-D)。為了確定是否組織含有抗體靶標(biāo)(EpCAM)，將組織用直接標(biāo)記的PA6(抗人EpCAM)抗體染色。處理過和未處理的組織都顯示出抗體的結(jié)合。成熟人前列腺組織由于前列腺特異抗原(PSA)—前列腺細(xì)胞的一種標(biāo)記物—而也被強(qiáng)烈染色。
實(shí)施例4對(duì)mPA7抗體的安全性/功效研究用人胚胎胰臟和前列腺組織進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)。胰臟和前列腺組織被允許成熟11周，之后LnCAP前列腺腫瘤組織被植入對(duì)側(cè)。如實(shí)施例2中所述，用50μg/gx4劑mPA7抗體處理動(dòng)物。如在圖4A中所見，抗體處理導(dǎo)致腫瘤組織消失，僅僅剩下疤痕組織。4B中H&E染色切片中所示正常組織未受抗體處理的影響。
實(shí)施例5從人祖細(xì)胞和大鼠胚胎間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的正常組織重組體使用胚胎組織的完整小塊以成熟為成年表型的一個(gè)備選方案是使用與嚙齒類間充質(zhì)細(xì)胞重組的人祖細(xì)胞系以產(chǎn)生這樣一種組織，該組織中來自祖細(xì)胞系的一部分細(xì)胞是成人表型。該方案的一個(gè)實(shí)例在圖5中顯示。這里，hBLA(人膀胱上皮祖細(xì)胞)細(xì)胞系與大鼠胚胎膀胱間充質(zhì)細(xì)胞重組形成具有成人膀胱上皮表型的含有大鼠間充質(zhì)細(xì)胞和人上皮細(xì)胞的組織嵌合體。該組織用uroplakin—人膀胱傘狀細(xì)胞的一種標(biāo)記物—染色結(jié)果在上面的圖片中顯示。同樣的細(xì)胞可以與大鼠胚胎精囊間充質(zhì)細(xì)胞重組并允許體內(nèi)成熟6個(gè)月以形成具有大鼠間充質(zhì)細(xì)胞和成人前列腺上皮(在下面的圖片中用人前列腺特異抗原(PSA)染色)的組織嵌合體。類似地，已經(jīng)使用人胚胎肝臟細(xì)胞、人胚胎胰臟細(xì)胞(見專利美國專利號(hào)6,436,704)或人子宮/陰道/輸卵管祖細(xì)胞(見專利美國專利號(hào)6,416,999)與適宜的大鼠間充質(zhì)細(xì)胞重組制備人/大鼠嵌合組織而獲得組織重組體。
應(yīng)該理解此處描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅僅是闡明的目的，對(duì)其進(jìn)行的各種修改或改變也暗示給了本領(lǐng)域技術(shù)人員并且包括在本申請(qǐng)的精神和范圍和所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。此處所應(yīng)用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖颂幈煌暾胱鳛閰⒖嘉墨I(xiàn)，就好像每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)被特別和單獨(dú)的被指出并入作為參考文獻(xiàn)一樣。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生具有具成熟表型的來自第一種脊椎動(dòng)物的目標(biāo)正常組織和目標(biāo)患病組織的非人脊椎動(dòng)物模型的方法，該方法包括步驟(a)將從第一種動(dòng)物的未成熟細(xì)胞或祖細(xì)胞制備的未成熟目標(biāo)正常組織或正常組織重組體植入第二種非人脊椎動(dòng)物受體的足以支持所述組織生長和成熟的部位處；(b)允許第一種動(dòng)物的目標(biāo)正常組織發(fā)育成具有成熟表型的組織；(c)將第一種動(dòng)物的目標(biāo)患病組織或患病細(xì)胞植入非人脊椎動(dòng)物受體的足以支持該患病組織生長的部位處；和(d)允許來自第一種動(dòng)物的目標(biāo)患病組織或患病細(xì)胞生長。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將來自第一種動(dòng)物的目標(biāo)正常組織和目標(biāo)患病組織兩者植入單個(gè)非人脊椎動(dòng)物的不同部位處。
3.權(quán)利要求1的方法，其中將正常組織和患病目標(biāo)組織植入不同動(dòng)物。
4.權(quán)利要求1的方法，其中供體和正常的受體動(dòng)物屬于不同的物種。
5.權(quán)利要求1的方法，其中植入的目標(biāo)正常組織和植入的目標(biāo)患病組織都是人來源的。
6.權(quán)利要求1的方法，其中植入的目標(biāo)組織來自選自小鼠、大鼠、兔、鳥、貓、狗、豬、綿羊、山羊、鹿、馬、牛、人和非人靈長類的物種。
7.權(quán)利要求6的方法，其中非人靈長類為狒狒、黑猩猩或猴。
8.權(quán)利要求1的方法，其中非人脊椎動(dòng)物受體選自免疫缺陷的小鼠、大鼠、兔、貓、蛙、鳥、狗、豬、綿羊、山羊和非人靈長類。
9.權(quán)利要求8的方法，其中動(dòng)物為免疫缺陷的嚙齒類動(dòng)物。
10.用于評(píng)估存在于免疫缺陷的第二種非人受體或宿主動(dòng)物中具有成熟表型的來自第一種脊椎動(dòng)物物種的目標(biāo)組織的組織模型，其中目標(biāo)正常和/或患病的第一種物種組織為選自以下生物系統(tǒng)的組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦-大腦(含有神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)等的灰質(zhì)和白質(zhì))和腦-小腦、眼、腦干(腦橋、延髓、中腦)、脊髓；內(nèi)分泌系統(tǒng)腎上腺(皮質(zhì)和髓質(zhì))、卵巢、胰臟(胰島和外分泌胰腺)、甲狀旁腺、垂體(腺垂體和神經(jīng)垂體)、睪丸、甲狀腺(濾泡上皮、甲狀腺濾泡旁細(xì)胞、膠體，等)；乳腺乳腺(小葉、導(dǎo)管、肌上皮細(xì)胞，等)；造血系統(tǒng)脾臟、扁桃體、胸腺、骨髓(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞前體、巨核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞)、外周血細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、血紅細(xì)胞、血小板)；呼吸系統(tǒng)肺(支氣管、細(xì)支氣管、肺泡，等)；心血管系統(tǒng)心臟、血管(動(dòng)脈、靜脈，等)；胃腸系統(tǒng)食道、胃(胃底)、小腸(回腸、空腸或十二指腸)、結(jié)腸、肝臟(肝三聯(lián)、肝細(xì)胞，等)，唾液腺；泌尿生殖系統(tǒng)腎臟、泌尿器、膀胱、輸尿管、尿道、輸卵管、陰道、胎盤、前列腺、子宮、子宮頸；肌與骨骼系統(tǒng)骨骼?。黄つw皮膚(表皮、附器、真皮)；末梢神經(jīng)系統(tǒng)末梢神經(jīng)；間皮細(xì)胞來自胸壁、腹壁、心包或來自胃腸、心臟和/或肺樣品表面的襯細(xì)胞等。
11.具有成熟表型的目標(biāo)正常人組織和患病人組織的免疫缺陷嚙齒動(dòng)物模型，其中正常人組織選自肺、前列腺、腎臟、胰、膀胱、皮膚、肝臟、心、結(jié)腸、十二指腸、胃、甲狀腺、唾液腺和胸腺。
12.評(píng)估針對(duì)目標(biāo)患病組織進(jìn)行治療性治療的效果的方法，其包括步驟(a)將此種治療應(yīng)用于具有至少一種有成熟表型的目標(biāo)正常組織和目標(biāo)患病組織的免疫缺陷非人脊椎動(dòng)物受體動(dòng)物，其中這些目標(biāo)組織來自與受體動(dòng)物不同的脊椎動(dòng)物物種，和(b)評(píng)估該治療對(duì)目標(biāo)正常組織和患病組織的效果。
13.權(quán)利要求12的方法，其中治療性治療選自放射治療、化學(xué)治療、放射藥學(xué)治療或放射免疫治療。
14.權(quán)利要求12的方法，其中治療性治療包括施用用于腫瘤的放射成象的試劑。
15.確定試劑對(duì)目標(biāo)組織有毒的劑量的方法，其包括步驟(a)將試劑施用于免疫缺陷的受體動(dòng)物，其中該受體動(dòng)物具有至少一種具有成熟表型的來自供體動(dòng)物的目標(biāo)正常組織和目標(biāo)癌性組織，和(b)評(píng)估該試劑對(duì)正常和癌性目標(biāo)組織的任何毒性效果。
16.鑒定試劑對(duì)目標(biāo)患病細(xì)胞或癌性細(xì)胞的毒性大于對(duì)正常細(xì)胞的毒性的方法，該方法包括步驟(a)將試劑施用于免疫缺陷的受體動(dòng)物，其中該受體動(dòng)物具有具成熟表型的來自供體動(dòng)物的目標(biāo)正常組織和患病的或癌性目標(biāo)組織，和(b)鑒定減少患病的或癌性目標(biāo)組織的生長或破壞這些組織的程度大于正常組織的試劑。
17.確定試劑對(duì)患病或癌性細(xì)胞的毒性大于對(duì)正常細(xì)胞的毒性的有效量的方法，該方法包括步驟(a)將試劑施用于免疫缺陷的受體動(dòng)物，其中該受體動(dòng)物具有具成熟表型的來自供體動(dòng)物的目標(biāo)正常組織和癌性人組織，和(b)確定對(duì)正常的和患病的或癌性目標(biāo)組織有效的試劑量。
18.一種基于完整動(dòng)物的篩選測定法，其包括使用已經(jīng)接受本發(fā)明的目標(biāo)組織植入物或者其部分的非人宿主動(dòng)物，用于測試施用于所述動(dòng)物的治療的毒性、細(xì)胞抑制、抗微生物、抗炎或其他治療特性，或者測試此類治療在控制或抑制癌癥的發(fā)展、感染和/或疾病的活性。
19.篩選和鑒定或檢驗(yàn)治療、藥物或其他物質(zhì)對(duì)抗癌癥、感染和/或疾病的發(fā)展或在癌癥、感染和/或疾病的治療中的活性的方法，該方法包括步驟(a)對(duì)已經(jīng)接受根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)的目標(biāo)組織植入物或其部分的非人宿主動(dòng)物用所述治療、藥物或其他相關(guān)物質(zhì)處理，并(b)檢測或記錄與不接受該治療、藥物或物質(zhì)的相應(yīng)動(dòng)物相比，在癌癥、感染和/或疾病的發(fā)展方面減少的發(fā)生率和死亡率的減少，或者檢測或記錄維持、恢復(fù)或提高機(jī)體功能的有效性。
全文摘要
本發(fā)明涉及在非人動(dòng)物中使用胚胎組織產(chǎn)生組織模型。該組織模型含有這樣的目標(biāo)組織，其為被允許在非人宿主體內(nèi)發(fā)育以得到可用于評(píng)估試劑的毒性和/或功效的具有成熟表型的組織。
文檔編號(hào)A61K35/12GK1655671SQ03812486
公開日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2003年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月30日
發(fā)明者J·P·馬瑟, P·F·揚(yáng) 申請(qǐng)人:雷文生物技術(shù)公司