專利名稱：非病毒類基因送遞系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的用于核酸的非病毒類送遞系統(tǒng)。更具體而言，本發(fā)明涉及一種系統(tǒng)，用于在給予宿主組織核酸后促進(jìn)該核酸進(jìn)入該組織的細(xì)胞中。本發(fā)明的組合物以可生物降解的多糖脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)，由于具有某些化學(xué)修飾的緣故，該多糖能夠更有效地送遞編碼所需產(chǎn)物和/或促進(jìn)所需產(chǎn)物在所述組織細(xì)胞中表達(dá)的生物學(xué)活性核酸，如寡核苷酸或多核苷酸。
背景技術(shù)：
基因治療的概念是以核酸(DNA或RNA)可作為藥物產(chǎn)品從而在適當(dāng)位點(diǎn)引起治療性蛋白質(zhì)的體內(nèi)生產(chǎn)為基礎(chǔ)。通常將送遞核酸的系統(tǒng)分為病毒類送遞系統(tǒng)和非病毒類送遞系統(tǒng)。由于其高度進(jìn)化和特化的組分，病毒類系統(tǒng)是目前最有效的DNA送遞工具，實(shí)現(xiàn)高效的送遞和表達(dá)。但是，病毒類送遞系統(tǒng)涉及到安全性問題。毒性、免疫原性、對特殊細(xì)胞類型的有限靶向、有限的DNA攜帶能力、生產(chǎn)和包裝問題、重組和非常高的生產(chǎn)成本都阻礙了它們的臨床應(yīng)用(Luo和Saltzman，2000)。為此，在基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室和臨床應(yīng)用中越來越需要非病毒類送遞系統(tǒng)。但是，從制藥學(xué)的角度看，由于與病毒類送遞系統(tǒng)相比非病毒類送遞系統(tǒng)在體內(nèi)獲得的表達(dá)相對較低，送遞核酸的途徑仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)(Saeki等，1997)。
現(xiàn)有技術(shù)已描述了各種非病毒類送遞系統(tǒng)，包括陽離子脂質(zhì)、肽或聚合物與質(zhì)粒DNA(pDNA)形成的復(fù)合物(Boussif等，1995；Felgner等，1994；Hudde等，1999)。帶負(fù)電的核酸主要通過離子-離子相互作用而與陽離子分子相互作用，并從游離形式轉(zhuǎn)變形成緊密狀態(tài)。在這種狀態(tài)下，陽離子分子可提供針對核酸酶降解的保護(hù)，而且還賦予該核酸-陽離子復(fù)合物一些表面特性，以有利于該復(fù)合物與細(xì)胞的相互作用并被細(xì)胞攝取(Ledley，1996)。
在這些陽離子分子中，已顯示合成的聚合物聚氮丙啶(PEI)能與pDNA形成穩(wěn)定的復(fù)個(gè)物，并介導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因在體外和體內(nèi)的相對高的表達(dá)(Boussif等，1995；Ferrari等，1997；Gautam等，2001)。為此，常用PEI作為試驗(yàn)設(shè)計(jì)的參比系統(tǒng)。但是，已提出PEI的毒性和效率之間的大致相關(guān)性(Luo和Saltzman，2000)，最近的研究還提出使用PEI所涉及到的毒性(Godbey等，2001；Putnam等，2001)。PEI的另一缺點(diǎn)是，它不是可生物降解的。因此，它可能被長時(shí)間存儲在體內(nèi)。因此，仍非常需要研究有效、無毒的可生物降解的非病毒類送遞系統(tǒng)。
最常見的是通過腸胃外途徑將非病毒類送遞系統(tǒng)體內(nèi)送遞。靜脈給予小鼠后，緊密的核酸-陽離子分子復(fù)合物主要沉積在肺毛細(xì)血管中，在那基因在肺泡隔膜(alveolar septi)中毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)(Li和Huang，1997；Ki等，2000；Song等，1997)，甚至在肺泡細(xì)胞中表達(dá)(Bragonzi等，2000；Griesenbach等，1998)。但是不在上皮細(xì)胞中表達(dá)。但未配制的裸DNA在達(dá)到目的地前在血液循環(huán)中快速降解，因此通常沒有基因表達(dá)。相反，將裸DNA注射到骨骼肌肉則導(dǎo)致劑量依賴性的基因表達(dá)(Wolff等，1990)，當(dāng)將該DNA與非緊密但“相互作用”的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙烯醇(PVA)復(fù)合時(shí)，基因表達(dá)進(jìn)一步提高(WO 96/21470)(Mumper等，1996；Mumper等，1998)。因此，體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染是組織依賴性的，其方式不可預(yù)測，因而這仍是個(gè)挑戰(zhàn)。
還描述了非病毒類送遞系統(tǒng)的粘膜送遞，即送遞給胃腸道、鼻和呼吸道(Koping-Hoggard等，2001；Roy等，1999，WO 01/41810)。除了以非緊密形式送遞到鼻組織獲得最佳的基因表達(dá)(WO 01/41810)外，當(dāng)需要在粘膜組織中獲得高基因表達(dá)時(shí)，緊密型核酸-陽離子分子復(fù)合物要優(yōu)于非緊密型DNA。
現(xiàn)有技術(shù)中，非病毒類送遞系統(tǒng)是以分子量相當(dāng)高〔通常具有幾百個(gè)千道爾頓(kDa)，5kDa是下限〕的陽離子聚合物(如脫乙酰殼多糖)為基礎(chǔ)的，(如MacLaughlin等，1998；Roy等，1999；WO 97/42975)。主要的原因是低分子量(＜5kDa聚合物)與DNA形成不穩(wěn)定的復(fù)合物，導(dǎo)致基因表達(dá)少(Koping-Hoggard，2001)。但是，高分子量陽離子分子有很多缺點(diǎn)，如緊密型核酸-陽離子分子復(fù)合物的聚集增加、溶解問題(MacLaughlin等，1998)。此外，使用較低分子量的陽離子分子存在一些生物學(xué)優(yōu)點(diǎn)，即與較高分子量的陽離子分子相比，它們通常顯示出減少的毒性和減少的補(bǔ)體激活(Fischer等，1999；Plank等，1999)。
現(xiàn)有技術(shù)已描述了使用低分子量陽離子分子與核酸復(fù)合的一些例子(Florea，2001；Godbey等，1999；Koping-Hoggard，2001；MacLaughlin等，1998；Sato等，2001)。但是，這些低分子量陽離子分子與DNA形成不穩(wěn)定的緊密物(compact)，該緊密物在電場中分離(瓊脂糖凝膠電泳)，結(jié)果導(dǎo)致與較高分子量陽離子分子相比沒有體外基因表達(dá)或表達(dá)量少。這可以解釋為DNA和低分子量陽離子分子之間形成的復(fù)合物通常是不穩(wěn)定的，易于分解(Koping-Hoggard，2001)。實(shí)際上，瓊脂糖凝膠電泳期間陽離子分子-DNA緊密物的離解和裸DNA的釋放在文獻(xiàn)中通常被用作區(qū)分無效制劑與有效制劑的試驗(yàn)(Fischer等，1999；Gebhart和Kabanov，2001；Koping-Hoggard等，2001)。
現(xiàn)有技術(shù)公開了使用非病毒載體將核酸送遞給呼吸道的方法的各種例子(Deshpande等，1998；Ferrari等，1997；Gautam等，2000)。我們最近鑒別和表征了基于DNA-復(fù)合聚合物脫乙酰殼多糖的這樣一種系統(tǒng)(Koping-Hoggard等，2001)，該脫乙酰殼多糖是一種線性多糖，可從殼多糖衍生得到。在美國專利5972707(Roy等，1999)、美國專利申請?zhí)?001/0031497(Rolland等，2001)和WO 98/01160中也描述了脫乙酰殼多糖基的基因送遞系統(tǒng)。
已將脫乙酰殼多糖作為緊密連接-修飾劑引入，以增強(qiáng)藥物通過上皮屏障的送遞(Artursson等，1994)。認(rèn)為它在給人口服后是無毒的，而且已被批準(zhǔn)作為食物添加劑使用，并且還被加到傷口愈合產(chǎn)品中(Illum，1998)。
脫乙酰殼多糖包括一類由(1→4)-連接的2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖(GlcNAc，A單元)和2-胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖(GlcN，D單元)以各種組成和順序形成的水溶性線性多糖，可參見

圖1。A單元和D單元的相對含量可以A單元的分?jǐn)?shù)表示FA＝A單元數(shù)量/(A單元數(shù)量+D單元數(shù)量)FA與去-N-乙酰化單元的百分比具有以下關(guān)系％去-N-乙?；瘑卧?00％-(1-FA)。
各D單元含有親水和可質(zhì)子化的氨基基團(tuán)，而各A單元含有疏水的乙?；?。兩種單體的相對量(如A/D＝FA/(1-FA))可大范圍地變化，導(dǎo)致它們的化學(xué)、物理和生物學(xué)性質(zhì)有較寬的變動(dòng)。這包括脫乙酰殼多糖在溶液、膠凝狀態(tài)和固體狀態(tài)下的性能，以及它們與其他分子、細(xì)胞和其他生物的和非生物的物質(zhì)的相互作用。
當(dāng)脫乙酰殼多糖被用于非病毒類基因送遞系統(tǒng)時(shí)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)的影響最近被證實(shí)(Koping-Hoggard等，2001)。不同化學(xué)組成的脫乙酰殼多糖作為基因送遞系統(tǒng)，顯示出結(jié)構(gòu)依賴性效率。僅有與pDNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物的脫乙酰殼多糖給出顯著的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
不管脫乙酰殼多糖的FA還是分子量是多少，都可通過引入化學(xué)取代基而對其進(jìn)行化學(xué)修飾。葡糖胺單元的氨基基團(tuán)由于其反應(yīng)性的緣故而非常容易衍生。其次，羥基上的取代也是衍生脫乙酰殼多糖的一種可能途徑，如O-羧甲基脫乙酰殼多糖(Kurita，2002)。
文獻(xiàn)中已描述了大量的脫乙酰殼多糖衍生物，但在基因送遞系統(tǒng)中進(jìn)行了測試的衍生物非常少。但已報(bào)道三甲基化的脫乙酰殼多糖在上皮細(xì)胞系中起到基因送遞載體的作用(Thanou等，2002)。
Tommeraas等(2002)已描述一系列支化脫乙酰殼多糖，其中通過席夫堿形成(Schiff base formation)使醛與D單元上的氨基反應(yīng)而形成分支。如Yalpani&Hall(1984)所述，通常可通過在糖類的醛基和脫乙酰殼多糖的未取代氨基之間形成席夫堿而將單糖(如葡萄糖、半乳糖)、二糖(如乳糖)以及寡糖連接到脫乙酰殼多糖上。在大多數(shù)碳水化合物中，還原端上的醛基涉及到分子內(nèi)環(huán)的形成。但是，由于環(huán)形式(半縮醛)和開鏈(醛形式)之間的平衡，所有或大多數(shù)碳水化合物作為醛類發(fā)生反應(yīng)。對于酮糖如果糖，在環(huán)形式(半酮縮醇)與開環(huán)(酮形式)之間也存在相應(yīng)的平衡。
另一類型的碳水化合物基的醛類可通過用硝酸降解長鏈碳水化合物(如脫乙酰殼多糖)而獲得。在此反應(yīng)中，葡糖胺的殘基被脫去氨基，形成2，5-脫水-D-甘露糖，此產(chǎn)物具有一個(gè)醛基，該醛基不參與傳統(tǒng)的環(huán)形成。終止于此殘基的寡聚物易于通過席夫堿形成而連接到脫乙酰殼多糖或其他胺類的氨基(Tommeraas等，2002；Hoffman等，1983；Casu等，1986)。
根據(jù)本發(fā)明，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)某些支化脫乙酰殼多糖在基因送遞方面與相應(yīng)的先前已知的非支化脫乙酰殼多糖和脫乙酰殼多糖寡聚物相比是更有效的復(fù)合劑(complexing agent)。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及一種組合物，它含有a)核酸；和b)含共價(jià)連接于氨基基團(tuán)的支鏈基的脫乙酰殼多糖，其中，所述支鏈選自以下基團(tuán)具有2個(gè)或多個(gè)碳原子的烷基；單糖；寡糖或多糖。含有支化脫乙酰殼多糖的所述組合物特別適用于將核酸送遞到宿主組織的細(xì)胞中。根據(jù)本發(fā)明，意想不到的是，含有核酸如質(zhì)粒DNA和某些支化脫乙酰殼多糖的制劑能有利地實(shí)現(xiàn)核酸向所選擇組織的送遞，并獲得由各種核酸編碼的所需分子在體內(nèi)的表達(dá)。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物含有可在脫乙酰殼多糖的氨基與羰基化合物支鏈基之間形成席夫堿的反應(yīng)中獲得的支鏈。該反應(yīng)可由下式表示 式中N代表連接于脫乙酰殼多糖的葡糖胺殘基的C-2的N原子；R1和R2各自獨(dú)立表示氫原子，或R1表示氫原子、R2表示任選取代的直鏈或支鏈飽和或未飽和的至多達(dá)10個(gè)碳原子的烴基，或者R1和R2各自獨(dú)立表示任選取代的直鏈或支鏈飽和或未飽和的具有達(dá)10個(gè)碳原子的烴基；或者該羰基化合物表示單糖、寡糖或多糖；有可能的是，該席夫堿產(chǎn)物被還原，得到下式化合物 本發(fā)明的另一目的是提供一種制備用于向宿主組織細(xì)胞送遞核酸的含有核酸(如質(zhì)粒DNA)和某些支化脫乙酰殼多糖的組合物。本發(fā)明的方法包括以下步驟(a)將權(quán)利要求1(b)所述的支化脫乙酰殼多糖暴露于水性溶劑中；(b)將步驟(a)所得的水性溶液與水性溶劑中的所述核酸混合；和(c)減少步驟(b)所獲得的產(chǎn)物溶液的體積，獲得所需的組合物濃度。
本發(fā)明又一目的是提供一種向宿主組織細(xì)胞給予核酸(如質(zhì)粒DNA)和某些支化脫乙酰殼多糖的方法。本發(fā)明向哺乳動(dòng)物給予核酸的方法是通過將該組合物引入該哺乳動(dòng)物而實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明又一目的是本發(fā)明組合物作為哺乳動(dòng)物預(yù)防性或治療性藥劑的用途。本發(fā)明組合物可同等地用作體外或體內(nèi)診斷劑。
本發(fā)明的這些和其他目的由下文所述的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例提供。
本發(fā)明制備用于將核酸送遞給宿主組織細(xì)胞的組合物的方法包括以下步驟制備某些支化脫乙酰殼多糖，和(a)將所述支化脫乙酰殼多糖暴露于pH范圍為4.0-8.0的水性溶劑中，(b)將步驟(a)的水性溶液與水性溶劑中的所述核酸混合，和(c)將步驟(b)獲得的溶液脫水，得到體內(nèi)給予前所需的組合物濃度。步驟(c)可通過以下方式進(jìn)行(1)將步驟(b)中的產(chǎn)品溶液的液體蒸發(fā)，得到所需的濃度；或(2)凍干步驟(b)所得的產(chǎn)品溶液，接著重新配制，以獲得所需的濃度。
本發(fā)明另一實(shí)施例提供了一種將制劑送遞給宿主組織細(xì)胞的方法。較佳的是，通過口腔、頰、舌下、直腸、陰道、鼻或肺部途徑，以給予粘膜組織的方式將所述組合物給予哺乳動(dòng)物。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施例，通過腸胃外給藥將所述組合物給予哺乳動(dòng)物。
更具體的是，本發(fā)明涉及權(quán)利要求1-15所定義的組合物。本發(fā)明的實(shí)施例還涉及權(quán)利要求16-24的主題。
在下文詳細(xì)描述的基礎(chǔ)上將能更容易理解本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。但是，應(yīng)當(dāng)注意的是，這些詳細(xì)的描述和具體實(shí)施例雖然表明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但它們僅僅是闡述性的，因?yàn)樵谶@些詳細(xì)描述的基礎(chǔ)上，在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種改變和變動(dòng)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。
附圖描述圖1脫乙酰殼多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)。此例子顯示了脫乙酰殼多糖鏈的一個(gè)片段，其中該片段含有一個(gè)N-乙?；?β-D-葡糖胺殘基(A單元)和3個(gè)β-D-葡糖胺殘基(D單元)。D單元的氨基可以是質(zhì)子化的，也可以是非質(zhì)子化的，這取決于pH。
圖2支化脫乙酰殼多糖的例子。其中支鏈已通過與乙酰的還原性N烷基化而引入，結(jié)果導(dǎo)致在氨基上得到作為取代基的乙基。支化的程度可通過如改變加入的乙醛量或改變反應(yīng)時(shí)間而加以控制。
圖3支化脫乙酰殼多糖。其中支鏈已通過與D-葡萄糖的還原性N-烷基化而引入。
圖4在對應(yīng)于還原端的鏈末端上含有2，5-脫水-D-呋喃型甘露糖(M)殘基的脫乙酰殼多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在此例子中，余下的所有殘基都是N-乙酰基-D-葡糖胺(FA＝1.0)。
圖5顯示三聚體AAM通過還原性胺化支化成脫乙酰殼多糖的氨基。
圖6含有AAM支鏈的不同程度支化(DS)的脫乙酰殼多糖的1H-NMR光譜(DPn＝25，F(xiàn)A＜0.001)。
圖7顯示瓊脂糖凝膠延遲檢測，表明在支化脫乙酰殼多糖與pLuc之間形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。
圖8顯示在用支化脫乙酰殼多糖寡聚物與pLuc之間形成的穩(wěn)定復(fù)合物轉(zhuǎn)染293細(xì)胞72小時(shí)后支化分子對熒光素酶基因表達(dá)的影響。
圖9顯示用三聚體支化脫乙酰殼多糖寡聚物與pLuc之間形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)染(A)293細(xì)胞和(B) Calu-3細(xì)胞72小時(shí)后，三聚體支化的程度對熒光素酶基因表達(dá)的影響。
圖10顯示用經(jīng)7％三聚體AAM支化的脫乙酰殼多糖寡聚物轉(zhuǎn)染后，(A)293細(xì)胞和(B)Calu-3細(xì)胞中熒光素酶基因表達(dá)的時(shí)間-過程研究。
使用報(bào)道子蛋白質(zhì)熒光素酶的表達(dá)作為體外細(xì)胞模型中治療性蛋白質(zhì)的模型，結(jié)果意想不到地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明含有質(zhì)粒DNA和某些支化脫乙酰殼多糖的組合物能有利地實(shí)現(xiàn)將該核酸送遞給細(xì)胞，并獲得由所述核酸編碼的所需分子的表達(dá)。
已發(fā)現(xiàn)某些支化脫乙酰殼多糖與pLuc形成穩(wěn)定的復(fù)合物(如瓊脂糖凝膠電泳所揭示的)，結(jié)果導(dǎo)致高的熒光素酶基因表達(dá)。已發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的復(fù)合物的形成受到以下因素的影響(1)脫乙酰殼多糖與pDNA之間的胺/磷酸鹽電荷比(+/-)；(2)脫乙酰殼多糖的支化程度；和(3)支化的類型。通常，當(dāng)支化程度增加時(shí)，要形成穩(wěn)定的復(fù)合物則需要較高的支化脫乙酰殼多糖與pDNA之間的胺/磷酸鹽電荷比(+/-)。結(jié)果，介導(dǎo)低基因表達(dá)的不穩(wěn)定復(fù)合物甚至可在經(jīng)40％三聚體AAM支化的脫乙酰殼多糖寡聚物具有高達(dá)60∶1(+/-)的電荷比時(shí)形成，而介導(dǎo)高基因表達(dá)的穩(wěn)定的pDNA-復(fù)合物在經(jīng)7％三聚體AAM支化的脫乙酰殼多糖寡聚物具有的電荷比為10∶1(+/-)時(shí)即可形成。
穩(wěn)定的復(fù)合物比不穩(wěn)定復(fù)合物產(chǎn)生較高的基因表達(dá)的事實(shí)與現(xiàn)有技術(shù)相符(Fischer等，1999；Gebhart和Kabanow，2001；Koping-Hoggard等，2001)。因此，在體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染方面，與較不穩(wěn)定的復(fù)合物相比，具有較高復(fù)合物穩(wěn)定性的制劑被認(rèn)為是有利的。
與未分支脫乙酰殼多糖相比，基于所述分支脫乙酰殼多糖的穩(wěn)定復(fù)合物獲得較高的熒光素酶基因表達(dá)。
已發(fā)現(xiàn)人胚胎腎細(xì)胞系293中介導(dǎo)基因表達(dá)的效率依賴于支化分支的結(jié)構(gòu)，具有以下幾個(gè)排列順序7％三聚體AAM＞6％葡萄糖＞5％乙醛＞未支化脫乙酰殼多糖寡聚物。
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，基于脫乙酰殼多糖的pDNA-復(fù)合物與基于合成性聚合物聚氮丙啶PEI的pDNA-復(fù)合物相比，已顯示出較慢的基因表達(dá)的啟動(dòng)，在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后在早期時(shí)間點(diǎn)上介導(dǎo)低的基因表達(dá)(Koping-Hoggard等，2001；Erbacher等，1998)。
令人驚訝的是，與基于未支化的脫乙酰殼多糖相比，基于經(jīng)7％三聚體AAM支化的某些脫乙酰殼多糖的pDNA-復(fù)合物在人胚胎腎細(xì)胞系293中獲得的基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)與PEI的類似。此外，在人肺上皮細(xì)胞系Calu-3中也獲得類似的基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)，但與使用PEI相比，使用經(jīng)7％三聚體AAM支化的脫乙酰殼多糖寡聚物獲得意想不到的高10倍的表達(dá)。
現(xiàn)有技術(shù)已描述含有偶聯(lián)于DNA復(fù)合劑的糖殘基的pDNA復(fù)合物在氣管上皮細(xì)胞中的增加的胞內(nèi)攝取和增強(qiáng)的胞內(nèi)阻塞(Kollen等，1996；Fajac等，1999；Kollen等，1999)。在細(xì)胞表面膜上特殊糖結(jié)合外源凝集素的存在以及細(xì)胞內(nèi)外源凝集素的存在可能對含有糖殘基的這些pDNA系統(tǒng)的增加的轉(zhuǎn)染效率負(fù)責(zé)。但是，在如具有糖殘基偶聯(lián)到其上的多賴氨酸的情況下，效率依賴于與另一試劑氯喹的共給予，該試劑不能像本發(fā)明組合物那樣容易地被相同的細(xì)胞靶定，或者由于其明顯的毒性而不能在體內(nèi)使用。在上述基于含有某些支鏈的脫乙酰殼多糖的pDNA-復(fù)合物的描述中，沒有同時(shí)給予過其他試劑。
適當(dāng)?shù)?，含有支鏈的所述脫乙酰殼多糖通過選擇未支化的FA為0-0.70、較佳0-.035、更佳0-0.10、最佳0-0.01的脫乙酰殼多糖而獲得。然后通過酸水解、酶水解或通過與硝酸反應(yīng)而降解所述脫乙酰殼多糖，得到聚合的重均聚合度(DPw)為2-2500、較佳為3-250、最佳為4-50的產(chǎn)物。任選地，可將降解的脫乙酰殼多糖進(jìn)行分級分離，如進(jìn)行凝膠過濾，以產(chǎn)生具有更窄的分子量分布的脫乙酰殼多糖。用于分支的特別有用的起始原料脫乙酰殼多糖是同一日提出申請的未授權(quán)挪威專利申請20022148中描述的哪些化合物，本文將該文獻(xiàn)納入作為參考。在涉及在羰基化合物(較佳是醛)和脫乙酰殼多糖的D-葡糖胺殘基上的氨基形成席夫堿的方法中對該脫乙酰殼多糖進(jìn)行分支化。分支反應(yīng)較佳在合適的還原劑如NaCNBH3的存在下進(jìn)行，以減少席夫堿。通常，通過控制羰基化合物和D-葡糖胺殘基間的比例來控制分支的程度。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述羰基化合物是乙醛，它在與所述脫乙酰殼多糖分支化后得到圖2所示的結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述羰基化合物是D-葡萄糖，它在與所示脫乙酰殼多糖分支化后得到圖3所示的結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明的又一實(shí)施例中，所述羰基化合物是通過與硝酸反應(yīng)而部分解聚而從脫乙酰殼多糖衍生得到的多糖或寡糖，從而獲得所需的平均DP，并在鏈末端存在反應(yīng)性醛2，5-脫水-D-甘露糖，如圖4所示(Tommeraas等，2002)。任選地，可將部分降解的殼多糖分級分離，如進(jìn)行凝膠過濾，獲得單分散性寡聚物(單DP)，如Tommeraas等(2002)所述。含有所述反應(yīng)性醛的這些寡聚物還可進(jìn)一步與任何脫乙酰殼多糖反應(yīng)，產(chǎn)生圖5所示類型的支鏈。
在本發(fā)明的又一實(shí)施例中，所述羰基化合物是經(jīng)酸或脫乙酰殼多糖酶(chitosanase)部分水解而從脫乙酰殼多糖衍生得到的多糖或寡糖，從而獲得所需的平均DP和正常的還原末端(Varum等，2001)。任選地，可將部分降解的殼多糖分級分離，如進(jìn)行凝膠過濾，獲得單分散性寡聚物(單DP)，如Tommeraas等(2001)所述。含有所述還原末端的這些寡聚物還可與任何脫乙酰殼多糖發(fā)生進(jìn)一步的反應(yīng)，如產(chǎn)生如Yalpani和Hall(1984)在關(guān)于寡糖的綜述中所述的支鏈。
應(yīng)理解的是，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員能夠制備用其他分子(如用于靶向特定組織和/或細(xì)胞的肽)和穩(wěn)定劑〔如聚乙二醇，(PEG)〕支化的脫乙酰殼多糖。
本發(fā)明組合物的核酸適當(dāng)?shù)睾芯幋a序列，當(dāng)該核酸被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)該編碼序列將表達(dá)其功能。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例，所述核酸選自RNA和DNA分子。這些RNA和DNA分子包括環(huán)狀的分子、線性分子或兩者的混合物。較佳的是，所述核酸包括質(zhì)粒DNA。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述核酸含有編碼生物學(xué)活性產(chǎn)品如具有治療、診斷、免疫或抗原活性的蛋白質(zhì)、多肽或肽的編碼序列。
本發(fā)明還涉及上述組合物，其中所述核酸含有編碼蛋白質(zhì)、酶、多肽抗原或多肽激素的編碼序列，或所述核酸含有起到反義分子如RNA或化學(xué)修飾RNA的作用的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明組合物的方法，其中該方法包括以下步驟提供上述支化脫乙酰殼多糖，(a)將所述支化脫乙酰殼多糖暴露于pH為3.5-8.0的水性溶劑中，(b)將步驟(a)所得的水性溶液與水性溶劑中的所述核酸混合，和(c)將步驟(b)中獲得的產(chǎn)品溶液脫水，得到體內(nèi)給藥前的高濃度的該組合物?？刹捎靡韵路绞綄?shí)現(xiàn)步驟(c)(1)將步驟(b)的產(chǎn)品溶液中的液體蒸發(fā)，獲得所需的濃度，或者(2)將步驟(b)的產(chǎn)物溶液凍干，接著重新配制以獲得所需的濃度。通常，步驟(b)中所述核酸的濃度為1ng/ml-300μg/ml，較佳是1μg/ml-100μg/ml，更佳是10-50μg/ml；步驟(c)(1)中所述核酸的濃度為10ng/ml-3000μg/ml，較佳為10μg/ml-1000μg/ml，更佳是100-500μg/ml。
應(yīng)理解，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員能以不同的胺/磷酸鹽電荷比形成本發(fā)明組合物，以包括各種負(fù)電荷比、中性電荷比或正電荷比。
本發(fā)明還涉及一種將本發(fā)明的組合物導(dǎo)入哺乳動(dòng)物從而向哺乳動(dòng)物給予核酸的方法。較佳的是，通過肺部、鼻、口腔、頰、舌下、直腸或陰道途徑經(jīng)粘膜組織給予所述組合物。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施例，通過腸胃外給予哺乳動(dòng)物所述組合物。
本發(fā)明還涉及上述組合物在制備用于哺乳動(dòng)物的預(yù)防性或治療性治療的藥劑中的用途，或者在制備用于體內(nèi)或體外診斷方法的診斷劑的用途。本發(fā)明尤其涉及所述組合物在制備用于基因治療、反義治療或遺傳接種以預(yù)防或治療惡性腫瘤、自身免疫疾病、遺傳病、致病性感染以及其他病理性疾病的藥劑中的用途。
實(shí)施例實(shí)施例1全長去N-乙?；撘阴ざ嗵?de-N-acetylated chitosan)的制備(FA＜0.01)通過非均一性堿去酰基化〔50％(w/w)NaOH溶液，4小時(shí)，100℃，在密封的玻璃容器中〕將市售獲得的FA為1.0的脫乙酰殼多糖(10g)進(jìn)一步去N-乙?；?。過濾該脫乙酰殼多糖，用2×150毫升的甲醇和1×150毫升的甲醚洗滌，之后室溫干燥，接著用0.2M NaCl和去離子水透析。1H NMR光譜顯示FA＜0.01。
實(shí)施例2全長去N-乙?；撘阴ざ嗵堑慕饩?DPn＝25)如Allan和Peyron(1989，1995a、b)所述用亞硝酸(17mg NaNO2)將脫乙酰殼多糖(FA＜0.01，500毫克，成HCl形式)解聚。接著使用NaBH4進(jìn)行常規(guī)的還原、透析和凍干。發(fā)現(xiàn)該脫乙酰殼多糖被全部還原，采用1H NMR和13C NMR光譜測得重均聚合度(DPn)為25。
實(shí)施例3具有反應(yīng)性還原端的N乙?；丫畚锏闹苽鋵⒚撘阴ざ嗵?FA-0.59，固有粘度[η]＝826毫升/克，500毫克，HCl形式)溶解在30毫升2.5％(v/v)乙酸中。將氮?dú)夤呐荽等朐撊芤褐?分鐘，除去溶解的氧。冷卻到4℃后，加入新鮮配制的NaNO2溶液(100mg)，使反應(yīng)在黑暗中、在4℃進(jìn)行12小時(shí)。離心產(chǎn)物(10分鐘，5000rpm)，過濾(8μm)，除去全長N-乙酰化寡聚物的不溶級分，然后凍干。
實(shí)施例4N-乙?；丫畚锏姆蛛x和他們的化學(xué)結(jié)構(gòu)的測定用Superdex 30(Pharmacia Biotech，Uppsala)包裹的、串聯(lián)的兩根2.5厘米×100厘米柱進(jìn)行凝膠過濾，分離出寡聚物(500毫克)，用0.15M、pH4.5的乙酸銨洗脫，流量為0.8毫升/分鐘。使用實(shí)時(shí)折光率(refraction index，RI)檢測器(Shimadzu RID-6A)監(jiān)測洗脫。收集4毫升的級分，合并，最后經(jīng)凍干獲得純化的寡聚物。
實(shí)施例5經(jīng)寡糖支化的全長去N-乙?；撘阴ざ嗵堑闹苽湓谙率龀绦蚝?，使用純化的三聚體對全長去-N乙?；撘阴ざ嗵?FA＜0.01，DPn＝25)進(jìn)行還原性N-烷基化使低分子量全長去N-乙?；撘阴ざ嗵?DPn＝25，20μmol的D單元)和全長N-乙酰化三聚體(A-A-M)(2.0，12，20和40μmol)在0.1M乙酸中的溶液與0.1M氯化鈉(5毫升，pH5.5，室溫)反應(yīng)4天。分別在第2和24小時(shí)將NaCNBH3(50毫克)加到反應(yīng)混合物中。反應(yīng)過程中的pH值從不超過6.5。透析除去未反應(yīng)的三聚體(A-A-M)，將支化脫乙酰殼多糖轉(zhuǎn)化成氯鹽，凍干，-20℃保存。
實(shí)施例6經(jīng)D-葡萄糖支化的全長去N-乙?；撘阴ざ嗵堑闹苽洳捎门c實(shí)施例5相同的方法，用D-葡萄糖還原性N-烷基化全長去N-乙?；撘阴ざ嗵?FA＜0.01，DPn＝25)，不同之處在于用D-葡萄糖(4.0μmol)代替三聚體(A-A-M)。
實(shí)施例7經(jīng)乙醛支化的全長去N-乙?；撘阴ざ嗵堑闹苽洳捎门c實(shí)施例5相同的方法用D-葡萄糖還原性N-烷基化全長去N-乙?；撘阴ざ嗵?FA＜0.01，DPn＝25)，不同之處在于用乙醛(4.0μmol)代替三聚體(A-A-M)。
實(shí)施例8含有支化的脫乙酰殼多糖與pDNA的組合物的配制根據(jù)實(shí)施例5-7所述的方法，分別制得經(jīng)6、10和20％乙醛和葡萄糖支化和經(jīng)7、23和40％三聚體AAM支化的脫乙酰殼多糖寡聚物和脫乙酰殼多糖寡聚物。從Aldevron(Fargo，ND，美國)購得熒光蟲熒光素酶質(zhì)粒DNA(pLuc)。在無菌蒸餾去離子水中配制陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物的原液(2mg/ml)，pH6.2±0.1，接著無菌過濾。先將陽離子寡聚物、接著將pLuc加到用渦流攪拌器(Heidolph REAX 2000，KEBO實(shí)驗(yàn)室，Spanga，Sweden)劇烈攪拌的無菌水中，以10∶1、30∶1和60∶1(+/-)的電荷比配制陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物與pLuc之間形成的復(fù)合物。pDNA的濃度保持在13.3μg/ml的恒定值。此外，用25kDa的PEI(Aldrich Sweden，Stockholm，Sweden)以先前優(yōu)化的電荷比5∶1(+/-)配制pLuc(Bragonzi等，2000；Koping-Hoggard等，2001)。
在瓊脂糖凝膠電泳中測試復(fù)合物的穩(wěn)定性。復(fù)合物的穩(wěn)定性高度依賴于支化的程度。以10％和20％的支化程度與乙醛和葡萄糖支化的脫乙酰殼多糖寡聚物沒有形成穩(wěn)定的復(fù)合物。在此試驗(yàn)中，與40％三聚體支化的脫乙酰殼多糖寡聚物也沒有形成穩(wěn)定的復(fù)合物。
圖7顯示表明在支化脫乙酰殼多糖寡聚物與pLuc之間形成穩(wěn)定的復(fù)合物的瓊脂糖凝膠延遲試驗(yàn)。未取代的脫乙酰殼多糖和經(jīng)7％三聚體AAM支化的脫乙酰殼多糖在10∶1(+/-)的電荷比就已與pDNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物。但是，分別用6％乙醛和葡萄糖支化的脫乙酰殼多糖寡聚物要形成穩(wěn)定的復(fù)合物則需要高達(dá)60∶1(+/-)的電荷比。
實(shí)施例9使用含有支化脫乙酰殼多糖和pDNA的制劑進(jìn)行的基因表達(dá)研究如實(shí)施例8所述制備由支化脫乙酰殼多糖寡聚物與pLuc形成的復(fù)合物。在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將人腎上皮細(xì)胞系293(ATCC，Rockville，MD，美國)以70％鋪滿接種在96孔組織培養(yǎng)平板上(Costar，Cambridge，UK)。以100000個(gè)細(xì)胞/平方厘米的密度將人肺上皮細(xì)胞Calu-3接種在96孔組織培養(yǎng)平板(Costar)上，培養(yǎng)14天，在轉(zhuǎn)染前獲得分化的細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前，清洗細(xì)胞，然后每孔加入50微升(相當(dāng)于0.33微克的pLuc)的復(fù)合物制劑。培養(yǎng)5小時(shí)后，除去該制劑，加入0.2毫升新鮮的培養(yǎng)基。試驗(yàn)時(shí)間超過兩天的，每兩天換一次培養(yǎng)基。在指定的時(shí)間點(diǎn)上，用PBS(pH7.4)清洗細(xì)胞，用裂解緩沖液(Promega，Madison，WI)裂解，用照明計(jì)(Mediators PhL，Vienna，Austria)測量熒光素酶基因表達(dá)。根據(jù)螢火蟲熒光素酶(Sigma，St.Louise，MO)制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定表達(dá)的熒光素酶的量。采用BCA試驗(yàn)(Pierce，Rockford，IL)分析各樣品中的總蛋白含量，并使用BSA(牛血清清蛋白)作為參比蛋白進(jìn)行定量。在微平板讀數(shù)器(Multiscan MCC/340，Labsystem Oy，Helsinki，F(xiàn)inland)上測量540納米波長的吸光度。用平均值±一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)值計(jì)算熒光素酶基因表達(dá)(皮克熒光素酶/微克總細(xì)胞蛋白)，n＝3-6。
圖8顯示用支化脫乙酰殼多糖寡聚物與pLuc形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)染293細(xì)胞72小時(shí)后該細(xì)胞中支化分子對熒光素酶基因表達(dá)的影響。轉(zhuǎn)染效率的順序依次為7％三聚體AAM＞6％葡萄糖＞6％乙醛＞未支化的脫乙酰殼多糖寡聚物。
圖9顯示用三聚體支化脫乙酰殼多糖寡聚物與pLuc之間形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)染(A)293細(xì)胞和(B)Calu-3細(xì)胞72小時(shí)后，三聚體支化的程度對熒光素酶基因表達(dá)的影響。在293細(xì)胞中，效率的順序依次為PEI≈7％三聚體＞23％三聚體＞未支化脫乙酰殼多糖寡聚物＞40％三聚體。令人驚訝的是，在Calu-3細(xì)胞中獲得另一順序的效率7％三聚體＞23％三聚體＞PEI＞未支化的脫乙酰殼多糖寡聚物＞40％三聚體。使用40％支化程度的寡聚物所獲得的低轉(zhuǎn)染效率可解釋為在此高程度的支化下形成的復(fù)合物不穩(wěn)定。
圖10顯示用經(jīng)7％三聚體AAM支化的脫乙酰殼多糖寡聚物轉(zhuǎn)染后，(A)293細(xì)胞和(B)Calu-3細(xì)胞中熒光素酶基因表達(dá)的時(shí)間-過程研究。令人驚訝的是，在293細(xì)胞系中，與PEI相比，觀察到基于經(jīng)7％三聚體AAM支化的脫乙酰殼多糖的pLuc復(fù)合物快速啟動(dòng)基因表達(dá)。此外，在Calu-3細(xì)胞系中，經(jīng)7％三聚體AAM支化的脫乙酰殼多糖寡聚物獲得的熒光素酶基因表達(dá)是PEI的10倍。
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權(quán)利要求
1.一種組合物，它含有a)核酸；和b)含有共價(jià)連接于其氨基的支鏈基的脫乙酰殼多糖，其中所述支鏈選白以下基團(tuán)具有2個(gè)或多個(gè)碳原子的烷基、單糖、寡糖或多糖。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述脫乙酰殼多糖的N-乙?；?D-葡糖胺殘基的分?jǐn)?shù)(FA)為0-0.70、較佳為0-0.35、更佳為0-0.10、最佳為0-0.01。
3.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于，所述脫乙酰殼多糖的重均聚合度(DPw)是2-2500、較佳是3-250、更佳是4-50。
4.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述脫乙酰殼多糖的1-60％、較佳2-40％、最佳3-20％的D葡糖胺殘基攜帶支鏈基。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述支鏈在所述氨基與羰基化合物支鏈基之間形成席夫堿的反應(yīng)中獲得，該反應(yīng)如下 式中N代表連接于脫乙酰殼多糖的葡糖胺殘基的C-2的N原子；R1和R2各自獨(dú)立表示氫原子，或R1表示氫原子、R2表示任選取代的直鏈或支鏈飽和或未飽和的至多達(dá)10個(gè)碳原子的烴基，或者R1和R2各自獨(dú)立表示任選取代的直鏈或支鏈飽和或未飽和的具有達(dá)10個(gè)碳原子的烴基；或者該羰基化合物表示單糖、寡糖或多糖；有可能的是，該席夫堿產(chǎn)物被還原，得到下式化合物
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述羰基化合物是乙醛，其中R1代表氫原子，R2代表乙基。
7.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述羰基化合物是單糖D-葡萄糖。
8.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述羰基化合物是由1→4連接的D-葡糖胺殘基與在還原端的2，5-脫水-D-甘露糖組成的寡聚物，具有下式 式中n表示非末端殘基的數(shù)目，為0-100、較佳0-10、最佳0-3，此寡聚物的FA任選在0-0.5的范圍內(nèi)。
9.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述羰基化合物是由1→4連接的N-乙?；?D-葡糖胺殘基與在還原端的2，5-脫水-D甘露糖形成的寡糖，具有下式 式中n表示非末端殘基的數(shù)目，為0-100、較佳0-10、最佳0-3。
10.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述羰基化合物是由1→4連接的N-乙?；?D-葡糖胺殘基與N-乙?；?D-葡糖胺形成的寡聚物，具有下式 其中H，OH代表還原端的α-或β-端基異構(gòu)體，中n表示非末端殘基的數(shù)目，為0-100、較佳0-10、最佳0-3。
11.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述羰基化合物是由1→4連接的D-葡糖胺形成的寡聚物，具有下式 其中，H，OH代表還原端的α-或β-端基異構(gòu)體，中n表示非末端殘基的數(shù)目，為0-100、較佳0-10、最佳0-3，此寡聚物的FA任選在0-0.5的范圍內(nèi)。
12.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物基本上具有凈正電荷比。
13.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物的pH為3.5-8.0。
14.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述核酸包括編碼序列，在所述核酸被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)該編碼序列將表達(dá)其功能。
15.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述核酸選自DNA和RNA分子。
16.一種制備前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)將權(quán)利要求1(b)所述的支化脫乙酰殼多糖暴露于水性溶劑中；(b)將步驟(a)所得的水性溶液與水性溶劑中的所述核酸混合；和(c)減少步驟(b)所獲得的產(chǎn)物溶液的體積，獲得所需的組合物濃度。
17.一種向哺乳動(dòng)物給予核酸的方法，其特征在于，使用前述任一項(xiàng)所述的組合物，將其導(dǎo)入所述哺乳動(dòng)物中。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，通過肺部、鼻、口腔、頰、舌下、直腸和陰道途徑向粘膜組織引入從而向哺乳動(dòng)物給予所述組合物。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，通過腸胃外途徑，即靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或心臟內(nèi)給藥向粘膜下組織，或者通過內(nèi)部器官、血管或手術(shù)中暴露的其他機(jī)體表面或腔室給予哺乳動(dòng)物所述組合物。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物使得所述核酸能在所述哺乳動(dòng)物中發(fā)揮其功能。
21.權(quán)利要求1-15所述的組合物作為哺乳動(dòng)物預(yù)防性或治療性藥劑的用途。
22.權(quán)利要求21所述的組合物在惡性腫瘤、自身免疫疾病、遺傳病、致病性感染以及其他病理性疾病的基因治療、反義治療或遺傳接種以進(jìn)行預(yù)防性或治療性治療中的用途。
23.權(quán)利要求1-15所述的組合物作為體外或體內(nèi)診斷劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新穎的組合物，它含有核酸和含有共價(jià)連接于其氨基的支鏈基的脫乙酰殼多糖，其中所述支鏈選自具有2個(gè)或更多個(gè)碳原子的烷基、單糖、寡糖或多糖。該組合物特別可用作非病毒類基因送遞系統(tǒng)。該組合物促進(jìn)核酸導(dǎo)入它所給予的細(xì)胞中，并促進(jìn)該核酸的功能的表達(dá)。
文檔編號A61K47/36GK1655826SQ03812348
公開日2005年8月17日 申請日期2003年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月3日
發(fā)明者P·阿爾圖松, B·E·克里斯頓森, M·科平-霍格德, K·托默森, K·M·瓦姆 申請人:Fmc生物聚合物聯(lián)合股份有限公司