專利名稱：Hiv抑制蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及HIV融合抑制劑和白蛋白融合蛋白的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
背景2001年末，在美國(guó)和加拿大估計(jì)有940,000名成人和兒童患有HIV/AIDS。該區(qū)的成人患病率是0.6％，其中婦女占HIV-陽性成人的20％。在2001年間，在該區(qū)有45,000名成人和兒童新近感染了HIV(UNAIDS AIDS Epidemic Update，2001年11月)。
近幾年，在發(fā)展抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療人免疫缺陷病毒(HIV)中取得了顯著的進(jìn)展，主要是通過干擾病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程和成熟來靶向病毒復(fù)制。然而需要新的藥物種類克服藥物耐受性和毒性作用，潛在的病毒儲(chǔ)備(reservoirs)，以及抗藥性的問題。需要更安全的治療和改進(jìn)的定量給藥方案以促進(jìn)更好的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療依從性。這些治療必須有可接受的風(fēng)險(xiǎn)/收益比例，并應(yīng)該能夠和其他抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療同時(shí)使用。發(fā)展藥物的一種有希望的方法就是干擾HIV的進(jìn)入。
HIV-1的包膜糖蛋白產(chǎn)生為gp160前體，該蛋白包埋于病毒顆粒核心周圍的膜雙層結(jié)構(gòu)中。所述糖蛋白的160kDa重量的近50％由N連接的碳水化合物組成。Env在合成非共價(jià)結(jié)合的外部(exterior)gp120亞單位和跨膜gp41亞單位的過程中發(fā)生蛋白水解而裂解。所述gp120亞單位在與細(xì)胞受體的附著中起作用，并且與其受體結(jié)合時(shí)其構(gòu)象會(huì)改變。gp120中的構(gòu)象改變導(dǎo)致gp41的融合肽的暴露，它是氨基酸的疏水部分，直接介導(dǎo)膜融合。激發(fā)后，gp41經(jīng)過巨大的構(gòu)象改變，其中兩條α螺旋形成卷曲的螺旋結(jié)構(gòu)(coiled coils)，該結(jié)構(gòu)可幫助插入融合肽并形成融合孔(fusion pore)。通過使用模擬這些螺旋的肽或用結(jié)合關(guān)鍵螺旋結(jié)構(gòu)的小分子干擾這些構(gòu)象改變被證明是有效抑制病毒進(jìn)入其靶細(xì)胞的方法。(綜述見Chan DC和Kim PS(1998)Cell 93681-684；Doranz BJ(2000)Emerging Therapeutic Targets 4423-437；LaBranche CC(2001)AntiviralResearch 5095-115)。Env以gpl20/gp41亞單位的三聚體形式到達(dá)細(xì)胞表面，并通過形成病毒膜和細(xì)胞膜之間的孔促進(jìn)融合。
T-20也稱DP-178，是保守的36個(gè)氨基酸的肽，來自gp41的C肽。它和前發(fā)夾結(jié)構(gòu)中間體結(jié)合，并抑制gp41中進(jìn)一步的構(gòu)象改變，從而阻斷病毒進(jìn)入其靶細(xì)胞中(Wild CT等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.919770-9774)。已顯示T-20對(duì)HIV-1的多種分化株(clades)具有活性，然而，它不抑制HIV-2或SIV。在低納摩爾范圍內(nèi)(0.2-2nM)的T-20在細(xì)胞-細(xì)胞融合試驗(yàn)中顯示抗病毒活性。T-20對(duì)應(yīng)于HIV-1 gp41蛋白的氨基酸(aa)638到673(36 aa)。
T-1249是與T-20的設(shè)計(jì)相似的另一種融合抑制劑，但它對(duì)HIV-1，HIV-2，和SIV有活性，并包含增強(qiáng)子序列(US 6,258,782)。該增強(qiáng)子序列源自gp41，并據(jù)稱可改善其附著的任何多肽的藥代動(dòng)力學(xué)特性。T-1249的長(zhǎng)度為39個(gè)氨基酸，與T-20部分同源，但具有氨基酸交換和額外的gp41氨基酸序列，并具有治療T-20抗性病毒的能力。此外，T-1249在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的半衰期比T-20長(zhǎng)(AUC延長(zhǎng)兩倍)，從而可每日一次定量給藥(once-daily dosing)。
5-螺旋(5-Helix)來自HIV-1的gp41中的氨基酸位置558到678，所含6個(gè)螺旋中的5個(gè)(三個(gè)N-和兩個(gè)C-螺旋)形成gp41發(fā)夾三聚體結(jié)構(gòu)的核心，所述結(jié)構(gòu)由短肽接頭連接。第三個(gè)C多肽的缺口形成與gp41的羧基末端區(qū)結(jié)合的位點(diǎn)。如果在形成發(fā)夾三聚體之前能夠接近(至少是瞬間地)該區(qū)，預(yù)期5-螺旋的結(jié)合能夠防止與融合事件相關(guān)的構(gòu)象改變，從而防止細(xì)胞受到感染(Root MJ(2001)Science 291884-888)。
5-螺旋是通過細(xì)菌表達(dá)產(chǎn)生的，并且在體外的生理?xiàng)l件下是穩(wěn)定的，病毒感染性和細(xì)胞-細(xì)胞融合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)顯示可有力地抑制納摩爾范圍的HIV-1膜融合。由此可推論，C-肽的結(jié)合是5-螺旋的抗病毒活性的關(guān)鍵決定因素。5-螺旋可抑制HIV-1的A，B和D型分化株的分離物(isolates)的感染，證實(shí)了gp41發(fā)夾三聚體內(nèi)N和C末端區(qū)之間的保守界面。
Cyanovirin-N是一種自Nostoc ellipsosporum分離的小蛋白，它與gpl20上的糖結(jié)構(gòu)結(jié)合(Boyd等(1997)Antimicrob.Agents Chemother.411521-1530；Gustafson等(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.238223-228)。
已對(duì)T-20和T-1249進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。對(duì)于T-20，采用的常用劑量為50mg，每天兩次。測(cè)定的血漿半衰期約為1.8小時(shí)。靈長(zhǎng)類動(dòng)物中T-1249的半衰期比T-20長(zhǎng)(AUC增加了兩倍)。
長(zhǎng)期和短期使用HAART的預(yù)期持續(xù)時(shí)間和由于抗藥性造成治療失敗的增加表明，的確需要包括進(jìn)入(entry)抑制劑在內(nèi)的多種創(chuàng)新性抗逆轉(zhuǎn)錄治療。HIV融合抑制劑，例如T-20和T-1249，提供了除傳統(tǒng)的蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑以外的新的治療原則。白蛋白融合技術(shù)如果能夠顯著延長(zhǎng)血漿半衰期和生物利用度，可每周給藥一次并顯著增加腸外HIV藥物作為一線治療的可接受性。例如T-20和T-1249白蛋白融合物的產(chǎn)品，由于其改善了副作用的情況可以改善某些病人對(duì)治療方案的耐受性。諸如T-20和T-1249的肽是疏水性的，它們與白蛋白融合改善了其可溶性，從而也提高了生物利用度并可配成更高濃度的配制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)，它包含HIV融合抑制肽(包括，但不限于，與HIV env蛋白結(jié)合的肽或者來自HIV env蛋白的肽)，所述肽與白蛋白或其片段或變體融合。在本發(fā)明中這些融合蛋白統(tǒng)稱“本發(fā)明的蛋白融合蛋白”。本發(fā)明的這些融合蛋白顯示延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期和/或延長(zhǎng)的活性或治療活性。
本發(fā)明包括治療性白蛋白融合蛋白，組合物，藥物組合物，配制劑和試劑盒。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的核酸分子，以及包含這些核酸分子的載體，用這些核酸分子和載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及利用這些核酸，載體和/或宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的方法。
本發(fā)明還涉及抑制HIV誘導(dǎo)的細(xì)胞融合的組合物和方法。本發(fā)明還涉及抑制HIV傳染到未被感染的細(xì)胞和用于預(yù)防和/或治療HIV相關(guān)疾病的組合物和方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.N-末端T-1249-(GGS)4GG-白蛋白融合物(fusion)開放閱讀框架的DNA序列。(該DNA序列編碼初級(jí)(primary)翻譯產(chǎn)物并因此，最開始的72個(gè)核苷酸編碼24個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列，在本發(fā)明的實(shí)施例中，該序列在酵母菌的分泌過程中被去除)。
圖2.N-末端T-1249-(GGS)4GG-白蛋白融合蛋白的氨基酸序列。(該氨基酸序列代表圖1顯示的DNA序列的初級(jí)翻譯產(chǎn)物，并因此包含在酵母菌分泌過程中被去除的24個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列。因此，該蛋白序列不代表用于本發(fā)明的病毒抑制實(shí)施例中的蛋白序列)。
圖3.C-末端白蛋白-(GGS)4GG-T-1249融合物開放閱讀框架的DNA序列。(該DNA編碼初級(jí)翻譯產(chǎn)物，并因此最開始的72個(gè)核苷酸編碼一個(gè)24個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列，在本發(fā)明的實(shí)施例中，該序列在自酵母菌的分泌中被去除)。
圖4.C-末端白蛋白-(GGS)4GG-T-1249融合蛋白的氨基酸序列。(該氨基酸序列代表圖3顯示的DNA序列的初級(jí)翻譯產(chǎn)物，并因此包含在酵母分泌中被去除的24個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列。因此，該蛋白序列不代表用于本發(fā)明的病毒抑制實(shí)施例中的蛋白序列)。
圖5.N-末端T-20-(GGS)4GG-白蛋白融合物開放閱讀框架的DNA序列。(該DNA編碼初級(jí)翻譯產(chǎn)物，并因此最開始的72個(gè)核苷酸編碼一個(gè)24個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列，在本發(fā)明的實(shí)施例中，該序列在自酵母菌的分泌中被去除)。
圖6.N-末端T-20-(GGS)4GG-白蛋白融合蛋白的氨基酸序列。(該氨基酸序列代表圖5顯示的DNA序列的初級(jí)翻譯產(chǎn)物，并因此包含在酵母菌分泌過程中被去除的24個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列。因此，該蛋白序列不代表用于本發(fā)明的病毒抑制實(shí)施例中的蛋白序列)。
圖7.C-末端白蛋白-(GGS)4GG-T-20融合物開放閱讀框架的DNA序列。(該DNA編碼初級(jí)翻譯產(chǎn)物，并因此最開始的72核苷酸編碼一個(gè)24個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列，在本發(fā)明的實(shí)施例中，該序列在自酵母菌的分泌中被去除)。
圖8.C-末端白蛋白-(GGS)4GG-T-20融合蛋白的氨基酸序列。(該氨基酸序列代表圖7顯示的DNA序列的初級(jí)翻譯產(chǎn)物，并因此包含在酵母菌分泌過程中被去除的24個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列。因此，該蛋白序列不代表用于本發(fā)明的病毒抑制實(shí)施例中的蛋白序列)。
圖9.使用4-12％的梯度SDS非還原膠對(duì)T-20白蛋白融合物進(jìn)行電泳(A)膠體藍(lán)(Colloidal Blue)膠體；(B)抗-HSA Western蛋白印跡。
圖10.細(xì)胞-細(xì)胞融合試驗(yàn)中T-20白蛋白融合物的抗病毒活性，所述活性有賴于在pmt1基因缺陷的酵母菌菌株中的表達(dá)。PMT1，野生型；pmt1，缺陷型。
圖11.使用4-12％的梯度SDS非還原膠對(duì)C末端T-1249白蛋白融合物進(jìn)行電泳(A)膠體藍(lán)膠體；(B)抗-HSA Western蛋白印跡圖12.C-末端T-1249白蛋白融合蛋白的抗病毒活性。
圖13.C-末端T-20白蛋白融合蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果。
圖14(A-D)成熟形式的人白蛋白(SEQ ID NO18)的氨基酸序列和編碼它的多核苷酸(SEQ ID NO17)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種融合蛋白，它包含與HIV融合抑制肽偶聯(lián)的白蛋白。這類肽包括，但不限于，與HIV env蛋白結(jié)合的肽或來源于HIV env蛋白的肽，包括與HIV gp41結(jié)合的肽或來源于HIV gp41的肽。這些肽包括T-20，T-1249，5-螺旋或cyanovirin-N，或其片段或其變體，所述肽都具有HIV融合抑制特性。
本文術(shù)語“蛋白”和“肽”是非限制性的并且包括蛋白和多肽以及肽。
本發(fā)明還涉及雙功能(或多功能)融合蛋白，其中的白蛋白與兩種(或多種)HIV融合抑制肽偶聯(lián)，所述的HIV融合抑制肽可選地為不同的HIV融合抑制肽。與只包含一種類型的HIV融合抑制肽的白蛋白融合蛋白相比，預(yù)期這類具有不同的HIV融合抑制肽的雙功能(或多功能)融合蛋白具有改善的抗藥性情況，這是由于抗藥性突變HIV菌株的產(chǎn)生可能被顯著推遲。與只包含一種類型的HIV融合抑制肽的白蛋白融合蛋白相比，這種雙功能(或多功能)融合蛋白也可以顯示協(xié)同的抗-HIV效果(盡管注意到5-螺旋和C-肽顯示互相拮抗)。
本發(fā)明還涉及一種融合蛋白，其中一種(或多種)HIV融合抑制肽或其片段或其變體與兩種白蛋白分子或其片段或其變體偶聯(lián)，所述HIV融合抑制肽可選為不同的HIV融合抑制肽，所述白蛋白分子可以是相同的或不同的。
此外，化學(xué)成分(Chemical entity)可以通過共價(jià)的方式附著于本發(fā)明的融合蛋白上，或聯(lián)合使用所述化學(xué)成分與本發(fā)明的融合蛋白，以增強(qiáng)生物活性或調(diào)節(jié)生物活性。
預(yù)期本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可延長(zhǎng)HIV融合抑制肽的體內(nèi)半衰期。延長(zhǎng)所述白蛋白融合肽的體外或體內(nèi)半衰期到超過未連接白蛋白的肽的半衰期的2倍，5倍或更多倍。此外，至少部分由于所述肽半衰期的延長(zhǎng)，預(yù)期本發(fā)明的白蛋白融合蛋白會(huì)降低定量給藥該治療性肽的頻率。所述定量給藥頻率比未連接白蛋白的治療性肽的定量給藥頻率減少了至少四分之一，或減少了至少二分之一或更多。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白在體內(nèi)和/或體外延長(zhǎng)肽的半衰期，和/或穩(wěn)定該肽和/或其在溶液中(或在藥物組合物中)的活性。這些白蛋白融合蛋白可以作為治療劑，預(yù)期可減小使用大量過量載體蛋白(例如白蛋白，非融合的)來配置蛋白溶液的需要，從而防止由于例如非特異性結(jié)合等的因素而丟失蛋白。
本發(fā)明還包括編碼該白蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有這些核酸的載體，由這些核酸載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及使用這些核酸，載體和/或宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的方法。本發(fā)明進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)基因有機(jī)體，這些有機(jī)體經(jīng)修飾從而包含本發(fā)明的核酸分子，可選地經(jīng)修飾可表達(dá)由所述核酸分子編碼的白蛋白融合蛋白。
本發(fā)明還包含一種藥物配制劑，該配制劑包含本發(fā)明的白蛋白融合蛋白和可藥用的稀釋劑或載體。這種配制劑可以在試劑盒或容器中。這樣的試劑盒或容器可以和如何延長(zhǎng)蛋白的半衰期的說明書包裝在一起。這種配制劑可用于預(yù)防，治療，改善或診斷例如哺乳動(dòng)物或人的患者體內(nèi)的HIV感染或HIV相關(guān)疾病，疾病的癥狀或相關(guān)的疾病，該方法包括將藥物配制劑給藥患者的步驟。
本發(fā)明進(jìn)一步包含有效最小化與用適度較高濃度的HIV融合抑制肽治療哺乳動(dòng)物相關(guān)的副作用(例如注射位點(diǎn)反應(yīng)，頭痛，惡心，發(fā)熱，能量水平增加，皮疹，衰弱，腹瀉，眩暈，過敏性反應(yīng)，中性粒細(xì)胞水平異常降低)的方法，所述方法包括將本發(fā)明的白蛋白融合HIV融合抑制肽給藥所述哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明包含預(yù)防，治療或改善HIV感染和/或由于HIV感染造成的疾病或病癥的方法，包括將包含HIV融合抑制肽(或其片段或其變體)的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白以能有效治療，預(yù)防或緩解所述疾病或病癥的量給藥哺乳動(dòng)物，在該動(dòng)物中這種預(yù)防，治療，或者改善是其所需要的。在本發(fā)明中，諸如T-20和/或T1249等的HIV融合抑制肽也被稱作“治療性蛋白”。
本發(fā)明包括的白蛋白融合蛋白含有T-20和/或T-1249肽或T-20和/或T-1249的單體(包括其片段或其變體)的多重拷貝，它們與白蛋白或白蛋白(包括其片段或其變體)的多重拷貝融合。
本發(fā)明還包括延長(zhǎng)哺乳動(dòng)物體內(nèi)HIV T-20和/或T-1249肽的半衰期的方法。所述方法將HIV T-20和/或T-1249肽與白蛋白連接，形成白蛋白融合的HIV T-20和/或T-1249肽，并將該白蛋白融合的HIV T-20和/或T-1249肽給藥哺乳動(dòng)物。具體地，所述白蛋白融合的HIV T-20和/或T-1249肽的半衰期可被延長(zhǎng)到超過缺乏該連接的白蛋白的HIV T-20和/或T-1249肽的半衰期的至少2倍，5倍，10倍，20倍，30倍，40倍或至少50倍。
本文舉例說明的是顯示抗病毒活性的融合蛋白，它包含與T-20和/或T-1249融合的白蛋白。這樣的抗病毒活性包括，但不限于，抑制HIV傳染到未被感染的CD-4+細(xì)胞。此外，本發(fā)明還涉及使用這種包含與T-20和/或T-1249融合的白蛋白的融合蛋白抑制人或非人逆轉(zhuǎn)錄病毒，尤其是HIV傳染到未被感染的細(xì)胞的抑制劑。
本發(fā)明還包括與現(xiàn)有技術(shù)相比的改良的生產(chǎn)治療性成分(therapeuticmoiety)的方法。例如，本發(fā)明提供了與現(xiàn)有技術(shù)中復(fù)雜的化學(xué)合成方法相比增強(qiáng)的生產(chǎn)具有活性成分T-20或T-1249的蛋白的方法。(見，例如SCRIPMagazine，September2002，7-10頁和WO 99/48513″Methods and Compositionsfor Peptide Synthesis″)。
下文詳細(xì)討論了本發(fā)明的各方面。
T-20T-20(也稱為DP-178)是一種肽，其氨基酸序列為YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO1)，相應(yīng)于HIV-1LAI分離株(isolate)的跨膜蛋白gp41的氨基酸殘基638到673。用于本發(fā)明的T-20肽包括其片段或其變體，例如可以是天然存在的HIV T-20肽的任何類似物，同源物，片段或衍生物的分子，例如美國(guó)專利6,133,418和WO 94/28920所述的以及表1列出的對(duì)比文件中的那些分子，上述對(duì)比文件的具體內(nèi)容包含在此作為參考。用于本發(fā)明的HIV T-20肽只需具有SEQ ID NO1的HIVT-20肽的單一生物活性。
用于本發(fā)明的T-20肽顯示抗病毒活性，并可以進(jìn)一步具有其它有利特征，例如增加的生物利用度，和/或穩(wěn)定性，或降低的宿主免疫識(shí)別。
當(dāng)T-20(或其片段或其變體)在能夠進(jìn)行O-糖基化的酵母菌中表達(dá)時(shí)，任何絲氨酸或蘇氨酸都可被修飾，或降低其數(shù)量以最小化O-糖基化的效應(yīng)或降低T-20(或其片段或其變體)的生物活性?？蛇x地，或此外，可使用糖基化不足(underglycosylates)(即O-糖基化缺陷)的酵母菌。
T-1249T-1249的氨基酸序列是WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO2)。見例如美國(guó)專利6,258,782和WO 99/59615。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可以鑒定用于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的T-1249活性片段及其變體，包括在專利文件和表1中列出的對(duì)比文件中描述的那些技術(shù)，所述對(duì)比文件包含在文中作為參考。
5-螺旋5-螺旋是一種設(shè)計(jì)的蛋白，其中用短的Gly/Ser肽序列交替連接(N-C-N-C-N)三個(gè)N-肽片段(N40)和兩個(gè)C-肽片段(C38)。以單字母氨基酸密碼表示的各部分的序列是N40，QLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILA(SEQ ID NO3)；C38，HTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQ-NQQEKNEQELLE(SEQ ID NO4)；N至C接頭，GGSGG(SEQ ID NO5)；和C至N接頭，GSSGG(SEQ IDNO6)(Root等)。用專利文件和表1中列出的對(duì)比文件中描述的技術(shù)可鑒定用于本發(fā)明白蛋白融合蛋白的5-螺旋的活性片段及其變體，所述對(duì)比文件包含在文中作為參考。
Cvanovirin-NCyanovirin-N的氨基酸序列是LGKFSQTCYNSAIQGSVLTSTCERTNGGYNTSSIDLNSVIENVDGSLKWQPSNFIE TCRNTQLAGSSELAAECKTRAQQFVSTKINLDDHIANIDGTLKYE(SEQ ID NO7)(Gustafson等)。用專利文件和表1中列出的對(duì)比文件中描述的技術(shù)可鑒定用于本發(fā)明白蛋白融合蛋白的Cyanovirin-N的活性片段及其變體，所述對(duì)比文件包含在文中作為參考。
白蛋白術(shù)語人血清白蛋白(HAS)和人白蛋白(HA)在本文中可互換使用。術(shù)語“白蛋白”和“血清白蛋白”更廣泛，并包含人血清白蛋白(及其片段和變體)以及來自其它物種的白蛋白(及其片段和變體)。
本文中的“白蛋白”指為白蛋白的蛋白(albumin protein)或氨基酸序列，或具有一種或多種白蛋白功能活性(例如生物活性)的白蛋白片段或變體的統(tǒng)稱。具體地，“白蛋白”指人白蛋白或其片段(見EP201 239，EP 322 094 WO97/24445，WO95/23857)，具體為圖14和本文的SEQ ID NO18中，圖15和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355,547中的SEQ ID NO18和WO01/79480中顯示的成熟形式的人白蛋白，或者來自其它脊椎動(dòng)物的白蛋白或其片段，或者這些分子的類似物或其變體或其片段。
用于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的人血清白蛋白含有以下一組或兩組點(diǎn)突變SEQ ID NO18Leu-407到Ala，Leu-408到Val，Val-409到Ala，和Arg-410到Ala的點(diǎn)突變；或Arg-410到Ala，Lys-413到Gln，和Lys-414到Gln的點(diǎn)突變(見例如，國(guó)際公開WO95/23857，包含于文中作為參考)。在其他實(shí)施方案中，包含一組或所有兩組上述點(diǎn)突變的本發(fā)明的白蛋白具有改進(jìn)的對(duì)酵母菌Yap3p的蛋白裂解的穩(wěn)定性/抵抗力，使得酵母菌宿主細(xì)胞表達(dá)的重組白蛋白融合蛋白的產(chǎn)生增加。
文中足以延長(zhǎng)治療性蛋白的體內(nèi)半衰期，治療活性，或保質(zhì)期(shelf-life)的白蛋白的一部分指如下的一部分它的長(zhǎng)度或結(jié)構(gòu)足以使得與非融合狀態(tài)的治療性蛋白的體內(nèi)半衰期，治療活性或保質(zhì)期相比，所述白蛋白融合蛋白的治療蛋白部分的體內(nèi)半衰期，治療活性或保質(zhì)期得以穩(wěn)定，延時(shí)(prolong)或延長(zhǎng)(extend)。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以包含上述HA序列的全長(zhǎng)，或者可以包括HA序列的一個(gè)或多個(gè)片段，所述片段能夠穩(wěn)定或延長(zhǎng)該蛋白的治療活性。這種片段的長(zhǎng)度可以是10個(gè)或更多個(gè)氨基酸，或者可以包括來自HA序列的約15，20，25，30，50或更多個(gè)連續(xù)的氨基酸，或者可以包括HA的部分或所有特定結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以是正常HA的變體。本發(fā)明白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分也可以是本文所述治療性蛋白的變體。術(shù)語“變體”包括保守或非保守的插入，缺失和取代，其中這些變化基本上不改變白蛋白的一種或多種抗腫瘤(oncotic)特性，有用的配體結(jié)合特性和非免疫源特性，或者基本上不改變賦予所述治療性蛋白的治療活性的活性位點(diǎn)或活性結(jié)構(gòu)域。
具體地，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可以包括人白蛋白天然存在的多態(tài)性變體，和人白蛋白的片段，例如EP 322 094公開的那些片段(即HA(Pn)，其中n是369到419)。所述白蛋白可以來自任何脊椎動(dòng)物，特別是任何哺乳動(dòng)物，例如人，母牛，綿羊或豬。非哺乳動(dòng)物白蛋白包括，但不限于，母雞和鮭魚。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分與治療性蛋白部分可能來自不同的動(dòng)物。
通常，HA片段或變體的長(zhǎng)度至少為100個(gè)氨基酸，可選至少長(zhǎng)150個(gè)氨基酸。所述HA變體可能由至少一個(gè)完整的HA結(jié)構(gòu)域組成或可選地包含至少一個(gè)完整的HA結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域例如結(jié)構(gòu)域1(SEQ ID NO18的氨基酸1-194)，2(SEQ ID NO18的氨基酸195-387)，3(SEQ ID NO18的氨基酸388-585)，1+2(SEQ ID NO18的1-387)，2+3(SEQ IDN018的195-585)或1+3(SEQ ID NO18的氨基酸1-194+SEQ ID NO18的氨基酸388-585)。每個(gè)結(jié)構(gòu)域本身由兩個(gè)同源的亞結(jié)構(gòu)域組成，即1-105，120-194，195-291，316-387，388-491和512-585，所述亞結(jié)構(gòu)域之間具有可彎曲的亞結(jié)構(gòu)域間接頭區(qū)，所述接頭區(qū)包括殘基Lys106到Glu119，Glu292到Val315和Glu492到Ala511。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以包括至少一個(gè)HA的亞結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域或其保守性修飾物。如果融合是基于亞結(jié)構(gòu)域的，一些或所有相鄰的接頭都可選地用來連接所述治療性蛋白部分。
白蛋白融合蛋白本發(fā)明總體上涉及白蛋白融合蛋白以及治療，預(yù)防，或改善疾病或病癥的方法。本文的“白蛋白融合蛋白”指通過至少一個(gè)白蛋白分子(或其片段或其變體)與至少一個(gè)治療性蛋白分子(或其片段或其變體)的融合形成的蛋白。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白包括至少一種治療性蛋白的片段或變體以及至少一種人血清白蛋白的片段或變體，例如通過彼此的基因融合使它們相互連接(即通過核酸的翻譯產(chǎn)生白蛋白融合蛋白，其中所述核酸中，編碼所有或一部分治療性蛋白的多核苷酸與編碼所有或一部分白蛋白的多核苷酸在閱讀框內(nèi)相連接)。所述治療性蛋白和白蛋白蛋白，一旦成為白蛋白融合蛋白的一部分，就可稱為該白蛋白融合蛋白的“一部分(portion)”，“一個(gè)區(qū)(region)”或“一個(gè)成分(moiety)”。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的一種白蛋白融合蛋白包括一種治療性蛋白和一種血清白蛋白，或可選地由上述兩種蛋白組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的白蛋白融合蛋白包括一種具有生物活性的和/或治療活性的治療性蛋白的片段和一種血清白蛋白，或可選地由上述兩種蛋白組成。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的白蛋白融合蛋白包括一種具有生物活性和/或治療活性的治療性蛋白的變體，和一種血清白蛋白，或可選地由上述兩種蛋白組成。在其他實(shí)施方案中，白蛋白融合蛋白的血清白蛋白組分是血清白蛋白的成熟部分。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的白蛋白包括一種治療性蛋白和一種有生物活性和/或治療活性的血清白蛋白片段，或可選地由上述兩種蛋白組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的白蛋白包括一種治療性蛋白和一種有生物活性和/或治療活性的血清白蛋白變體，或可選地由上述兩種蛋白組成。在一些實(shí)施方案中，白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分是治療性蛋白的成熟部分。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的白蛋白包括一種有生物活性和/或治療活性的治療性蛋白的片段或變體和一種有生物活性和/或治療活性的血清白蛋白片段或變體，或可選地由上述兩種蛋白組成。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的白蛋白包括一種治療性蛋白的成熟部分和一種血清白蛋白的成熟部分，或可選地由上述兩種蛋白組成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述白蛋白融合蛋白包含N末端部分的HA，C末端部分的治療性蛋白?？蛇x地，也可使用包含C末端部分的HA，N末端部分的治療性蛋白的白蛋白融合蛋白。
在另一實(shí)施方案中，所述白蛋白融合蛋白中的治療性蛋白融合于白蛋白的N末端和C末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，該在N和C末段融合的治療性蛋白是同一種治療性蛋白。在另一實(shí)施方案中，在N和C末段融合的治療性蛋白是不同的治療性蛋白。在另一實(shí)施方案中，在N和C末段融合的治療性蛋白是不同的治療性蛋白，所述治療性蛋白可用來治療或預(yù)防同一種疾病，病癥或病情。在另一實(shí)施方案中，在N和C末段融合的治療性蛋白是不同的治療性蛋白，所述治療性蛋白可用來治療或預(yù)防已知通常同時(shí)出現(xiàn)在病人中的疾病或病癥。
除了其中的白蛋白部分與治療性蛋白部分的N末段和/或C末段融合的融合蛋白，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白還可通過將治療性蛋白或目的肽插入HA的內(nèi)部區(qū)產(chǎn)生。例如，在HA分子的蛋白序列內(nèi)的α-螺旋的終點(diǎn)和起點(diǎn)之間，存在許多環(huán)(loops)和轉(zhuǎn)彎(turn)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)是通過二硫鍵穩(wěn)定的。HA分子的晶體結(jié)構(gòu)分析(PDB鑒定子(identifiers)1A06，1BJ5，1BKE，1BMO，1E7E至1E7I和1UOR)發(fā)現(xiàn)所述環(huán)的絕大部分都伸展到HA分子體以外。這些環(huán)可用于有治療活性的肽或治療性蛋白的插入，或內(nèi)部融合以實(shí)質(zhì)上產(chǎn)生出具有特定生物活性的白蛋白分子，所述治療活性肽尤其指那些需要二級(jí)結(jié)構(gòu)有功能的肽。
所述肽或多肽可插入人白蛋白中的環(huán)，從而產(chǎn)生出本發(fā)明的白蛋白融合蛋白，所述環(huán)包括Val54-Asn61，Thr76-Asp89，Ala92-Glu100，Gln170-Ala176，His247-Glu252，Glu266-Glu277，Glu280-His288，Ala362-Glu368，Lys439-Pro447，Val462-Lys475，Thr478-Pro486，和Lys560-Thr566。在其他實(shí)施方案中，肽或多肽被插入成熟人白蛋白(SEQ IDNO18)中的Val54-Asn61，Gln170-Ala176，和/或Lys560-Thr566環(huán)。
被插入的肽可以是源自噬菌體展示或合成肽文庫中篩選出來的具有特定生物活性的肽或者來自具有所需功能的分子的活性部分。此外，可以在特定的環(huán)內(nèi)或通過將隨機(jī)肽插入HA分子的特定環(huán)內(nèi)產(chǎn)生隨機(jī)肽文庫，在該文庫中展示了所有可能的氨基酸組合。
通過以下方法中的一種可以在HA或HA結(jié)構(gòu)域片段的基礎(chǔ)上產(chǎn)生這樣的文庫。
(a)對(duì)HA或HA結(jié)構(gòu)域片段的一種或多種肽環(huán)內(nèi)的氨基酸進(jìn)行隨機(jī)突變?？梢杂眠@種方式使環(huán)內(nèi)的一個(gè)，多個(gè)或所有殘基突變。
(b)用長(zhǎng)度為Xn的隨機(jī)肽取代或插入HA或HA結(jié)構(gòu)域片段的一種或多種環(huán)(即，內(nèi)部融合)，其中X是氨基酸而n是殘基的數(shù)目；(c)除(a)和/或(b)的N-，C-或N-和C-末端肽/蛋白融合。
通過將針對(duì)不同靶點(diǎn)的不同環(huán)的不同篩選所得的肽移植到相同的HA或HA結(jié)構(gòu)域片段中，也可以制備所述HA或HA結(jié)構(gòu)域片段。
插入人血清白蛋白的環(huán)中的肽是治療性蛋白肽或其肽片段或其肽變體。例如，插入人血清白蛋白的環(huán)內(nèi)的肽可以包括T-20和/或T-1249肽或其肽片段或其肽變體。更具體地，本發(fā)明包括的白蛋白融合蛋白包括長(zhǎng)度為至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少20，至少25，至少30，至少35，或至少40個(gè)氨基酸的肽片段或肽變體，所述肽片段或肽變體插入到人血清白蛋白的環(huán)內(nèi)。本發(fā)明包括的白蛋白融合蛋白還包括長(zhǎng)度為至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少20，至少25，至少30，至少35，或至少40個(gè)氨基酸的肽片段或肽變體，所述肽片段或肽變體融合于人血清白蛋白的N末端。本發(fā)明包括的白蛋白融合蛋白包括長(zhǎng)度為至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少20，至少25，至少30，至少35，或至少40個(gè)氨基酸的肽片段或肽變體，所述肽片段或肽變體融合于人血清白蛋白的C末端。
通常，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可以具有一個(gè)源自HA的區(qū)和一個(gè)源自治療性蛋白的區(qū)。然而，可利用每種蛋白的多個(gè)區(qū)制備本發(fā)明的白蛋白融合蛋白。類似地，一種或一種以上的治療性蛋白可以用來制備本發(fā)明的白蛋白融合蛋白。例如，治療性蛋白可以融合于HA的N末端和C末端。在這樣一種結(jié)構(gòu)中，治療性蛋白部分可以是相同的或不同的治療性蛋白分子。雙功能白蛋白融合蛋白的結(jié)構(gòu)可以表示為X-HA-Y或Y-HA-X或X-Y-HA或HA-X-Y或HA-Y-X-HA或HA-X-X-HA或HA Y-Y-HA或HA-X-HA-Y或X-HA-Y-HA或多重組合和/或?qū)和/或Y插入HA序列內(nèi)的任何位置。
根據(jù)其功能，半衰期等，可以按各種比例制備雙或多功能白蛋白融合蛋白。
也可以制備雙或多功能白蛋白融合蛋白，使得融合物的治療蛋白部分通過HA中另一末端的蛋白或肽靶向靶器官或細(xì)胞類型。
除了融合已知的治療性分子，還可以通過篩選文庫獲得所述肽，該文庫被構(gòu)建為通常為6，8，12，20或25或Xn(其中X是氨基酸(aa)且n等于殘基數(shù))的隨機(jī)選擇的氨基酸與HA或HA的結(jié)構(gòu)域片段的N-，C-，或N-和C-末端的融合物的文庫，并且該文庫中包括所有可能的氨基酸組合。這種方法特別的優(yōu)勢(shì)在于可以在HA分子上原位篩選所述肽，而且由此該肽的特性是被選出來的，而不像通過任何其他方法然后被附著于HA產(chǎn)生的肽那樣，可能是經(jīng)過修飾產(chǎn)生該特性。
此外，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白還可包括接頭肽，所述接頭肽為與融合的部分之間，以更好地在物理上分開各部分，并因此使得例如在與治療性白蛋白部分的相關(guān)受體結(jié)合時(shí)，該治療性蛋白的可接近性最大化。所述接頭肽可能由這樣的氨基酸組成，它們使得該接頭肽更加柔韌(flexible)或更加僵硬(rigid)。
因此，如上述，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可以具有以下的結(jié)構(gòu)式R2-R1；R1-R2；R2-R1-R2；R2-L-R1-L-R2；R1-L-R2；R2-L-RI；或R1-L-R2-L-R1，其中，R1是至少一種治療性蛋白，肽或多肽序列(包括其片段或其變體)，且不必要是相同的治療性蛋白，L是接頭，R2是血清白蛋白序列(包括其片段或其變體)。示例性的接頭包括(GGGGS)n(SEQ ID NO8)或(GGGSn(SEQ ID NO9)或(GGS)n，其中N是大于或等于1的整數(shù)且其中G代表甘氨酸而S代表絲氨酸。當(dāng)R1是兩種或多種治療性蛋白，肽或多肽序列時(shí)，這些序列可選地通過接頭連接。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白包含的治療性蛋白與不與白蛋白融合的相同治療性蛋白的保質(zhì)期或體內(nèi)半衰期或治療活性相比，前者具有延長(zhǎng)的保質(zhì)期或體內(nèi)半衰期或治療活性。保質(zhì)期通常指這樣一段時(shí)期，在該時(shí)期內(nèi)溶液中或其他儲(chǔ)存配制劑中的治療性蛋白的治療活性是穩(wěn)定的，并沒有不適當(dāng)?shù)貑适е委熁钚?。許多治療性蛋白在非融合狀態(tài)下都是高度不穩(wěn)定的。如下所述，摻入本發(fā)明的白蛋白融合蛋白后，通常這些治療性蛋白的保質(zhì)期都顯著延長(zhǎng)。
具有“延時(shí)的(prolonged)”或“延長(zhǎng)的(extended)”保質(zhì)期的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白顯示比處于同樣的儲(chǔ)存和處理?xiàng)l件下的標(biāo)準(zhǔn)品更大的治療活性。所述標(biāo)準(zhǔn)品可以是未融合的全長(zhǎng)治療性蛋白。當(dāng)該白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分是類似物，變體或發(fā)生其它變異或者不包括該蛋白的完整序列，治療活性的延長(zhǎng)也可以和該類似物，變體，變異的肽或不完整的序列的非融合對(duì)等物(equivalent)進(jìn)行對(duì)比。例如，當(dāng)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白處于和標(biāo)準(zhǔn)品相同的儲(chǔ)藏和處理?xiàng)l件下并在一個(gè)給定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較時(shí)，它保持標(biāo)準(zhǔn)品的約100％以上的治療活性，或大于標(biāo)準(zhǔn)品的約105％，110％，120％，130％，150％或200％的治療活性。然而，注意到治療活性有賴于治療性蛋白的穩(wěn)定性，因此治療活性可以低于100％。
也可用儲(chǔ)存后保持的治療活性評(píng)估保質(zhì)期，以儲(chǔ)存開始時(shí)的治療活性為標(biāo)準(zhǔn)。顯示延時(shí)的或延長(zhǎng)的治療活性因而具有延時(shí)的或延長(zhǎng)的保質(zhì)期的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白，可保持的治療活性超過相同條件下等量未融合治療性蛋白的治療活性的約50％以上，約60％，70％，80％，或90％或更多。
治療性蛋白如上述，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白包含至少一種治療性蛋白的片段或變體和至少一種人血清白蛋白的片段或變體，它們通常通過基因融合互相連接。
本文的“治療性蛋白”指具有一種或幾種治療和/或生物活性的HIV融合抑制肽(例如T-20，T-1249，5-螺旋或cyanovirin-N)，或其片段或其變體。因此，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可以包含至少一種治療性蛋白的片段或變體。此外，術(shù)語“治療性蛋白”可以指內(nèi)源性治療蛋白或其天然存在的相關(guān)物質(zhì)。變體包括突變體，類似物，和模擬物(mimetics)，以及同源物，包括內(nèi)源性治療蛋白或其天然存在的相關(guān)物質(zhì)。
顯示“治療活性”的多肽或“治療上有活性的”蛋白，是指具有一種或多種與治療性蛋白相關(guān)的已知的生物和/或治療活性的多肽，所述治療性蛋白例如本文所述的或本領(lǐng)域已知的一種或多種治療性蛋白。一個(gè)非限制性的示例中，“治療性蛋白”是可用于治療，預(yù)防或緩解疾病，病情或病癥的蛋白。
本文的“治療活性”或”活性“指這樣一種活性，其效果與病人所需的治療結(jié)果一致，或者與非人哺乳動(dòng)物或其它物種或有機(jī)體中的所需效果一致。治療活性可以在體內(nèi)或體外測(cè)定。例如，可以在細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)定所需的效果。這種體外的或細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)通常用于本領(lǐng)域所描述的許多治療性蛋白。
有用的試驗(yàn)的實(shí)例包括，但不限于，表1的對(duì)比文件和出版物中的那些試驗(yàn)(例如美國(guó)專利6,133,418，第12欄，第20-58行)，具體包含在文中作為參考，以及實(shí)施例8和11所述的那些試驗(yàn)。本發(fā)明的融合蛋白顯示的抗病毒活性可以通過例如簡(jiǎn)易的體外試驗(yàn)測(cè)定，例如以下所述的試驗(yàn)，這些試驗(yàn)可以檢測(cè)融合蛋白抑制合胞體(syncytia)形成的能力，或者抑制游離于細(xì)胞外的病毒(cell-free virus)感染的能力。使用這些試驗(yàn)方法可測(cè)定例如該融合蛋白顯示對(duì)給定的病毒毒株的相對(duì)抗病毒活性和/或該融合蛋白的毒株特異性抑制活性。細(xì)胞-細(xì)胞融合試驗(yàn)可用來檢測(cè)融合蛋白抑制HIV誘導(dǎo)的體外合胞體形成的能力。這種試驗(yàn)可以包括在慢性HIV感染的細(xì)胞和待檢測(cè)的肽存在的條件下培養(yǎng)未被感染的CD4+細(xì)胞(例如Molt或CEM細(xì)胞)。對(duì)于每種肽，可測(cè)定肽濃度的范圍。所述范圍包括沒有加入該肽的對(duì)照培養(yǎng)。培養(yǎng)采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的標(biāo)準(zhǔn)條件。溫育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后(例如37℃下24到72小時(shí))，用顯微鏡檢查培養(yǎng)物中是否存在多核巨細(xì)胞，該細(xì)胞表明細(xì)胞融合體和合胞體形成。
作為另一個(gè)實(shí)施例，可利用逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)試驗(yàn)來檢驗(yàn)該融合蛋白抑制游離于細(xì)胞外的HIV感染CD4+細(xì)胞的能力。這種試驗(yàn)包括在待測(cè)定的融合蛋白存在的條件下培養(yǎng)適當(dāng)濃度的病毒(即TCID50)和CD4+細(xì)胞。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的培養(yǎng)條件。如上述，使用包括不加入肽的對(duì)照培養(yǎng)在內(nèi)的一定濃度范圍內(nèi)的融合蛋白。溫育適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時(shí)間(例如7天)后，使用標(biāo)準(zhǔn)步驟制備不含細(xì)胞的上清液，并測(cè)定上清液中RT活性的存在以確定感染的成功。使用例如Goff等(Goff，S.等，1981，J.Virol 38239-248)和/或Willey等(Willey，R.等，1988，J.Virol.62139-147)所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定RT活性。這些對(duì)比文件的全文包含在本文中作為參考。
可以通過附加1個(gè)或多個(gè)寡糖基團(tuán)來修飾對(duì)應(yīng)于本發(fā)明白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白。所述糖基化修飾可在很大程度上影響蛋白的物理特性并且在蛋白的穩(wěn)定性，分泌和定位中也很重要。這種修飾在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355,547和WO 01/79480中描述，所述對(duì)比文件包含在本文中作為參考。
可以修飾對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白，以及其類似物和變體，使得一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)上的糖基化發(fā)生改變，所述改變是表達(dá)它們的宿主細(xì)胞或者其他表達(dá)條件對(duì)其核酸序列操縱的結(jié)果。例如，通過消除或引入糖基化位點(diǎn)可以制備糖基化異構(gòu)體，如通過氨基酸殘基的取代或缺失，例如用天冬酰胺取代谷氨酰胺，或者通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述蛋白制備非糖基化的重組蛋白，所述宿主細(xì)胞不糖基化所述蛋白，例如大腸桿菌或糖基化缺陷的酵母菌。這些方法的實(shí)施例在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355,547和WO01/79480中有詳細(xì)描述，所述對(duì)比文件包含在本文中作為參考，并且是本領(lǐng)域已知的。
表1非窮盡性地列出了對(duì)應(yīng)于本發(fā)明白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白。該“治療性蛋白X”一欄公開了治療性蛋白分子和括號(hào)內(nèi)的科學(xué)及商品名稱，所述分子包括治療性蛋白分子或其片段或其變體或可選地由這些成分組成。本文的“治療性蛋白X”指單個(gè)的治療性蛋白分子(如由CAS和Genbank登錄號(hào)可得的氨基酸序列所定義的)，或者指與該欄中公開的給定治療性蛋白分子相關(guān)的整組治療性蛋白。與這些蛋白相關(guān)的信息均包含在本文中作為參考，尤其涉及本發(fā)明所述的氨基酸序列。“PCT/專利對(duì)比文件”一欄提供了描述治療性蛋白分子的美國(guó)專利號(hào)，或?qū)＠?或公開的專利申請(qǐng)的PCT國(guó)際公開號(hào)?！癙CT/專利對(duì)比文件”一欄引用的每件專利和/或公開的專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容均包含在本文中作為參考。具體地，每篇引用的“PCT/專利對(duì)比文件”中的序列表中說明的具體多肽的氨基酸序列，例如每篇引用的“PCT/專利對(duì)比文件”中詳細(xì)描述的這些氨基酸序列(突變，片段等)的變體，例如每篇引用的“PCT/專利對(duì)比文件”中詳細(xì)描述的治療指征，以及詳細(xì)描述說明的具體多肽的活性測(cè)定，且更具體地每篇引用的“PCT/專利對(duì)比文件”中的實(shí)施例包含在文中作為參考?！吧锘钚浴币粰诿枋隽伺c該治療性蛋白分子相關(guān)的生物活性?！跋嚓P(guān)信息”一欄中引用的每篇對(duì)比文件的全文內(nèi)容都包含在本文中作為參考，具體涉及對(duì)比文件中描述的測(cè)定相應(yīng)生物活性的各活性測(cè)定法(見例如方法部分)?！皟?yōu)選指癥Y”一欄描述了通過治療性蛋白X或包含治療性蛋白X部分的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白來治療，預(yù)防，診斷或改善的疾病，病癥和/或病情。
表1

在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白具有治療活性和/或?qū)?yīng)于該治療活性的生物活性和/或?qū)?yīng)于表1相應(yīng)行中列出的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白的生物活性(見例如，表1中的“生物活性”和“治療性蛋白X”欄)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療活性蛋白部分是對(duì)比序列的片段或變體，并且具有對(duì)應(yīng)表1的“生物活性”一欄中公開的相應(yīng)治療性蛋白的治療活性和/或生物活性。
多肽和多核苷酸片段及變體片段本發(fā)明還涉及表1中所述的治療性蛋白，白蛋白，和/或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的片段。
即使從蛋白的N末端消除一個(gè)或多個(gè)氨基酸導(dǎo)致所述治療性蛋白，白蛋白，和/或白蛋白融合蛋白的一種或多種生物功能發(fā)生修飾或丟失，仍然可保持其他治療活性和/或功能活性(例如生物活性，多聚體化能力，結(jié)合配體的能力)。例如，當(dāng)完整多肽的較少部分殘基從N末端去除時(shí)，具有N末端缺失的多肽通常保持誘導(dǎo)和/或結(jié)合抗體的能力，所述抗體識(shí)別該多肽的完整或成熟形式。通過本文所述的常規(guī)方法和其他本領(lǐng)域已知的方法可輕易測(cè)定缺乏完整多肽的N-末端殘基的具體多肽是否保持這種免疫活性。具有大量缺失的N末端氨基酸殘基的突變蛋白(mutein)完全可能保持一些生物或免疫活性。事實(shí)上，由少至6個(gè)氨基酸殘基組成的肽通常會(huì)激發(fā)免疫應(yīng)答。
相應(yīng)地，對(duì)應(yīng)于本發(fā)明白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白片段包括全長(zhǎng)蛋白以及從對(duì)比多肽(例如表1公開的治療性蛋白)的氨基酸序列的氨基端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。編碼這些多肽的多核苷酸也包含在本發(fā)明中。
此外，對(duì)應(yīng)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的血清白蛋白多肽的片段，包括全長(zhǎng)蛋白以及從對(duì)比多肽(即血清白蛋白)的氨基酸序列的氨基端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。編碼這些多肽的多核苷酸也包含在本發(fā)明中。
此外，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白片段，包括全長(zhǎng)白蛋白融合蛋白以及從該蛋白的融合蛋白的氨基端消除一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。編碼這些多肽的多核苷酸也包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明還提供了一種從治療性蛋白的氨基酸序列的羧基端消除了一個(gè)或多個(gè)殘基的多肽，所述治療性蛋白對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分(例如，表1中涉及的治療性蛋白)。編碼這些多肽的多核苷酸序列也包含在本發(fā)明中。
此外，本發(fā)明提供了一種從白蛋白的氨基酸序列的羧基端消除一個(gè)或多個(gè)殘基的多肽，所述白蛋白對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分(例如，血清白蛋白)。編碼這些多肽的多核苷酸序列也包含在本發(fā)明中。
此外，本發(fā)明提供了一種從本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的羧基端消除一個(gè)或多個(gè)殘基的多肽。編碼這些多肽的多核苷酸序列也包含在本發(fā)明中。
此外，可結(jié)合上述任何N或C末端的消除產(chǎn)生N和C末端缺失的對(duì)比多肽(例如表1中涉及的治療性蛋白，或血清白蛋白(例如SEQ ID NO18)，或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白)。本發(fā)明還提供了從所述氨基末端和羧基末端消除一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。編碼這些多肽的多核苷酸序列也包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明還涉及含有與本文所述的對(duì)比多肽序列(例如本發(fā)明的治療性蛋白，血清白蛋白或白蛋白融合蛋白)至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的多肽的蛋白，或其片段。在一些實(shí)施方案中，該應(yīng)用涉及包含與對(duì)比多肽具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的多肽的蛋白，所述對(duì)比多肽的氨基酸序列具有上述的N和C末端缺失。編碼這些多肽的多核苷酸也包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明的其他多肽片段包含顯示所述治療性蛋白或血清白蛋白的多肽序列的治療活性和/或功能活性(例如生物活性)的氨基酸序列，或者由該氨基酸序列組成，所述氨基酸序列是片段。
其他多肽片段是有生物活性的片段。有生物活性的片段是那些顯示與本發(fā)明的多肽的活性類似而無需相同的活性的片段。所述片段的生物活性可以包括增加的所需活性，或減小的不需要的活性。
變體“變體”指與對(duì)比核酸或多肽不同但仍保持其必要特性的多核苷酸或核酸。通常，變體總體上十分相似，且在許多區(qū)內(nèi)，與對(duì)比核酸或多肽完全一致。
本文的“變體”是指本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分，或者這樣一種白蛋白融合蛋白，它與本發(fā)明的治療性蛋白(見表1中“治療性”一欄)，白蛋白和/或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的序列各有不同，但保持所述蛋白的至少一種功能特性和/或治療特性(例如表1中“生物活性”一欄公開的治療活性和/或生物活性)，如本文其它部分所述或本領(lǐng)域已知的特性。通常，變體總體上都非常相似，而且在很多區(qū)內(nèi)，都與對(duì)應(yīng)于本發(fā)明白蛋白融合蛋白的治療性部分的治療性蛋白，對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白，和/或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列相同。編碼這些變體的核酸包含在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明還涉及一種蛋白，它包含與例如對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白(例如表1公開的氨基酸序列，或其片段或其變體)，對(duì)應(yīng)于本發(fā)明白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白(例如SEQID NO18或其片段或其變體)，和/或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同一性的氨基酸序列，或者由這樣的序列組成。還提供了這些多肽的片段(例如本文所述的那些片段)。本發(fā)明還包括一種多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸與編碼本發(fā)明的氨基酸序列的核酸分子的互補(bǔ)物(complement)在嚴(yán)格的條件下雜交(例如45攝氏度6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，與縛束在濾紙上的DNA雜交，然后在約50-65攝氏度0.2X SSC，0.1％SDS中進(jìn)行一到多次洗滌)，在高度嚴(yán)格的條件下雜交(例如45攝氏度6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，與縛束在濾紙上的DNA雜交，然后在約68攝氏度0.1X SSC，0.2％SDS中進(jìn)行一到多次洗滌)，或者在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它嚴(yán)格雜交條件下雜交(見例如Ausubel，F(xiàn).M.等，eds.，1989 Current protocol的MolecularBiology，Green publishing associates，Inc.，和John Wiley&Sons Inc.，NewYork，6.3.1-6.3.6和2.10.3頁)。編碼這些多肽的多核苷酸也包含在本發(fā)明中。
具有與本發(fā)明的目標(biāo)(query)氨基酸序列至少例如95％的“同一性”的氨基酸序列的多肽的意思是，除了目的(subject)多肽序列可以包括目標(biāo)多肽的每100個(gè)氨基酸中的5個(gè)氨基酸變異外，目的多肽的氨基酸序列與目標(biāo)氨基酸序列相同。換言之，為獲得具有與目標(biāo)多肽的氨基酸序列具有至少95％的同一性的多肽，目的序列中有5％的氨基酸殘基可以被插入，缺失，或被其它氨基酸取代。對(duì)比序列的這些變異可以出現(xiàn)在對(duì)比氨基酸序列的氨基或者羧基末端位置，或者在那些末端位置之間的任何位置，可以單獨(dú)散布在對(duì)比序列中的殘基中，或者以一個(gè)或多個(gè)連續(xù)的組的形式位于對(duì)比序列中。
實(shí)際上，使用已知的計(jì)算機(jī)程序可以方便地測(cè)定具體的任何多肽是否與例如本發(fā)明的白蛋白融合蛋白或其片段(例如該白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分或者該白蛋白融合蛋白的白蛋白部分)的氨基酸序列具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。這樣的程序和使用所述程序的方法在例如美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355，547和WO01/79480(41-43頁)中描述，所述對(duì)比文件包含在本文中作為參考，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。
本發(fā)明的多核苷酸變體可包含在編碼區(qū)，非編碼區(qū)或這兩個(gè)區(qū)內(nèi)的變異。多核苷酸變體包括含有產(chǎn)生沉默取代，添加或缺失的變異的那些變體，但所述變異不改變所編碼的多肽的特性或活性。由于基因密碼子的簡(jiǎn)并性，這樣的多核苷酸變體可以通過沉默取代產(chǎn)生。多肽變體包括那些其中少于50，少于40，少于30，少于20，少于10，或5-50，5-25，5-10，1-5，或1-2個(gè)氨基酸以任何組合方式被取代，缺失或添加的那些變體。制備多核苷酸變體的理由有很多，例如為了對(duì)特定宿主而言密碼子表達(dá)最優(yōu)化(將人mRNA中的密碼子改變成例如酵母菌或大腸桿菌的微生物宿主優(yōu)選的密碼子)。
在另一實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸被最優(yōu)化用來在酵母菌或哺乳細(xì)胞中表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的多核苷酸被最優(yōu)化用來在酵母菌或哺乳細(xì)胞中表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸被最優(yōu)化用來在酵母菌或哺乳細(xì)胞中表達(dá)。
在另一可選的實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的密碼子最優(yōu)化的多核苷酸不與編碼該治療性蛋白的野生型多核苷酸在本文所述的嚴(yán)格條件下雜交。在另一實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的密碼子最優(yōu)化的多核苷酸不與編碼該白蛋白的野生型多核苷酸在本文所述的嚴(yán)格條件下雜交。在另一實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的密碼子最優(yōu)化的多核苷酸不與編碼治療性蛋白部分或白蛋白部分的野生型多核苷酸在本文所述的嚴(yán)格條件下雜交。
在另一的實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白的多核苷酸不包括該治療性蛋白天然存在的序列，或者可選地不由該治療性蛋白天然存在的序列組成。在另一的實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸不包括該白蛋白天然存在的序列，或者可選地不由該白蛋白天然存在的序列組成。在另一實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸不包括該治療性蛋白部分或該白蛋白部分天然存在的序列，或者可選地不由該治療性蛋白部分或該白蛋白部分天然存在的序列組成。
在另一實(shí)施方案中，所述治療性蛋白可以通過淘選(biopanning)從隨機(jī)肽文庫選擇，這樣將不會(huì)存在天然產(chǎn)生的野生型多核苷酸。
天然存在的變體稱為“等位基因變體”，并且涉及占據(jù)有機(jī)體的染色體給定座位基因之多種替換形式中的一種。(GenesII，Lewin，B.，ed.，JohnWiley&Sons，New York(1985))。這些等位基因變體可以在多核苷酸和/或多肽水平上不同，并且包含于本發(fā)明中?？蛇x地，可以通過誘變技術(shù)或直接合成制備非天然存在的變體。
使用已知的蛋白質(zhì)工程和重組DNA技術(shù)，可以產(chǎn)生變體來改善或改變本發(fā)明的多肽的性質(zhì)。本發(fā)明的多肽可從N末端或C末端消除一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，而基本上不喪失生物功能。見例如Ron等，J.Biol.Chem2682984-2988(1993)(KGF變體)和Dobeli等，J.Biotechnology7199-216(1998)(干擾素γ的變體)。
另外，大量證據(jù)表明變體通常保持與天然存在的蛋白相似的生物活性(例如Gayle andcoworkers(J.Biol.Chem.26822105-22111(1993)(IL-1a變體))。此外，即使從多肽的末端消除一個(gè)或多個(gè)氨基酸造成一種或多種生物功能的修飾或喪失，其他生物活性仍可被保持。例如，當(dāng)分泌形式的部分殘基從N末端或C末端去除時(shí)，缺失變體誘導(dǎo)和/或結(jié)合識(shí)別該分泌形式的抗體的能力很可能被保持。所述蛋白的缺失N末端或C末端殘基的特定多肽是否保持這種免疫活性，可通過本文所述的常規(guī)方法和本領(lǐng)域已知的其他方法輕易測(cè)定。
因此，本發(fā)明還包括具有功能活性(例如生物活性和/或治療活性)的多肽變體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的白蛋白融合蛋白的變體具有功能活性(例如生物活性和/或治療活性，例如表1“生物活性”一欄中公開的活性)，所述功能活性對(duì)應(yīng)于所述白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分相應(yīng)的治療性蛋白的一種或多種生物活性和/或治療活性。這樣的變體包括根據(jù)本領(lǐng)域已知的通常規(guī)則篩選的缺失，插入，翻轉(zhuǎn)，重復(fù)和取代，所述變異幾乎不影響變體的活性。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體具有保守的取代?！氨Ｊ氐娜〈笔侵附M間交換，例如取代脂肪族或疏水氨基酸Ala，Val，Leu和Ile之間的取代；酸性殘基Asp和Glu之間的取代；酰胺殘基Asn和Gln之間的取代，堿性殘基Lys，Arg，和His之間的取代；芳香族殘基Phe，Tyr，和Trp之間的取代，和體積小的氨基酸Ala，Ser，Thr，Met，和Gly之間的取代。
涉及如何制備表型沉默的氨基酸取代的指導(dǎo)在例如Bowie等，″Deciphering the Message in Protein SequencesTolerance to Amino AcidSubstitutions，″Science 2471306-1310(1990)，中給出，其中作者指出有兩種主要的策略來研究氨基酸序列對(duì)改變的耐受性。
如作者所述，蛋白質(zhì)具有令人驚訝的耐受氨基酸取代的能力。作者進(jìn)一步指出哪些氨基酸改變很可能在蛋白質(zhì)中特定的氨基酸位置上是允許的。例如，大多數(shù)被包埋的(包埋在蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)中)的氨基酸殘基要求非極性側(cè)鏈，而通常表面?zhèn)孺湹臉O少的特征是保守的。此外，被耐受的保守氨基酸取代涉及脂肪族或疏水氨基酸Ala，Val，Leu和Ile的取代；羥基殘基Ser和Thr的取代；酸性殘基Asp和Glu的取代；胺殘基Asn和Gln的取代，堿性殘基Lys，Arg，和His的取代；芳香族殘基Phe，Tyr，和Trp的取代，以及體積小的氨基酸Ala，Ser，Thr，Met，和Gly的取代。
除了保守的氨基酸取代，本發(fā)明的變體包括(i)包含一種或多種非保守的氨基酸殘基取代的多肽，其中取代的氨基酸殘基可以是也可以不是基因密碼子編碼的，或(ii)包含一種或多種具有取代基的氨基酸殘基取代的多肽，或(iii)與另一種化合物融合或通過化學(xué)方法偶聯(lián)的多肽，例如增加該多肽的穩(wěn)定性和/或溶解性的化合物(例如聚乙二醇)，(iv)含有附加的氨基酸的多肽，例如IgG Fc融合區(qū)多肽。通過本文的教導(dǎo)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員完全可以掌握這樣的多肽變體。
例如，含有用另一種帶電荷的或中性氨基酸取代帶電氨基酸的氨基酸取代的多肽變體可以制備出具有改善的特性例如更少發(fā)生聚合的蛋白。由于聚合物的免疫原活性，藥物制劑的聚集可以降低其活性和增加其清除率。見Pinckard等，Clin.Exp.Immunol.2331-340(1967)；Robbins等，Diabetes 36838-845(1987)；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10307-377(1993)。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包括本文所述的治療性蛋白和/或人血清白蛋白，和/或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列的片段或變體，或由它們組成，其中與對(duì)比氨基酸序列相比，所述片段或變體具有1-5，5-10，5-25，5-50，10-50或50-150個(gè)氨基酸殘基的添加，取代和/或缺失。在具體的實(shí)施方案中，所述氨基酸取代是保守的。編碼這些多肽的核酸也包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明的多肽可以由通過肽鍵或修飾的肽鍵，即肽等電子體(isostere)，連接各氨基酸形成并且可以包含除了基因編碼的20個(gè)氨基酸以外的氨基酸。也可以通過例如翻譯后加工的天然方法，或者通過本領(lǐng)域已知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾所述多肽。這樣的修飾在基本的教科書里有所描述，并在專題文章以及大量研究文獻(xiàn)中有更詳細(xì)的描述。通常修飾可以出現(xiàn)在多肽中的任何位置，包括多肽主鏈，氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基端。可以理解同樣類型的修飾可以相同或不同程度地出現(xiàn)在給定多肽的多個(gè)位置。另外，給定的多肽可以包括多種類型的修飾。例如由于遍在蛋白化作用(ubiquitination)，多肽可以是分枝的，且也可以是環(huán)化的而具有或沒有分枝。環(huán)化的，分枝的，和分枝環(huán)化的多肽可以產(chǎn)生自翻譯后天然加工或可通過合成方法被制備。修飾包括乙?；?，?；珹DP-核糖基化，酰胺化，黃素共價(jià)附著，亞鐵血紅素部分共價(jià)附著，核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)附著，脂類或脂類衍生物的共價(jià)附著，磷脂酰肌醇的共價(jià)附著，交聯(lián)，環(huán)化，二硫鍵形成，去甲基化，共價(jià)交聯(lián)形成，胱氨酸形成，焦谷氨酸(pyroglutamate)形成，甲酰化，γ羧化作用，糖基化，GPI錨定物形成，羥基化，碘化，甲基化，豆蔻?；趸?，PEG化(pegylation)，蛋白水解加工，磷酸化，異戊二烯化，外消旋作用，selenoylation，硫酸鹽化，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的氨基酸添加到蛋白，例如精氨酰化(arginylation)和遍在蛋白化作用。
此外，化學(xué)成分也可以共價(jià)附著于所述白蛋白融合蛋白以增強(qiáng)或調(diào)節(jié)具體的功能或生物活性，例如通過Current Opinions in Biotechnology，10324(1999)中所述的方法。
本發(fā)明包括的附加翻譯后修飾包括，例如N連接的或O連接的碳水化合物鏈，N末端或C末端的加工，化學(xué)部分附著于氨基酸主鏈，N-連接的或O連接的碳水化合物鏈的化學(xué)修飾，以及由原核宿主細(xì)胞表達(dá)造成的N末端蛋氨酸殘基的添加或缺失。所述白蛋白融合蛋白的其他修飾方法包括，但不限于，化療劑，如藥物，和/或可檢測(cè)的標(biāo)記，如酶，熒光素，同位素和/或親和標(biāo)記以便檢測(cè)和分離蛋白。這種修飾的實(shí)例在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355,547和WO01/79480(105-106頁)中給出，上述對(duì)比文件包含在文中作為參考，并且是本領(lǐng)域熟悉的。
功能活性“具有功能活性的多肽”指能夠顯示一種或多種已知的功能活性的多肽，所述功能活性與治療性蛋白的全長(zhǎng)，前蛋白，和/或成熟形式相關(guān)。這樣的功能活性包括，但不限于，生物活性，抗原性(與抗多肽抗體結(jié)合的能力(或與結(jié)合抗多肽抗體的多肽競(jìng)爭(zhēng)的能力))，免疫原性(產(chǎn)生與本發(fā)明特定多肽結(jié)合的抗體的能力)，與本發(fā)明的多肽形成多聚體的能力，以及與多肽的受體或配體結(jié)合的能力。
“具有生物活性的多肽”指在具體的生物試驗(yàn)中，顯示與本發(fā)明的治療性蛋白，包括其成熟形式的活性相似但不必要相同的活性的多肽，所述多肽的活性可以是劑量依賴或非劑量依賴性的。如果存在劑量依賴性，所述活性無需與本發(fā)明的多肽的劑量依賴性相同，而是基本上與本發(fā)明的多肽在給定的活性中的劑量依賴性相似。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白具有至少一種與沒有和白蛋白融合的該治療性蛋白(或其片段或其變體)相關(guān)的生物和/或治療活性。
適用本領(lǐng)域已知的常規(guī)修飾法，以及本文所述的實(shí)驗(yàn)方法可以測(cè)定本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的功能活性(例如生物活性)。具體地，可以使用表1的″相關(guān)出版物″一欄中的方法測(cè)定白蛋白融合蛋白的功能活性(例如生物活性或治療活性)。此外，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以使用表1的相應(yīng)行中的方法常規(guī)地測(cè)定本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分對(duì)應(yīng)的治療性蛋白的片段的活性。此外，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以適用本領(lǐng)域已知的方法和/或如美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355,547和WO01/79480中所述方法常規(guī)地測(cè)定本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分對(duì)應(yīng)的白蛋白片段的活性。
此外，本文所述的方法(見實(shí)施例和表1)以及本領(lǐng)域已知的其他方法可以常規(guī)地用于測(cè)定本發(fā)明的白蛋白融合蛋白及其片段，變體或衍生物激發(fā)與本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分和/或白蛋白部分相關(guān)的生物活性和/或治療活性的能力。其他方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的并包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
融合蛋白的表達(dá)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可以通過酵母菌，如細(xì)菌等的微生物，或者人或動(dòng)物細(xì)胞系的分泌被制備成重組分子?？蛇x地，所述多肽自宿主細(xì)胞中分泌。
為表達(dá)本發(fā)明舉例說明的白蛋白融合蛋白，成功地使用了如WO95/33833舉例說明的HSP150基因中斷(disrupted)的酵母菌株或WO00/44772[rHA法](用于降低/消除所述白蛋白融合物的O-連接的糖基化)舉例說明的PTM1基因中斷的酵母菌株，或WO 95/23857舉例說明的YAP3基因中斷的酵母菌株，以及與它們相組合的酵母菌PRB1啟動(dòng)子，WO 90/01063舉例說明的HAS/MFα-1融合前導(dǎo)序列，酵母菌ADH1終止子，LEU2選擇標(biāo)記物和美國(guó)專利5,637,504中舉例說明的中斷(disintegration)載體pSAC35。
其他可用于本發(fā)明的酵母菌株，啟動(dòng)子，前導(dǎo)序列，終止子，標(biāo)記物和載體在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355,547和WO01/74980(94-99頁)中描述，該文獻(xiàn)包含在本文中作為參考，并且是本領(lǐng)域已知的。
本發(fā)明還包括細(xì)胞，可選為酵母細(xì)胞，所述細(xì)胞被轉(zhuǎn)化以表達(dá)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白。除了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞本身，本發(fā)明還涉及培養(yǎng)基中的那些細(xì)胞的培養(yǎng)物，可選地為單克隆(均一克隆)培養(yǎng)物，或者來自單克隆培養(yǎng)的培養(yǎng)物。如果所述多肽是被分泌的，所述培養(yǎng)基將含有該多肽和細(xì)胞，或如果細(xì)胞被過濾或離心去除的情況下不含有細(xì)胞。許多已知并可用的表達(dá)系統(tǒng)包括細(xì)菌(例如大腸桿菌和枯草桿菌)，酵母菌(例如釀酒酵母，乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces.lactis)和巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)，絲狀真菌(例如曲菌)，植物細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。
通過傳統(tǒng)方法制備所需的蛋白，例如通過插入宿主染色體中或游離的質(zhì)粒上的編碼序列?？捎盟璧鞍椎木幋a序列以例如電穿孔的任何常見的方法轉(zhuǎn)化酵母菌。通過電穿孔轉(zhuǎn)化酵母菌在Becker&Guarente(1990)MethodsEnzymol.194，182中公開。
成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，可以通過已知的技術(shù)被鑒定。例如，通過引入表達(dá)載體產(chǎn)生的細(xì)胞可以生長(zhǎng)以表達(dá)所需的多肽。收獲并裂解細(xì)胞，并使用例如Southern(1975)J Mol.Biol.98，503或Berent等(1985)Biotech.3,208所述的方法檢查細(xì)胞的DNA含量以確定DNA的存在?？蛇x地，上清液中所述蛋白的存在可以通過使用抗體檢測(cè)。
有用的酵母菌質(zhì)粒載體包括pRS403-406和pRS413-416，通常自Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA 92037，USA可得。質(zhì)粒pRS403，pRS404，pRS405和pRS406是酵母菌整合質(zhì)粒(Integrating plasmids)(YIps)并包括酵母可選標(biāo)記物HIS3，TRPI，LEU2和URA3。質(zhì)粒pRS413-416是酵母著絲點(diǎn)質(zhì)粒(Centromere plasmids)(YCps)。
制備在酵母菌中表達(dá)的白蛋白融合蛋白的載體包括pPPC0005，pScCHSA，pScNHSA，和pC4HAS，所述載體于2001年4月11日保存在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type Culture Collection)，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，并在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355,547和WO01/79480中描述，這些文獻(xiàn)包含在本文中作為參考。
另一種預(yù)期可用于在酵母中表達(dá)白蛋白融合蛋白的載體是pSAC35載體，所述載體在Sleep等，BioTechnology 842(1990)中描述，其全文包含在本文中作為參考。美國(guó)專利5,637 504描述了中斷(disintegration)類型的載體的質(zhì)粒pSAC35。
已發(fā)展出多種方法通過互補(bǔ)粘末端將DNA可操作地連接于載體。例如，可將互補(bǔ)的均聚物束(complementary homopolymer tracts)加入DNA片段中從而將其插入載體DNA。隨后通過互補(bǔ)均聚物尾之間的氫鍵連接所述載體和DNA片段形成重組的DNA分子。
含有一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)的合成接頭提供了將DNA片段連接到載體的另一種方法。通過內(nèi)切酶的限制性消化產(chǎn)生所述DNA片段，并用噬菌體T4 DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理，這些酶能夠用其3’5’-核酸內(nèi)切酶活性去除突出的，γ-單鏈末端，并用其聚合活性填補(bǔ)凹陷的3’末端。這些活性的結(jié)合由此產(chǎn)生了平末端的DNA片段。隨后在能夠催化平末端DNA分子連接的酶(例如噬菌體T4 DNA接合酶)存在的條件下，將過量的接頭分子與所述平末端DNA片段共同溫育。因此，該反應(yīng)的產(chǎn)物是其末端具有聚合的接頭序列的DNA片段。然后用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈钸@些DNA片段，并與表達(dá)載體接連，所述表達(dá)載體已經(jīng)被產(chǎn)生與所述DNA片段相匹配的末端的酶裂解過。
含有多種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的合成接頭可從多處購(gòu)得。
根據(jù)本發(fā)明修飾DNA例如制備HA變體的一種適當(dāng)?shù)姆椒ǎ抢肧aiki等(1988)Science 239，487-491所述的聚合酶鏈反應(yīng)。在該方法中，被酶擴(kuò)增的DNA側(cè)接兩種特異的寡核苷酸引物，所述引物自身也被摻入擴(kuò)增的DNA中。該特異的引物可以包含限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，用本領(lǐng)域已知的方法將其克隆到表達(dá)載體中。
本發(fā)明可用作表達(dá)所述白蛋白融合蛋白的宿主的示例性酵母菌種是畢赤酵母屬(Pachia)(以前被分類為漢遜酵母(Hansenula))，酵母屬(Saccharomyces)，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)，曲菌屬(Aspergillus)，假絲酵母屬(Candida)，球擬酵母屬(Torulopsis)，有孢圓酵母屬(Torulaspofa)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，固囊酵母屬(Citeronzyces)，管囊酵母屬(Pachysolen)，接合酵母屬(Zygosaccharomyces)，德巴利酵母屬(Debaromyces)，木霉屬(Trichoderma)，頭孢菌屬(Cephalosporium)，腐質(zhì)霉菌(Humicola)，毛霉屬(Mucor)，脈孢霉(Neurospora)，西洋蓍霉(yarrowia)，梅奇酵母屬(Metschunikowia)，紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)，白冬孢酵母菌屬(Leucosporidium)，Botryoascus，鎖擲酵母菌屬(Sporidiobolus)，擬內(nèi)孢菌屬(Endomycopsis)等。包括選自酵母屬，裂殖酵母菌屬，畢赤酵母菌屬，或球擬酵母屬的菌屬。酵母屬的實(shí)例是釀酒酵母，意大利酵母和魯酵母。美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355,547和WO01/79480(97-98頁)中描述了其他種類的實(shí)例和轉(zhuǎn)化它們的方法，這些文獻(xiàn)包含在文中作為參考。
EP 251 744，EP 258 067和WO 90/01063中教導(dǎo)了轉(zhuǎn)化釀酒酵母的方法，其所有內(nèi)容包含在文中作為參考。
適合釀酒酵母的啟動(dòng)子包括與以下基因相連的啟動(dòng)子PGKI基因，GAL1或GAL10基因，CYCI，PHO5，TRPI，ADHI，ADH2，和甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，丙糖磷酸異構(gòu)酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，葡萄糖激酶，α-配對(duì)因子信息素[alpha-mating factorpheromone](一種配對(duì)因子信息素)，PRBI啟動(dòng)子，GUT2啟動(dòng)子，GPDI啟動(dòng)子和涉及5’調(diào)控區(qū)的部分與其它啟動(dòng)子的5’調(diào)控區(qū)或者上游激活位點(diǎn)(例如EP-A-258 067的啟動(dòng)子)雜交體的雜交啟動(dòng)子。
用于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的便利可調(diào)控啟動(dòng)子是如Maundrell(1990)J.Biol.Chem.265，10857-10864所述的來自nmt基因的硫胺可抑制(repressible)的啟動(dòng)子和如Hoffman&Winston(1990)Genetics 124，807-816所述的葡萄糖可抑制的jbpl基因啟動(dòng)子。
轉(zhuǎn)化畢赤酵母屬以表達(dá)外來基因的方法的教導(dǎo)見例如Cregg等(1993)和各種Phillips專利(例如美國(guó)專利4 857467，包含在文中作為參考)，并且畢赤酵母表達(dá)試劑盒可自Invitrogen BV，Leek，Netherlands，和InvitrogenCorp.，San Diego，California購(gòu)得。適宜的啟動(dòng)子包括AOXI和AOX2。Gleeson等(1986)J.Gen.Microbiol.132，3459-346包括了漢遜酵母載體和轉(zhuǎn)化的信息，適宜的載體是MOX1和FMD1；且EP 361 991，F(xiàn)leer等(1991)和Rhone-Poulenc Rorer的其他出版物教導(dǎo)了如何在克魯維酵母屬中表達(dá)外來蛋白。
轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)可以是真核生物基因的3’側(cè)接序列，所述序列包含用于轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化的適當(dāng)信號(hào)。適宜的3’側(cè)接序列可以是例如天然地與使用的表達(dá)控制序列相連的基因的序列，即可以與啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)?？蛇x地，在任選地使用釀酒酵母ADH I的終止序列時(shí)，所述序列也可以不同。
最初，可以使用分泌性前導(dǎo)序列表達(dá)適合需要的白蛋白融合蛋白，所述前導(dǎo)序列可以是選定的酵母菌中的任何有效的前導(dǎo)序列。用于釀酒酵母的前導(dǎo)序列包括來自配對(duì)因子α多肽(MF α-1)的序列和EP-A-387319的雜交前導(dǎo)序列。在成熟的白蛋白被釋放到周圍的培養(yǎng)集中以前，這樣的前導(dǎo)序列(或信號(hào))可以被酵母菌裂解。此外，這樣的前導(dǎo)序列包括JP 62-096086(授權(quán)號(hào)911036516)中公開的釀酒酵母轉(zhuǎn)化酵素(invertase)(SUC2)，酸性磷酸酶(PH05)，MFα-1的前序列，0葡聚糖酶(BGL2)和致死毒素(killer toxin)；糖化酵母葡糖淀粉酶I1(S.diastaticus glucoamylase I1)；卡爾酵母α半乳糖苷酶(S.carlsbergensis α-galactosidase)(MEL1)；乳酸克魯維酵母致死毒素(K lactiskiller toxin)和假絲酵母葡糖淀粉酶(Candida glucoamylase)的前導(dǎo)序列。
重組和合成法生產(chǎn)白蛋白融合蛋白的其他方法本發(fā)明包括編碼白蛋白融合蛋白的多核苷酸，以及載體，宿主細(xì)胞和含有這些多核苷酸的有機(jī)體。本發(fā)明還包括通過合成和重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的方法。所述多核苷酸，載體，宿主細(xì)胞，和有機(jī)體可以利用本領(lǐng)域已知的方法分離和純化。
用于本發(fā)明的載體可以是例如，噬菌體，質(zhì)粒，粘粒，微小染色體，病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
可用于克隆和/或表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的載體是那些能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)多核苷酸的那些載體，其中該多核苷酸需要在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)。通常，該多核苷酸和/或載體可用于原核或真核的任何細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如人(例如HeLa)，猴(例如Cos)，兔(例如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞)，大鼠，倉鼠(例如CHO，NSO和幼年倉鼠腎細(xì)胞)或小鼠細(xì)胞(例如L細(xì)胞)，植物細(xì)胞，酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌)。見F.Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology.Greene PublishingAssociates and Wiley-Interscience(1992)和Sambrook等(1989)中用于各種類型的宿主細(xì)胞的適宜載體的實(shí)例。然而，須注意，當(dāng)使用復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，病毒繁殖將只出現(xiàn)在互補(bǔ)的宿主細(xì)胞中。
含有這些多核苷酸的宿主細(xì)胞可用來表達(dá)大量用于例如藥品，診斷試劑，疫苗和治療方法中的蛋白。所述蛋白可以通過本領(lǐng)域已知的或者本文所述的方法分離和純化。
編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可以和含有選擇性標(biāo)記物的載體相連，用于在宿主中繁殖。通常，質(zhì)粒載體可以被引入例如磷酸鈣沉淀物的沉淀物，或者具有帶電的脂類的復(fù)合物中。如果載體是病毒，可使用適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系將其在體外進(jìn)行包裝，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主細(xì)胞中。
多核苷酸插入序列可以和與宿主細(xì)胞相容的適當(dāng)啟動(dòng)子可操作地連接，其中所述多核苷酸將被表達(dá)。所述啟動(dòng)子可以是強(qiáng)啟動(dòng)子和/或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的實(shí)例包括噬菌體λPL啟動(dòng)子，大腸桿菌lac，trp，phoA和tac啟動(dòng)子，SV40早期和晚期啟動(dòng)子，以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs的啟動(dòng)子等等。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知其它適宜的啟動(dòng)子。表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，終止位點(diǎn)，和位于被轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物可包括分別位于被翻譯的多肽起點(diǎn)的翻譯起始密碼子和位于該多肽末端的適當(dāng)位置上的終止密碼子(UAA，UGA，或UAG)。
本文所述的表達(dá)載體可包括至少一種可選擇的標(biāo)記。這類標(biāo)記包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶，G418，谷氨酰胺合酶，或者新霉素抗性，用于培養(yǎng)大腸桿菌和其他細(xì)菌的四環(huán)素，卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。適當(dāng)?shù)乃拗鞯拇硇詫?shí)例包括，但不限于，細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌，鏈霉菌屬和鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，例如酵母菌細(xì)胞(例如釀酒酵母或巴氏畢赤酵母(ATCC保藏號(hào)201178)；昆蟲細(xì)胞，例如果蠅S2和秋粘蟲(Spodoptera)Sf9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞例如CHO，COS，NSO，293，和Bowes黑素瘤細(xì)胞；以及植物細(xì)胞。本領(lǐng)域已知培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和條件。
在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可以和信號(hào)序列融合，所述信號(hào)序列將本發(fā)明的蛋白的位置導(dǎo)向原核或真核細(xì)胞的特定隔室和/或指導(dǎo)本發(fā)明的蛋白自原核或真核細(xì)胞的分泌。例如，在大腸桿菌中，可將所述蛋白的分泌導(dǎo)向壁膜間隙。可以和本發(fā)明的白蛋白融合蛋白融合從而將多肽的表達(dá)導(dǎo)向細(xì)菌的壁膜間隙的信號(hào)序列或蛋白的實(shí)例包括，但不限于，pelB信號(hào)序列，麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)信號(hào)序列，MBP，ompA信號(hào)序列，位于壁膜間隙的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素B亞基的信號(hào)序列，以及堿性磷酸酶的信號(hào)序列。多種可購(gòu)得的載體可用于構(gòu)建可導(dǎo)向蛋白定位的融合蛋白，例如可自New England Biolabs購(gòu)得的Pmal系列載體(具體為pMAL-p系列)。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多核苷酸白蛋白融合蛋白可以和pelB果膠酸裂合酶信號(hào)序列融合來增加這類多肽在革蘭氏陰性細(xì)菌中的表達(dá)和純化效率。見美國(guó)專利5,576,195和5,846,818，其全文內(nèi)容包含在本文中作為參考。
可以和本發(fā)明的白蛋白融合蛋白融合以導(dǎo)向其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的分泌的信號(hào)肽的實(shí)例包括，但不限于MPIF-1信號(hào)序列(例如GenBank登錄號(hào)為AAB51134的氨基酸1-21)，stanniocalcin信號(hào)序列(MLQNSAVLLLLVISASA，SEQ ID NO10)和共有信號(hào)序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG，SEQ ID NO11)。適宜和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)聯(lián)合使用的信號(hào)序列是gp67信號(hào)序列(例如GenBank登錄號(hào)AAA72759的氨基酸1-19)。
使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作為選擇性標(biāo)記的載體可以分別在藥物methionine sulphoximine或甲氨蝶呤(methotrexate)的存在下被擴(kuò)增。以谷氨酰胺合酶為基礎(chǔ)的載體的優(yōu)勢(shì)在于可利用谷氨酰胺合酶陰性的細(xì)胞系(例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，NSO)。通過提供額外的抑制子來防止內(nèi)源性基因的功能，谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)也可在表達(dá)谷氨酰胺合酶的細(xì)胞(例如中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞)中起作用。谷氨酰胺表達(dá)系統(tǒng)及其組分在以下PCT出版物中詳細(xì)描述WO87/04462；WO86/05807；WO89/01036；WO89/10404；和WO91/06657，其全文包含在本文中作為參考。此外，谷氨酰胺表達(dá)載體可以自Lonza Biologics，Inc.(Portsmouth，NH)獲得。Bebbington等，Bio/tecAnology 10169(1992)和Biblia和RobinsonBiotechnol.Prog.111(1995)中描述了使用GS表達(dá)系統(tǒng)在小鼠骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)和制備單克隆抗體，這些文獻(xiàn)包含在本文中作為參考。
本發(fā)明還涉及含有載體構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，例如本文描述的那些，還包括含有本發(fā)明的核苷酸序列的宿主細(xì)胞，所述核苷酸序列通過使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)與一個(gè)或多個(gè)異源性調(diào)控序列區(qū)(例如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)可操作地連接。宿主細(xì)胞可以是更高等的真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如人來源的細(xì)胞)或較低等的真核細(xì)胞，例如酵母菌細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。可選擇調(diào)節(jié)插入的基因序列的表達(dá)或者以特定所需方式修飾并加工該基因產(chǎn)物的宿主菌株。在特定誘導(dǎo)物的存在下，特定啟動(dòng)子啟動(dòng)的表達(dá)可以被提高；從而可控制基因改造的多肽的表達(dá)。此外，不同的宿主細(xì)胞具有不同的蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后加工和修飾(例如磷酸化，裂解)特性和具體機(jī)制?？蛇x擇適宜的細(xì)胞系以保證對(duì)表達(dá)的外來蛋白進(jìn)行所需的修飾和加工。
磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，轉(zhuǎn)導(dǎo)，感染或其他方法均可影響將本發(fā)明的核酸和核酸構(gòu)建體引入所述宿主細(xì)胞。這類方法在多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中描述，例如Davis等，Basic Methods In Molecular Biology(1986)。事實(shí)上具體涉及本發(fā)明的多肽可以被缺乏重組載體的宿主細(xì)胞表達(dá)。
除了包含含有本發(fā)明所述的載體構(gòu)建體的宿主細(xì)胞以外，本發(fā)明還包含原代，傳代和無限繁殖的脊椎動(dòng)物來源的宿主細(xì)胞，具體為哺乳動(dòng)物來源，所述宿主細(xì)胞經(jīng)過改造消除或取代了內(nèi)源性基因物質(zhì)(例如對(duì)應(yīng)于治療性蛋白的編碼序列可以被對(duì)應(yīng)于治療性蛋白的白蛋白融合蛋白取代)，和/或包括了基因物質(zhì)(可包括例如異源性多核苷酸序列，例如對(duì)應(yīng)于所述治療性蛋白的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白)。與內(nèi)源性多核苷酸可操作地連接的基因物質(zhì)可以活化，改變，和/或擴(kuò)增內(nèi)源性多核苷酸。
此外，可利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將異源性多核苷酸(例如編碼白蛋白，或其片段或變體的多核苷酸)和/或異源性控制區(qū)(例如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)和編碼治療性蛋白的內(nèi)源性多核苷酸序列通過同源重組可操作地連接(見例如，美國(guó)專利5,641,670，1997年6月24日公開；國(guó)際公開WO 96/29411；國(guó)際公開WO 94/12650；Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；和Zijlstra等，Nature 342435-438(1989)，其全文的公開內(nèi)容均包含在本文中作為參考)。
有利地，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可以通過已知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，磷酸纖維素層析，疏水性相互作用層析，親和層析，羥磷灰石層析，疏水電荷相互作用層析和血凝素層析。在一些實(shí)施方案中，高效液相色譜(HPLC)可用于純化。
在優(yōu)選的一些實(shí)施方案中，使用一種或多種以下的色譜柱純化本發(fā)明的白蛋白融合蛋白Q瓊脂糖FF柱，SP瓊脂糖FF柱，Q瓊脂糖高效柱，Blue瓊脂糖FF柱，Blue柱，苯基瓊脂糖FF柱，DEAE瓊脂糖FF，或甲基柱(MethylColumn)。
此外，可利用國(guó)際公開WO 00/44772(全文內(nèi)容包含在本文中作為參考)中所述的方法純化本發(fā)明的白蛋白融合蛋白。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可輕易改造本文所述用于純化本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的方法。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可以從以下物質(zhì)中回收通過重組技術(shù)從原核或真核宿主中制備的產(chǎn)物，所述宿主包括例如細(xì)菌，酵母菌，較高等的植物，昆蟲，和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)重組制備法中所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。此外，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白還可以包括起始的修飾的蛋氨酸殘基，有時(shí)可以是宿主介導(dǎo)方法的結(jié)果。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知在所有真核細(xì)胞中翻譯起始密碼子編碼的N末端蛋氨酸翻譯后通常從任何蛋白中被高效地去除。盡管大多數(shù)蛋白上的N末端蛋氨酸在大多數(shù)原核細(xì)胞中也被有效地去除，但對(duì)于一些蛋白質(zhì)，這種自原核細(xì)胞去除的過程效率很低，與N末端蛋氨酸共價(jià)連接的氨基酸的性質(zhì)有關(guān)。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白以及結(jié)合治療性蛋白或其片段或其變體的抗體可以和例如促進(jìn)純化的肽等標(biāo)記序列融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記氨基酸序列可以是六個(gè)組氨酸的肽，例如pQE載體中提供的標(biāo)記(QIAGEN，Inc.，9259 EtonAvenue，Chatsworth，CA，91311)，其中許多是可以購(gòu)得的。如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86821-824(1989)所述，六個(gè)組氨酸為所述融合蛋白提供了簡(jiǎn)便的純化。其他可用于純化的肽標(biāo)記包括，但不限于，“HA”標(biāo)記，它對(duì)應(yīng)于來自流感病毒紅細(xì)胞凝集素蛋白(influenzahemagglutinin protein)(Wilson etal.，Cell 37767(1984))的一個(gè)表位和″FLAG″標(biāo)記。
此外，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可以和治療性部分偶聯(lián)，所述治療性部分例如細(xì)胞毒素，例如細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑或殺細(xì)胞劑，或者放射活性金屬離子，例如α-發(fā)射離子如213Bi。這種制劑的實(shí)例見美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355，547和WO01/79480(107頁)，包含在本文中作為參考。
白蛋白融合蛋白也可以附著于固體支持物上，所述蛋白具體用于免疫測(cè)定或純化被本發(fā)明的白蛋白融合蛋白縛束，與該白蛋白融合蛋白結(jié)合或者相連的多肽。這種固體支持物包括，但不限于，玻璃，纖維素，聚丙烯酰胺，尼龍，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。
本發(fā)明還提供了該白蛋白融合蛋白的化學(xué)修飾衍生物，所述衍生物具有額外的優(yōu)點(diǎn)，例如該多肽增加的溶解性，穩(wěn)定性和循環(huán)時(shí)間，或降低的免疫源性(見美國(guó)專利4,179,337)。涉及使用聚乙二醇的實(shí)施例見WO01/79480(109-111頁)，包含在本文中作為參考。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的存在和量可以通過使用本領(lǐng)域熟悉的免疫測(cè)定法ELISA測(cè)定。
多肽的使用本文鑒定的每種多肽均有多種用法。以下的說明是示例性的并使用了已知的技術(shù)。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可用于治療，預(yù)防和/或診斷哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人中的多種疾病。這種疾病包括，但不限于，本文表1的標(biāo)題“生物活性”下所述的那些疾病。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可以用作人和非人逆轉(zhuǎn)錄病毒，具體為HIV傳染到未被感染的細(xì)胞的的抑制物。人逆轉(zhuǎn)錄病毒的傳染可以被本發(fā)明的肽抑制，所述病毒包括但不限于所有HIV-1和HIV-2，以及人T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV-I，II，III)。非人逆轉(zhuǎn)錄病毒的傳染可以被本發(fā)明的肽抑制，所述病毒包括但不限于牛白血病病毒(bovine leukosis virus)，貓肉瘤和白血病病毒，猿肉瘤和白血病病毒，和綿羊進(jìn)行性肺炎病毒。
此外，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可用來治療或預(yù)防疾病或病癥。對(duì)于HIV，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可用作預(yù)防或治療AIDS或其他HIV相關(guān)疾病或病癥的預(yù)防劑或治療劑。
此外，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可用作以前未曾感染的個(gè)體急性暴露于HIV病毒后的預(yù)防措施。該肽的這種預(yù)防性用法的實(shí)例包括，但不限于，預(yù)防病毒從母親傳染到胎兒，以及其他存在HIV傳染可能性的設(shè)備，例如在治療設(shè)備中工作者暴露于含有HIV的血液產(chǎn)品的事故。在這樣的情形下，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可以起到預(yù)防性疫苗的作用，其中宿主產(chǎn)生針對(duì)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的抗體，所述抗體通過例如抑制進(jìn)一步的HIV感染來中和HIV病毒。
白蛋白融合蛋白可用于測(cè)定生物樣品中的多肽水平。例如，放射標(biāo)記的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可用來顯影(imaging)體內(nèi)的病毒結(jié)節(jié)(nodes)。測(cè)定實(shí)例在例如美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355,547和WO 0179480(112-122頁)中給出，包含在本文中作為參考，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白也可用于激發(fā)抗體，所述抗體可用來測(cè)定所述治療性蛋白，白蛋白和/或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白自重組細(xì)胞中的蛋白表達(dá)，作為評(píng)估該宿主細(xì)胞的或生物樣品中的轉(zhuǎn)化的一種方法。此外，本法明的白蛋白融合蛋白可用來測(cè)定本文所述的生物活性。
轉(zhuǎn)基因有機(jī)體表達(dá)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的轉(zhuǎn)基因有機(jī)體也包含在本發(fā)明內(nèi)。轉(zhuǎn)基因有機(jī)體是基因被修飾的有機(jī)體，重組的，外源的或克隆的基因物質(zhì)被轉(zhuǎn)移至其中。這種基因物質(zhì)通常稱為轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因的核酸序列可以包括一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，和其他核酸序列如內(nèi)含子，所述序列對(duì)于所編碼的蛋白的最佳表達(dá)和分泌是必要的。轉(zhuǎn)基因可設(shè)計(jì)成導(dǎo)向所編碼蛋白的表達(dá)，從而易化有機(jī)體或由該有機(jī)體制備的產(chǎn)物中回收該蛋白，所述產(chǎn)物例如該有機(jī)體的乳汁，血液，尿液，蛋，頭發(fā)或種子。該轉(zhuǎn)基因可由來自與目的動(dòng)物的種類相同或不同的物種的基因組的核酸序列組成。該轉(zhuǎn)基因可在通常不能發(fā)現(xiàn)特定核酸序列的基因組位點(diǎn)或轉(zhuǎn)基因的通常位點(diǎn)上發(fā)生整合。
術(shù)語“生殖細(xì)胞系轉(zhuǎn)基因有機(jī)體”指一種轉(zhuǎn)基因有機(jī)體，其中基因變異或基因信息被引入生殖系細(xì)胞中，從而顯示轉(zhuǎn)基因有機(jī)體將遺傳信息傳至后代的能力。如果這種后代事實(shí)上具有一些或全部所述變異或遺傳信息，那么它們也是轉(zhuǎn)基因有機(jī)體。所述變異或遺傳信息對(duì)于轉(zhuǎn)基因接受者所屬的有機(jī)體的種類是異源的，只對(duì)特定個(gè)體接受者異源，或者可以是接受者已經(jīng)具備的遺傳信息。在最后一種情形下，變異的或引入的基因與天然基因的表達(dá)可以不同。
轉(zhuǎn)基因有機(jī)體可以是轉(zhuǎn)基因人，動(dòng)物或植物。通過多種不同的方法可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因，所述方法包括轉(zhuǎn)染，電穿孔，顯微注射，胚胎干細(xì)胞中的基因打靶和重組病毒及逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(見例如，美國(guó)專利4,736,866；美國(guó)專利5,602,307；Mullins等(1993)Hypertension 22(4)630-633；Brenin etal.(1997)Surg.Oncol.6(2)99-110；Tuan(ed.)，Recombinant Gene ExpressionProtocols，Methods in Molecular Biology No.62，Humana Press(1997))?？赏ㄟ^任何有利于多種核酸分子共轉(zhuǎn)染的方法將核酸片段引入可重組的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可輕易獲得產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的詳細(xì)方法，包括美國(guó)專利5,489,743和美國(guó)專利5,602,307中的公開內(nèi)容。美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355,547和WO01/79480(151-162頁)還提供了其他信息，包含在文中作為參考。
基因治療編碼本法明的白蛋白融合蛋白的構(gòu)建體可用作基因治療方案的一部分來遞送治療有效量的白蛋白融合蛋白。在體內(nèi)將核酸引入細(xì)胞的一種方法是利用含有編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的核酸的病毒載體。使用病毒載體感染細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是大部分目的細(xì)胞可以獲得核酸。此外，例如通過病毒載體內(nèi)所含的cDNA，在攝入病毒載體核酸的細(xì)胞中有效地表達(dá)該病毒載體內(nèi)編碼的分子。所述白蛋白融合蛋白延長(zhǎng)的血漿半衰期甚至可以補(bǔ)償可能的低表達(dá)水平。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒相關(guān)病毒載體可用作重組基因遞送系統(tǒng)在體內(nèi)轉(zhuǎn)移編碼白蛋白融合蛋白的外源性核酸分子。這些載體提供了將核酸轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的有效遞送，并且被轉(zhuǎn)移的核酸被穩(wěn)定整合入宿主的染色體DNA。這種載體的實(shí)例，使用它們的方法，以及其優(yōu)點(diǎn)和非病毒遞送方法在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355,547和WO01/79480(151-153頁)中詳細(xì)描述，包含在本文中作為參考。
編碼本發(fā)明白蛋白融合蛋白的基因的基因遞送系統(tǒng)可以通過多種方法被引入病人中。例如，基因遞送系統(tǒng)的藥物制劑可以例如通過靜脈注射被系統(tǒng)導(dǎo)入，且該蛋白在目的細(xì)胞中的特定轉(zhuǎn)導(dǎo)主要原因在于基因遞送載體提供的轉(zhuǎn)導(dǎo)特異性，轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列控制該受體基因表達(dá)而導(dǎo)致的細(xì)胞類型或組織類型表達(dá)的特異性，或者二個(gè)因素的結(jié)合。在其他實(shí)施方案中，由于重組基因被非常局部化地引入動(dòng)物中，其起始遞送更加局限。例如，基因遞送載體可以通過導(dǎo)管(見美國(guó)專利5,328,470)或通過立體方法注射(Stereotactic injection)(例如Chen等(1994)PNAS 913054-3057)被引入?；蛑委煒?gòu)建體的藥物制劑可以基本上由可接受的稀釋劑中的基因遞送系統(tǒng)組成，或者可以包括包埋有該基因遞送載體的緩釋基質(zhì)。如果白蛋白融合蛋白可以自例如逆轉(zhuǎn)錄載體等的重組細(xì)胞中完整地產(chǎn)生，所述藥物配制劑可以包含一種或多種產(chǎn)生該白蛋白融合蛋白的細(xì)胞。其他的基因治療法在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355,547和WO01/79480(153-162頁)中描述，包含在本文中作為參考。
藥物或治療組合物本發(fā)明的白蛋白融合蛋白或其配制劑可以通過包括腸外(例如皮下或肌肉內(nèi))注射或靜脈內(nèi)輸注等的任何傳統(tǒng)方式給藥。所述治療可以由單劑量或一段時(shí)間內(nèi)的多劑量(plurality of doses)組成。此外，給藥所述劑量或多劑量的頻率低于與沒有和白蛋白融合的治療性蛋白的給藥頻率。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可以單獨(dú)給藥，可取地以藥物配制劑和一種或多種可接受的載體的形式給藥。所述載體必須是“可接受的”，其含義是能夠與所述白蛋白融合蛋白相容，而對(duì)接受者無害。通常，所述載體是無菌且不含致熱原的水或鹽溶液。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白尤其適合作為水溶液載體中的配制劑，例如無菌無致熱原的水，鹽溶液或其它等張溶液，這是由于其在溶液中的保質(zhì)期延長(zhǎng)。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以在分裝前數(shù)周，數(shù)月或更長(zhǎng)時(shí)間預(yù)先配成水溶液。
可根據(jù)所述白蛋白融合蛋白在溶液配制劑中具有延長(zhǎng)的保質(zhì)期來制備含有白蛋白融合蛋白的配制劑。如上所述，許多這些治療性蛋白與HA融合后其保質(zhì)期顯著增長(zhǎng)或延長(zhǎng)。
在適合給藥氣溶膠的情況下，使用標(biāo)準(zhǔn)方法可將本發(fā)明的白蛋白融合蛋白配制成氣溶膠。術(shù)語“氣溶膠”包括本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的任何含氣懸浮相，它能夠被吸入細(xì)支氣管或鼻通道。具體地，氣溶膠包含本發(fā)明白蛋白融合蛋白的含氣懸浮小液滴，可以在有刻度劑量的吸入器或霧化器，或在噴霧器中產(chǎn)生。氣溶膠還包括懸浮于氣體或其它載體氣體中的本發(fā)明化合物的干粉組合物，例如可以通過從吸入器中吹出而被遞送。
該配制劑可方便地配成單位劑量形式并通過任何制藥領(lǐng)域已知的方法制備。這種方法包括將白蛋白融合蛋白和組成一種或多種附加成分的載體結(jié)合的步驟。通常所述配制劑是通過將所述活性成分和液體載體或者細(xì)碎粒狀的固體載體或者兩種載體按照一致的方式緊密結(jié)合，然后如果有必要，對(duì)所述產(chǎn)物塑造形狀。
適合腸外給藥的配制劑包括水性和非水性的無菌注射液以及水性和非水性的懸液，所述注射液含有抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑和使得所述配制劑適合給藥接受者的溶質(zhì)；所述懸液包括懸浮劑和增稠劑。該配制劑可置于單位劑量或者多劑量容器中，例如密封的安瓿，小瓶或注射器，并可儲(chǔ)存在凍干的條件下，只需在使用前加入無菌的液體載體，例如注射用水?？蓮臒o菌粉末制備即時(shí)注射液和懸液。劑量配制劑(Dosage formulations)含有的治療性白蛋白的摩爾濃度或劑量低于治療性蛋白的非融合(non-fused)的標(biāo)準(zhǔn)配置劑，因?yàn)楸景l(fā)明的許多白蛋白融合蛋白的血清半衰期延長(zhǎng)。
作為一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的治療性白蛋白包含一個(gè)或多個(gè)治療性蛋白區(qū)，其劑量形式可以根據(jù)該白蛋白融合蛋白的效力相對(duì)于該治療性蛋白的效力計(jì)算，同時(shí)還考慮到白蛋白融合蛋白比天然治療性蛋白的血清半衰期和保質(zhì)期延長(zhǎng)。例如，在由與全長(zhǎng)治療性蛋白融合的全長(zhǎng)HA組成的白蛋白融合蛋白中，等單位劑量表示更大的試劑重量但給藥頻率卻減少了。
本發(fā)明的配置劑或組合物可以和試劑盒一起包裝，或者包含在試劑盒中，并含有說明書或包裝插入頁說明該白蛋白融合蛋白組分延長(zhǎng)的半衰期。例如，這種說明書或包裝插入頁可以說明考慮到本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的增長(zhǎng)(extend)或延長(zhǎng)(prolong)的保質(zhì)期而推薦的儲(chǔ)存條件，例如時(shí)間，溫度和光。這種說明書或包裝插入頁還可以說明本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的具體優(yōu)勢(shì)，例如便于儲(chǔ)存需要在野外，受約束的醫(yī)院、臨床或辦公室外使用的配置劑。如上所述，本發(fā)明的配置劑可以是液體形式的，并且在次理想環(huán)境的條件下儲(chǔ)存而不會(huì)顯著丟失治療活性。
本發(fā)明還提供了通過對(duì)病人給藥可藥用的載體中的治療有效量的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白或者編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸(“白蛋白融合多核苷酸”)來治療和/或預(yù)防疾病或病癥的方法(例如，本文公開的任何一種或多種疾病或病癥)。
可通過本領(lǐng)域已知的方法確定給藥本發(fā)明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的有效劑量，所述方法的參數(shù)是生物半衰期，生物利用度和毒性，包括使用例如表1的對(duì)比文件中描述的常規(guī)體外和體內(nèi)研究的數(shù)據(jù)，使用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法。
按與良好的醫(yī)療實(shí)踐一致的方式配置并給藥該白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸，并考慮到個(gè)體病人的臨床狀況(尤其是單獨(dú)使用白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸治療的副作用)，遞送的位點(diǎn)，給藥方法，給藥的時(shí)間安排，以及其它醫(yī)師已知的因素。本文的“有效量”是基于上述考慮因素而確定的。
例如，確定遞送物質(zhì)的有效量有賴于多種因素，例如該物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，病人的年齡和體重，需要治療的準(zhǔn)確情況和嚴(yán)重性，以及給藥的途徑。治療的頻率有賴于多種因素，給藥每劑白蛋白融合蛋白或多核苷酸構(gòu)建體的量以及受者的健康和病史。準(zhǔn)確的量，給藥次數(shù)，以及給藥的時(shí)間安排可以由主治醫(yī)師或有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師確定。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白和多核苷酸可以給藥任何動(dòng)物，優(yōu)選給藥哺乳動(dòng)物和鳥類。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物包括人，犬，貓，小鼠，大鼠，兔子，綿羊，牛，馬和豬，具體優(yōu)選人。
通常主張本發(fā)明的白蛋白融合蛋白給藥較低劑量(未融合的治療性蛋白的摩爾基數(shù))或給藥的頻率低于未融合的治療性蛋白。治療有效量劑量指化合物的劑量足以降低HIV在體內(nèi)的滴度，緩解癥狀或疾病穩(wěn)定或延長(zhǎng)病人的生存期或提高生活質(zhì)量。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)在于它們可以模擬連續(xù)輸注“經(jīng)典藥物”，即相同的抑制活性需要較少的蛋白當(dāng)量。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白具有以下其它優(yōu)點(diǎn)(i)基于HIV感染的表型的劑量最優(yōu)化設(shè)計(jì)，以適合HIV的特定生長(zhǎng)，病毒負(fù)荷或抵抗性特性(例如快速和慢速生長(zhǎng))；和(ii)在治療期間控制/維持藥物濃度在有效的濃度內(nèi)。此外，當(dāng)多肽(例如T-20和T-1249)是疏水性時(shí)，其和白蛋白的融合增加其溶解性，也可使生物利用度增加并可配制成更高濃度的配置劑。
例如，未融合的T-20的臨床試驗(yàn)中使用了典型的50mg每天兩次的劑量(Zhang 2002，Kilby 2002，Kilby 1998)，且在未融合的T-1249的臨床試驗(yàn)中使用12.5mg/天到200mg/天的劑量，并顯示了劑量相關(guān)的HIV抑制作用(Gulick，2002)。預(yù)期本發(fā)明的白蛋白融合蛋白中T-20或T-1249的劑量或給藥頻率(即活性部分的摩爾當(dāng)量)小于未融合的T-20或T-1249的劑量或給藥頻率。
白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可以通過口服，經(jīng)直腸，經(jīng)腸外，腦池內(nèi)，陰道內(nèi)，腹膜內(nèi)，經(jīng)局部(例如通過粉劑，藥膏，膠體，藥滴或經(jīng)皮貼劑)，經(jīng)頰，或作為口腔或鼻內(nèi)噴霧劑的方式給藥?！翱伤幱玫妮d體”指任何無毒的固體，半固體或液體濾液，稀釋劑，膠囊制備材料或其它配制劑輔料。本文所用術(shù)語“腸外”給藥方式包括靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，胸骨內(nèi)，皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注。
以例如美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355,547和WO01/79480(129-130頁)中所述的持續(xù)釋放系統(tǒng)適宜地給藥本發(fā)明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸，該文獻(xiàn)包含在本文中作為參考。
對(duì)于腸外給藥，在一個(gè)實(shí)施方案中，通常通過按所需的純度以單位劑量可注射(溶液，懸液或乳液)的形式混合所述白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸和可藥用的載體，該載體在使用的劑量和濃度下對(duì)受者無毒并與配制劑內(nèi)的其他成分相容。例如，所述配制劑可選不包括氧化劑和其他已知對(duì)治療有害的化合物。
本發(fā)明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可以單獨(dú)給藥或者和其他治療劑聯(lián)合給藥?？梢院捅景l(fā)明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合給藥的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸藥劑包括，但不限于，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒制劑如蛋白酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，整合酶和組裝抑制物；化療劑，抗生素，類固醇和非類固醇抗炎藥劑，傳統(tǒng)的免疫治療劑，和/或例如美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/355,547和WO01/79480(132-151頁)中所述的治療劑的治療，這些文獻(xiàn)包含在本文作為參考?？蓪⑸鲜鏊幬锏慕M合同時(shí)給藥，例如作為混合物同時(shí)給藥，分別但同時(shí)給藥；或者序貫給藥。所述的給藥包括聯(lián)合的藥劑作為治療性混合物被同時(shí)給藥的情況，并且還包括聯(lián)合的藥劑分別但同時(shí)給藥的方法，例如通過分開的靜脈內(nèi)給藥通道輸入同一個(gè)體?！奥?lián)合”給藥進(jìn)一步包括分開給予化合物或藥劑，先給第一種，然后是第二種。
適宜用于本發(fā)明的藥物組合物包括這樣的組合物，其中含有能夠獲得其預(yù)期目的有效量的活性成分。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可以和逆轉(zhuǎn)錄病毒制劑，核苷/核苷酸逆轉(zhuǎn)錄抑制劑(NRTIs)，非核苷逆轉(zhuǎn)錄抑制劑(NNRTIs)，和/或蛋白酶抑制劑(PIs)聯(lián)合給藥。
本發(fā)明還提供了藥物包或試劑盒，所述藥物包或試劑盒包含一個(gè)或幾個(gè)容器，其中充滿一種或幾種包含本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的藥物組合物的成分?？蛇x地這樣的容器攜帶由調(diào)控藥物或生物制品的生產(chǎn)，使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定格式的說明，該說明反映該機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)了為人類用藥所進(jìn)行的生產(chǎn)，使用和銷售。
對(duì)發(fā)明作了一般性描述后，通過參考以下實(shí)施例可以輕易理解相同的內(nèi)容，所述實(shí)施例是用來說明而非限制本發(fā)明的。
無需進(jìn)一步的說明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員即可以利用前述和下列的實(shí)施例，制造并利用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的改變，并實(shí)施要求保護(hù)的方法。因此以下實(shí)施例旨在具體說明本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案，不應(yīng)被理解為以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1構(gòu)建N-末段和C-末端白蛋白-(GGS)4GG接頭克隆載體重組白蛋白表達(dá)載體pDB2243和pDB2244已在專利申請(qǐng)WO 00/44772中描述。重組白蛋白表達(dá)載體pAYE645和pAYE646已在英國(guó)專利申請(qǐng)0217033.0中描述。修飾質(zhì)粒pDB2243以在所述白蛋白多肽的C末端引入一種DNA序列，該序列編碼14個(gè)氨基酸的多肽接頭N-GGSGGSGGSGGSGG-C((GGS)4GG，“N”和“C”表示該多肽序列的方向)，使得另一種多肽鏈可以隨后被插入(GGS)4GG接頭的C末端產(chǎn)生普通構(gòu)型的C-末端白蛋白融合物，白蛋白-(GGS)4GG-多肽。類似地，修飾質(zhì)粒pAYE645以在所述白蛋白多肽的N末端引入編碼(GGS)4GG接頭的DNA序列，使得另一種多肽鏈可以隨后被插入(GGS)4GG接頭的N末端產(chǎn)生白蛋白-(GGS)4GG-多肽的常規(guī)構(gòu)型的N-末端白蛋白融合物。
Sleep，D等(1991)Bio/Technology 9，183-187和專利申請(qǐng)WO 00/44772中所述的質(zhì)粒pDB2243含有酵母PRBI啟動(dòng)子和酵母ADH1終止子，它們提供了適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子序列。用BamHI完全消化質(zhì)粒pDB2243，用T4 DNA聚合酶和dNTPs使凹陷的末端變成平端，并最后再連接產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2566。
雙鏈的合成的寡核苷酸接頭Bsu36I/HindIII接頭是通過退火合成的寡核苷酸JH033A和JH033B而合成的。
JH033A5′-TTAGGCTTAGGTGGTTCTGGTGGTTCCGGTGGTTCTGGTGGATCCGGTGGTTAATA-3′(SEQ ID NO12)JH033B5′-AGCTTATTAACCACCGGATCCACCAGAACCACCGGAACCACCAGAACCACCTAAGCC-3′(SEQ ID NO13)退火后的Bsu36I/HindIII接頭與HindIII/Bsu36I切割的pDB2566連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2575X，該質(zhì)粒包含白蛋白編碼區(qū)，其C末端具有(GGS)4GG肽接頭。
含有酵母PRBI啟動(dòng)子和酵母ADHI終止子的質(zhì)粒pAYE645提供適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子序列，其描述見英國(guó)專利申請(qǐng)0217033.0.。使用限制性酶AflII完全消化質(zhì)粒pAYE645，并用限制性酶HindIII部分消化，然后分離包含酵母PRB1啟動(dòng)子3’末端和rHA編碼序列的DNA片段。質(zhì)粒pDB2241在專利申請(qǐng)WO 00/44772中描述，并用AflII/HindIII消化，分離包含酵母PRB1啟動(dòng)子5’末端和酵母ADH1終止子的DNA片段。然后將來自pAYE645的AflII/HindIII DNA片段克隆入AflII/HindIII Pbd2241載體DNA片段以產(chǎn)生出質(zhì)粒pDB2302。使用PacI/XhoI完全消化質(zhì)粒pDB2302，并分離6.19kb的片段，凹陷的末端用T4 DNA聚合酶和dNTPs處理成平端，并再連接形成質(zhì)粒pDB2465。使用ClaI將質(zhì)粒pDB2465線性化，凹陷的末端用T4 DNA聚合酶和dNTPs處理成平端，并再連接形成質(zhì)粒pDB2533。使用BlnI將該質(zhì)粒線性化，凹陷的末端用T4 DNA聚合酶和dNTPs處理成平端，并再連接形成質(zhì)粒pDB2534。使用BmgBI/BglII完全消化質(zhì)粒pDB2534，分離6.96kb DNA片段并與兩個(gè)雙鏈寡核苷酸接頭VC053/VC054和VC057/VC058中的一個(gè)相連，以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2540，或與兩個(gè)雙鏈寡核苷酸接頭VC055/VC056和VC057/VC058中的一個(gè)相連，以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2541。
VC053
5′-GATCTTTGGATAAGAGAGACGCTCACAAGTCCGAAGTCGCTCACCGGT-3′(SEQ ID NO14)VC0545′-pCCTTGAACCGGTGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCTCTCTTATCCAAA-3′(SEQ ID NO15)。
VC0555′-GATCTTTGGATAAGAGAGACGCTCACAAGTCCGAAGTCGCTCATCGAT-3′(SEQ ID NO16)。
VC0565′-pCCTTGAATCGATGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCTCTCTTATCCAAA-3′(SEQ ID NO19)。
VC0575′-pTCAAGGACCTAGGTGAGGAAAACTTCAAGGCTTTGGTCTTGATCGCTTTCG CTCAATACTTGCAACAATGTCCATTCGAAGATCAC-3′(SEQ ID NO20)。
VC0585’-GTGATCTTCGAATGGACATTGTTGCAAGTATTGAGCGAAAGCGATCAAGACCAAAGCCTTGAAGTTTTCCTCACCTAGGT-3′(SEQ ID NO21)。
通過退火合成的寡核苷酸JH035A和JH035B，合成雙鏈的合成的寡核苷酸接頭，BglIIlAgeI接頭。
JH035A5′-GATCTTTGGATAAGAGAGGTGGATCCGGTGGTTCCGGTGGTTCTGGTGGTTCCGGTGGTGACGCTCACAAGTCCGAAGTCGCTCA-3′(SEQ ID NO22)JH035B5′-CCGGTGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCACCACCGGAACCACCAGAACCACCGGAACCACCGGATCCACCTCTCTTATCCAAA-3′(SEQ ID NO23)
將退火后的BglII/AgeI接頭連接入BglII/AgeI切割的pDB2540以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2573X，該質(zhì)粒包含白蛋白編碼區(qū)和在其N末端的(GGS)4GG肽接頭。
實(shí)施例2N-末端和C-末端白蛋白-T-1249融合物的構(gòu)建構(gòu)建N-末端T-1249-(GGS)4GG-白蛋白表達(dá)質(zhì)粒通過連接兩個(gè)合成的DNA片段產(chǎn)生包含T-1249的氨基酸序列的DNA克隆，所述DNA片段的每一個(gè)都是從兩個(gè)互相重疊的合成的寡肽制備的。DNA片段1是通過退火寡核苷酸5′-GTGAGATCTTTGGATAAC-AGATGGCAAGAATGGGAACAAAAGATTAC-3′(SEQID NO 24) 和5′-CACGAGCTTGTTCCAACAAAGCAGTAATCTTTTGTTCCCATTC-3′(SEQID NO25)，然后用Taq DNA聚合酶進(jìn)行引物延伸反應(yīng)以產(chǎn)生雙鏈DNA片段而產(chǎn)生的。通過類似的方法產(chǎn)生DNA片段2，使用的寡核苷酸是5′-GTGAGCTCAAATTCAACAAGAAAAGAACGAATACGAATTGCAAAAGTTGGACAAGTGGG-3′(SEQ ID NO26)和5′-CACGGATCCACCGAACCATTCCCACAAAGAAGCCCACTTGTCCAACTTTTGCAATTCGTATTC-3′(SEQ ID NO27)。然后用限制性內(nèi)切酶BglII/AluI消化DNA片段1，并用限制性內(nèi)切酶AluI/BamHl消化DNA片段2。然后將這兩個(gè)片段連接于載體pLITMUS29(New England Biolabs)中，用BglII和BamHl消化產(chǎn)生pLIT-T-1249-N。
使用BamHI和BglII完全消化質(zhì)粒pLIT-T-1249-N。將0.14kb DNA片段接入BamHI，BglII消化的pDB2573內(nèi)以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2667。在EP-A-286424中公開并被Sleep，D.，等(1991)Bio/Technology 9，183-187描述的“中斷(disintegration)”質(zhì)粒pSAC35提供了適宜的酵母菌載體序列。使用NotI完全消化質(zhì)粒pDB2667并分離3.15kb N末端T-1249-(GGS)4GG-rHA表達(dá)盒，然后將該表達(dá)盒連接到NotI小牛小腸磷酸酶處理過的pSAC35中，以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2681。
構(gòu)建C-末端白蛋白-(GGS)4GG-T-1249表達(dá)質(zhì)粒使用正向引物5′-GTGGGATCCGGTGGTTGGCAAGAATGGGAACAAAAGATTAC-3′(SEQID NO28)和反向引物5′-CACAAGCTTATTAGAACCATTCCCACAAAGAAGC-3′(SEQ ID NO29)從pLIT-T-1249-N擴(kuò)增PCR片段。使用BamHI和HindIII完全消化所得片段，并接入類似地用BamHl和HindIII消化的載體pLITMUS29中，以產(chǎn)生pLIT-T-1249-C。使用HindIII部分消化質(zhì)粒pDB2575，然后用BamHI完全消化。分離所需的6.55kb DNA片段并與來自質(zhì)粒pLIT-T-1249-C的0.13kbBamHI/HindIII片段連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2668。
在EP-A-286 424中公開并由Sleep，D.，等(1991)Bio/Technology 9，183-187描述的“中斷”質(zhì)粒pSAC35提供了適宜的酵母菌載體序列。使用NotI完全消化質(zhì)粒pDB2668并分離3.15kb C末端rHA-(GGS)4GG-T-1249表達(dá)盒，然后將該表達(dá)盒連接到NotI小牛小腸磷酸酶處理過的pSAC35中，以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2682。
實(shí)施例3構(gòu)建N-末端和C-末端白蛋白-T-20融合物基本克隆的產(chǎn)生T-20序列的克隆可通過以下方法進(jìn)行，對(duì)從細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HIV-1中分離的RNA進(jìn)行RT-PCR，從而擴(kuò)增PCR片段，使用的正向引物為5′-GTGCCTTGGAATGCTAGTTG-3′(SEQ ID NO30)，反向引物為5′-CTTAAACCTACCAAGCCTCC-3′(SEQ ID NO31)，然后將T-20的序列克隆到載體pCR4-TOPO(Invitrogen)中產(chǎn)生pCR4-HIV-T-20。
構(gòu)建N-末端T-20-(GGS)4GG-白蛋白表達(dá)質(zhì)粒使用正向引物DS2235′-CTCTAGATCTTTGGATAAGAGATACACCAGCTTAATACACTCCTTAATTGAA G-3′(SEQ ID NO32)和反向引物DS2245′-CCACCGGATCCACCAAACCAATTCCACAAACTTGCCCATTTATC-3′(SEQ ID NO33)從pCR4-HIV-T-20中擴(kuò)增PCR片段。使用BglII和BamHI以及0.13kb DNA片段將所述DNA片段完全消化，并將該片段偶聯(lián)到類似地用BglII和BamHI消化的pDB2573內(nèi)，以產(chǎn)生pDB2593。通過“中斷”質(zhì)粒pSAC35提供適當(dāng)?shù)慕湍篙d體序列，該質(zhì)粒在EP-A-286 424中公開并被Sleep，D.，等(1991)Bio/Technology 9，183-187描述。NotI N-末端T-20-(GGS)4GG-rHA表達(dá)盒分離自pDB2593，純化后接入NotI消化的pSAC35(已經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理)，從而產(chǎn)生出兩個(gè)質(zhì)粒，第一個(gè)質(zhì)粒pDB2595，其含有表達(dá)方向和LEU2相同的NotI表達(dá)盒，而第二個(gè)質(zhì)粒pDB2596含有NotI表達(dá)方向和LEU2相反的表達(dá)盒。
構(gòu)建C-末端白蛋白-(GGS)4GG-T-20表達(dá)質(zhì)粒使用正向引物DS2255′-TGGTGGATCCGGTGGTTACACCAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGC-3′(SEQ ID NO34)和反向引物DS2265′-AATTAAGCTTATTAAAACCAATTCCACAAACTTGCCCATTTATCTAATTCC-3′(SEQ ID NO35)從pCR4-HIV-T-20擴(kuò)增PCR片段。使用BamHI和HindIII以及0.13kb DNA片段將所述DNA片段完全消化，并將該片段偶聯(lián)到類似地用BamHI和HindIII消化的pDB2575內(nèi)，以產(chǎn)生pDB2594。通過“中斷”質(zhì)粒pSAC35提供適當(dāng)?shù)慕湍篙d體序列，該質(zhì)粒在EP-A-286 424中公開并被Sleep，D.，等(1991)Bio/Technology 9，183-187描述。NotIC-末端rHA-(GGS)4GG-T-20表達(dá)盒分離自pDB2594，純化后接入NotI消化的pSAC35(已經(jīng)小牛小腸磷酸酶處理)，從而產(chǎn)生出兩個(gè)質(zhì)粒，第一個(gè)質(zhì)粒pDB2597含有表達(dá)方向和LEU2相同的NotI表達(dá)盒，而第二個(gè)質(zhì)粒pDB2598含有表達(dá)方向和LEU2相反的NotI表達(dá)盒。
實(shí)施例4酵母菌的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)條件公開于WO 95/23857，WO 95/33833和WO 94/04687中的酵母菌株被轉(zhuǎn)化成Sleep D.，等(2001)Yeast 18，403-421中描述的亮氨酸原養(yǎng)型。取出轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到緩沖的基本培養(yǎng)基上(BMM，Kerry-Williams，S.M.等(1998)Yeast14，161-169描述)并在30℃溫育直到生長(zhǎng)的量足夠進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
實(shí)施例5白蛋白T-20融合蛋白的表達(dá)和純化rHA融合物在搖瓶培養(yǎng)中表達(dá)，并使用標(biāo)準(zhǔn)白蛋白通過SDS測(cè)定其表達(dá)水平。rHA-GS-T-20和T-20-GS-rHA的發(fā)酵培養(yǎng)(如WO 00/44772所述)上清中的表達(dá)水平均＞2g.L-1。
C-末端T-20純化使用WO 00/44772描述的標(biāo)準(zhǔn)rHASP-FF條件和洗脫緩沖液純化C-末端T-20。然后使用標(biāo)準(zhǔn)rHA DE-FF條件純化洗脫物，但在洗脫緩沖液中額外加入了200mM NaCI(該鹽濃度不是最優(yōu)化的，因此可以有變化)。隨后濃縮純化后的物質(zhì)并用PBS滲濾。
N-末端T-20純化使用標(biāo)準(zhǔn)rHA SP-FF條件和洗脫緩沖液純化N-末端T-20。然后使用標(biāo)準(zhǔn)rHA DE-FF條件純化洗脫物。使用標(biāo)準(zhǔn)洗脫緩沖液和含有200mMNaCl的標(biāo)準(zhǔn)洗脫液洗脫DE-FF。兩種洗脫物在SDS-PAGE上的表現(xiàn)不同，并分別作為DE-FF洗脫物#1和DE-FF洗脫物#2被處理。這兩種純化后的物質(zhì)隨后被濃縮至＞5mg/ml并使用10kDa分子量的截留膜(cut-off membranes)以7倍連續(xù)體積的PBS進(jìn)行滲濾。
實(shí)施例6通過在4-12％梯度SDS非還原膠體上去除樣品，并使用抗-HSA抗體進(jìn)行Western蛋白印跡，從而表征純化后的T-20白蛋白融合蛋白。結(jié)果顯示于圖9中。插圖說明(A)膠體為Blue Gel；(B)抗-HSA Western蛋白印跡。如下表加樣

“SPT9901”是酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)物上清，它不含有白蛋白或白蛋白融合物。該物質(zhì)用來顯示W(wǎng)estern蛋白印跡上檢測(cè)到的免疫交叉反應(yīng)是由于表達(dá)白蛋白融合蛋白的酵母菌株產(chǎn)生了一些特定的種類，而不是由于抗體和酵母菌(宿主)來源的成分之間的非特異交叉反應(yīng)性。
實(shí)施例7白蛋白T-20融合蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)動(dòng)物模型通過單次靜脈注射或皮下注射在第0天將白蛋白融合T-20(350μg/kg)給藥每組各三只雄性和三只雌性兔子。抽取血樣用于測(cè)定基線的抗原水平和靜脈給藥檢測(cè)物質(zhì)后5分鐘，10分鐘，20分鐘，30分鐘，45分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，8小時(shí)，24小時(shí)(1天)，48小時(shí)(2天)，72小時(shí)(3天)，5天，7天，9天，11天，和14天的抗原水平和基線的抗原水平，以及皮下注射后30分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，8小時(shí)，24小時(shí)(1天)，48小時(shí)(2天)，72小時(shí)(3天)，5天，7天，9天，11天，和14天的抗原水平。
變量藥代動(dòng)力學(xué)(PK)變量血漿濃度時(shí)間曲線下面積(AUC)，最大濃度(Cmax)，最大濃度時(shí)間(tmax)，平均停留時(shí)間(mean residence time)，吸收和分布的半衰期(如果適用)，清除，分布體積。
分析方法可用抗人白蛋白ELISA測(cè)定白蛋白融合的T-20血漿濃度。白蛋白融合的T-20用于產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。ELISA的檢測(cè)限是5ng/ml。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析個(gè)體血漿濃度通過非線性回歸分析每只動(dòng)物的白蛋白融合的T-20的血漿濃度-時(shí)間分布圖。小于＜5ng/mL的值按5ng/mL處理。從測(cè)定的濃度中減去基線測(cè)定的濃度值。產(chǎn)生的任何負(fù)值都?xì)w零。通過最小平方法將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化指數(shù)模型。對(duì)靜脈給藥后的分布圖，使用開放的雙隔室模型(open two-compartmentmodel)。對(duì)于皮下給藥后的分布圖，使用一級(jí)輸入(first-order input)和滯后時(shí)間(lag time)的開放單隔室模型(open one-compartment model)。
在皮下治療的組中，藥物動(dòng)力學(xué)分析限于對(duì)前七天的血漿濃度水平的分析，這是由于以后推定的抗體形成使得血漿濃度的測(cè)定不可信。
在靜脈給藥治療組，使用線性梯形規(guī)則(linear trapezoidal rule)計(jì)算AUC直到最后的測(cè)定值(AUC0-14d)。
由于皮下給藥組中對(duì)前七天的限制，額外計(jì)算兩組的直至7天的AUC(AUC0-7d)并替換皮下給藥組的AUC0-7d。
總結(jié)和比較分析總結(jié)每種給藥途徑的個(gè)體PK結(jié)果(最小值，中間值，最大值，平均值，標(biāo)準(zhǔn)差)。
對(duì)主要變量進(jìn)行了雙向差異分析(two-way analysis of variance)，所述變量包括清除半衰期，AUC和Cmax(均轉(zhuǎn)化為log形式)。固定的因素是給藥途徑。評(píng)估治療組間的適當(dāng)對(duì)照。還考慮到不等差異(unequal variances)的可能性。
為進(jìn)行分析，假定In(半衰期)，In(AUC)和In(Cmax)都是標(biāo)準(zhǔn)分布的。使用雙側(cè)90％可信區(qū)間，在α水平為0.1時(shí)，比較給藥途徑間的生物利用度(絕對(duì)生物利用度)。
結(jié)果T-20-AFP在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的濃度平均值和標(biāo)準(zhǔn)差都顯示在圖13中。
在通過靜脈給藥治療的動(dòng)物中，T-20-AFP水平顯示的分布期為約10小時(shí)，然后是較慢的清除期(elimination phase)。T-20-AFP的水平在14天內(nèi)保持在100ng/mL以上。
在以皮下注射治療的動(dòng)物中，經(jīng)過2.3小時(shí)的平均遲滯期后，出現(xiàn)了T-20-AFP水平。在注射后24到48小時(shí)之間，達(dá)到峰值水平。在7天內(nèi)，下降曲線與靜脈給藥治療組的曲線幾乎完全相同。該時(shí)間點(diǎn)后，T-20-AFP水平急劇下降，可能表明抗體有干擾。因此，7天以后測(cè)定的值不包括在藥代動(dòng)力學(xué)分析中。
結(jié)論經(jīng)靜脈應(yīng)用后T-20-AFP從血漿中清除的最終的平均半衰期是81小時(shí)，經(jīng)皮下應(yīng)用的半衰期是76小時(shí)。這兩組的半衰期極為一致，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是不顯著的。
靜脈應(yīng)用后，分布期持續(xù)10小時(shí)，而平均半衰期為4.1小時(shí)，然后進(jìn)入清除期。皮下給藥后，平均滯后時(shí)間(average lag-time)是2.3小時(shí)，然后T-20-AFP的水平升高，其平均吸收半衰期為7.9小時(shí)。
皮下應(yīng)用后，生物利用度的0到7天AUC是72％，而Cmax是28％。這些數(shù)據(jù)證明了白蛋白顯著延長(zhǎng)T-20肽的血漿半衰期的能力。據(jù)報(bào)道，人體內(nèi)對(duì)應(yīng)于皮下給藥45和180mg的T-20肽其終末半衰期(Terminal half-life)分別是3.46和4.35小時(shí)(Zhang X等，2002)。加上上述從兔子中獲得的數(shù)據(jù)，估計(jì)在人體內(nèi)與白蛋白融合的T-20肽的血漿半衰期可延長(zhǎng)至少10倍。
實(shí)施例8白蛋白T-20融合蛋白的體外效力在體外利用細(xì)胞-細(xì)胞融合試驗(yàn)測(cè)定HIV肽白蛋白融合物的抗病毒活性?；旧?，將Jurkat細(xì)胞懸液(2×106/ml)與HIV抑制劑或?qū)φ盏鞍兹芤阂约癏IV-1(1.5×105/ml)混合，每種樣品均重復(fù)測(cè)定8次，并在37℃溫育4天。評(píng)估每種樣品的細(xì)胞-細(xì)胞融合的數(shù)量和質(zhì)量，通過融合事件比對(duì)照組的減少測(cè)定抗病毒活性。純化的蛋白和酵母細(xì)胞培養(yǎng)物上清適宜這種方法。
PMT1菌株中產(chǎn)生的T-20標(biāo)準(zhǔn)酵母菌產(chǎn)生的rHA-GS-T-20和T-20-GS-rHA被純化，并在上述試驗(yàn)中篩選其抗病毒活性。對(duì)照包括培養(yǎng)基對(duì)照(RPMI)，1和3μM重組白蛋白。RHA-GS-T-20的濃度為3μM，在該濃度下，RHA-GS-T-20不顯示任何HIV抑制效應(yīng)，而且融合事件的平均數(shù)量與重組白蛋白(Recombumin)對(duì)照組相等。這些結(jié)果顯示在圖10中。使用純化后的T-20-GS-rHA獲得了類似的結(jié)果(2次洗脫，見實(shí)施例6)，但至少1μM的濃度顯示了較小的抗病毒效應(yīng)。O-連接的甘露糖基化很可能解釋rHA-GS-T-20缺乏抗HIV活性或T-20-GS-rHA較低的抗HIV活性。該假設(shè)由以下試驗(yàn)支持。
Pmt1菌株產(chǎn)生的T-20為減少0-連接的糖基化，磷酸甘露糖轉(zhuǎn)移酶1基因缺陷(pmt1)缺陷的酵母菌株可用于表達(dá)rHA-GS-T-20并且目前可觀察到顯著的抗病毒活性。50％抑制濃度在4和13nM之間(圖10)，提示T-20肽的抗病毒活性在類似的范圍內(nèi)(Wild CT等1994.PNAS 919770-9774)。
實(shí)施例9C-末端T-1249白蛋白融合蛋白的表達(dá)和純化在搖瓶培養(yǎng)中表達(dá)rHA融合物，并使用白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品通過SDS-PAGE測(cè)定表達(dá)水平。發(fā)酵培養(yǎng)物(如WO 00/44772中所述，在pH5.5)上清液中rHA-GS-T-1249的表達(dá)水平＞2g.L-1。
使用WO 00/44772中所述的標(biāo)準(zhǔn)rHA SP-FF條件和洗脫緩沖液純化C-末端T-1249。然后使用WO 00/44772中所述的標(biāo)準(zhǔn)rHA SP-FF條件純化洗脫物，但標(biāo)準(zhǔn)rHA洗脫液是用于洗滌棄去部分并另外含有200mM NaCl的標(biāo)準(zhǔn)rHA洗脫緩沖液進(jìn)行額外的洗脫。隨后純化后的物質(zhì)被濃縮到＞5mg/mL并使用10kDa分子量的截留膜以7個(gè)連續(xù)體積的PBS進(jìn)行滲濾。
實(shí)施例10C末端T-1249白蛋白融合蛋白純化后的鑒定將樣品轉(zhuǎn)移到4-12％的梯度SDS非還原膠體上，并用抗-HAS抗體進(jìn)行Western蛋白印跡，通過上述方法鑒定純化后的C-末端T-1249白蛋白融合蛋白。結(jié)果顯示在圖11中。插圖說明(A)膠體為Blue Gel；(B)抗-HSAWestern蛋白印跡。如下加載樣品

實(shí)施例11純化后白蛋白T-1249融合物的體外效力純化標(biāo)準(zhǔn)(PMT1)酵母菌株產(chǎn)生的T-1249-GS-rHA(實(shí)施例9)并在上述試驗(yàn)中檢測(cè)其抗病毒活性。圖12顯示了在10和100nM之間獲得50％抑制濃度(IC50)。
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US 6,258,782US 6,348,568WO 94/28920WO 99/48513WO 99/59615WO 01/03723WO 01/37896EP 0 652 895所述的具體實(shí)施方案是對(duì)本發(fā)明各個(gè)方面的單獨(dú)描述，而不用來限制本發(fā)明的范圍，功能上相同的方法和組分都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，通過說明書和附圖的內(nèi)容，除本說明顯示和描述的內(nèi)容以外的對(duì)本發(fā)明的各種修飾，對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是顯而易見的。此種修飾落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
以上引用的每篇對(duì)比文件的全文內(nèi)容都包含在本文中作為參考。
權(quán)利要求
1.一種白蛋白融合蛋白，它包含HIV融合抑制肽或其片段或變體，和白蛋白或其片段或變體，其中所述自蛋白或其片段或變體具有白蛋白活性。
2.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，它包括HIV env或其片段或變體，和白蛋白或其片段或變體。
3.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述HIV融合抑制肽是與HIVenv結(jié)合的肽。
4.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述HIV融合抑制肽是HIVgp41或其片段或變體。
5.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述HIV融合抑制肽是與HIVgp41結(jié)合的肽。
6.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述HIV融合抑制肽是T-20或T-1249，或T-20或T-1249的片段或變體。
7.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述白蛋白融合蛋白包含至少兩種HIV融合抑制肽或其片段或其變體。
8.權(quán)利要求7的白蛋白融合蛋白，該融合蛋白包含第一HIV融合抑制肽或其片段或變體，和第二HIV融合抑制肽或其片段或變體，其中所述第一HIV融合抑制肽或其片段或變體與所述第二HIV融合抑制肽或其片段或變體不同。
9.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中與非融合狀態(tài)下的HIV融合抑制肽或其片段或其變體的體內(nèi)半衰期相比，所述白蛋白活性具有延長(zhǎng)HIV融合抑制肽或其片段或變體在體內(nèi)的半衰期的能力。
10.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，還包含一種或多種其它HIV融合抑制肽或其片段或變體，或一種或多種其它白蛋白或其片段或變體。
11.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述融合蛋白還包含一個(gè)化學(xué)部分。
12.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中HIV融合抑制肽或其片段或變體與白蛋白的N末端或該白蛋白片段或變體的N末端融合。
13.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中HIV融合抑制肽或其片段或變體與白蛋白的C末端或該白蛋白片段或變體的C末端融合。
14.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中HIV融合抑制肽或其片段或變體與白蛋白的內(nèi)部區(qū)或該白蛋白片段或變體的內(nèi)部區(qū)融合。
15.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中HIV融合抑制肽或其片段或變體通過接頭與白蛋白或該白蛋白的片段或變體分離。
16.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白包括以下結(jié)構(gòu)式R2-R1；R1-R2；R2-R1-R2；R2-L-R1-L-R2；R1-L-R2；R2-L-R1；或R1-L-R2-L-R1，其中R1是至少一種治療性蛋白，肽或多肽序列(包括其片段或變體)，且不必要是相同的治療性蛋白，L是接頭且R2是血清白蛋白序列(包括其片段或變體)。
17.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述白蛋白融合蛋白的體內(nèi)半衰期比處于未融合狀態(tài)的HIV融合抑制肽的體內(nèi)半衰期長(zhǎng)。
18.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中與白蛋白或其片段或其變體融合的HIV融合抑制肽或其片段或其變體，其體外生物活性高于未融合狀態(tài)下的HIV融合抑制肽或其片段或其變體的體外生物活性。
19.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中與白蛋白或其片段或其變體融合的HIV融合抑制肽或其片段或其變體，其體內(nèi)生物活性高于未融合狀態(tài)下的HIV融合抑制肽或其片段或其變體的體內(nèi)生物活性。
20.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，所述蛋白在酵母中表達(dá)。
21.權(quán)利要求20的白蛋白融合蛋白，其中所述酵母是糖基化缺陷的。
22.權(quán)利要求20的白蛋白融合蛋白，其中所述酵母是糖基化和蛋白酶缺陷的。
23.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，所述蛋白被哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)。
24.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，所述白蛋白融合蛋白被哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)在培養(yǎng)物中。
25.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-24中任意一項(xiàng)的白蛋白融合蛋白和載體。
26.一種藥物組合物，其包含有效量的權(quán)利要求1-24中任意一項(xiàng)的白蛋白融合蛋白和可藥用的載體或賦形劑。
27.治療病人的疾病或病癥的方法，包括給藥有效量的權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白的步驟。
28.治療患有可用HIV融合抑制肽治療的HIV感染的病人的方法，包括給藥有效量的權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白的步驟。
29.延長(zhǎng)HIV融合抑制肽或其片段或其變體的體內(nèi)半衰期的方法，包括將所述HIV融合抑制肽或其片段或其變體與白蛋白或白蛋白片段或變體融合的步驟，所述白蛋白或其片段或變體足以延長(zhǎng)非融合狀態(tài)下的該HIV融合抑制肽或其片段或其變體的體內(nèi)半衰期。
30.延長(zhǎng)哺乳動(dòng)物體內(nèi)HIV融合抑制肽的的半衰期的方法，所述方法包括將所述HIV融合抑制肽與白蛋白相連接，形成白蛋白融合的HIV融合抑制肽，并將所述白蛋白融合的HIV融合抑制肽給藥所述哺乳動(dòng)物，從而將所述白蛋白融合的HIV融合抑制肽的半衰期延長(zhǎng)，超過未連接白蛋白的HIV融合抑制肽的半衰期的至少兩倍。
31.一種核酸分子，包含編碼權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白的多核苷酸序列。
32.包含權(quán)利要求31的核酸分子的載體。
33.含有權(quán)利要求31的核酸分子的宿主細(xì)胞。
34.抑制HIV傳染到細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與有效濃度的權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白或核酸構(gòu)建體接觸有效的一段時(shí)間，從而使所述細(xì)胞不被病毒所感染，所述核酸構(gòu)建體能夠表達(dá)有效濃度的權(quán)利要求1所述的白蛋白融合蛋白。
35.中和宿主中的HIV的方法，包括對(duì)宿主給藥有效濃度的權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白或核酸構(gòu)建體，使得宿主產(chǎn)生的免疫應(yīng)答足以中和病毒，并抑制病毒感染宿主中未被感染的細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體能夠表達(dá)有效濃度的權(quán)利要求1所述的白蛋白融合蛋白。
36.中和宿主中的HIV的方法，包括對(duì)宿主給藥有效濃度的權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白激發(fā)的抗體，從而抑制宿主中未被感染的細(xì)胞的病毒感染。
37.最小化用HIV融合肽治療哺乳動(dòng)物的副作用的方法，所述方法包括給藥白蛋白融合的HIV融合抑制肽或能夠?qū)λ霾溉閯?dòng)物表達(dá)所述HIV融合抑制肽的核酸構(gòu)建體。
38.生產(chǎn)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白的方法，所述方法包括(a)提供一種核酸，所述核酸包含編碼可在細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)表達(dá)白蛋白融合蛋白的核苷酸序列；(b)在細(xì)胞或有機(jī)體中表達(dá)所述核酸以形成白蛋白融合蛋白；和(c)純化所述白蛋白融合蛋白。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述白蛋白融合蛋白在糖基化缺陷的酵母菌菌株中表達(dá)。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述白蛋白融合蛋白在有糖基化能力的酵母菌菌株中表達(dá)。
41.用于誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物中對(duì)HIV感染的免疫力的疫苗組合物，包括可藥用的載體和治療有效量的權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白或能夠表達(dá)有效濃度的權(quán)利要求1所述的白蛋白融合蛋白的核酸構(gòu)建體。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的疫苗組合物，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
43.誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物中對(duì)HIV感染的免疫力的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求41的疫苗組合物。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含例如T－20和/或T－1249肽(包括，但不限于其片段及其變體)等的HIV融合抑制肽的蛋白，所述蛋白顯示抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性，并融合于白蛋白(包括，但不限于白蛋白的片段及變體)。這些融合蛋白在本文中統(tǒng)稱“本發(fā)明的白蛋白融合蛋白”。這些融合蛋白顯示延長(zhǎng)的保質(zhì)期和/或延長(zhǎng)的或治療性活性。本發(fā)明包括治療性白蛋白融合蛋白，組合物，藥物組合物，配制劑和試劑盒。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有這些核酸的載體，由這些核酸和載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和使用這些核酸，載體和/或宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的方法。本發(fā)明還涉及抑制HIV－誘導(dǎo)的細(xì)胞融合的組合物和方法。本發(fā)明還涉及抑制HIV傳染至未感染細(xì)胞的組合物和方法。
文檔編號(hào)A61P31/18GK1642567SQ03806968
公開日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月7日
發(fā)明者漢斯-彼得·豪澤, 托馬斯·韋默, 達(dá)雷爾·斯利普 申請(qǐng)人:達(dá)爾塔生物技術(shù)有限公司