專利名稱：脂聯(lián)素的糖基同工型及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總體涉及新陳代謝(更具體而言不僅僅是葡萄糖代謝)和脂聯(lián)素(adiponectin)(更具體而言不僅僅是脂聯(lián)素的糖基同工型)對新陳代謝的調(diào)控方面。
背景技術：
在本說明書中被加以編號引作參考的出版物對應于本說明書結尾所列的參考文獻。
脂聯(lián)素(也稱為ACRP30、脂肪Q或GBP28)是一種專一地由脂肪細胞分泌的蛋白，其最初由四個研究小組采用不同的方法克隆得到。見如，Scherer，P.E.，等，生物學化學期刊(journal of biological chemistry)270(45)26746-26749(1995)；Nakano，Y.，等，生物化學期刊(journalof biochemistry)120(4)803-12(1996)；Hu，E.，等，生物學化學期刊(journal of biological chemistry)271(18)10697-10703(1996)和Maeda，K.，等，生物化學與生物物理學研究通訊(Biochemical &Biophysical Research Communications)，c221(2)286-9(1996)。脂聯(lián)素基因位于染色體的3q27上，3q27是2型糖尿病和其他代謝綜合征的易感基因座[12-14]。一些最新研究表明脂聯(lián)素可能是關鍵的、長期尋找的與肥胖癥、胰島素耐受和2型糖尿病相關的激素[9-11]。
本發(fā)明人已經(jīng)假定一些糖基化形式的以及許多其他形式脂聯(lián)素的功效。
在2002年12月18日提交的NZ專利申請523410和523411(尚未公開)和相應的US臨時專利申請中，本發(fā)明人要求保護各種形式脂聯(lián)素(包括人的哺乳動物的脂聯(lián)素)分別在治療哺乳動物或人的肝臟疾病和TNF-α相關疾病中的用途。
肝臟疾病(包括但不限于酒精性肝臟疾病(ALD))困擾全世界成千上萬名患者，是發(fā)達國家中導致死亡的主要原因之一1。
例如，酒精性肝臟疾病發(fā)展的特征是脂肪變性(脂肪浸潤)、發(fā)炎、壞死和最終纖維化和肝硬變；當發(fā)生嚴重的肝炎時，通常導致死亡2。
當前還沒有可以預防和逆轉(zhuǎn)酒精性肝臟疾病的有效藥物試劑。
解釋酒精誘導的肝中毒(hepatoxicity)的機理是復雜并且原因多樣。
許多最近的研究表明，一些通過激活的Kupffer細胞產(chǎn)生的促炎細胞因子可能與酒精性肝臟疾病的發(fā)病有關4，5。例如，在由酒精誘導的肝損傷的人類患者與動物模型中，已經(jīng)觀察到TNF-α、白細胞介素(IL)-1β和IL-6的循環(huán)水平升高6，7。這些細胞因子的表達水平與疾病過程密切相關。Kupffer細胞的損耗防止向胃內(nèi)飼喂酒精的模型中的酒精誘導的早期肝損傷8，并且還能夠抑制口服飼喂酒精的模型中的酒精誘導的微泡和大泡的脂肪變性9，這些發(fā)現(xiàn)進一步證實這些細胞因子在ALD發(fā)病機理中的關鍵性作用。酒精性肝臟損傷通過施用抗TNF-α的抗體極大地減弱10，并且可以通過TNF-α受體1擊昏小鼠中消除11。而且，用抑制Kupffer細胞中TNF-α生成的化合物，即反應停處理，能徹底地預防大鼠發(fā)生酒精性肝損傷12。
與促炎細胞因子相反，一些抗炎細胞因子已經(jīng)被證明具有保護肝的作用7。
人脂聯(lián)素(也稱作ACRP30、脂肪Q(adipoQ)和GBP28)是一種專一地由脂肪組織分泌的蛋白13。
脂聯(lián)素最初由四個研究小組采用不同的方法克隆得到。見，如Scherer，P.E.，等，生物學化學期刊(Journal of Biological Chemistry)270(45)26746-26749(1995)；Nakano，Y.，等，生物化學期刊(Journalof Biochemistry)120(4)803-12(1996)；Hu，E.，等，生物學化學期刊(Journal of Biological Chemistry)271(18)10697-10703(1996)和Maeda，K.，等，生物化學與生物物理學研究通訊(Biochemical &Biophysical Research Communicatuions)，c221(2)286-9(1996)。人類脂聯(lián)素基因位于染色體3q27上。
人和小鼠的脂聯(lián)素與這些蛋白具有模塊設計(modular design)的蛋白質(zhì)家族共有序列同源性，即特征性的NH2-末端膠原樣區(qū)域和COOH-末端補體因子Clq樣球形域的蛋白家族共有序列同源性。脂聯(lián)素的三維結構與TNF-α的十分相似14。
Maeda等15已經(jīng)證實在小鼠中不能生成內(nèi)源性脂聯(lián)素，恢復生成脂聯(lián)素mRNA的能力可以降低脂肪細胞中存在的TNF-αmRNA水平的異常升高，以及降低血漿中TNF-α水平的異常升高。
但是，應當指出逐漸增多的被充分闡述的關于基因表達的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后控制的機制，如可選的mRNA剪接、內(nèi)部核糖體進入、翻譯移碼和/或再編碼、和氨基酸的翻譯后修飾如糖基化，都過于簡單地提出一種基因僅能夠編碼一種多肽產(chǎn)物的觀點。因此，恢復產(chǎn)生特定mRNA的能力不必確定該mRNA的哪種可能多肽產(chǎn)物或者可能多肽產(chǎn)物的何種組合，將會產(chǎn)生任何可觀察到的生物學效果。
已經(jīng)證明將脂聯(lián)素施用給小鼠會對脂類代謝產(chǎn)生有益作用，如從血漿中增強脂類的清除和增加肌肉中脂肪酸的β-氧化16，17。脂聯(lián)素能夠直接作用于肝組織并抑制葡萄糖生成18，19。脂聯(lián)素還具有直接的抗炎作用20。
最近，脂聯(lián)素被證明是治療肥胖相關的代謝綜合征的有前景的候選藥物13。給小鼠補充重組的脂聯(lián)素能夠減少高血糖癥18，反轉(zhuǎn)胰島素耐受16和引起持續(xù)的體重下降而不影響食物攝取17。
本發(fā)明人還假設脂聯(lián)素可能具有保護肝臟的作用，脂聯(lián)素及其激動劑可被臨床應用于肝臟疾病的治療中，包括乙醇相關的肝臟疾病。
因此，本發(fā)明人用小鼠脂聯(lián)素在具有酒精誘導的肝損傷的小鼠模型中驗證這種假設。
結果，本發(fā)明人根據(jù)脂聯(lián)素和/或其激動劑在小鼠中的活性，確定了它們在哺乳動物(包括人類)的肝臟疾病包括酒精誘導的肝損傷中的作用。
本發(fā)明人還證明了許多肝臟癥狀伴隨著低血液和脂肪濃度的脂聯(lián)素蛋白和脂聯(lián)素mRNA(與酒精攝食相關的數(shù)據(jù)，見本申請)，如酒精性肝臟疾病、酒精性肝脂肪變性、酒精性肝炎和酒精性肝壞死、糖尿病性脂肪變性和糖尿病、高脂肪食物±肝脂肪變性繼發(fā)的胰島素耐受。
在長期采食高脂肪的含有酒精食物后，小鼠體內(nèi)小鼠脂聯(lián)素的循環(huán)濃度顯著降低。給這些小鼠施用重組的小鼠脂聯(lián)素顯著地減輕肝腫大和脂肪變性(脂肪肝)，而且還顯著地降低炎癥和血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平的升高。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)小鼠脂聯(lián)素治療降低肝臟中TNF-α生成，和脂肪酸合酶和脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白CD36的表達。
TNF-α是具有多重生物活性的調(diào)控細胞因子。TNF-α在殺死腫瘤、調(diào)節(jié)對組織損傷的反應和保護宿主免受各種微生物感染中起總體作用。例如，TNF-α由已經(jīng)被革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)激活的巨噬細胞釋放，并且可能是參與細菌性膿毒病相關的內(nèi)毒素休克的發(fā)生和發(fā)病機理的極其重要的內(nèi)源性介質(zhì)。
但是，在一些疾病狀態(tài)和炎癥反應如類風濕性關節(jié)炎、惡病質(zhì)、和敗血性休克中，其活性似乎是過度的。過量的TNF-α導致過度免疫反應，表現(xiàn)為過度刺激分泌白細胞介素-6和粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、多形核噬中性白細胞的細胞毒性升高，和細胞粘著分子表達延長，所有這些都具有有害作用。
在動物模型中，抑制炎癥反應過程中的TNF-α活性的有益效果已經(jīng)用TNF-α的中和單克隆抗體證實。
TNF-α的生物活性包括抑制脂蛋白脂肪酶合成(“惡液質(zhì)素”)、激活多形核白細胞、抑制細胞生長或刺激細胞生長、對一些被轉(zhuǎn)化的細胞類型的細胞毒性作用、抗病毒活性、刺激骨吸收、刺激膠原酶和前列腺素E2生成，和免疫調(diào)控作用，包括激活T細胞、B細胞、單核細胞、胸腺細胞和刺激主要組織相容性復合物I類和II類分子的細胞表面表達。
TNF-α因其導致組織損傷的促炎作用而著名，如誘導血管內(nèi)皮細胞的促凝血活性、提高嗜中性粒細胞和淋巴細胞的附著，和刺激血小板激活因子從巨噬細胞、嗜中性粒細胞和血管內(nèi)皮細胞中釋放。
TNF-α與許多感染、免疫紊亂、腫瘤病理學的發(fā)病機理相關，如在伴隨著一些惡性腫瘤的惡病質(zhì)中，和在自身免疫病理學和移植物抗宿主病理學中。TNF-α與癌癥和感染病理學的聯(lián)系往往與宿主的分解代謝狀態(tài)相關。癌癥患者中的一個主要問題是體重下降，通常伴隨著食欲減退。過度消瘦導致所謂的“惡病質(zhì)”。惡病質(zhì)包括體重逐漸下降、食欲減退、和身體機能由于惡性腫瘤的生長持久地被損害。基本生理紊亂可能與生物攝取相對于能量消耗下降相關。因而惡病質(zhì)狀態(tài)與嚴重的發(fā)病率相關，構成癌癥死亡率的主要部分。許多研究表明在癌癥、感染病理學和其他分解代謝狀況中，TNF-α是惡病質(zhì)的重要介質(zhì)。
在革蘭氏陰性膿毒和內(nèi)毒素性休克的病理生理結果中，包括發(fā)燒、不適、食欲減退和惡病質(zhì)，TNF-α被認為起主要作用。內(nèi)毒素是潛在的單核細胞/巨噬細胞活化劑，刺激TNF-α和其他細胞因子的產(chǎn)生和分泌。由于TNF-α能夠模仿內(nèi)毒素的許多生物學作用，TNF-α被推斷是導致內(nèi)毒素相關疾病的臨床表現(xiàn)的主要介質(zhì)。
TNF-α和其他單核細胞來源的細胞因子介導對內(nèi)毒素的代謝和神經(jīng)激素的反應。將內(nèi)毒素施給人類志愿者引起的急性疾病具有類似感冒癥狀，包括發(fā)燒、心動過速、代謝速度和應激激素釋放升高。在患有革蘭氏陰性膿血癥的患者中也發(fā)現(xiàn)TNF-α的循環(huán)水平升高。用TNF-α(由于其殺腫瘤的作用)治療癌癥患者，表明大于545微克/m2/24小時的劑量產(chǎn)生了與給健康的人注射內(nèi)毒素(4ng/kg)類似的變化，說明了TNF-α作為敗血癥和內(nèi)毒素反應的主要宿主介質(zhì)的作用。給人或大鼠長期靜脈內(nèi)灌注TNF-α與食欲減退、液體保持力、急性期反應和負氮平衡相關(即典型的分解代謝作用)，說明TNF-α可能與嚴重疾病中出現(xiàn)的許多變化相關。
在此所用的“TNF-α相關疾病”或“TNF-α疾病”或“TNF-α紊亂”是由于存在TNF-α而產(chǎn)生或惡化的，和/或能夠通過抑制和/或拮抗作用于TNF-α或TNF-α的作用位點來治療的疾病或紊亂。這種疾病或紊亂包括，例如，炎癥性疾病(如糖尿病并發(fā)癥如視網(wǎng)膜病、腎病、神經(jīng)病、主要血管和微血管紊亂、糖尿病性腎?。魂P節(jié)炎如慢性類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、類風濕性脊髓炎和骨膜瘤形成(periosteosis)；術后/外傷后的炎癥；腫脹修復；咽炎；膀胱炎；肺炎；心肌炎；心肌癥；特發(fā)性皮炎；炎癥性腸道疾病如克隆病和潰瘍性結腸炎；腦膜炎；炎癥性眼病；炎癥性肺病如肺炎、硅肺、結節(jié)性肺病、炎癥性骨紊亂和肺結核)、循環(huán)疾病(如慢性心力衰竭包括心律不齊、心絞痛、心肌梗死、心功能不全和充血性心力衰竭，動脈硬化包括動脈粥樣硬化癥、高血壓、深靜脈血栓、閉塞性外周循環(huán)衰竭，局部的大腦循環(huán)衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血綜合癥、雷諾病、Buerger病)、門脈高壓、肺動脈高壓、變應性疾病如哮喘、過敏性鼻炎、結膜炎、消化道過敏反應、花粉病和過敏反應、慢性閉塞性肺病、膠原形成(如紅斑狼瘡、皮肥厚、多發(fā)性動脈炎)、克隆病、自體免疫溶血性貧血、牛皮癬、肝臟疾病如肝炎包括慢性病和硬化、胰腺病如胰腺炎、神經(jīng)變性疾病(如阿爾茨海默氏病、帕金森病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、AIDS、腦病)、中樞神經(jīng)衰竭(例如腦血管衰竭如腦出血和腦梗塞及其后遺癥、顱創(chuàng)傷、脊髓損傷、腦水腫、癡呆、健忘癥、失憶、多發(fā)性硬化)、毒血癥(如敗血癥、敗血性休克、內(nèi)毒素休克、革蘭氏陰性敗血癥、毒素休克綜合癥)、更年期衰退、妊娠中毒、肥胖病、高脂血癥、高膽固醇血癥、異常葡萄糖耐受、實體瘤、腫瘤(如惡性黑色素瘤、惡性淋巴瘤、消化器官(如胃、腸道)的癌癥、癌癥和伴隨的惡病質(zhì)、內(nèi)分泌疾病(如Addison病、Cushing綜合癥、黑素細胞瘤、原發(fā)性醛固酮增多癥)、Creutzfeldt-Jakob病、病毒感染(如巨細胞病毒、流感病毒、皰疹病毒等的感染)、經(jīng)皮冠狀動脈成形成形、血管肥大或閉塞、PTCA/支架/旁路手術后的血管再閉塞/再狹窄、干預后的血管肥大或閉塞、抑制植入誘導的血管衰退和排斥、器官或組織移植后的排斥和自體免疫疾病(如器官特異性疾病如甲狀腺炎或非特異性器官疾病如風濕癥的和骨性關節(jié)炎)、在新型(neopastic)治療過程中TNF生成相關的負作用，還消除和改善與治療或預防移植排斥相關的休克相關綜合癥、透析性低血壓、青光眼、眼壓高、重癥肌無力、長期脫脂癥(defatigation)、骨病(如骨折、骨再折、骨質(zhì)疏松癥、骨軟化、骨Behcet病、強直性脊柱炎、慢性風濕性關節(jié)炎、膝關節(jié)炎以及在相關疾病中關節(jié)組織損壞)、神經(jīng)紊亂包括對各個神經(jīng)、神經(jīng)根、脊髓和/或大腦的創(chuàng)傷、損傷壓迫(如急性脊髓和大腦損傷、髓鞘脫失病、如多發(fā)性硬化癥、由轉(zhuǎn)移腫瘤、原發(fā)性或轉(zhuǎn)移的大腦腫瘤產(chǎn)生的脊髓壓迫、由轉(zhuǎn)移腫瘤產(chǎn)生的慢性疼痛綜合癥、炎癥性CNS疾病，如亞急性硬化型全腦炎(panenencephalitis)、亨廷頓病、Guillain-Barre綜合癥、Bell氏癱瘓、糖尿病性神經(jīng)病、視神經(jīng)炎、黃斑退化、色素性視網(wǎng)膜炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、肌肉萎縮癥，和多肌炎-皮肌炎)，TNF-α誘導的胰島素耐受、異常凋亡(如病毒誘導的凋亡抑制)、糖尿病或應激高血糖癥的并發(fā)癥(如心肌梗塞、充血性心力衰竭，和心原性休克)、慢性阻塞性肺疾病、慢性支氣管炎和肺氣腫。
發(fā)明概述在一個方面，本發(fā)明是脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽被糖基化并且其中脂聯(lián)素是重組的、分離的、純化的或合成的。優(yōu)選但不是必須，所述脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選糖基化的脂聯(lián)素多肽為至少約50％純度(更優(yōu)選為至少約80％純度)(更加優(yōu)選為至少約90％純度)(還更加優(yōu)選為至少約95％純度)和(最優(yōu)選為至少約99％純度)。
對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨?；涣u基化或者未被羥基化。在一些實施方案中，對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨?；涣u基化。在另一些實施方案中，該脯氨?；幢涣u基化。
優(yōu)選地至少一個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化。
優(yōu)選地糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一種或多種。
在一些實施方案中，對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的兩個或更多個賴氨酸殘被糖基化。在其他實施方案中，對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的三個或更多個賴氨酸殘基被糖基化。還有在其他實施方案中，對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的全部四個賴氨酸殘基都被糖基化。
無論被糖基化的賴氨酸殘基，優(yōu)選地糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一種或多種。優(yōu)選脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65的位置上具有一個或多個α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基、在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基68的位置上具有一個或多個α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基、在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基77的位置上具有一個或多個α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基、和/或在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上具有一個或多個α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基(即所有15種可能性)。
在本發(fā)明的一些類型中，脂聯(lián)素多肽在每個賴氨酸殘基65、68、77和101上具有至少一個糖部分。
優(yōu)選地糖基化具有單個糖部分。在其他實施方案中，糖基化具有多種糖成分。
本發(fā)明還包括前述的脂聯(lián)素多肽，其與由藥學上可接受的賦形劑、共活性劑(co-active)或稀釋劑中的一種或多種配制以適合于施用給哺乳動物患者。
還有另一個方面，本發(fā)明為在對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的位置上具有羥脯氨?；鶜埢闹?lián)素多肽，其中該多肽是重組的、分離的、純化的或合成的。
該多肽可以與由藥學上可接受的賦形劑、共活性劑或稀釋劑的一種或多種一起配制以適合于施用給哺乳動物患者。
在還有一方面，本發(fā)明是藥物組合物、其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的每個殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸的脂聯(lián)素多肽。
在另一個方面，本發(fā)明是藥物劑量單位，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的每個殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸的脂聯(lián)素多肽。
在另一個方面，本發(fā)明是包含脂聯(lián)素多肽的組合物，其中脂聯(lián)素多肽被糖基化和其中該脂聯(lián)素多肽(優(yōu)選人的)是重組的、分離的、純化的、或合成的。
優(yōu)選組合物與其他藥學上可接受的賦形劑、共活性劑、稀釋劑等配制以適合于施用給哺乳動物患者。
優(yōu)選對應于人脂聯(lián)素的殘基91的脂聯(lián)素多肽的殘基是羥基脯氨酸。
優(yōu)選至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化。
優(yōu)選糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
在一些類型中，對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的兩個或更多個賴氨酸殘基被糖基化，對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的三個或更多個賴氨酸殘基被糖基化，或者對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的全部四個賴氨酸殘基都被糖基化。
優(yōu)選糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
優(yōu)選對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的每個殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸。對應于人脂聯(lián)素的殘基91的人脂聯(lián)素多肽的殘基不必是羥基脯氨酸，但是優(yōu)選被羥基化。
糖基化可以具有單一糖部分或者具有多種糖部分。
優(yōu)選脂聯(lián)素多肽在每個賴氨酸殘基65、68、77和101上具有至少一個葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。
優(yōu)選脂聯(lián)素多肽具有天然哺乳動物脂聯(lián)素多肽的序列。
優(yōu)選脂聯(lián)素多肽基本上不含至少一個未被糖基化的脂聯(lián)素多肽的同工型(isoform)。
優(yōu)選地組合物基本上不含同工型1。
優(yōu)選地組合物基本上不含同工型2。
優(yōu)選地組合物基本上不含任何未被糖基化的脂聯(lián)素多肽同工型。
優(yōu)選主要脂聯(lián)素多肽種類完全被糖基化。
優(yōu)選Lys-65、68、77和101全部被糖基化。
組合物可能含有一種以上脂聯(lián)素多肽同工型。
優(yōu)選同工型3是組合物中主要的脂聯(lián)素多肽，或同工型4是組合物中主要的脂聯(lián)素多肽，或同工型5是組合物中主要的脂聯(lián)素多肽，或同工型6是組合物中主要的脂聯(lián)素多肽。
將組合物施用給哺乳動物提高胰島素的作用。組合物有效地使亞生理血液胰島素濃度產(chǎn)生正常生理血液胰島素濃度的生物學作用。
在另一個方面，本發(fā)明是還包含胰島素的組合物。
優(yōu)選胰島素以足以產(chǎn)生在約50pM到約400pM之間的血液胰島素濃度的含量或濃度存在。
優(yōu)選胰島素以足以產(chǎn)生在約100pM到約300pM之間的血液胰島素濃度的含量或濃度存在。
優(yōu)選胰島素以足以產(chǎn)生約200pM的血液胰島素濃度的含量或濃度存在。
優(yōu)選當被施用給個體時，組合物抑制糖原異生。
優(yōu)選組合物有效地產(chǎn)生在1microg/mL到20microg/mL之間的血漿脂聯(lián)素多肽濃度(更優(yōu)選地產(chǎn)生在1.9microg/mL到17microg/mL之間的血漿脂聯(lián)素多肽濃度)。
在另一個方面，本發(fā)明是在個體中診斷存在或易于產(chǎn)生疾病狀態(tài)的方法，包括在該個體中確定特定脂聯(lián)素多肽同工型的水平或者至少兩種糖基化的脂聯(lián)素多肽同工型的表達模式，比較該表達模式與未患有該疾病狀態(tài)的個體的表達模式特征，其中表達模式的不同指示存在或易于產(chǎn)生該疾病。
優(yōu)選所用的脂聯(lián)素多肽同工型是先前定義的和/或下文參照附圖定義的糖基化的脂聯(lián)素多肽。
優(yōu)選個體是人。
疾病狀態(tài)可以是高血糖癥、胰島素耐受、與胰島素耐受相關的代謝綜合征、2型糖尿病、或肥胖癥(如包括體重增加、降低或控制或防止體重增加)、代謝綜合征包括高血壓、動脈硬化形成(artherosclerosis)、冠心病、缺血性心臟病、或多囊卵巢綜合征。
這些疾病可以是任何別處提及疾病，包括與肝臟和TNF-α相關的疾病。
脂聯(lián)素多肽可以從生物樣本中獲得。
水平或表達模式通過量化或評價糖基化的脂聯(lián)素多肽同工型的表達模式來獲得。評價方法優(yōu)選采用電泳、HLPC、或質(zhì)譜分析?？蛇x地或優(yōu)選采用特異性抗糖基化的脂聯(lián)素多肽同工型的抗體來量化和評價水平和表達模式。
在另一個方面，本發(fā)明是在個體中診斷存在或易于產(chǎn)生疾病狀態(tài)的方法，包括在該個體中確定特定脂聯(lián)素多肽同工型的水平或者至少兩種糖基化的脂聯(lián)素多肽同工型的表達模式，比較該表達模式與患有該疾病狀態(tài)的個體的表達模式特征，其中表達模式相似表示存在或傾向于產(chǎn)生該疾病。
所用的脂聯(lián)素多肽同工型優(yōu)選為前述的糖基化的脂聯(lián)素多肽。
優(yōu)選任何一種或多種所用的脂聯(lián)素多肽同工型是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選個體為人。
疾病狀態(tài)可以是高血糖癥、胰島素耐受、與胰島素耐受相關的代謝綜合征、2型糖尿病、或肥胖癥、代謝綜合征包括高血壓、動脈硬化形成、冠心病、缺血性心臟病、或多囊卵巢綜合征。
脂聯(lián)素多肽可以從生物樣本中獲得。
水平或表達模式優(yōu)選通過量化或評價糖基化的脂聯(lián)素同工型的表達模式來獲得。評價方法可以采用電泳、HLPC、或質(zhì)譜分析。水平和表達模式采用特異性抗糖基化的脂聯(lián)素多肽同工型的抗體來量化或評價。
在還有另一個方面，本發(fā)明是治療與脂聯(lián)素多肽調(diào)控或迷亂的胰島素敏感性相關的疾病狀態(tài)的方法，包括施用有效量的糖基化的脂聯(lián)素多肽，伴隨有或沒有藥學上可接受的賦形劑、共活化劑、稀釋劑等等。
疾病狀態(tài)可以是高血糖癥、胰島素耐受、與胰島素耐受相關的代謝綜合征、2型糖尿病、或肥胖癥、代謝綜合征包括高血壓、動脈硬化形成、冠心病、缺血性心臟病、或多囊卵巢綜合征。
優(yōu)選糖基化的脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素多肽選自以下的一種或多種i)一種脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化，ii)如i)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一種或多種，iii)一種脂聯(lián)素多肽，其中兩個或兩個以上對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，iv)如iii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，v)一種脂聯(lián)素多肽，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，vi)如v)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，vii)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的全部四個賴氨酸殘基都被糖基化，viii)如vii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，ix)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸，其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸，和x)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
優(yōu)選每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸。
可選每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
在另一個方面，本發(fā)明是治療與脂聯(lián)素多肽調(diào)控或異常胰島素敏感性相關的疾病狀態(tài)的方法，包括施用有效量的本發(fā)明的組合物，伴隨有或沒有藥學上可接受的賦形劑、共活性劑、稀釋劑等等。
疾病狀態(tài)可以是高血糖癥、胰島素耐受、與胰島素耐受相關的代謝綜合征、2型糖尿病、或肥胖癥、代謝綜合征包括高血壓、動脈硬化形成、冠心病、缺血性心臟病、或多囊性卵巢綜合征。
另一方面，本發(fā)明提供通過以下方法生產(chǎn)的產(chǎn)品，該方法包括在合適的表達載體上插入編碼脂聯(lián)素多肽的多核苷酸序列，將含有編碼脂聯(lián)素的多核苷酸序列的表達載體導入能夠表達、和/或加工、和/或糖基化所述脂聯(lián)素多肽的適當真核宿主細胞中來生產(chǎn)生物活性產(chǎn)品。
在一個實施方案中，多核苷酸序列(polynucleartide)編碼全長脂聯(lián)素，該全長脂聯(lián)素是含有信號序列的前體形式(prepro form)的脂聯(lián)素。
在另一方面，本發(fā)明提供探查(visit)哺乳動物患者中的體重下降的方法，包括施用有效量的糖基化的脂聯(lián)素多肽，伴隨有或沒有藥學上可接受的賦形劑、共活性劑、稀釋劑等等。
在另一方面，本發(fā)明提供在哺乳動物患者中減少體重增加的方法，包括施用有效量的糖基化的脂聯(lián)素多肽，伴隨有或沒有藥學上可接受的賦形劑、共活性劑、稀釋劑等等。
在另一方面，本發(fā)明提供在哺乳動物患者中預防肥胖癥的方法，包括施用有效量的糖基化的脂聯(lián)素多肽，伴隨有或沒有藥學上可接受的賦形劑、共活性劑、稀釋劑等等。
還有一方面，本發(fā)明提供在哺乳動物患者中預防體重增加的方法，包括施用有效量的糖基化的脂聯(lián)素多肽，伴隨有或沒有藥學上可接受的賦形劑、共活性劑、稀釋劑等等。
還有一方面，本發(fā)明提供治療缺乏脂聯(lián)素的哺乳動物患者或者將從這種治療中獲益的哺乳動物患者的方法，包括施用有效量的糖基化的脂聯(lián)素多肽，伴隨有或沒有藥學上可接受的賦形劑、共活性劑、稀釋劑等等。
另一個方面，本發(fā)明是糖基化的脂聯(lián)素多肽(可任選與藥學上可接受的賦形劑、共活性劑、稀釋劑和包裝容器(containment vessels))在制備藥物組合物或藥劑或劑量單位的用途，藥物組合物或藥劑或劑量單位在哺乳動物患者中用于i)在治療與脂聯(lián)素多肽調(diào)控相關的疾病狀態(tài)中；或ii)增強胰島素作用；或iii)抑制糖原異生。
該用途是采用還包括胰島素的所述藥物組合物或藥劑或劑量單位。胰島素的濃度可以是足以有效地產(chǎn)生在約50pM到約400pM之間的血液胰島素濃度。胰島素的濃度可以是足以有效地產(chǎn)生在約100pM到約300pM的血液胰島素濃度。胰島素濃度優(yōu)選為足以有效地產(chǎn)生200pM的血液胰島素濃度(即或壓強)。
糖基化的脂聯(lián)素多肽優(yōu)選為人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素多肽選自下面的一種或多種
i)一種脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化，ii)如i)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，iii)一種脂聯(lián)素多肽，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，iv)如iii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，v)一種脂聯(lián)素多肽，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，vi)如v)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，vii)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的全部四個賴氨酸殘基都被糖基化，viii)如vii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，ix)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸，其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸，和x)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
優(yōu)選每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸。
可選每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
另一個方面，本發(fā)明是包含或包括含有至少糖基化的脂聯(lián)素多肽的容器或呈遞單元的制品，和其或糖基化的脂聯(lián)素多肽的使用說明，其在哺乳動物患者中有效用于i)治療與脂聯(lián)素多肽調(diào)控相關的疾病狀態(tài)；或ii)增強胰島素作用；或iii)抑制糖原異生。
優(yōu)選糖基化的脂聯(lián)素多肽為人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素多肽選自下面的一種或多種i)一種脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化，ii)如i)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，iii)一種脂聯(lián)素多肽，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，iv)如iii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，v)一種脂聯(lián)素多肽，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，vi)如v)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，vii)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基中的全部四個都被糖基化，viii)如vii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，ix)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸，其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸，和x)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
優(yōu)選每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸。
可選每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
在另一個方面，本發(fā)明是一種配方或劑量形式，當被施用給或自動施用給人類或其他哺乳動物時，能夠遞送有效量的糖基化脂聯(lián)素多肽，足以有效地用于治療哺乳動物患者中的與脂聯(lián)素多肽調(diào)控相關的疾病狀態(tài)。
優(yōu)選該配方或劑量形式還含有胰島素。胰島素的濃度足以產(chǎn)生在約50pM到約400pM之間的血液胰島素濃度。胰島素的濃度優(yōu)選足以產(chǎn)生在約100pM到約300pM之間的血液胰島素濃度。
更優(yōu)選胰島素的濃度足以產(chǎn)生約200pM的血液胰島素濃度(即存在量)。
優(yōu)選糖基化的脂聯(lián)素多肽為人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素多肽選自下面的一種或多種i)一種脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化，ii)如i)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，iii)一種脂聯(lián)素多肽，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，iv)如iii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，
v)一種脂聯(lián)素多肽，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，vi)如v)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，vii)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基中的全部四個都被糖基化，viii)如vii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，ix)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸，其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸，和x)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
在一些制品類型中，每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸。
在其他制品類型中，每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
在另一個方面，本發(fā)明是一種配方或劑量形式，當被施用給或自動施用給人類或其他哺乳動物時，能夠遞送有效量的糖基化脂聯(lián)素多肽，足以提高胰島素的作用。
優(yōu)選脂聯(lián)素多肽為人脂聯(lián)素。
優(yōu)選在配方或劑量形式中，脂聯(lián)素多肽選自下面的一種或多種i)一種脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化，ii)如i)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，iii)一種脂聯(lián)素多肽，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，iv)如iii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，v)一種脂聯(lián)素多肽，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，vi)如v)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，vii)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基中的全部四個都被糖基化，viii)如vii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，ix)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸，其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸，和x)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
在另一個方面，本發(fā)明是一種配方或劑量形式，當被施用給或自動施用給人類或其他哺乳動物時，能夠遞送有效量的糖基化脂聯(lián)素多肽，足以提高胰島素的作用，其中脂聯(lián)素多肽優(yōu)選如前述定義。
優(yōu)選配方或劑量形式還含有胰島素(優(yōu)選如前述定義存在)。
在另一個方面，本發(fā)明是一種配方或劑量形式，當被施用給或自動施用給人類或其他哺乳動物時，能夠遞送有效量的糖基化脂聯(lián)素多肽，足以抑制糖原異生。
優(yōu)選脂聯(lián)素多肽是重組的、分離的、純化的、或合成的。
優(yōu)選脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化。
在另一個方面，本發(fā)明在于一種配方或劑量形式，當被施用給或自動施用給人類或其他哺乳動物時，能夠呈遞有效量的糖基化脂聯(lián)素多肽，足以提高胰島素的作用，其中脂聯(lián)素多肽如上文定義。
優(yōu)選該配方或劑量形式還含有胰島素(如達到先前公開的水平)。
還有另一個方面，本發(fā)明在于監(jiān)控對哺乳動物個體的治療的方法，該個體易感或患有一種癥狀a.與脂聯(lián)素多肽調(diào)控相關；b.需要增強胰島素，或c.需要抑制糖原異生，所述方法包含或包括監(jiān)控個體中糖基化脂聯(lián)素多肽存在量提高的步驟，其中糖基化的脂聯(lián)素多肽具有如下之一(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰基殘基被羥基化。
(C)(A)和(B)。
優(yōu)選所用的脂聯(lián)素多肽同工型是如先前公開的糖基化脂聯(lián)素多肽。
癥狀可以是高血糖癥、胰島素耐受、與胰島素耐受相關的代謝綜合征、2型糖尿病、或肥胖癥、代謝綜合征包括高血壓、動脈硬化形成、冠心病、缺血性心臟病、或多囊卵巢綜合征中的一種或多種。
在另一個方面，本發(fā)明在于制備含有糖基化的脂聯(lián)素多肽的組合物的方法，其包括步驟；(a)獲得包含至少兩種糖基化程度或類型不同的脂聯(lián)素多肽的第一組合物；和(b)區(qū)分脂聯(lián)素多肽的形式至少到一定程度，這種區(qū)分基于糖基化程度或類型，從而產(chǎn)生在脂聯(lián)素多肽模式上區(qū)別于第一組合物的第二組合物。
優(yōu)選該方法在第二組合物中富含或至少基本分離出本文所描述的任何一種脂聯(lián)素多肽。
優(yōu)選所述脂聯(lián)素多肽是通過在哺乳動物細胞中表達編碼脂聯(lián)素多肽的重組多核苷酸來獲得。
優(yōu)選重組多核苷酸編碼具有在圖5中描述的序列的多肽或其生物活性片段或其變體。
可選脂聯(lián)素多肽從動物組織中純化，如人的、小鼠的、大鼠的、狗的、牛的、或非人的靈長類的組織。
優(yōu)選該組織是血清或脂肪細胞。
分離中可包括或不包括電泳的步驟。
分離中可包括或不包括層析的步驟。
優(yōu)選第二組合物是本發(fā)明的組合物或多肽。
在另一個方面，本發(fā)明涉及特異性抗選自以下的脂聯(lián)素多肽的糖基同工型的抗體(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰基殘基被羥基化。
(C)(A)和(B)。
優(yōu)選抗體是單克隆抗體。
抗體可能能夠雙位點捕獲。
在另一個方面，本發(fā)明涉及任何這種抗體的組合物。
在另一個方面，本發(fā)明涉及對特異性抗選自以下的脂聯(lián)素多肽糖基同工型(glycoisoform)的抗體特異性的雜交瘤(hydridoma)(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化。
(C)(A)和(B)。
在另一個方面，本發(fā)明涉及篩選一種試劑或用于在哺乳動物中提高如下之一的糖基化脂聯(lián)素多肽的水平的試劑的方法(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化。
(C)(A)和(B)。
該方法包含給予哺乳動物或其組織或通過這些哺乳動物或哺乳動物組織改進哺乳動物這種糖基化的脂聯(lián)素多肽的生成。
在另一個方面，本發(fā)明涉及用于提高具有如下之一的糖基化脂聯(lián)素多肽的水平的試劑(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化。
(C)(A)和(B)。
通過篩選的方法來確定，該方法包含給予哺乳動物或其組織或通過這些哺乳動物或哺乳動物組織改進哺乳動物這種糖基化的脂聯(lián)素多肽產(chǎn)品的生成。
在另一個方面，本發(fā)明涉及脂聯(lián)素多肽同工型的混合物，通過去除、轉(zhuǎn)化或合成，基本含有或富含同工型，其中至少一個或多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基被糖基化和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化。
在另一個方面，本發(fā)明涉及脂聯(lián)素多肽同工型的混合物，通過去除、轉(zhuǎn)化或合成，其基本含有或富含同工型，其中至少一個或多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基未被羥基化。
通過去除、轉(zhuǎn)化或合成，脂聯(lián)素多肽的同工型基本含有或富含至少一個或多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化的同工型。
本發(fā)明還涉及脂聯(lián)素多肽的同工型，其基本含有或富含(通過去除、轉(zhuǎn)化或合成)至少一個或多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化和在對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的位置上具有羥基脯氨?；鶜埢耐ば?，或者脂聯(lián)素多肽的同工型，其基本含有或富含(通過去除、轉(zhuǎn)化或合成)至少一個或多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化和在對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的位置上沒有羥基脯氨?；鶜埢耐ば?。
在另一個方面，本發(fā)明是篩選一種或多種能夠表達糖基化脂聯(lián)素多肽的細胞的方法，包含鑒定和/或確定特異性脂聯(lián)素多肽同工型的水平或至少兩種由所述細胞或細胞群表達的糖基化脂聯(lián)素多肽同工型的表達模式和/或純化和/或分離所述細胞或細胞群。
優(yōu)選地，糖基化的脂聯(lián)素多肽為人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素多肽選自下面的一種或多種i)一種脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化，ii)如i)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，iii)一種脂聯(lián)素多肽，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，iv)如iii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，v)一種脂聯(lián)素多肽，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，vi)如v)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，vii)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基中的全部四個都被糖基化，viii)如vii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，
ix)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸，其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸，和x)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
優(yōu)選每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸。
優(yōu)選每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
優(yōu)選采用特異性抗選自以下脂聯(lián)素多肽的糖基同工型的抗體來鑒定和/或確定任何一種或脂聯(lián)素多聚體(adiponectinpoly)(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化。
(C)(A)和(B)。
優(yōu)選該抗體是單克隆抗體。
優(yōu)選該抗體特異性抗其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸的脂聯(lián)素多肽。
優(yōu)選該抗體特異性抗其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸的脂聯(lián)素多肽。
本發(fā)明還是任何一種或多種通過按照權利要求231的方法鑒定和/或分離和/或純化的細胞。
因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及治療遭受或患有肝臟疾病和/或具有任何肝臟疾病特征的哺乳動物患者的方法，包含或包括給該患者施用脂聯(lián)素和/或其激動劑。
肝臟疾病可以是急性肝臟疾病、慢性肝臟疾病、肝臟炎癥、肝功能紊亂、脂肪肝(肝臟脂肪變性)、肝臟纖維化、肝臟硬化、肝臟壞死、肝細胞壞死、酒精性肝臟疾病、酒精性肝脂肪變性、酒精性肝炎、酒精性肝壞死、酒精性肝硬化、肝壞死、肝脂肪變性、與糖尿病相關的肝脂肪變性、與富含脂類的食物相關的肝脂肪變性、與脂類代謝異常相關的肝脂肪變性、由任何情況引起的肝炎、由任何情況導致的肝壞死、急性肝炎、慢性肝炎、慢性自發(fā)性(active)肝炎、肝臟的病毒感染或發(fā)炎繼發(fā)的肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、任何藥物或毒素作用繼發(fā)的肝炎、膽汁郁積隨之發(fā)生的肝炎或肝功能紊亂、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肝臟肉芽腫病，和/或其中腫瘤壞死因子的組織或血液濃度提高起致病作用的情況中的任何一種或多種。
優(yōu)選哺乳動物是人并且脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的一個或多個殘基被糖基化的人脂聯(lián)素。可以預期，當指非人類物種的脂聯(lián)素時，是不同于人脂聯(lián)素的脂聯(lián)素變體或平截的(truncated)脂聯(lián)素，脂聯(lián)素殘基參照采用對應于人序列殘基的編號，通過兩個序列的最佳排列來確定。
脂聯(lián)素制劑可以適合于施用給人的方式配制，優(yōu)選以腸胃外施用的方式，通過如皮下的(s.c.)、真皮內(nèi)的(i.d.)、靜脈內(nèi)的(i.v.)、腹膜內(nèi)的(i.p.)或經(jīng)真皮(transdermal)的路徑。其他的制劑也可以，其中所述脂聯(lián)素通過口腔、直腸、陰道、膀胱內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、腦內(nèi)或其他本領域技術人員知曉的路徑被施用。
優(yōu)選的施用路徑是腸胃外。適合于腸胃外施用的脂聯(lián)素被配制在含有穩(wěn)定用緩沖劑的水溶液中，優(yōu)選在或接近等滲強度，和具有適當?shù)姆栏瘎⒎滥瓌?、抗沉淀劑和其他本領域技術人員已知的穩(wěn)定劑來適合于施用給哺乳動物特別是人的蛋白質(zhì)的藥物配制劑，特別是適合于在溶液中穩(wěn)定施用給哺乳動物優(yōu)選是人的治療性蛋白質(zhì)的那些。
在另一個方面，本發(fā)明涉及治療遭受或患有酒精性肝臟疾病和/或具有任何酒精性肝臟疾病特征的哺乳動物患者的方法，包含或包括給該患者施用脂聯(lián)素和/或其激動劑。
在另一個方面，本發(fā)明涉及治療哺乳動物患者來預防和/或反轉(zhuǎn)酒精性肝臟疾病和/或任何肝臟疾病特征的方法，包含或包括給該患者施用脂聯(lián)素和/或其激動劑。
在另一個方面，本發(fā)明涉及治療遭受肝臟疾病或具有任何肝臟疾病特征的人的方法，包含或包括給該患者施用有效量的脂聯(lián)素和/或其激動劑。
在另一個方面，本發(fā)明涉及治療哺乳動物患者來預防和/或反轉(zhuǎn)酒精性肝臟疾病和/或任何酒精性肝臟疾病特征的方法，包含或包括給該患者施用脂聯(lián)素和/或其激動劑。
還在另一個方面中，本發(fā)明涉及治療遭受酒精性肝臟疾病和/或具有任何酒精性肝臟疾病特征的人的方法，包含給該患者施用有效量的脂聯(lián)素和/或其激動劑。
還在另一個方面中，本發(fā)明涉及治療遭受肝臟脂肪變性(脂肪浸潤)、肝臟炎癥、肝壞死、肝纖維化、肝硬化、和/或肝功能紊亂的任何一種或多種的哺乳動物患者的方法，包含給該患者施用脂聯(lián)素和/或其激動劑。
在還有一個方面中，本發(fā)明涉及一種制品，其包含或包括含有脂聯(lián)素、和/或脂聯(lián)素激動劑的容器；脂聯(lián)素或脂聯(lián)素激動劑(如含在容器中的)用于治療、預防或反轉(zhuǎn)肝臟疾病和/或肝臟疾病的任何特征的使用說明書。
在還有一個方面中，本發(fā)明涉及一種制品，其包含或包括含有脂聯(lián)素、和/或脂聯(lián)素激動劑的容器；脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素激動劑(如含在容器中的)用于治療、預防或反轉(zhuǎn)酒精性肝臟疾病和/或酒精性肝臟疾病的任何特征的使用說明書。
在還有一個方面中，本發(fā)明涉及一種制品，其包含或包括含有脂聯(lián)素、和/或脂聯(lián)素激動劑的包裝材料；脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素激動劑(如含在包裝材料中的)用于治療、預防或反轉(zhuǎn)肝臟疾病和/或肝臟疾病的任何特征的使用說明書。
在還有一個方面中，本發(fā)明涉及一種制品，其包含或包括含有脂聯(lián)素、和/或脂聯(lián)素激動劑的包裝材料；脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素激動劑(如，含在包裝材料中的)用于治療、預防或反轉(zhuǎn)酒精性肝臟疾病和/或酒精性肝臟疾病的任何特征的使用說明書。
在還有一個方面，本發(fā)明涉及(優(yōu)選有效量的)脂聯(lián)素，和/或脂聯(lián)素激動劑與其他一種或多種材料(無論受體、共活性劑、稀釋劑等和/或無論劑量單位限定的容器)在加工有效用于在哺乳動物(人或其他動物)中治療、預防或反轉(zhuǎn)疾病和/或肝臟疾病的任何特征的劑量單位或藥物組合物中的用途。
在還有一個方面，本發(fā)明涉及(優(yōu)選有效量的)脂聯(lián)素，和/或脂聯(lián)素激動劑與其他一種或多種材料(無論受體、共活性劑、稀釋劑或其他和/或無論劑量單位限定的容器)在加工有效用于在哺乳動物(人或其他動物)中治療、預防或反轉(zhuǎn)酒精性疾病和/或酒精性肝臟疾病的任何特征的劑量單位或藥物組合物中的用途。
在另一個方面，本發(fā)明涉及治療哺乳動物患者的方法，其以任何順序包含或包括，監(jiān)測哺乳動物患者中的脂聯(lián)素，和或給該哺乳動物施用脂聯(lián)素和或其激動劑，這種治療的目的在于治療、反轉(zhuǎn)或預防肝臟疾病和或肝臟疾病(可包括酒精性肝臟疾病)的任何特征。優(yōu)選哺乳動物是人。
在另一個方面，本發(fā)明涉及治療哺乳動物患者的方法，其以任何順序包含或包括，監(jiān)測哺乳動物患者中的脂聯(lián)素mRNA，和或給該哺乳動物施用脂聯(lián)素和或其激動劑，這種治療的目的在于治療、反轉(zhuǎn)或預防肝臟疾病和/或肝臟疾病(可包括酒精性肝臟疾病)的任何特征。優(yōu)選哺乳動物是人。
在另一個方面，本發(fā)明涉及測定哺乳動物患者中脂聯(lián)素的方法，其包含或包括分析血液或組織中的脂聯(lián)素濃度。
脂聯(lián)素的濃度可以通過本領域技術人員熟知的任何方法測定，包括但不限于免疫學方法如放射免疫檢測(RIA)、BLISA等，這些方法在本申請人的在先公開的US申請60/349,885中被描述，該申請還描述了活性形式的脂聯(lián)素及其組合物。
優(yōu)選組織是脂肪組織。
在另一個方面，本發(fā)明涉及測定哺乳動物患者中的脂聯(lián)素的方法，其包含或包括分析血液或組織中的脂聯(lián)素mRNA的濃度。
脂聯(lián)素mRNA的濃度可以通過本領域技術人員熟知的任何方法測定，包括但不限于RT-PCR、Northern分析、原位雜交(situ hybridisation)和放射免疫檢測(RIA)。
優(yōu)選組織是脂肪組織。
在另一個方面，本發(fā)明涉及能夠測定哺乳動物患者的脂聯(lián)素的分析方法，包含或包括從哺乳動物患者中分離血液或組織樣本，制備樣本，通過本領域技術人員熟知的任何方法分析血液或組織中的脂聯(lián)素濃度，包括但不限于免疫學方法如放射免疫檢測(RIA)、BLISA等。測定脂聯(lián)素的方法在先前提及的US專利申請No.60/349,885中被描述，其中還描述了活性形式的脂聯(lián)素及其組合物。
在還有一個方面，本發(fā)明涉及治療哺乳動物患者的方法，該患者遭受或患有選自以下的任何疾病急性肝臟疾病、慢性肝臟疾病、肝臟炎癥、肝臟功能紊亂、脂肪肝(肝脂肪變性)、肝臟纖維化、肝臟硬化、肝臟壞死、肝細胞壞死、酒精性肝臟疾病、酒精性肝脂肪變性、酒精性肝炎、酒精性肝壞死、酒精性肝硬化、肝壞死、肝脂肪變性、與糖尿病相關的肝脂肪變性、與富含脂類的飲食相關肝脂肪變性、與脂類代謝異常相關的肝脂肪變性、由任何情況引起的肝炎、由任何情況導致的肝壞死、急性肝炎、慢性肝炎、慢性自發(fā)性肝炎、肝臟的病毒感染或發(fā)炎繼發(fā)的肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、任何藥物或毒素作用繼發(fā)的肝炎、膽汁郁積隨之發(fā)生的肝炎或肝功能紊亂、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肝臟肉芽腫病，和/或其中腫瘤壞死因子的組織或血液濃度升高起致病作用的情況，包含或包括給該患者施用脂聯(lián)素和/或其激動劑。
優(yōu)選患者是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
在人類治療中，脂聯(lián)素優(yōu)選包括與人脂聯(lián)素相關的脂聯(lián)素和/或其激動劑，例如通過傳統(tǒng)的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學和免疫學方法獲得，它們屬于本領域的技術。脂聯(lián)素可以通過將編碼蛋白的多核苷酸(通常為DNA)序列插入到表達載體中并在適當?shù)乃拗髦斜磉_多肽來重組生產(chǎn)。編碼所需多肽的多核苷酸，無論是被融合的或成熟形式，和無論是否含有用于分泌的信號序列，被連接到適合于任何適當宿主的表達載體上。雖然由于真核細胞能夠進行翻譯后的修飾如糖基化而推薦采用真核表達系統(tǒng)，但是可以使用任何本領域技術人員知曉的各種表達載體。可以在任何適當?shù)挠煤芯幋a重組多肽的DNA的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞中實現(xiàn)表達。真核宿主細胞的例子是本領域已知的，包括酵母、鳥類、昆蟲、植物和動物細胞如COS7、Hela、CHO及其它的哺乳動物細胞。從脂肪細胞中衍生得到的細胞特別適合于本文定義的脂聯(lián)素多肽的表達?？梢灶A期，真核宿主細胞可能有差別地糖基化表達的蛋白，以至于適當?shù)乃拗骷毎梢酝ㄟ^確定表達蛋白被糖基化的方式來鑒定。因此，可以選擇表達期望的脂聯(lián)素多肽的糖基化同工型的宿主細胞。重組生產(chǎn)的標準技術被描述如在上文的Sambrook中?？梢酝ㄟ^在哺乳動物細胞中表達編碼脂聯(lián)素或其生物活性片段或其變體或其同工型的重組多核苷酸來獲得脂聯(lián)素。
在另一個實施方案中，脂聯(lián)素(包括同工型和糖基化同工型的混合物)還可以從動物組織如但不限于血清或脂肪細胞中純化。從脂肪細胞中純化脂聯(lián)素的方法在本領域是熟知的，還在先前提及的US專利申請No.60/349,885中進一步被描述?？梢垣@得糖基化脂聯(lián)素組合物的動物包括但不限于人、小鼠、大鼠、狗、牛和非人的靈長類。
按照本發(fā)明，“有效量”的含義是任何足以實現(xiàn)包括臨床效果的有益的或期望效果的含量。
應當指出，本發(fā)明人已經(jīng)證明許多肝臟疾病，如酒精性肝臟疾病、酒精性肝脂肪變性、酒精性肝炎和酒精性肝壞死、糖尿病性脂肪變性和糖尿病、繼發(fā)高脂肪飲食±肝脂肪變性的胰島素耐受，都伴隨著脂聯(lián)素蛋白和脂聯(lián)素mRNA的血液和脂肪濃度下降(與酒精攝食相關的數(shù)據(jù)，見本申請)。
因此，治療的重要原則是當出現(xiàn)脂聯(lián)素缺乏時，理想地在治療條件下將足量的活性形式的脂聯(lián)素優(yōu)選施給哺乳動物或人，來恢復循環(huán)的、血液的或組織的脂聯(lián)素到正常水平，或在正常水平的±5％內(nèi)，或在正常水平的±10％內(nèi)，或在正常水平的±25％內(nèi)，或在正常水平的±50％內(nèi)。但是，當明顯地存在正常循環(huán)濃度的脂聯(lián)素時，脂聯(lián)素治療也可能是有效的，以至存在正常脂聯(lián)素水平不是脂聯(lián)素治療的禁忌征。
這種有效量可以通過各種給藥路徑一次或多次地被施用。
本文的“哺乳動物”的含義除了人和小鼠之外還包括任何適當?shù)牟溉閯游?，但不限于家畜、運動動物(sport animal)、寵物、靈長類動物。
這種酒精性肝臟疾病的狀況特征可以通過脂肪變性(脂肪浸潤)、炎癥、壞死、纖維化、硬化和/或功能紊亂中任何一種或多種來預測。
按照本發(fā)明，適合用于人的治療的優(yōu)選劑量單位是能夠?qū)⒅?lián)素施用給人而不會導致在存儲中喪失其穩(wěn)定性或在體內(nèi)產(chǎn)生有益效果之前的不必要地失活的任何形式。
這將會在下文中以其更加簡單的形式被描述，而不依賴于任何的容器(無論是膠囊或其他形式)，脂聯(lián)素可以借助手術植入遞送裝置如滲透泵被施用，這是本領域熟知的，適合于治療性蛋白施用的可替代劑量形式也可以被使用。
因此，在本發(fā)明的另一個方面是治療其本身還能夠編碼脂聯(lián)素的哺乳動物患者的方法，包含給患者施用足量的脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點的激動劑來抑制TNF-□水平低于將沒有這種施用時存在或可能存在的水平。
優(yōu)選這種施用是治療、改善、預防和/或反轉(zhuǎn)TNF-□疾病或紊亂和/或TNF-□疾病或紊亂的任何特征。
優(yōu)選哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更加優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基的一個或多個被糖基化的人脂聯(lián)素。
優(yōu)選所述TNF-□疾病或紊亂是如下的任何一種或多種炎癥性疾病、循環(huán)疾病、門脈高壓、肺動脈高血壓、變應性疾病、克隆病、自體免疫溶血性貧血、牛皮癬、肝臟疾病、胰腺病、神經(jīng)變性疾病、中樞神經(jīng)衰竭、毒血癥、更年期衰退、妊娠中毒、肥胖病、高脂血癥、高膽固醇血癥、異常葡萄糖耐受、實體瘤、腫瘤和伴隨的惡病質(zhì)、內(nèi)分泌疾病、Creutzfeldt-Jakob病、病毒感染、經(jīng)皮冠狀動脈成形、血管肥大或閉塞、PTCA/支架/旁路手術后的血管再閉塞/再狹窄、干預后的血管肥大或閉塞、抑制植入誘導的血管衰退和排斥、器官或組織移植后的排斥和自體免疫疾病、在新型治療過程中TNF生成相關的負作用，還消除和改善與治療或預防移植排斥相關的休克相關綜合癥、透析性低血壓、青光眼、眼壓高、重癥肌無力、長期脫脂癥、骨病、神經(jīng)紊亂、TNF-□誘導的胰島素耐受、異常凋亡、糖尿病或應激高血糖癥的并發(fā)癥、慢性阻塞性肺疾病、慢性支氣管炎和肺氣腫。
優(yōu)選所述炎癥反應是如下的任何一種糖尿病并發(fā)癥如視網(wǎng)膜病、腎病、神經(jīng)病、主要血管和微血管紊亂、糖尿病性腎?。魂P節(jié)炎如慢性類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、類風濕性脊髓炎和骨膜瘤形成；術后/外傷后的炎癥；腫脹修復；咽炎；膀胱炎；肺炎；心肌炎；心肌癥；特發(fā)性皮炎；炎癥性腸道疾病如克隆病和潰瘍性結腸炎；腦膜炎；炎癥性眼病；炎癥性肺病如肺炎、硅肺、結節(jié)性肺病、炎癥性骨紊亂和肺結核。
優(yōu)選所述循環(huán)疾病包括如下的任何一種慢性心力衰竭包括心律不齊、心絞痛、心肌梗死、心功能不全和充血性心力衰竭，動脈硬化包括動脈粥樣硬化癥、高血壓、深靜脈血栓、閉塞性外周循環(huán)衰竭、局部的大腦循環(huán)衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血綜合癥、雷諾病、Buerger病。
優(yōu)選所述變應性疾病包括如下的任何一種哮喘、過敏性鼻炎、結膜炎、消化道過敏反應、花粉病和過敏性反應、慢性閉塞性肺病、膠原形成。
優(yōu)選所述神經(jīng)變性疾病包括如下的任何一種阿爾茨海默氏病、帕金森病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、AIDS、腦病。
優(yōu)選所述中樞神經(jīng)衰竭包括如下的任何一種腦血管衰竭如腦出血和腦梗塞及其后遺癥、顱創(chuàng)傷、脊髓損傷、腦水腫、癡呆、健忘癥、失憶、多發(fā)性硬化。
優(yōu)選所述毒血癥包括如下的任何一種敗血癥、敗血性休克、內(nèi)毒素休克、革蘭氏陰性敗血癥、毒素休克綜合癥。
優(yōu)選所述癌癥腫瘤包括如下的任何一種惡性黑色素瘤、惡性淋巴瘤、消化器官的癌癥。
優(yōu)選所述內(nèi)分泌疾病包括如下的任何一種Addison病、Cushing綜合癥、黑素細胞瘤、原發(fā)性醛固酮增多癥。
優(yōu)選所述自體免疫疾病包括如下的任何一種器官特異性疾病如甲狀腺炎或非特異性器官疾病如風濕癥的和骨性關節(jié)炎。
優(yōu)選所述骨病包括如下的任何一種如骨折、骨再折、骨質(zhì)疏松癥、骨軟化、骨Behcet病、強直性脊柱炎、慢性風濕性關節(jié)炎、膝關節(jié)炎以及在相關疾病中關節(jié)組織損壞。
優(yōu)選所述神經(jīng)紊亂包括對各個神經(jīng)、神經(jīng)根、脊髓和/或大腦的創(chuàng)傷、損傷壓迫，如急性脊髓和大腦損傷、髓鞘脫失病、如多發(fā)性硬化癥、由轉(zhuǎn)移腫瘤、原發(fā)性或轉(zhuǎn)移的大腦腫瘤產(chǎn)生的脊髓壓迫、由轉(zhuǎn)移腫瘤產(chǎn)生的慢性疼痛綜合癥、炎癥性CNS疾病，如亞急性硬化型全腦炎、亨廷頓病、Guillain-Barre綜合癥、Bell氏癱瘓、糖尿病性神經(jīng)病、視神經(jīng)炎、黃斑退化、色素性視網(wǎng)膜炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、肌肉萎縮癥，和多肌炎-皮肌炎。
優(yōu)選所述異常凋亡包括任何病毒誘導的凋亡抑制。
優(yōu)選所述糖尿病或應激高血糖癥的并發(fā)癥包括如下的任何一種或多種心肌梗塞、充血性心力衰竭，和心原性休克。
優(yōu)選脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更加優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的一個或多個殘基被糖基化的人脂聯(lián)素?？梢灶A期，當指非人類物種的脂聯(lián)素時，是不同于人脂聯(lián)素的脂聯(lián)素變體或平截的脂聯(lián)素，脂聯(lián)素殘基參照采用對應于人序列殘基的編號，通過這兩條序列的最佳排列來確定。
脂聯(lián)素制劑可以適合于施用給人的方式配制，優(yōu)選以腸胃外施用的方式，通過如皮下的(s.c.)、真皮內(nèi)的(i.d.)、靜脈內(nèi)的(i.v.)、腹膜內(nèi)的(i.p.)或經(jīng)皮的路徑。其他的制劑也是可以，其中所述脂聯(lián)素通過口腔、直腸、陰道、膀胱內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、腦內(nèi)或其他本領域技術人員知曉的路徑被施用。
優(yōu)選的施用路徑是腸胃外。適合于腸胃外施用的脂聯(lián)素被配制在含有穩(wěn)定用緩沖劑的水溶液中，優(yōu)選在或接近等滲強度，和具有適當?shù)姆栏瘎?、防沫劑、抗沉淀劑和其他本領域技術人員已知的穩(wěn)定劑以適合于施用給哺乳動物特別是人的蛋白質(zhì)的藥物配制劑，特別是適合于在溶液中穩(wěn)定施用給哺乳動物優(yōu)選是人的治療性蛋白質(zhì)的那些。
在第二個方面，本發(fā)明涉及治療其自身還能夠編碼脂聯(lián)素的哺乳動物患者的方法，包含或包括給該患者施用足量的脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點的激動劑來將TNF-α水平抑制為低于沒有這種施用時存在或可能存在的水平，從而對于如下的任何一種或多種的癥狀產(chǎn)生有利反應炎癥疾病、循環(huán)疾病、門脈高壓、肺動脈高血壓、變應性疾病、克隆病、自體免疫溶血性貧血、牛皮癬、肝臟疾病、胰腺病、神經(jīng)變性疾病、中樞神經(jīng)衰竭、毒血癥、更年期衰退、妊娠中毒、肥胖病、高脂血、高膽固醇血癥、異常葡萄糖耐受、實體瘤、腫瘤和伴隨的惡病質(zhì)、內(nèi)分泌疾病、Creutzfeldt-Jakob病、病毒感染、經(jīng)皮冠狀動脈成形、血管肥大或閉塞、PTCA/支架/旁路手術后的血管再閉塞/再狹窄、干預后的血管肥大或閉塞、抑制植入誘導的血管衰退和排斥、器官或組織移植后的排斥和自體免疫疾病、在新型治療過程中TNF生成相關的負作用，還消除和改善與治療或預防移植排斥相關的休克相關綜合癥，透析性低血壓、青光眼、眼壓高、重癥肌無力、長期脫脂癥、骨病、神經(jīng)紊亂、TNF-α誘導的胰島素耐受、異常凋亡、糖尿病或應激高血糖癥的并發(fā)癥、慢性阻塞性肺疾病、慢性支氣管炎和肺氣腫。
優(yōu)選所述炎癥反應是如下的任何一種糖尿病并發(fā)癥如視網(wǎng)膜病、腎病、神經(jīng)病、主要血管和微血管紊亂、糖尿病性腎?。魂P節(jié)炎如慢性類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、類風濕性脊髓炎和骨膜瘤形成；術后/外傷后的炎癥；腫脹修復；咽炎；膀胱炎；肺炎；心肌炎；心肌癥；特發(fā)性皮炎；炎癥性腸道疾病如克隆病和潰瘍性結腸炎；腦膜炎；炎癥性眼病；炎癥性肺病如肺炎、硅肺、結節(jié)性肺病、炎癥性骨紊亂和肺結核。
優(yōu)選所述循環(huán)疾病包括如下的任何一種慢性心力衰竭包括心律不齊、心絞痛、心肌梗死、心功能不全和充血性心力衰竭，動脈硬化包括動脈粥樣硬化癥、高血壓、深靜脈血栓、閉塞性外周循環(huán)衰竭、局部的大腦循環(huán)衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血綜合癥、雷諾病、Buerger病。
優(yōu)選所述變應性疾病包括如下的任何一種哮喘、過敏性鼻炎、結膜炎、消化道過敏反應、花粉病和過敏反應、慢性閉塞性肺病、膠原形成。
優(yōu)選所述神經(jīng)變性疾病包括如下的任何一種阿爾茨海默氏病、帕金森病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、AIDS、腦病。
優(yōu)選所述中樞神經(jīng)衰竭包括如下的任何一種腦血管衰竭如腦出血和腦梗塞及其后遺癥、顱創(chuàng)傷、脊髓損傷、腦水腫、癡呆、健忘癥、失憶、多發(fā)性硬化。
優(yōu)選所述毒血癥包括如下的任何一種敗血癥、敗血性休克、內(nèi)毒素休克、革蘭氏陰性敗血癥、毒素休克綜合癥。
優(yōu)選所述癌癥腫瘤包括如下的任何一種惡性黑色素瘤、惡性淋巴瘤、消化器官的癌癥。
優(yōu)選所述內(nèi)分泌疾病包括如下的任何一種Addison病、Cushing綜合癥、黑素細胞瘤、原發(fā)性醛固酮增多癥。
優(yōu)選所述自體免疫疾病包括如下的任何一種器官特異性疾病如甲狀腺炎或非特異性器官疾病如風濕癥的和骨性關節(jié)炎。
優(yōu)選所述骨病包括如下的任何一種如骨折、骨再折、骨質(zhì)疏松癥、骨軟化、骨Behcet病、強直性脊柱炎、慢性風濕性關節(jié)炎、膝關節(jié)炎以及在相關疾病中關節(jié)組織損壞。
優(yōu)選所述神經(jīng)紊亂包括對各個神經(jīng)、神經(jīng)根、脊髓和/或大腦的創(chuàng)傷、損傷壓迫，如急性脊髓和大腦損傷、髓鞘脫失病、如多發(fā)性硬化癥、由轉(zhuǎn)移腫瘤、原發(fā)性或轉(zhuǎn)移的大腦腫瘤產(chǎn)生的脊髓壓迫、由轉(zhuǎn)移腫瘤產(chǎn)生的慢性疼痛綜合癥、炎癥性CNS疾病，如亞急性硬化型全腦炎、亨廷頓病、Guillain-Barre綜合癥、Bell氏癱瘓、糖尿病性神經(jīng)病、視神經(jīng)炎、黃斑退化、色素性視網(wǎng)膜炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、肌肉萎縮癥，和多肌炎-皮肌炎。
優(yōu)選所述異常凋亡包括任何病毒誘導的凋亡抑制。
優(yōu)選所述糖尿病或應激高血糖癥的并發(fā)癥包括如下的任何一種或多種心肌梗塞、充血性心力衰竭，和心原性休克。
優(yōu)選哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更加優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的一個或多個殘基被糖基化的人脂聯(lián)素?？梢灶A期，當指非人類物種的脂聯(lián)素時，是不同于人脂聯(lián)素的脂聯(lián)素變體或平截的脂聯(lián)素，脂聯(lián)素殘基參照采用對應于人序列殘基的編號，通過這兩條序列的最佳排列來確定。
脂聯(lián)素制劑可以適合于施用給人的方式配制，優(yōu)選以腸胃外施用的方式，通過如皮下的(s.c.)、真皮內(nèi)的(i.d.)、靜脈內(nèi)的(i.v.)、腹膜內(nèi)的(i.p.)或經(jīng)皮的路徑。其他的制劑也是可以，其中所述脂聯(lián)素通過口腔、直腸、陰道、膀胱內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、腦內(nèi)或其他本領域技術人員知曉的路徑被施用。
優(yōu)選的施用路徑是腸胃外。適合于腸胃外施用的脂聯(lián)素被配制在含有穩(wěn)定用緩沖劑的水溶液中，優(yōu)選在或接近等滲強度，和具有適當?shù)姆栏瘎?、防沫劑、抗沉淀劑和其他本領域技術人員已知的穩(wěn)定劑來適合于施用給哺乳動物特別是人的蛋白質(zhì)的藥物配制劑，特別是適合于在溶液中起穩(wěn)定施用給哺乳動物優(yōu)選是人的治療性蛋白質(zhì)的作用的那些。
在本發(fā)明的另一個方面中，提供一種治療自身還能夠編碼脂聯(lián)素的哺乳動物患者的方法，包括給該患者施用足量的脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點的激動劑來將TNF-αmRNA水平抑制為低于將沒有這種施用時存在或可能存在的水平。
優(yōu)選這種施用將治療、改善、預防和/或反轉(zhuǎn)TNF-α疾病或紊亂或TNF-α疾病或紊亂的任何特征。
優(yōu)選哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更加優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的一個或多個殘基被糖基化的人脂聯(lián)素。
在本發(fā)明的另一個方面中，提供一種治療自身還能夠編碼脂聯(lián)素的哺乳動物患者的方法，包括給該患者施用足量的脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點的激動劑來治療、改善、預防和/或反轉(zhuǎn)TNF-α疾病和/或紊亂或TNF-α疾病或紊亂的任何特征。
在本發(fā)明的另一個方面中，提供一種改善哺乳動物患者中的TNF-α的有害作用的方法，包含給需要這種治療的患者施用治療有效量的脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點的激動劑。
優(yōu)選哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更加優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的一個或多個殘基被糖基化的人脂聯(lián)素。
在本發(fā)明的另一個方面中，提供一種治療遭受或可能具有與不期望的高水平TNF-α相關的疾病或紊亂的哺乳動物患者的方法，該方法包含給患者施用有效量的脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點的激動劑。
優(yōu)選哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更加優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的一個或多個殘基被糖基化的人脂聯(lián)素。
在本發(fā)明的另一個方面中，提供一種抑制和拮抗TNF-α活性來治療哺乳動物患者中與TNF-α相關的疾病或紊亂的方法，該方法包含給患者施用有效量的脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點的激動劑。
優(yōu)選哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更加優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的一個或多個殘基被糖基化的人脂聯(lián)素。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種治療哺乳動物患者的方法，其以任何順序包括或包含，(直接地或間接地)監(jiān)測哺乳動物患者中的脂聯(lián)素，和/或給哺乳動物患者施用脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點的激動劑，這樣的治療將TNF-α水平抑制為低于沒有這種施用時存在或可能存在的水平。
優(yōu)選這種施用是來治療、改善、預防和/或反轉(zhuǎn)TNF-α疾病或紊亂和/或TNF-α疾病或紊亂的任何特征。
優(yōu)選哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更加優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的一個或多個殘基被糖基化的人脂聯(lián)素。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種治療哺乳動物患者的方法，其以任何順序包括或包含，(直接地或間接地)監(jiān)測哺乳動物患者中的脂聯(lián)素mRNA，和/或給哺乳動物患者施用脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點的激動劑，這樣的治療將TNF-α抑制為低于沒有這種施用時存在或可能存在的水平。
優(yōu)選這種施用是來治療、改善、預防和/或反轉(zhuǎn)TNF-α疾病或紊亂和/或TNF-α疾病或紊亂的任何特征。
優(yōu)選哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更加優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基的一個或多個被糖基化的人脂聯(lián)素。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種治療哺乳動物患者的方法，其以任何順序包括或包含，(直接地或間接地)監(jiān)測哺乳動物患者中的脂聯(lián)素，和/或給哺乳動物患者施用脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點的激動劑，這種治療的目的在于治療、反轉(zhuǎn)或預防TNF-α疾病或紊亂和/或TNF-α疾病或紊亂的任何特征。
優(yōu)選哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更加優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的一個或多個殘基被糖基化的人脂聯(lián)素。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種治療哺乳動物患者的方法，其以任何順序包括或包含，(直接地或間接地)監(jiān)測哺乳動物患者中的脂聯(lián)素mRNA，和/或給哺乳動物患者施用脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點的激動劑，這種治療的目的在于治療、反轉(zhuǎn)或預防TNF-α疾病或紊亂和/或TNF-α疾病或紊亂的任何特征。
優(yōu)選哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更加優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基的一個或多個被糖基化的人脂聯(lián)素。
還有一方面，本發(fā)明涉及(優(yōu)選有效量的)脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點激動劑與其他一種或多種材料(無論是受體、共活性劑、稀釋劑等等和/或劑量單位限定的容器)在加工有效用于抑制TNF-α低于沒有這種施用時存在或可能存在的水平的劑量單位或藥物組合物中的用途。
優(yōu)選這種劑量形式或藥物組合物是用來治療、改善、預防和/或反轉(zhuǎn)TNF-α疾病或紊亂或TNF-α疾病或紊亂的任何特征。
優(yōu)選哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更加優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的一個或多個殘基被糖基化的人脂聯(lián)素。
還有一方面，本發(fā)明涉及(優(yōu)選有效量的)脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點激動劑與其他一種或多種材料(無論是受體、共活性劑、稀釋劑或等等和/或劑量單位限定的容器)在加工有效用于治療、預防和/或反轉(zhuǎn)TNF-α疾病和/或紊亂或TNF-α疾病或紊亂的任何特征的劑量單位或藥物組合物中的用途。
優(yōu)選哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更加優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的一個或多個殘基被糖基化的人脂聯(lián)素。
還有一個方面，本發(fā)明涉及一種制品，其包含或包括含有脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點激動劑的容器；脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點激動劑(如，含有在容器中的)用于有效抑制TNF-α低于沒有這種施用時會存在或可能存在的水平的使用說明書。
在還有一個方面中，本發(fā)明在于一種制品，其包含或包括含有脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點激動劑的容器；脂聯(lián)素或脂聯(lián)素作用位點激動劑(如含在容器中的)用于治療、預防或反轉(zhuǎn)TNF-α疾病或紊亂和/或TNF-α疾病或紊亂的任何特征的使用說明書。
還有一個方面，本發(fā)明在于一種制品，其包含或包括含有脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點激動劑的包裝材料；脂聯(lián)素或脂聯(lián)素作用位點激動劑(如，含在包裝材料中的)用于有效抑制TNF-α低于沒有這種施用時會存在或可能存在的水平的使用說明書。
在還有一個方面中，本發(fā)明涉及一種制品，其包含或包括含有脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點激動劑的包裝材料；脂聯(lián)素或脂聯(lián)素作用位點激動劑(如含在包裝材料中的)用于治療、預防或反轉(zhuǎn)TNF-α疾病和/或紊亂或TNF-α疾病或紊亂的任何特征的使用說明書。
在另一個方面，本發(fā)明涉及治療遭受或患有肝臟疾病和/或具有肝臟疾病的任何特征的哺乳動物患者的方法，其包含或包括給該患者使用脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點激動劑。
肝臟疾病是急性肝臟疾病、慢性肝臟疾病、肝臟炎癥、肝臟功能紊亂、脂肪肝(肝脂肪變性)、肝臟纖維化、肝臟硬化、肝臟壞死、肝細胞壞死、酒精性肝臟疾病、酒精性肝脂肪變性、酒精性肝炎、酒精性肝壞死、酒精性肝硬化、肝壞死、肝脂肪變性、與糖尿病相關的肝脂肪變性、與富含脂類的飲食相關肝脂肪變性、與脂類代謝異常相關的肝脂肪變性、由任何情況引起的肝炎、由任何情況導致的肝壞死、急性肝炎、慢性肝炎、慢性自發(fā)性肝炎、肝臟的病毒感染或發(fā)炎繼發(fā)的肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、任何藥物或毒素作用繼發(fā)的肝炎、膽汁郁積隨之發(fā)生的肝炎或肝功能紊亂、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肝臟肉芽腫病，和/或其中腫瘤壞死因子的組織或血液濃度升高起致病作用的情況中的任何一種或多種.
優(yōu)選哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
優(yōu)選脂聯(lián)素是全長的。
優(yōu)選脂聯(lián)素被糖基化。
更加優(yōu)選脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的一個或多個殘基被糖基化的人脂聯(lián)素。
在人類治療中，脂聯(lián)素優(yōu)選包括與人脂聯(lián)素相關的脂聯(lián)素，和/或其激動劑例如通過傳統(tǒng)的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學和免疫學方法獲得，它們屬于本領域的技術。脂聯(lián)素可以通過將編碼蛋白的多核苷酸(通常為DNA)序列插入到表達載體中并在適當?shù)乃拗髦斜磉_多肽來重組生產(chǎn)。編碼所需多肽的多核苷酸，無論是被融合的或成熟形式，和無論是否含有用于分泌的信號序列，被連接到適合于任何適當宿主的表達載體上。雖然由于真核細胞能夠進行翻譯后的修飾如糖基化而推薦采用真核表達系統(tǒng)，但是可以采用任何本領域技術人員知曉的各種表達載體?？梢栽谌魏芜m當?shù)挠煤芯幋a重組多肽的DNA分子的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞中實現(xiàn)表達。真核宿主細胞的例子是本領域已知的，包括酵母、鳥類、昆蟲、植物和動物細胞如COS7、Hela、CHO及其它的哺乳動物細胞。重組生產(chǎn)的標準技術被描述如在上文的Sambrook中?？梢酝ㄟ^在哺乳動物細胞中表達編碼脂聯(lián)素或其生物活性片段或其變體或其同工型的重組多核苷酸來獲得脂聯(lián)素。
在另一個實施方案中，脂聯(lián)素(包括同工型和糖基化同工型的混合物)還可以從動物組織中純化，例如但不限于血清或脂肪細胞。從脂肪細胞中純化脂聯(lián)素的方法在本領域是熟知的，還在先前提及的US專利申請No.60/349,885中進一步被描述。可以獲得糖基化脂聯(lián)素組合物的動物包括但不限于人、小鼠、大鼠、狗、牛和非人的靈長類。
按照本發(fā)明，“有效量”的含義是任何其單獨或與其他的這些量合作時足以實現(xiàn)包括臨床效果的有益的或期望效果的含量。
應當指出，本發(fā)明人已經(jīng)證明許多肝臟疾病，如酒精性肝臟疾病、酒精性肝脂肪變性、酒精性肝炎和酒精性肝壞死、糖尿病性脂肪變性和糖尿病、高脂肪飲食±肝脂肪變性繼發(fā)的胰島素耐受，都伴隨著脂聯(lián)素蛋白和脂聯(lián)素mRNA的血液和脂肪濃度下降(與酒精攝食相關的數(shù)據(jù)，見本申請)。
因此，治療的重要原則是當出現(xiàn)脂聯(lián)素缺乏時，理想地在治療條件下將足量的活性形式的脂聯(lián)素優(yōu)選施給哺乳動物或人，恢復循環(huán)的、血液的或組織的脂聯(lián)素到正常水平，或在正常水平的±5％內(nèi)，或在正常水平的±10％內(nèi)，或在正常水平的±25％內(nèi)，或在正常水平的±50％內(nèi)。但是，當明顯地存在正常循環(huán)濃度的脂聯(lián)素時，脂聯(lián)素治療也可能是有效的，使得存在正常脂聯(lián)素水平不是脂聯(lián)素治療的禁忌征。
這種有效量可以通過各種給藥路徑一次或多次地被施用。
本文的“哺乳動物”的含義包括，除了人和小鼠之外，還包括任何適當?shù)牟溉閯游锏幌抻诩倚?、運動動物、寵物、靈長類動物。
這種酒精性肝臟疾病的狀況特征可以通過脂肪變性(脂肪浸潤)、炎癥、壞死、纖維化、硬化和/或功能紊亂中任何一種或多種來預測。
按照本發(fā)明，適合用于人的治療的優(yōu)選劑量單位是能夠?qū)⒅?lián)素施用給人而不導致在存儲中喪失其穩(wěn)定性或在體內(nèi)在產(chǎn)生有益效果之前不必要地失活的任何形式。
這將會在下文中以其更加簡單的形式被描述，而不依賴于任何的容器(無論是膠囊或其他形式)，脂聯(lián)素可以借助手術植入遞送裝置如滲透泵被施用，這是本領域熟知的，適合于治療性蛋白施用的可替代劑量形式也可以被使用。
本發(fā)明提供糖基化的脂聯(lián)素和糖基化脂聯(lián)素的組合物。優(yōu)選這種脂聯(lián)素用于治療或制藥用途(如本文公開的任何作用)。在一個方面，本發(fā)明提供被糖基化的和被重組、分離、純化或合成的脂聯(lián)素多肽。優(yōu)選脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。優(yōu)選至少對應于人脂聯(lián)素賴氨酸殘基65、68，77和101(殘基按照人多肽被編號)的賴氨酸殘基之一被糖基化。在一個實施方案中，脂聯(lián)素完全被糖基化。在本發(fā)明的另一個方面，被加到賴氨酸殘基上的糖部分是葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。在另一個方面，脂聯(lián)素多肽在賴氨酸殘基68、71、80和104(小鼠)或殘基65、68、77和101(人)的每個上至少具有一個葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽在至少賴氨酸殘基68、71、80和104(小鼠)或殘基65、68、77和101(人)之一上或全部Lys-68、71、80和104(小鼠)或Lys-65、68、77和101(人)上具有結構X1，其中每個X1單獨選自葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基半乳糖基部分、半乳糖基葡糖基部分的一種或多種。在一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽中的所有賴氨酸都被充分糖基化。
在另一個方面，本發(fā)明提供含有被糖基化的脂聯(lián)素多肽的組合物。在一個實施方案中，組合物中的脂聯(lián)素多肽是重組的、分離的、純化的或合成的。在另一個實施方案中，組合物中的脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。優(yōu)選至少對應于脂聯(lián)素賴氨酸殘基65、68，77和101(殘基按照人的多肽被編號)的賴氨酸殘基之一被糖基化。在另一個實施方案中，組合物含有重組、分離、純化或合成的脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素賴氨酸殘基65、68，77和101(或其他物種或脂聯(lián)素變體的相應殘基)的賴氨酸殘基之一被糖基化。在一個實施方案中，組合物含有所有賴氨酸殘基(Lys-65、68、77和101)都被糖基化的脂聯(lián)素多肽。在另一個實施方案中，組合物含有在每個賴氨酸殘基65、68、77和101上具有至少一個糖部分的脂聯(lián)素多肽。在另一個實施方案中，組合物含有被單個糖部分糖基化的脂聯(lián)素。單個糖部分可以是如唾液酸、葡糖基、半乳糖基、N-乙酰半乳糖基、N-乙酰葡糖基、唾液酸基Lewis X(sialylLewis X)、和巖藻糖基。在另一個實施方案中，組合物含有用多個糖部分糖基化的脂聯(lián)素。在另一個實施方案中，組合物含有在每個賴氨酸殘基65、68、77和101上具有至少一個葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分的脂聯(lián)素多肽。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽在至少賴氨酸殘基68、71、80和104(小鼠)或殘基65、68、77和101(人)之一或全部Lys-68、71、80和104(小鼠)或Lys-65、68、77和101(人)上具有結構X1，其中每個X1單獨選自葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基半乳糖基部分、半乳糖基葡糖基部分的一種或多種。在一個實施方案中，組合物含有在所有賴氨酸殘基65、68、77和101上具有結構X1的脂聯(lián)素多肽。在另一個實施方案中，組合物含有具有天然哺乳動物脂聯(lián)素的序列的脂聯(lián)素多肽。
在另一個方面，本發(fā)明提供含有脂聯(lián)素多肽的組合物，其基本上不含有至少一種非糖基化的脂聯(lián)素同工型。在一個實施方案中，組合物基本上不含有同工型1。在另一個實施方案中，組合物基本上不含同工型2。在另一個實施方案中，組合物基本上不含任何非糖基化的脂聯(lián)素同工型。
在另一個方面，本發(fā)明提供含有脂聯(lián)素多肽的組合物，其中主要的脂聯(lián)素種類被完全糖基化。在一個實施方案中，組合物含有Lys-68、71、80和104全部被糖基化的脂聯(lián)素。在另一個實施方案中，組合物含有一種以上的脂聯(lián)素同工型。在另一個實施方案中，同工型3是組合物中的主要脂聯(lián)素。在另一個實施方案中，同工型4是組合物中主要的脂聯(lián)素。在另一個實施方案中，同工型5是組合物中主要的脂聯(lián)素。在另一個實施方案中，同工型6是組合物中主要的脂聯(lián)素。
在另一個方面，發(fā)明提供一種組合物，當將組合物施用給哺乳動物時增強胰島素的作用。在一個實施方案中，胰島素存在的含量或濃度足以產(chǎn)生在約50pM到約400pM之間的血液胰島素濃度。在另一個實施方案中，胰島素存在的含量或濃度足以產(chǎn)生在約100pM到約300pM之間的血液胰島素濃度。在另一個實施方案中，胰島素存在的含量或濃度足以產(chǎn)生約200pM的血液胰島素濃度。
在另一個方面，本發(fā)明提供糖基化脂聯(lián)素的組合物，其中當該組合物被施用給個體時抑制糖原異生作用。
在另一個方面，發(fā)明提供制備含有糖基化脂聯(lián)素的組合物的方法，其通過獲得含有糖基化程度或類型不同的至少兩種形式脂聯(lián)素的第一組合物，然后根據(jù)糖基化程度或類型分離脂聯(lián)素，從而制備在脂聯(lián)素模式上區(qū)別于第一組合物的第二組合物。在一個實施方案中，脂聯(lián)素是通過在哺乳動物細胞中表達編碼脂聯(lián)素的重組多核苷酸來獲得。在一個實施方案中，重組多核苷酸編碼具有在圖5中描述的序列的多肽或其生物活性片段或其變體。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素從動物組織中純化。在另一個實施方案中，動物是人、小鼠、大鼠、狗、牛、或非人的靈長類。在另一個實施方案中，組織是血清或脂肪細胞。在另一個實施方案中，分離中包括電泳的步驟。在另一個實施方案中，分離中不包括電泳的步驟。在另一個實施方案中，分離中包括層析的步驟。在另一個實施方案中，分離中不包括層析的步驟。在另一個實施方案中，第二組合物是上述所列的要求保護的任何組合物之一。
在另一個方面，發(fā)明提供通過任何上述方法制備的組合物。
在另一個方面，發(fā)明提供通過監(jiān)測特定脂聯(lián)素同工型的水平或至少兩種糖基化的脂聯(lián)素同工型的表達模式，來診斷個體中患有或易感與脂聯(lián)素調(diào)控相關的疾病狀態(tài)的方法。在一個實施方案中，疾病狀態(tài)是高血糖癥、胰島素耐受、與胰島素耐受相關的代謝綜合征、2型糖尿病、代謝綜合征包括特發(fā)性高血壓性動脈硬化形成、冠心病、缺血性心臟病、多囊卵巢綜合征或其他與脂聯(lián)素缺乏或肥胖相關的狀態(tài)。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素得自生物樣本。在另一個實施方案中，至少一種同工型是完全糖基化的同工型。在另一個實施方案中，通過確定糖基化脂聯(lián)素同工型的水平和表達模式來獲得水平和表達模式。在另一個實施方案中，評價的方法是電泳、HPLC或質(zhì)譜分析。
在另一個方面，發(fā)明提供診斷個體中患有或易于產(chǎn)生疾病狀態(tài)的方法，其通過在個體中測定特定脂聯(lián)素同工型的水平或至少兩種糖基化的脂聯(lián)素同工型的表達模式，并將該表達模式與沒有遭受這種疾病狀態(tài)的個體的表達模式特征比較，其中表達模式的差異指示患有或者可能產(chǎn)生該疾病。
在另一個方面，發(fā)明提供診斷個體中患有或易于產(chǎn)生疾病狀態(tài)的方法，其通過測定個體中特定的脂聯(lián)素同工型的水平或至少兩種糖基化的脂聯(lián)素同工型的表達模式，并將該表達模式與患有這種疾病狀態(tài)的個體的表達模式特征比較，其中表達模式相似指示患有或可能產(chǎn)生該疾病。
在另一個方面，本發(fā)明提供通過給個體施用有效量的任何上述的組合物來治療個體中與脂聯(lián)素調(diào)控相關的疾病狀態(tài)的方法。在一個實施方案中，疾病狀態(tài)是高血糖癥、胰島素耐受、與胰島素耐受相關的代謝綜合征、2型糖尿病、代謝綜合征包括高血壓、動脈硬化形成、冠心病、缺血性心臟病、多囊卵巢綜合征或其他與脂聯(lián)素缺乏或肥胖相關的狀態(tài)。
在另一個方面，本發(fā)明提供糖基化的脂聯(lián)素多肽在制備用于在哺乳動物患者中i)治療與脂聯(lián)素調(diào)控相關的疾病狀態(tài)；或ii)提高胰島素作用；或iii)抑制糖原異生的劑量單位或藥物組合物或藥劑中的用途。優(yōu)選所述脂聯(lián)素多肽是重組的、分離的、純化的或合成的。優(yōu)選所述脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。優(yōu)選所述劑量單位或藥物組合物或藥劑還包含胰島素。優(yōu)選胰島素的濃度足以有效地產(chǎn)生在約50pM到約400pM的血液胰島素濃度。優(yōu)選胰島素的濃度足以有效地產(chǎn)生在約100pM到約300pM的血液胰島素濃度。優(yōu)選胰島素濃度足以有效地產(chǎn)生約200pM的血液胰島素濃度。
附圖簡要說明

圖1表示通過雙向電泳(2-DE)分離的脂肪細胞分泌的蛋白，顯示多種脂聯(lián)素同工型。分匯合的3T3-L1前脂肪細胞(A)或分化誘導8天后的脂肪細胞(B)用PBS洗滌3次，然后用無血清的DMEM培養(yǎng)4hr。收集培養(yǎng)物、濃縮，通過2-DE從各個樣本中分離出50μg蛋白，用試驗方法(實施例1)中描述的銀染色可視化。脂肪細胞中優(yōu)先分泌的蛋白用編號的箭頭標注。在(C)中，來自脂肪細胞的分泌蛋白如上通過2-DE分離，轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上，用以1∶1000稀釋的兔抗脂聯(lián)素抗體檢測。表明所有8個箭頭標記的蛋白與抗脂聯(lián)素抗體發(fā)生免疫反應。
圖2表示在2-DE分離后，脂肪細胞分泌產(chǎn)物的糖蛋白檢測。200μg從脂肪細胞的培養(yǎng)物中收獲的蛋白質(zhì)通過如圖1的2-DE分離，轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上，并用檢測糖蛋白的免疫印跡(immu-bolt)試劑盒進行檢測。8種不同的脂聯(lián)素同工型如圖1用編號的箭頭標注。
圖3表示衍生自不同脂聯(lián)素同工型的胰蛋白酶肽(tryptic peptide)混合物MALDI-TOF質(zhì)譜分析圖。細菌產(chǎn)生的脂聯(lián)素(A)，從脂肪細胞中分泌的脂聯(lián)素同工型1(B)和同工型3(C)，和在COS-7細胞中被表達的脂聯(lián)素同工型3(D)在凝膠中用胰蛋白酶消化，胰蛋白酶混合物通過MALDI-TOF MS分析。表明用箭頭標注的三種肽(分子量(mass)為1679、4260和4276Da)在脂肪細胞和COS-7細胞生成的所有糖基化同工型(3到8)中被重復地觀察到，而不是在兩種未糖基化同工型(1和2)或細菌生產(chǎn)的脂聯(lián)素中。
圖4表示通過RP-HLPC、MALDI-TOF MS以及氨基酸測序分部分離和表征脂聯(lián)素的胰蛋白酶肽。通過2-DE分離的脂聯(lián)素的所有糖基化同工型從凝膠中被切除，匯集，用胰蛋白酶消化。胰蛋白酶肽混合物通過RP-HLPC分離。收集每個部分，用MALDI-TOF MS分析。含有分子量為1679、4260和4276Da的肽的三個部分分別用A、B和C表示。下表給出氨基酸序列、試驗觀察的分子量、理論分子量和這三種肽的分子量差別。
圖5給出脂聯(lián)素的膠原域的四個被修飾的賴氨酸(按照鼠的編號體系被編號為68、71、80和104)在所有種類中是保守的。小鼠、人、牛、猴和狗的脂聯(lián)素的序列分別參照登錄號BAB22597、NP_004788、AAK58902、AAK92202和AAL09702。四個被修飾的賴氨酸和其周邊序列(surrounding motif)以高亮顯示。
圖6表示圖4中分離的三種胰蛋白酶肽的氨基酸分析。肽A(具有1679Da的分子量)、肽B(具有4260Da的分子量)、肽C(具有4276Da的分子量)在110℃下用6N HCl消化24hr(表明這種處理破壞糖殘基但是可以檢測和量化羥基賴氨酸和羥基脯氨酸[26])，游離氨基酸殘基通過PITC衍生，通過421氨基酸分析儀分析。a氨基酸標準物的光譜。b羥基脯氨酸標準物的光譜。c羥基賴氨酸標準物的光譜。d肽A的光譜。e肽C的光譜。f肽B的光譜。
圖7表示來自Asp-N消化的肽B和C的肽混合物的MALDI-TOFMS光譜。在圖4中分離的肽C(I)和B(II)進一步用Asp-N消化，然后用如圖3中的MALDI-TOF MS分析。肽序列和對各個物質(zhì)的可能的修飾顯示在各個峰上方。表明Pro94排布為羥基化的脯氨酸也被氨基酸序列確定。
圖8表示在四個羥基賴氨酸上的糖苷含有葡糖基和半乳糖基基團。COS-7細胞用pcDNA-Ad-F轉(zhuǎn)染，然后在含有2mM葡萄糖的DMEM中用100μCi/ml 3H-1-半乳糖放射標記48hr，或者在含有2mM半乳糖的DMEM中用100μCi/ml 3H-1-葡萄糖放射標記48hr。從細胞培養(yǎng)物中純化FLAG標記的脂聯(lián)素，來自未被標記或放射標記的脂聯(lián)素的胰蛋白酶肽混合物用如圖4中的RP-HPLC分離來獲得肽A、B和C。為了比較放射性，各種肽的等分試樣進行液體閃爍計數(shù)。
圖9表示FLAG標記的脂聯(lián)素變體(K→R)的表達和碳水化合物檢測。COS-7細胞用pcDNA-Ad-F或pcDNA-Ad(K→R)-F轉(zhuǎn)染。(注pcDNA-Ad-F是表達FLAG標記的野生型鼠脂聯(lián)素的pcDNA載體，pcDNA-Ad(K→R)-F是表達鼠脂聯(lián)素變體的等價載體，該變體中四個在野生型分子中通常被羥基化和糖基化的賴氨酸殘基被突變?yōu)榫彼釟埢?。48hr后，F(xiàn)LAG標記的脂聯(lián)素或脂聯(lián)素變體(K→R)從細胞培養(yǎng)物中被純化。500ng來自各個樣本的蛋白用15％SDS-PAGE分離，用考馬斯亮蘭(CBB)染色(組A)或用免疫印跡糖蛋白檢測試劑盒檢測(組B)。表明絕大部分糖基化在脂聯(lián)素變體(K→R)中被去除。
圖10表示脂聯(lián)素和脂聯(lián)素變體對初級大鼠肝臟細胞中由胰島素引起的對葡萄糖生成的抑制的影響。上邊組(組A)表示缺少或存在20μ/ml由COS-7細胞生成的脂聯(lián)素或脂聯(lián)素變體(K→R)或者20μ/ml細菌生成的脂聯(lián)素時，用逐步加量的胰島素處理后對肝臟葡萄糖生成的抑制。下邊組(組B)表示在用50pM胰島素加上逐步加量的由COS-7細胞生成的脂聯(lián)素或脂聯(lián)素變體(K→R)，或者細菌生產(chǎn)的脂聯(lián)素處理后，肝臟葡萄糖生成的抑制。結果被描述為葡萄糖生產(chǎn)相對于未被處理的細胞中的產(chǎn)量的百分比例下降，表示為平均值±標準方差(n＝4)。Ad來自COS-7細胞的脂聯(lián)素；Ad變體來自COS-7細胞的脂聯(lián)素變體(K→R)。pAd來自大腸桿菌(E.Coli)的脂聯(lián)素。
圖11表示長期攝食酒精降低血漿脂聯(lián)素，升高TNF-α并導致肝臟損傷。在小鼠被飼喂高脂肪液體對照食物(虛線)或者高脂肪含酒精食物(實線)后，在不同階段采集血漿樣本，然后按照本文描述量化血漿脂聯(lián)素(A)、ALT(B)和TNF-α(C)的水平。*P＜0.05酒精食物對對照食物(n＝6)。
圖12表示脂聯(lián)素處理消除了小鼠中酒精誘導的肝中體重比(A)和血漿ALT濃度(B)的升高。在攝食液體對照食物(LC)、液體酒精食物(LE)或在最后2周用脂聯(lián)素處理的液體酒精食物(LE+Ad)的5周后收集血漿樣本，尸體解剖時測定肝臟與體重比(A)和血清ALT水平(B)(n＝5)。*P＜0.05是與僅食用LE食物的小鼠比較。
圖13表示脂聯(lián)素對酒精誘導的脂肪變性和炎癥的影響。在攝食液體對照食物肝樣本(LC)、液體乙醇食物(LE)或在最后2周用脂聯(lián)素處理的液體酒精食物(LE+Ad)5周后，從小鼠肝臟中取出肝臟樣本，用油紅O(上邊組)或蘇木精和曙紅(下邊組)進行染色。結果是來自六個獨立試驗的代表性顯微照片。
圖14表示脂聯(lián)素降低脂肪酸合酶(FAS)和CD36的mRNA表達，和抑制肝臟中TNF-α生成(A)。從飼喂液體對照食物、液體酒精食物或用脂聯(lián)素處理的液體酒精食物的小鼠肝臟中提取總RNA，并分別用33P標記的TNF-α、FAS或CD36進行RNA印跡分析(B)。來自組A的結果通過磷光成像(phosphorimaging)儀量化(n＝5)。在對16S RNA的豐度歸一化后，相對于未處理的HF/LC配對飼喂的對照物，所有RNA水平被表達(C)。TNF-α的血漿濃度用來自Chemico的ELISA試劑盒量化(n＝5)。**P＜0.01HF/LE食物與HF/LE食物加上脂聯(lián)素處理比較。FAS，脂肪酸合酶；TNF-α，腫瘤壞死因子α。
圖15表示脂聯(lián)素的肝臟保護作用的可能機制的圖示。FA游離脂肪酸；ACC乙酰輔酶A羧化酶；AMPK5’-AMP活性激酶；FAS脂肪酸合酶；TNF-α腫瘤壞死因子α。
圖16在具有周邊序列GXKGE(D)的脂聯(lián)素的膠原域內(nèi)的一些保守賴氨酸殘基(小鼠脂聯(lián)素的Lys68、71、80和104或者其他種類或脂聯(lián)素變體中的相應殘基)上發(fā)生脂聯(lián)素的糖基化和羥基化。
發(fā)明祥述I.一般技術除非特別說明，在本發(fā)明的實施中采用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學、和免疫學的傳統(tǒng)技術，它們屬于本領域的技術。這些技術在文獻中被充分說明，如分子克隆實驗室手冊，第二版(Molecular CloningA LaboratoryManual，second edition)(Sambrook等，1989)和分子克隆“實驗室手冊，第三版(Molecular CloningA Laboratory Manual，third edition)(Sambrook和Russel，2001)(在此均稱為“Sambrook”)；分子生物學中的現(xiàn)有方法(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等編輯，1987，包括2001附錄)；PCR聚合酶聯(lián)反應(PCRThePolymerase Chain Reaction)，(Mullis等編輯，1994)；Harlow和Lane(1988)抗體，實驗室手冊，冷泉巷出版社，紐約(Harlow and Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，NewYork)，和Harlow和Lane(1999)利用抗體，實驗室手冊，冷泉巷出版社，冷泉巷，紐約(Harlow and Lane(1999)Using AntibodiesALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY)(在此均稱為“Harlow和Lane”)，Beaucage等編輯，核酸化學中的現(xiàn)有方法(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry)，JohnWiley & Sons，Inc，紐約，2000)。
II.定義“抗體”(Abs)和“免疫球蛋白”(Igs)是具有相同結構特征的糖蛋白?？贵w具有與特定抗原的結合特異性，而免疫球蛋白包括抗體和不具有抗原特異性的其他抗體樣的分子。后者種類的多肽為，例如，少量由淋巴系統(tǒng)生成而大部分由骨髓瘤生成。術語“抗體”廣義上被使用，特別地包括不限于完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩個完整抗體形成的多重特異性抗體(如雙特異性抗體)和具有期望的生物活性的抗體片段。
“抗體片段”包括完整抗體的一個部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結合或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；雙抗體(diabodies)；線性抗體(Zapata等，蛋白質(zhì)工程(ProteinEng.)，8101057-1062 )；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多重特異性抗體。
本文所用的術語“單克隆抗體”是指從基本同源的抗體(homogeneous antibodies)群中獲得的抗體，即除了可能以極少量存在的可能天然突變體，構成該組的單個抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，直接對抗單個抗原位點。而且，與通常包括直接對抗不同決定簇(表位)的不同抗體的傳統(tǒng)(多克隆)抗體制劑相反，每個單克隆抗體直接對抗抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性，單克隆抗體的優(yōu)點在于其可以通過雜交瘤(hybridoma)培養(yǎng)合成，不會被其他的免疫球蛋白污染。修飾基因“單克隆”表明了從基本上同源的抗體群體中獲得的抗體的特征，并且不能如所需抗體的生產(chǎn)通過任何特定方法構建。例如，按照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過最先由Kohler等，自然(Nature)，256495 描述的雜交瘤方法制備，或者通過重組DNA方法制備(見如，美國專利No.4,816,567)?！皢慰寺】贵w”也可以用Clackson等，自然(Nature)，352624-628 和Mark等，分子生物學期刊(J.Mol.Biol.，)，222581-597(1991)中描述的技術從噬菌體抗體文庫中分離得到。
單克隆抗體在此特別地包括“嵌合的”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與從特定物種得到抗體的相應序列相同或同源，或者屬于特定的抗體類型或亞類型，而鏈的剩余部分與衍生自其他物種的抗體的相應序列相同或同源，或者屬于其他的抗體類型或亞類，以及具有期望的生物活性的這種抗體的片段。
可以預期，本文描述的每一個脂聯(lián)素糖基化同工型的單克隆特異性抗體可以被用于治療和診斷在此描述的脂聯(lián)素疾病和紊亂。
“多克隆抗體”制備多克隆抗體的方法是技術人員已知的。例如可以通過一次或多次注射免疫試劑以及如果需要和佐劑，在哺乳動物中產(chǎn)生多克隆抗體。
一般地，可以通過多次皮下或腹膜內(nèi)注射，將免疫試劑和/或佐劑注射到哺乳動物中。免疫試劑可以包括本發(fā)明的脂聯(lián)素多肽或其融合蛋白。
將免疫試劑與已知在被免疫的哺乳動物中具有免疫原性的蛋白結合是有用的。這種免疫原性蛋白的例子包括但不限于匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、和大豆胰蛋白酶抑制劑?？杀皇褂玫淖魟┑睦影‵reumd完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷酰基脂類A、合成的海藻糖二棒分枝菌酸鹽(dicorynomycolate))。本領域技術人員不需要過度試驗就可以選擇免疫方法。
“單克隆抗體”此外，脂聯(lián)素多肽抗體可選可以是單克隆抗體。單克隆抗體可以采用雜交瘤的方法，如由Kohler和Milstein，自然(nature)，256495(1975)描述的方法制備。在一種雜交瘤方法中，小鼠、倉鼠或其他適當?shù)乃拗鲃游锿ǔＳ妹庖咴噭┟庖邅懋a(chǎn)生淋巴細胞，淋巴細胞產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生會特異地與免疫試劑結合的抗體。
此外，可以在體外免疫淋巴細胞。
免疫試劑通常包括脂聯(lián)素多肽，包括片段，或這種蛋白的融合蛋白或其片段。一般地，如果需要人源的細胞，即采用外周血淋巴細胞(“PBLs”)，或者如果要求非人的哺乳動物來源的細胞，則采用脾臟細胞或淋巴結細胞。然后用合適的融合試劑如聚乙二醇將淋巴細胞與無限增殖的細胞系融合來形成雜交瘤細胞[Goding，單克隆抗體原理與操作，學院出版社，(1986)59-103(Goding，Monoclonal AntibodiesPrincipales and Practice，Academic Press，(1986)pp.59-103)]。無限增殖的細胞系通常是被轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞，特別是嚙齒動物、牛和人源的骨髓瘤細胞。一般采用大鼠或小鼠的骨髓瘤細胞系。雜交瘤細胞可以在適合的培養(yǎng)物中培養(yǎng)，培養(yǎng)物中優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的無限增殖細胞的生長和存活的物質(zhì)。
優(yōu)選無限增殖細胞系有效融合，通過被選擇的產(chǎn)生抗體的細胞支持抗體穩(wěn)定高水平的表達，并且對培養(yǎng)物如HAT培養(yǎng)物敏感。更加優(yōu)選無限增殖細胞系是鼠骨髓瘤細胞系，它可以從如沙克學院細胞分類中心，圣地亞哥，加利福尼亞(Salk Institute Cell Distribution Center，SanDiego，California)和美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，馬納薩斯，弗吉尼亞(the American Type Culture Collection(ATCC)，Manassas，Virginia)。人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤(heteromyeloma)細胞系也被描述用于人單克隆抗體的制備[Kozbor，免疫學期刊(J.Immunol.)，1333001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體生產(chǎn)技術和應用(MonoclonalAntibodv Production Techniques and Applications)，Marcel Dekker，Inc.，紐約(1987)pp.5163]。
然后可以分析培養(yǎng)雜交瘤細胞的培養(yǎng)物是否存在單克隆抗體。優(yōu)選通過雜交瘤細胞生產(chǎn)的單克隆抗體的結合特異性用免疫沉淀法或用體外結合分析如放射免疫檢測測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)確定。這些技術和分析方法在本領域是已知的。單克隆抗體的結合親和性可以如通過Munson和Pollard，分析生物化學(Anal.Biochem.)，107220(1980)的斯卡查德分析來確定。
在鑒定了期望的雜交瘤細胞后，通過限制性稀釋程序亞克隆該克隆(clones)并用標準的方法培養(yǎng)。用于該目的的合適培養(yǎng)物包括如Dulbecco′s Modifie Eagle′s Medium和RPMI-1640培養(yǎng)物。此外，雜交瘤細胞也可以作為腹水體內(nèi)生長在哺乳動物中。
從培養(yǎng)物或腹水液中分離或純化由亞克隆分泌的單克隆抗體可以用傳統(tǒng)的免疫球蛋白純化程序，如蛋白A瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
單克隆抗體還可以通過重組DNA方法制備。編碼本發(fā)明的單克隆抗體的DNA可以用傳統(tǒng)方法(如采用能夠特異性地結合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易地分離和測序。本發(fā)明的雜交瘤細胞作為這種DNA的優(yōu)選來源。一旦被分離，該DNA被放入到表達載體上，然后將載體轉(zhuǎn)染給宿主細胞，在重組的宿主細胞中實現(xiàn)單克隆抗體的合成。DNA也可以被修飾。
抗體可以是單價抗體。制備單價抗體的方法在本領域是公知的。
體外方法也適合于制備單價抗體。可以采用本領域已知的常規(guī)技術完成抗體來制備其片段，特別是Fab片段。
“人和人源化抗體”人源化形式的非人(如鼠)抗體是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體的其它抗原結合序列)，其含有衍生自非人的免疫球蛋白的最短序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的互補決定區(qū)(CDR)的殘基被來自非人物種如小鼠、大鼠或兔的具有期望的特異性、親和性和容量(capacity)的CDR(供體抗體)的殘基取代。
在有些情況下，人免疫球蛋白的Fv構架殘基被相應的非人的殘基取代。人源化抗體還可以包含即不存在于受體抗體、也不在輸入的CDR或構架序列中的殘基?？傊?，人源化抗體基本包含至少一個，典型兩個可變域(variable domain)的全部，其中對應于非人免疫球蛋白的全部或基本上全部的CDR區(qū)和全部或基本上全部的FR區(qū)是人免疫球蛋白的共有序列。人源化抗體最好還至少包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的一部分，通常是人的免疫球蛋白。
人源化非人的抗體的方法在本領域是公知的。一般地，人源化抗體具有一個或多個導入的來自非人來源的氨基酸殘基。這些非人的氨基酸殘基通常稱作為“輸入”殘基(import residue)，其通常從“輸入”的可變域得到。人源化基本上可以按照下面的Winter和co-worker方法[Jones等，自然(nature)，321522-525(1986)；Riechmann等，自然(nature)，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科學(science)，2391534-1536(1988)]進行，用嚙齒類CDRs或CDR序列取代人抗體的相應序列。
因此，這種“人源化”抗體是嵌合抗體，其中基本上小于完整的人可變域已經(jīng)被來自非人的物種的相應序列取代。實際上，人源化抗體通常是人抗體，其中一些CDR殘基和可能一些FR殘基被來自嚙齒類抗體中的同功位點(analogous site)的殘基取代。
人抗體還可以采用本領域已知的各種技術制備，包括噬菌體展示文庫[Hoogenboom和Winter，分子生物學期刊(J.Mol.Biol.)，227381(1991)；Marks等，分子生物學期刊(J.Mol.Biol.)，222581(1991)]。
Cole等和Berner等的技術也可以用來制備人的單克隆抗體[Cole等，單克隆抗體與癌癥治療(Monoclonal Antibodies and CancerTherapy)，Alan R.Liss，77(1985)，和Berner等，免疫學期刊(J.Immunol.，)147(1)86-95(1991)]。類似地，人抗體可以通過將人免疫球蛋白基因座(loci)導入轉(zhuǎn)基因動物來制備，如內(nèi)源性免疫球蛋白基因已經(jīng)部分地或完全地被滅活的小鼠。在攻擊中觀察到人抗體的生產(chǎn)，其在所有方面，包括基因重排、裝配和抗體所有組成成分中，與在人中所觀察到的相似。
“雙特異性抗體”雙特異性抗體是對于至少兩個不同抗原具有結合特異性的單克隆抗體，優(yōu)選為人的或人源化抗體。
制備雙特異性抗體的方法在本領域是已知的。通常地，重組制備雙特異性抗體是基于共表達兩個免疫球蛋白的重鏈/輕鏈對，其中兩個重鏈具有不同特異性(Milstein和Cuello，自然(nature)，305537-539 )。由于免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的隨機分類，這些雜交瘤(四分瘤(quadromas))生產(chǎn)10種不同抗體分子的可能混合物，這些抗體中只有一種具有正確(correct)雙特異性結構。純化正確的分子通常通過親和層析步驟完成。
具有期望的結合特異性的抗體可變域(抗體-抗原結合位點)可以被融合到免疫球蛋白恒定域(domain)序列上。對于生產(chǎn)雙特異性抗體的更加詳細的描述見如Suresh等，酶學中的方法(Methods inEnzymology)，121210(1986)。
按照WO96/27011中描述的其他方法，一對抗體分子之間的接觸面(interface)可以被設計來最大化從重組細胞培養(yǎng)物中回收的異源二聚體的百分比。優(yōu)選的接觸面至少包含抗體恒定域的CH3區(qū)的一部分。
在這種方法中，一個或多個來自第一個抗體分子的接觸面的小的氨基酸側(cè)鏈被大的側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。
通過用較小的側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代大的氨基酸側(cè)鏈，在第二個抗體分子的接觸面上形成與大側(cè)鏈相同或相似大小的補償“空腔”。這提供了一種機制來使異源二聚體的產(chǎn)量超過其他不期望的終產(chǎn)物如同源二聚體。
雙特異性抗體可以制備成全長抗體或抗體片段(如F(ab’)2雙特異性抗體)。由抗體片段生產(chǎn)雙特異性抗體的方法已經(jīng)在文獻中被描述。如，雙特異性抗體可以采用化學連接的方法制備。Brennan等，科學(Science)，22981(1985)描述了一種蛋白酶剪切(proteolyticallycleaved)水解完整抗體來生成F(ab’)2片段的方法。在存在連二硫絡合劑亞砷酸鈉下的情況下，這些片段被還原以穩(wěn)定鄰位二硫基，并防止分子間二硫化物形成。然后生成的Fab’片段被轉(zhuǎn)化成硫硝基苯甲酸酯(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。然后通過用巰基乙胺還原，將Fab’-TNB衍生物之一復原成Fab’-巰基，并與等摩爾量的其他Fab’-TNB衍生物混合來形成雙特異性抗體。生成的雙特異性抗體可以用作酶的選擇性固定的試劑。
Fab’片段可以直接地從大腸桿菌中回收，并被化學偶聯(lián)來形成雙特異性抗體。Shalaby等，試驗方法期刊(J.Exp.Med.)，175217-225(1992)描述完全人源化的雙特異性抗體F(ab’)2分子的制備。每一個Fab’片段分別由大腸桿菌分泌，并體外直接化學偶聯(lián)產(chǎn)生雙特異性抗體。
直接從重組細胞培養(yǎng)物中制備和分離雙特異性抗體片段的各種技術也已經(jīng)被描述，例如，已經(jīng)用亮氨酸拉鏈制備了雙特異性抗體。
Kostelny等，免疫學期刊(J.Immunol)，148(5)1547-1553(1992)。通過基因融合將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽連接到兩種不同抗體的Fab’部分。在鉸鏈區(qū)還原抗體同源二聚體以形成單體，然后再氧化形成抗體異源二聚體。這種方法還可以用于制備抗體同源二聚體。
在Hollinger等，美國國家科學院匯編90(Proc.Natal.Acad.Sci.USA 90)6444-8448(1993)中描述的“雙抗體(diabody)”技術提供了另一種制備雙特異性抗體片段的機制。該片段包含通過接頭連接到輕鏈可變域(VL)的重鏈可變域(VH)，該接頭很短以至同一條鏈上的兩個域之間不能配對。
因而，迫使一個片段上的區(qū)域VH和V與互補的其他片段上的VL和VH域配對，從而形成了兩個抗原結合位點。另一種采用單鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的方案也已經(jīng)被報道。見Gruber等，免疫學期刊(J.Immunol.)1525368(1994)。
高于二價的抗體也是可預期的。例如，可以制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學期刊(J.Immunol.)14760(1991)。
示例的雙特異性抗體可以與本文給出的多肽上的兩個不同表位結合。
另外，抗多肽的臂可以與結合到白細胞上的觸發(fā)分子的臂聯(lián)合來研究對細胞表達特定多肽的細胞防御機制，觸發(fā)分子如T細胞受體分子(如CD2、CD3、CD28或B7)，或IgG的Fc受體(FcyR)，如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcFyRIII(CD16)。雙特異性抗體還可以用于將細胞毒性物質(zhì)定位在表達特定多肽的細胞上。這些抗體具有多肽結合臂和結合細胞毒性試劑或放射性核素螯合劑，如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。另一種目標雙特異性抗體結合多肽，還進一步結合組織因子(TF)。
“復共軛抗體(Heteroconiugate Antibodies)”復共軛抗體由二個共價結合的抗體組成?？梢灶A料該抗體可以采用合成蛋白化學中的已知方法體外制備，包括那些涉及交聯(lián)劑的方法。例如，可以采用二硫化物交換反應或通過形成硫醚鍵來構建免疫毒素。用于該目的的適合試劑的例子包括亞氨基硫醇鹽和甲基-4巰基丁酰胺(methyl-4mercaptobutyrimidate)和那些在例如美國專利US專利No.4,676,980中公開的試劑。
“篩選檢測”可被設計成尋找模擬天然PRO或PRO受體的生物活性的前導化合物(lead compounds)。這些篩選檢測包括能夠進行化學文庫的高通量篩選的檢測，使其特別適合于確定小分子藥物候選物?？赡艿男》肿影ê铣傻挠袡C或無機的化合物。該檢測可以以各種方式進行，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結合檢測、生物化學篩選檢測、免疫檢測和基于細胞的檢測。這些方法在本領域被充分表述。這些分析可以以各種方式進行，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結合檢測、生物化學篩選檢測、免疫檢測和基于細胞的檢測。這些方法在本領域被充分表述。
“免疫測定”包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、蛋白質(zhì)印跡。適合的抗體檢測標記在本領域是已知的，包括酶標簽，如葡糖氧化酶，和放射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(112In)和锝(99MTc)，和熒光標簽，如熒光素和羅丹明和生物素，熒光放射性同位素、熒光鄰近標記和其他本領域技術人員已知的標記。
“基本同源”或“基本相同”是指序列同源性，當采用如下的序列比較算法之一或通過視察(Visual inspection)測定，進行最大對應的比較和排列時，其中至少50％的序列是相同的，優(yōu)選至少60％、優(yōu)選至少70％、優(yōu)選至少80％、更加優(yōu)選至少90％的核苷酸或氨基酸殘基同一性。兩條序列(氨基酸或核苷酸)可以在它們的全長進行比較(如果他們長度基本不同，兩者中較短的那條的長度)。對于序列比較，通常一條序列作為參比序列，被檢測的序列與之比較。當采用序列比較算法時，檢測和參比序列都被輸入到計算機中，如果需要，指定亞序列坐標(subsequence coordinate)等同物，指定序列算法程序參數(shù)。然后序列比較算法根據(jù)設定的程序參數(shù)計算檢測序列相對于參比序列的百分比序列同一性。可以通過Smith & Waterman先進應用數(shù)學(Adv.Appl.Math.)2482(1981)的局部同源性算法(the local homologyalgorithm)、Needleman & Wunsch，分子生物學期刊(J.Mol.Biol.)48443(1970)同源性序列對比排列算法(the homology alignmentalgorithm)、Pearson & Lipman，美國國家科學院匯編(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444(1988)的檢索相似性方法(the search for similaritymethod)、這些算法(威斯康星州麥迪遜的遺傳計算小組，575科學Dr.的威斯康星遺傳軟件包中(the Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的計算機化工具，或者通過觀察(參見Ausubel等，分子生物學中的現(xiàn)有方法(Current Protocols In MolecularBiology)，Greene Publishing和Wiley-Interscience，紐約，同上)來引入用于比較的序列的最佳序列對比。當采用任何上述算法時，使用視窗(Window)長度的缺少參數(shù)(default parameters)、間隙罰分(gappenalty)等。兩種核酸序列或多肽基本上相同的另一個指示是第一種多肽(如由第一種核酸編碼的多肽)與第二種多肽(如由第二種核酸編碼的多肽)發(fā)生免疫交叉反應。因此，例如當兩種肽僅區(qū)別于保守置換時，一種多肽與第二種多肽基本相同。
當術語“基本上純”或“分離的”涉及蛋白質(zhì)和多肽時，表示這些多肽從與之天然相關的蛋白質(zhì)或其他污染物中分離出來。當一種蛋白質(zhì)超過含有該蛋白的組合物的總蛋白含量的約50％，典型地超過總蛋白含量的約60％時，該蛋白質(zhì)或多肽被認為是基本上純的。更典型地，基本上純或分離的蛋白質(zhì)或多肽將構成總蛋白的至少約75％，更優(yōu)選至少約90％。優(yōu)選該蛋白質(zhì)將構成組合物中的總蛋白的超過約90％，更優(yōu)選超過約95％。
“有效量”是足以有效地產(chǎn)生有益的或期望的效果包括臨床效果的含量。有益效果包括但不限于改進個體對胰島素敏感的能力、降低胰島素耐受、減輕高血糖癥、改善個體的肥胖癥。有效量可以通過各種施用途徑一次或多次施用。
本文所用“治療”是用于獲得有益的或期望的效果包括和優(yōu)選臨床效果的方法。有益的或臨床的效果包括但不限于改進個體對胰島素敏感的能力、降低胰島素耐受、減輕高血糖癥、改善個體的肥胖癥。在一段時間內(nèi)實施治療計劃，包括多種劑量、多次施用和/或不同的施用途徑?？傊行Я康陌腔?lián)素的組合物被施用來治療。當顯然存在正常循環(huán)濃度的脂聯(lián)素時，脂聯(lián)素治療也是有效的，因此，存在正常脂聯(lián)素水平不是脂聯(lián)素治療的禁忌征。
“生物樣本”包括從個體中獲得的各種樣本類型，可用于診斷或監(jiān)測分析。該定義包含血液或其他生物來源的液體樣本、固體組織樣本如活體解剖樣本或組織培養(yǎng)物或由其衍生的細胞，和其后代。該定義還包括在獲取之后以任何方式被處理的樣本，如用藥劑處理，穩(wěn)定化，或富集某些成分，如蛋白質(zhì)或多核苷酸。術語“生物樣本”包括臨床樣本，還包括培養(yǎng)物中的細胞、細胞上清液、細胞溶解產(chǎn)物、血清、血漿、生物液體和組織樣本。
本文所用術語“統(tǒng)計學上顯著”、“統(tǒng)計學上顯著差異”等等具有本領域的通常意義，是指偶然發(fā)生所觀察的差異的概率(或當在測定“統(tǒng)計學上相似”的情況下，觀察到不存在差異的概率)(p值)低于某個預先確定的水平，即p值＜0.05，優(yōu)選＜0.01和更優(yōu)選＜0.001。各種適合的統(tǒng)計方法是技術人員熟知的，可以用于測定統(tǒng)計顯著性(如標準方差方法如學生t-檢驗{用于兩個樣本比較}、ANOVA{方差分析}和置信區(qū)間分析；軟件如第8版本SAS系統(tǒng)(SAS System Version 8)(SASInstitute Inc.，卡里，新喀里多尼亞，美國(Cary，NC，USA))可用于分析)。
“個體”是脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選為人。哺乳動物包括但不限于家畜、運動動物、寵物、靈長類、小鼠和大鼠。
因此，本文所用術語“劑量形式”包括本領域熟知的適合于適合施用給哺乳動物特別是人的蛋白質(zhì)的藥物配制劑的任何合適的劑量形式，特別是(雖然不是唯一地)那些適合于在溶液中穩(wěn)定施用給哺乳動物優(yōu)選為人的治療性蛋白的。所有這些無論脂聯(lián)素是否是組合物形式。
一個例子是口服形式的片劑、膠囊、錠劑等形式、或任何液體形式如糖漿、水溶液、乳劑等，能夠防止治療性蛋白在產(chǎn)生作用之前降解，如果是口腔劑量形式，則防止在消化道中產(chǎn)生作用之前被降解。
用于經(jīng)膚遞送的劑量形式的例子包括經(jīng)皮的貼片、經(jīng)皮膚的繃帶等。
包括在體表(topical)劑量形式中的是任何的洗液(lotion)、棒狀物、噴霧劑、軟膏、糊劑、乳油等。其直接或者通過媒介如襯墊、貼片等應用于皮膚。
用于栓劑遞送的劑量形式的例子包括被插入到體孔中的任何固體或其他劑量形式(特別是被插入到直腸、陰道和尿道中的那些)。
用于轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)的遞送的劑量單位的例子包括沉淀劑，灌腸劑、陰道栓劑、塞子、乳油、凝膠、糊劑、泡沫，噴霧溶液、散劑和類似配制劑，其除了活性成分外還含有如本領域已知的合適的載體。
用于長效施用(depot administration)的劑量單位的例子包括活性劑的藥丸或小的圓柱體或其中活性劑被夾塞在可生物降解的聚合物基質(zhì)、微乳劑、脂質(zhì)體中或被裝入微膠囊中的固體形式。
可植入的輸注裝置的例子包括任何固體形式，其中活性劑被包被在或分散在可生物降解聚合物或合成聚合物如硅酮(silicone)、硅氧橡膠(silicone rubber)、硅橡膠(silastic)或類似聚合物中。
輸注裝置的可選劑量形式可以采用脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)。
通過大丸劑遞送的劑量單位例子包括單次或多次通過靜脈注射、皮下、皮內(nèi)下和肌內(nèi)給藥或口服。
用于吸入或吹入的劑量單位的例子包括包含溶液和/或藥學上可接受的、水溶的或有機溶劑或其混合物中的懸浮液和/或粉末的組合物。
蛋白質(zhì)的保守置換是用具有相似大小和電荷的氨基酸取代一個氨基酸。公知為等價的氨基酸組是(a)Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)Asn，Asp，Glu和Gln；(c)His，Arg和Lys；(d)Met，Glu，Ile和Val；和(e)Phe，Tyr和Trp。
III.脂聯(lián)素和脂聯(lián)素組合物本發(fā)明大體上涉及脂聯(lián)素和脂聯(lián)素組合物。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，存在多種脂聯(lián)素同工型并具有不同的生物活性。本發(fā)明的脂聯(lián)素和脂聯(lián)素組合物是有用的，特別用于治療的、診斷的、和其他的用途。在一個方面，本發(fā)明提供糖基化的脂聯(lián)素多肽，其是重組的、分離的、純化的或合成的。優(yōu)選脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。優(yōu)選至少對應于人脂聯(lián)素賴氨酸殘基65、68、77和101(按照人的肽編號的殘基)的賴氨酸殘基之一被糖基化。
在另一個方面，本發(fā)明提供含有脂聯(lián)素多肽的組合物，其中該脂聯(lián)素多肽被糖基化。優(yōu)選組合物的脂聯(lián)素多肽是重組的、分離的、純化的或合成的。更優(yōu)選組合物的脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。優(yōu)選至少對應于人脂聯(lián)素賴氨酸殘基65、68、77和101(按照人的肽編號的殘基)的賴氨酸殘基之一被糖基化。
在另一個方面，本發(fā)明提供含有重組的、分離的、純化的或合成的脂聯(lián)素多肽的組合物，其中至少對應于人脂聯(lián)素賴氨酸殘基65、68、77和101(按照人的肽編號的殘基)的賴氨酸殘基之一被糖基化。
根據(jù)賴氨酸殘基65、68、77和101上的糖基化(或缺少糖基化)相互區(qū)別的脂聯(lián)素多肽有時在此稱作為“糖基化同工型”。
A.脂聯(lián)素多肽在此所用“脂聯(lián)素多肽”可以是重組的、分離的、純化的或合成的。在一個實施方案中，脂聯(lián)素具有來自天然動物脂聯(lián)素的序列，如哺乳動物、如人、非人的靈長類、小鼠、大鼠、狗或牛。見如圖5。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽是糖基化的成熟形式，沒有加工前形式(pre-pro form)的信號序列。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽通過天然脂聯(lián)素蛋白的平截(天然的或重組的)和/或保守置換區(qū)別于天然脂聯(lián)素。在一個實施方案中，脂聯(lián)素具有與天然脂聯(lián)素的序列如圖5的序列基本上相似(即基本上相同)的序列。在一個實施方案中，這些平截的脂聯(lián)素多肽和保守置換物基本上與天然脂聯(lián)素同源，仍保留本文所公開的生物活性。在各種實施方案中，用于本發(fā)明的組合物中的脂聯(lián)素多肽包括圖5的脂聯(lián)素的等位變體、差異剪接變體、可變性剪接變體和基本上與圖5的脂聯(lián)素同源的其他天然脂聯(lián)素變體。其他有用的脂聯(lián)素變體是全長脂聯(lián)素的片段，如可以通過檢測全長脂聯(lián)素的一個或多個氨基酸殘基的缺失或全長脂聯(lián)素的平截來獲得。脂聯(lián)素的活性片段或部分可以從N末端或C末端或脂聯(lián)素肽中通過逐步缺失氨基酸殘基來確定。如果氨基酸被缺失而脂聯(lián)素的生物活性基本上沒有下降，則該氨基酸不包含活性片段部分。
可以通過本領域熟知的方法將脂聯(lián)素的這種活性片段或部分與其他多肽融合來獲得嵌合多肽。任何這種保持天然脂聯(lián)素的生物活性的嵌合多肽也被認為是本發(fā)明的脂聯(lián)素多肽。
脂聯(lián)素的功能性變體可以通過其生物學功能表征，其中脂聯(lián)素的功能性變體是能夠產(chǎn)生與脂聯(lián)素相同的生物反應的脂聯(lián)素作用位點的激動劑。這種功能性變體被認為是在此定義的脂聯(lián)素多肽。
同時在此特別提及由糖或糖的混合物的糖基化，或更特別提及各種實例如葡糖基半乳糖基(glucosylglactosyl)部分，該術語在其范圍內(nèi)包括糖基化部分的任何擴展和變化，其產(chǎn)生與特別指出的糖基化類似的生物活性。
同時在此特別提及羥基化，該術語包括羥基化部分的任何擴展和變化，包括產(chǎn)生與特別指出的羥基化類似的生物活性的其他修飾。
同時在此特別提及羥基脯氨酸，該術語在其范圍內(nèi)包括任何氨基酸，包括產(chǎn)生與特別指出的氨基酸類似的生物活性的被修飾氨基酸。
脂聯(lián)素制劑可以以適合于施用給人的方式配制，優(yōu)選為通過如皮下的(s.c.)、真皮內(nèi)的(i.d.)、靜脈內(nèi)的(i.v.)、腹膜內(nèi)的(i.p.)或經(jīng)皮的路徑腸胃外施用的方式。其他的制劑也是可預期的，其中所述脂聯(lián)素通過口腔、直腸、陰道、膀胱內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、腦內(nèi)或其他本領域技術人員知曉的路徑被施用。
優(yōu)選的給藥路徑是腸胃外。適合于腸胃外給藥的脂聯(lián)素被配制在含有穩(wěn)定用緩沖劑的水溶液中，優(yōu)選為或接近等滲強度，和具有適當?shù)姆栏瘎?、防沫劑、抗沉淀劑和其他本領域技術人員已知的穩(wěn)定劑以適合于施用給哺乳動物特別是人的蛋白質(zhì)的藥物配制劑，特別是適合于在溶液中穩(wěn)定施用給哺乳動物優(yōu)選是人的治療性蛋白質(zhì)的那些。
在本發(fā)明的一個實施方案中，組合物含有在體外分析如在實施例中所示測定肝細胞對胰島素的反應能力中具有可檢測生物活性的脂聯(lián)素多肽。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽具有至少一種以下的生物活性增強胰島素的作用，降低個體中胰島素耐受，抑制糖原異生，減緩高血糖癥或改善肥胖個體的健康狀況。在各種實施方案中，本發(fā)明組合物的脂聯(lián)素多肽的生物活性為具有圖5所示序列的脂聯(lián)素多肽的至少約50％和通常至少約95％，如圖5的人脂聯(lián)素多肽。
B.脂聯(lián)素同工型在一個方面，本發(fā)明涉及含有一種和多種脂聯(lián)素同工型的組合物。如本文所用脂聯(lián)素“同工型”是基于pI和表觀分子量相互區(qū)別的脂聯(lián)素多肽同工型。不同同工型可以通過標準方法如電泳鑒定。如圖1所示，從脂肪細胞中分離的脂聯(lián)素存在至少8種不同的同工型，可以按照如圖1和2所示的等電點(pI)和電泳遷移率(表觀分子量)來定義。一些同工型被糖基化(如同工型3、4、5和6)，而其他的沒有(如同工型1和2)。
C.脂聯(lián)素的糖基同工型(glycoisoform)如下文所述，在哺乳動物細胞中制備的脂聯(lián)素能夠進行翻譯后的修飾如糖基化。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)小鼠脂聯(lián)素賴氨酸殘基68、71、80和104以及相應的人脂聯(lián)素賴氨酸殘基65、68、77和101是糖基化的靶點。在一個方面，本發(fā)明提供含有人脂聯(lián)素、來自非人物種的脂聯(lián)素和在對應于人的脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的一個或多個殘基被糖基化的脂聯(lián)素的組合物?？梢灶A期，當涉及非人物種的脂聯(lián)素、脂聯(lián)素變體或區(qū)別于圖5所示的人脂聯(lián)素的平截脂聯(lián)素時，脂聯(lián)素的殘基參照采用相應的人序列殘基的編號，通過兩條序列的最佳排列確定。圖5顯示不同動物的脂聯(lián)素的序列排列。例如，在天然小鼠脂聯(lián)素中，相應的賴氨酸殘基是68、71、80和104。可以預期，當在一種物種(如人或小鼠)中討論編號時，還用來指其他物種的同等編號。
在一個方面，本發(fā)明提供被糖基化的脂聯(lián)素多肽，其是重組的、分離的、純化的或合成的。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。在另一個實施方案中，至少對應于賴氨酸殘基68、71、80和104(小鼠)或殘基65、68、77和101(人)的賴氨酸殘基之一被糖基化。在一個實施方案中，脂聯(lián)素完全被糖基化?！巴耆惶腔笔侵钢?lián)素多肽上糖基化的狀況，其中脂聯(lián)素多肽中的所有賴氨酸殘基被至少一種糖部分糖基化(如對應于賴氨酸殘基68、71、80和104(小鼠)或殘基65、68、77和101(人)的全部4個賴氨酸殘基被糖基化)。
賴氨酸殘基上的糖基化是O-連接的，使得一個或多個糖部分被添加到每個賴氨酸殘基上。在本發(fā)明的一個方面，被添加到賴氨酸殘基上的糖部分是葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。在另一個方面，脂聯(lián)素多肽在每一個賴氨酸殘基68、71、80和104(小鼠)或殘基65、68、77和101(人)上具有至少一種葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽在至少賴氨酸殘基68、71、80和104(小鼠)或殘基65、68、77和101(人)之一或者全部Lys-68、71、80和104(小鼠)或Lys-65、68、77和101(人)上具有結構X1，其中每個X1獨立地選自葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分中的一種或多種。在一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽的所有賴氨酸全部被糖基化。
糖基化的脂聯(lián)素多肽還可以通過其生物學作用表征。在一個實施方案中，糖基化的脂聯(lián)素多肽施用給哺乳動物可用于治療在此描述的與脂聯(lián)素調(diào)控相關的疾病狀態(tài)。在另一個實施方案中，如實施例中所描述，將糖基化的脂聯(lián)素多肽施用給哺乳動物增強胰島素的作用。在另一個實施方案中，糖基化的脂聯(lián)素多肽施用給動物時抑制糖原異生。
在另一個方面，本發(fā)明提供包含脂聯(lián)素多肽的組合物，其中脂聯(lián)素多肽被糖基化。在一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽是重組的、分離的、純化的或合成的。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。在另一個實施方案中，組合物被配制成含有或不含有其他藥學上可接受的賦形劑、共活性劑、稀釋劑等以適合于施用給哺乳動物患者。在另一個實施方案中，組合物還含有胰島素。優(yōu)選胰島素的濃度或含量足以產(chǎn)生在約50pM到400pM之間的血液胰島素濃度。優(yōu)選胰島素的濃度或含量足以有效地產(chǎn)生在約100pM到約300pM之間的血液胰島素濃度。更優(yōu)選胰島素優(yōu)選為足以有效地產(chǎn)生200pM的血液胰島素濃度的濃度含量。
在另一個方面，本發(fā)明提供脂聯(lián)素多肽的組合物，其中至少對應于賴氨酸殘基68、71、80和104(小鼠)或殘基65、68、77和101(人)的賴氨酸殘基之一被糖基化。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素完全被糖基化。“完全被糖基化”是指脂聯(lián)素多肽的糖基化狀態(tài)，其中脂聯(lián)素多肽中的所有賴氨酸殘基被至少一個糖部分糖基化。
賴氨酸殘基的糖基化是O-連接的，使得一個或多個糖部分被添加到每個賴氨酸殘基上。在本發(fā)明的一個方面，被添加到賴氨酸殘基上的糖部分是葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。在另一個方面，脂聯(lián)素多肽在每一個賴氨酸殘基68、71、80和104(小鼠)或殘基65、68、77和101(人)上具有至少一個葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽在至少一個賴氨酸殘基68、71、80和104(小鼠)或殘基65、68、77和101(人)上或者全部Lys-68、71、80和104(小鼠)或Lys-65、68、77和101(人)上具有結構X1，其中每個X1獨立地選自葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分中的一種或多種。在一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽中的所有賴氨酸全部被糖基化。在還有一個實施方案中，脂聯(lián)素選自脂聯(lián)素同工型3、4、5或6中的任何一種。
糖基化的脂聯(lián)素多肽的組合物還可以通過其生物作用表征。在一個實施方案中，如實施例中所描述將組合物施用給哺乳動物增強胰島素的作用。在另一個實施方案中，糖基化脂聯(lián)素多肽的組合物施用給動物時抑制糖原異生。
在一個方面，本發(fā)明提供脂聯(lián)素的組合物，其基本上不含有至少一種非糖基化的脂聯(lián)素同工型。在一個方面，組合物基本上不含有同工型1和/或同工型2。在另一個方面，組合物基本上不含有任何非糖基化的脂聯(lián)素同工型。當該同工型少于組合物中脂聯(lián)素蛋白重量的約20％，優(yōu)選少于10％，優(yōu)選少于5％，最優(yōu)選少于1％或0.1％時，在此所用的組合物“基本上不含有”同工型。用于獲得這種組合物的方法包括在實施例中公開的方法以及在蛋白質(zhì)純化和層析分析領域已知的方法。
在還有另一個方面，本發(fā)明提供含有脂聯(lián)素的組合物，其中僅僅或主要的脂聯(lián)素種類被完全糖基化。在一個實施方案中，組合物含有超過一種的脂聯(lián)素同工型和/或超過一種的糖基化狀態(tài)的脂聯(lián)素。組合物可以是同工型3、4、5或6中的任何一種是組合物中的主要脂聯(lián)素。在本文中，“主要”是指組合物中至少約50％的脂聯(lián)素多肽是特定糖基化狀態(tài)或特定同工型，優(yōu)選至少約60％，優(yōu)選至少約70％，優(yōu)選至少約80％，優(yōu)選至少約90％，優(yōu)選至少約95％和優(yōu)選至少約98％糖基化的脂聯(lián)素多肽。
糖基化的脂聯(lián)素多肽的組合物還可以通過其生物作用表征。在一個實施方案中，如實施例中所描述將組合物施用給哺乳動物增強胰島素的作用。在另一個實施方案中，糖基化脂聯(lián)素多肽的組合物被施用給動物時抑制糖原異生。
D.獲得糖基化脂聯(lián)素的方法多種方法可以用于獲得本發(fā)明的組合物。可以預期，脂聯(lián)素多肽可以通過重組或合成的方法制備，或從天然來源中分離或純化。
在一個實施方案中，通過重組方法制備一種或多種脂聯(lián)素同工型或糖基化同工型?？梢酝ㄟ^將編碼蛋白的多核苷酸(通常為DNA)序列插入到表達載體中并且在合適的宿主中表達該肽來重組制備脂聯(lián)素。編碼期望的多肽的多核苷酸，無論是融合或成熟形式，以及無論是否含有允許分泌的信號序列，被連接到適合于任何適當宿主的表達載體上。雖然由于真核細胞能夠進行翻譯后的修飾如糖基化而推薦采用真核表達系統(tǒng)，但是也可以采用任何本領域普通技術人員知曉的各種表達載體。可以在任何合適的宿主細胞中實現(xiàn)表達，該宿主細胞已經(jīng)用含有編碼重組肽的DNA的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。真核宿主細胞的例子是本領域已知的，包括酵母、鳥類、昆蟲、植物和動物細胞如COS7、Hela、CHO及其它的哺乳動物細胞。重組生產(chǎn)的標準技術被描述如在上文的Sambrook中?？梢酝ㄟ^在哺乳動物細胞中表達編碼脂聯(lián)素或具有任何在圖5中描述的動物(如人、小鼠等)的序列的多肽或其生物活性片段或其變體的重組多核苷酸來獲得脂聯(lián)素。
在另一個實施方案中，脂聯(lián)素(包括同工型和糖基化同工型的混合物)還可以從動物組織如但不限于血清或脂肪細胞中純化。用于從脂肪細胞中純化脂聯(lián)素的方法在本領域是公知的，在實施例中被進一步描述。從中可以獲得糖基化脂聯(lián)素的組合物的動物包括但不限于人、小鼠、大鼠、狗、牛和非人的靈長類。
重組得到或者從動物組織中獲得的脂聯(lián)素可以采用常規(guī)方法如在實施例中描述的電泳或?qū)游龇治?，根?jù)分子量、pI和/或脂聯(lián)素多肽中的糖基化含量進行分離。在本發(fā)明的一個方面，如上描述，含有脂聯(lián)素特定同工型或糖基化同工型的脂聯(lián)素組合物可以通過差別純化來制備。例如，按照本發(fā)明的方法，這包括獲得含有至少兩種區(qū)別于糖基化程度或類型的脂聯(lián)素形式的第一組合物，然后根據(jù)糖基化的程度或類型來分離脂聯(lián)素形式。這種方法制備在脂聯(lián)素模式上區(qū)別于第一組合物的第二組合物。
可以通過蛋白質(zhì)純化領域一些已知的方法從其他多肽中分離糖基化的脂聯(lián)素多肽。在一個實施方案中，采用雙向電泳進行分離，接著從凝膠中切除和洗脫蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，采用基于電荷選擇的親和柱進行分離。在另一個實施方案中，采用負載了凝集素的親和柱進行分離。在另一個實施方案中，采用選擇性蛋白純化方法，如免疫親和柱、大小排阻柱、凝集素親和、疏水作用、反相、陰離子和陽離子交換層析等(見通常R.Scopes，蛋白質(zhì)純化(Protein Purification)，Springer-Verlag，紐約(1982)和Deutscher，酶學中的方法(Methods inEnzymology)第182卷蛋白質(zhì)純化指南，學院公司，紐約(1990)(Guideto Protein Purification，Academic Press，Inc.N.Y.))。
在一個實施方案中，主要含有糖基化的脂聯(lián)素多肽的組合物通過使用凝集素柱與糖基化脂聯(lián)素多肽結合來獲得，例如，伴刀豆球蛋白A或麥胚凝集素柱。非糖基化的脂聯(lián)素將不會與該柱結合，從而流過該柱。然后從該柱上洗脫糖基化的脂聯(lián)素多肽來獲得主要含有糖基化的脂聯(lián)素多肽的組合物。
在另一個實施方案中，各種同工型和/或糖基化同工型通過以下方法對重組獲得的或從動物組織得到的脂聯(lián)素進行雙向凝膠，通過用抗體鑒定糖基化種(如實施例所示)，切除糖基化的脂聯(lián)素同工型的斑點(spot)或條帶(band)，從條帶上洗脫糖基化的脂聯(lián)素同工型來獲得基本純的一種糖基化脂聯(lián)素同工型的組合物?？梢灶A期，本發(fā)明的組合物可以通過如上描述的常規(guī)技術制備，包括分離和再結合特異性同工型和/或糖基化同工型來準備期望的實施方案。
IV.方法A.監(jiān)測表達可以監(jiān)測脂聯(lián)素同工型和糖基化同工型的表達。在本發(fā)明的一個方面，監(jiān)測和測定表達來診斷個體的疾病狀態(tài)或發(fā)生與脂聯(lián)素調(diào)控相關的疾病狀態(tài)的可能性。在各種實施方案中，疾病狀態(tài)是高血糖癥，胰島素耐受，與胰島素耐受相關的代謝綜合征，與胰島素耐受相關的代謝綜合征，2型糖尿病，代謝綜合征包括高血壓、動脈硬化形成、冠心病、缺血性心臟病、多囊卵巢綜合征或其他與脂聯(lián)素缺乏或肥胖相關的狀態(tài)。脂聯(lián)素可以從生物液體如血清或血液中獲得，通過電泳、HLPC或質(zhì)譜分析。通過任何本文公開的方法或本領域已知的方法(如雙向電泳)監(jiān)測表達模式。
可以通過監(jiān)測特定脂聯(lián)素同工型的水平，至少兩種脂聯(lián)素同工型或糖基化同工型的表達模式(expression profile)來進行監(jiān)測。在一個實施方案中，個體中的水平或表達模式與參比模式比較，其中與參比模式(reference profile)比較的統(tǒng)計學上的顯著相關診斷為一種癥狀。參比模式可以來自具有高血糖癥，胰島素耐受，與胰島素耐受相關的代謝綜合征，2型糖尿病，或肥胖的家族史的其他個體或者患有高血糖癥，胰島素耐受，與胰島素耐受相關的代謝綜合征，2型糖尿病，或肥胖癥的個體。參比模式還可以來自一群根據(jù)其疾病史分組的個體，如患有高血糖癥，胰島素耐受，與胰島素耐受相關的代謝綜合征，2型糖尿病，或肥胖癥。
某些糖基化脂聯(lián)素同工型的表達水平或表達模式(expressionpattern)可用于統(tǒng)計分析來確定本文描述的特定脂聯(lián)素相關疾病狀態(tài)表達模式的水平范圍或相關度。然后統(tǒng)計學上顯著相關可用于確定與期望的(或不期望的)預后相關的糖基化脂聯(lián)素同工型的水平或模式。然后可以確定來自生物樣本(如患者樣本)的糖基化脂聯(lián)素同工型的表達水平或表達模式，并與參比水平和表達模式比較來預測臨床結果。
在優(yōu)選實施方案中，在監(jiān)測方法中所用的任何一種或多種脂聯(lián)素同工型是人脂聯(lián)素。在另一個優(yōu)選實施方案中，個體是人。
B.治療方法和藥物制備本發(fā)明還提供治療個體中與脂聯(lián)素調(diào)控相關的疾病狀態(tài)。疾病狀態(tài)包括但不限于高血糖癥，胰島素耐受，與胰島素耐受相關的代謝綜合征，2型糖尿病，代謝綜合征包括高血壓、動脈硬化形成、冠心病、缺血性心臟病、多囊卵巢綜合征或其他與脂聯(lián)素缺乏或肥胖相關的狀態(tài)。
治療方案通常包括給被治療的個體施用有效量的糖基化脂聯(lián)素的組合物。有效量可以通過評價生物活性來測定如在實施例中公開的胰島素致敏作用。技術人員能夠通過逐步提高劑量并在每一步評價生物功能來確定糖基化組合物的含量。
糖基化脂聯(lián)素組合物可以在藥學上接受的賦形劑中被施用。藥學上可接受的賦形劑在本領域是已知的，是相對惰性的物質(zhì)，便于藥學上有效的物質(zhì)的施用。在一些實施方案中，本發(fā)明的脂聯(lián)素組合物被配制成通過注射施用(如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)等)。
因此，糖基化脂聯(lián)素的組合物可以結合藥學上可接受的載體如鹽水，Ringer溶液，葡萄糖溶液等。特定的劑量方案，即劑量、時間選擇和重復，將依賴于特定個體和該個體的病史。治療可包括在一定時期內(nèi)多次施用?？梢圆捎贸Ｒ?guī)臨床測定包括但不限于葡萄糖水平、葡萄糖禁食檢測和體外胰島素致敏試驗來評價治療的生物功能。
還可以加入抑制細菌或抑制真菌濃度的抗菌劑以符合美國藥典(United States Pharmacopeia)(USP)。這些試劑必須被加入到含有在多種劑量容器中的制劑中。在使用時，當內(nèi)容物的一部分如被皮下注射器針頭帶走，還必須具有充足的濃度以防止無意間導入制劑的微生物的繁殖。
可以加入氯化鈉或其他鹽來調(diào)整組合物的張力(tonicity)，特別對于腸胃外的配方，應當是等滲的或基本上等滲的，否則在施用處會產(chǎn)生嚴重的刺激和疼痛。
可以預期，本發(fā)明還提供在此公開的聯(lián)素組合物在制備藥物組合物中的用途。
在還有一個方面，本發(fā)明在于糖基化脂聯(lián)素多肽在制備劑量單位或藥物組合物或藥劑中的用途，劑量單位或藥物組合物或藥劑可在哺乳動物患者中用于治療與脂聯(lián)素調(diào)控相關的疾病狀態(tài)，或用于增強胰島素的作用，或用于抑制糖原異生。在一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽是重組的、分離的、純化的或合成的。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。在另一個實施方案中，至少一個對應于賴氨酸殘基68、71、80和104(小鼠)或殘基65、68、77和101(人)的賴氨酸殘基被糖基化。在另一個實施方案中，劑量單位或藥物組合物或藥劑還含有胰島素。優(yōu)選胰島素的存在量足以產(chǎn)生在約50pM到400pM之間的血液胰島素濃度。優(yōu)選胰島素的濃度或含量足以有效地產(chǎn)生在約100pM到約300pM之間的血液胰島素濃度。更優(yōu)選胰島素存在量為足以有效地產(chǎn)生約200pM的血液胰島素濃度。
本發(fā)明的腸胃外配方的適宜的給藥路徑包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、真皮的、關節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)等。皮下給藥路徑是優(yōu)選的。也可以粘膜遞送。
可以預期，本發(fā)明可以以組合物和/或配方被隨同給藥或連續(xù)施用和/或與胰島素混合。這依賴于具體情況和患者。適宜的治療方案可由醫(yī)生或開業(yè)醫(yī)生為每一位患者具體制定。多種胰島素可以從許多公司獲得，包括Eli Lilly & Company和Novo Nordisk?？梢垣@得的胰島素的種類為速效的、中等的和長效的胰島素。在這些分類中還有各種類型胰島素。本文定義的胰島素與脂聯(lián)素多肽之間的比例依賴于特定患者的個體需要。適宜的治療方案可由醫(yī)生或開業(yè)醫(yī)生為每一位患者最佳地制定。
用于本發(fā)明的組合物通過按照常規(guī)接受的程序混合各成分來制備。例如，在攪拌機或其他標準裝置中混合選定的組分來制備濃縮的混合物，然后通過加入水或增稠劑來調(diào)節(jié)到最終濃度和粘度，并可能加入緩沖劑來控制pH或其他溶質(zhì)來控制張力。
C.篩選本發(fā)明的組合物還可以用于篩選與脂聯(lián)素調(diào)控相關、一般來說與代謝相關的化合物。在一個實施方案中，將表達脂聯(lián)素的哺乳動物細胞如培養(yǎng)的細胞與試驗化合物接觸，然后監(jiān)測脂聯(lián)素同工型的水平或表達模式的變化。在一個實施方案中，脂聯(lián)素自然地被表達。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素被重組表達。在另一個實施方案中，通過在與試驗化合物接觸前量化脂聯(lián)素同工型含量并將該含量與細胞與試驗化合物接觸后測定的含量比較來檢測脂聯(lián)素同工型水平的變化。在蛋白質(zhì)化學領域蛋白質(zhì)量化是公知的，可以通過如蛋白質(zhì)印跡來實現(xiàn)。在另一個實施方案中，脂聯(lián)素同工型可以采用檢測蛋白質(zhì)斑點和條帶的相對水平的光密度計來量化。這種設備的例子為Molecular Dynamics的激光光密度計或Bio-Rad的GS-700。在另一個實施方案中，通過雙向電泳來檢測表達模式的變化。
試驗化合物是各種常規(guī)種類，包括但不限于，多肽；糖如寡糖和多糖；多核苷酸；脂類或磷脂；脂肪酸；類固醇；或氨基酸類似物。試驗化合物還可以是各種化學類型，包括但不限于，雜環(huán)化合物，碳環(huán)化合物，-內(nèi)酰胺，聚氨基甲酸酯(polycarbamate)，寡聚-N-取代甘氨酸、苯并二氮雜，噻唑烷二酮(thiazolidinone)和咪二唑二啉二酮(imidizolidinone)。一些試驗試劑是小分子，包括合成的有機化合物。試驗試劑可以從文庫中獲得，如天然產(chǎn)物文庫或組合文庫。許多不同類型的組合文庫和用于制備這種文庫的方法已經(jīng)被描述，包括如PCT公開WO93/06121、WO95/12608、WO95/35503、WO94/08051和WO95/30642。
在一個實施方案中，一種生物功能是脂聯(lián)素致敏肝細胞對胰島素作用的能力，其中如實施例中所描述，胰島素對肝細胞的作用通過脂聯(lián)素多肽來增強。由脂聯(lián)素多肽引起的胰島素對肝細胞作用的增強可以通過本領域技術人員公知的胰島素活性檢測來確定。一旦這種公知的檢測確定胰島素對細胞或細胞群的葡萄糖生成或糖原異生的作用。這種檢測可被用于確定一種試劑對于加劇、增強或相反地減弱胰島素的作用的能力?；衔锉恢鸩椒治鰜泶_定哪種化合物抑制或增強脂聯(lián)素的活性。
提供下列實施例僅用于說明而不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例實施例1試驗方案材料-地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、α-氰-4-羥基肉桂酸(αCHC)、膠原酶、鼠尾膠原I型、氨基酸標準物、FLAG肽、抗-FLAG M2親和凝膠和葡萄糖Trinder檢測試劑盒購自Sigma。人胰島素(Actrapid)得自Novo Nordisk?？偟募毎鸕NA提取試劑(TRIZOL)、TEV蛋白酶、哺乳動物表達載體PCDNA3.1(+)和原核表達載體pPROEX HTb得自Invitrogen。QuikChange定點誘變試劑盒得自Stratagene。BCA蛋白檢測試劑得自Pierce。用于糖蛋白探測的免疫印跡試劑盒來自Bio-Rad實驗室。FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑、胰蛋白酶和ASP-N內(nèi)切蛋白酶、和增強的化學發(fā)光(ECL)檢測系統(tǒng)來自RocheMolecular Biochemicals。Ni-NTA瓊脂糖柱得自QIAGEN。雙向凝膠電泳的所有消耗品、3H-1-半乳糖和3H-1-葡萄糖是Amersham Pharmacia的產(chǎn)品。所有氨基酸分析試劑和質(zhì)譜分析的Cal Mix2校準標準物來自Applied Biosystems。
3T3-L1細胞的分化和來自細胞培養(yǎng)物的蛋白的濃度——3T3-L1細胞以分會合培養(yǎng)維持在添加了10％胎牛血清的DMEM中。為了分化，細胞被植入150mm的平板，以達到100％會合，會合后1天用含有0.25μM地塞米松、0.5mM IBMX和10μg/ml胰島素的上述培養(yǎng)物誘導2天。接著用10μg/ml胰島素培養(yǎng)2天。然后細胞在含有10％胎牛血清的DMEM中再維持4天。
為了獲得從脂肪細胞中分泌的蛋白質(zhì)，細胞在分化后第8天用PBS洗滌3次，然后用無血清的培養(yǎng)物再培養(yǎng)4hr。收集培養(yǎng)物，以3,000×g離心10min，通過0.20μm的濾器過濾，然后用有5000Da的MWCO的濃縮器(Vivascience Ltd，Gloucestershire，UK)濃縮和脫鹽。然后用BCA試劑量化蛋白質(zhì)，并在-80℃下儲存直到使用。
雙向凝膠電泳(2-DE)，免疫印跡和糖檢測——由脂肪細胞或3T3L1前脂肪細胞(preadipocytes)分泌的蛋白質(zhì)通過先前描述的2-DE[24]分離。分離的蛋白質(zhì)用銀或考馬斯亮蘭R250(CBB)染色。進行免疫印跡時，通過2-DE分離的蛋白質(zhì)用Multiphor IINovablot電泳轉(zhuǎn)移單位(Pharmacia)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。該膜被阻斷，然后用兔抗-脂聯(lián)素多克隆抗體(1∶1000)在4℃下溫育過夜。在用辣根過氧化物酶共軛的第二抗體在室溫下再溫育一個小時后，用ECL檢測試劑盒檢測結合的抗體。糖蛋白用市購免疫印跡試劑盒按照生產(chǎn)商的指導檢測。
凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化和反向高效液相層析(RP-HPLC)——通過SDS-PAGE或2-DE凝膠分離的目標蛋白質(zhì)被切割，和凝膠碎片按照先前描述[25]進行凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化。提取的胰蛋白酶肽混合物通過RP HLPC在Jupiter 5μ C18柱上(250×2.00mm，Phenomenex)進行分餾。預熱的柱(37℃)用0.1％三氟乙酸(v/v)洗滌7min，接著用50min從8％到36％乙腈的線性梯度以200μ/min的流速洗脫。手工收集每種餾分，進一步進行如下所述的分析。3H-標記的糖肽通過液體閃爍計數(shù)來檢測。
氨基酸測序和氨基酸分析——通過2-DE分離的蛋白質(zhì)斑點被轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用CBB染色，切割，采用Edman降解方法用Perkin-Elmer(Procise，型號492)蛋白質(zhì)測序儀進行氨基酸測序。在RP-HPLC分餾后，通過對胰蛋白酶肽測序來獲得內(nèi)部氨基酸序列。
對于氨基酸分析，5μg胰蛋白酶肽被真空干燥并用6N HCl、1％苯酚在110℃下氣相中水解24hr。這種處理破壞糖殘基但是仍然允許檢測和量化羥基賴氨酸和羥基脯氨酸[26]。將游離氨基酸殘基溶解在40μl的0.025％K3EDTA中，用異硫氰酸苯酯(PITC)衍生，在Spheri-5PTC 5μ柱(220×2.1mm)上分離，和通過421氨基酸分析儀(AppliedBiosystems)分析。
基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laserdesorption ionization time of flight mass spectrometry)(MALDI-TOFMS)分析——0.5μl胰蛋白酶肽混合物或RP-HPLC分離的肽與等量的αCHC基質(zhì)(10mg/ml溶在60％乙腈/0.3％TFA中)混合，在樣本平板上打點并風干。在Voyager DE PRO Biospectrometry Workstation(Applied Biosystem)上用脈沖激光束(氮激光，？＝337nm)進行反射(Refelectron)質(zhì)譜分析。在加速電壓為20.0kV的正電模式(positivemode)中記錄所有的離子光譜。分光計用Cal Mix 2標準物混合物外校準。
小鼠脂聯(lián)素的克隆——用TRIZOL試劑按照生產(chǎn)商的指示從3T3-L1脂肪細胞中純化總的RNA。來自總RNA的寡-dT-引物cDNA作為基于小鼠脂聯(lián)素核苷酸序列(編號U37222)的PCR克隆的模板。然后脂聯(lián)素的全長cDNA被插入到pGEMT-easy載體上，并通過DNA測序驗證其序列。蛋白質(zhì)序列從甲硫氨酸殘基開始計數(shù)。
脂聯(lián)素及其變體的重組表達和純化——為了制備小鼠脂聯(lián)素的原核表達質(zhì)粒，用5’ATCGGGATCCGAAGATGACGTTACTACAACT3’作為正向引物(sense primer)和5’TACGAATTCTCAGTTGGTATCATGGTAGAG3’作為反向引物(antisense primer)來擴增DNA序列。擴增的DNA產(chǎn)物的BamH I/Sal I片段被亞克隆到pPROEX HTb質(zhì)粒上，得到編碼其N末端具有6×His標記的全長脂聯(lián)素的表達載體pPRO-His-Ad。除了正向引物為5’ATCGGGATCCGCCGCTTATATGTATCGCTC3’，類似的策略用于構建原核表達載體pPRO-His-gAd，其表達6×His標記的脂聯(lián)素的球形區(qū)(在110和247之間的氨基酸殘基)。His標記的全長脂聯(lián)素或其球形區(qū)在BL21細胞中表達，通過往生長培養(yǎng)物中加入1mM異丙基β-硫代吡喃型半乳糖苷來誘導。采用Ni-NTA瓊脂糖柱按照生產(chǎn)商的說明從細菌溶解產(chǎn)物中純化全長脂聯(lián)素或其球形區(qū)。純化后，用重組TEV蛋白酶裂解除去N末端標記。通過SDS-PAGE和HPLC進行蛋白質(zhì)的純化。
采用5’GCCCGCGGATCCATGCTACTGTTGCAAGCTCT3’作為正向引物和5’GGCCGCGAATTCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTTGGTATCATGGTAGAG3’作為反向引物擴增cDNA來生成用于哺乳動物的脂聯(lián)素的表達的載體。在BamH I/EcoR I消化之后，該片段被插入到pcDNA3.1載體中來生成pcDNA-Ad-F，其編碼在其C末端標記FLAG表位的全長脂聯(lián)素。然后采用QuikChange定點誘變試劑盒，該表達載體被用作模板來構建編碼脂聯(lián)素變體的載體，變體中的四個賴氨酸(68，71，80和104)被精氨酸取代。按照生產(chǎn)商推薦的標準設計誘變的寡核苷酸引物，密碼子由AAG變?yōu)镃GG(對于68和80)或由AAA變?yōu)镃GA(對于71和104)。編碼FLAG標記的全部四個賴氨酸被精氨酸取代的脂聯(lián)素變體的質(zhì)粒(稱作為pcDNA-Ad(K→R)-F)，通過各個位點順序突變來獲得，所有突變通過DNA測序確定。
用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑將這些哺乳動物的表達載體轉(zhuǎn)染給COS-7細胞或HEK-293細胞，細胞往無血清培養(yǎng)物中分泌脂聯(lián)素48hr。然后收集培養(yǎng)物，通過在3,000×g離心10min，接著用0.2μm的濾器過濾來去除細胞碎片。加入40％硫酸銨并在4℃下攪拌過夜來沉淀蛋白質(zhì)。再以8,000×g離心1hr后，將沉淀再懸浮在TBS中，采用MWCO為7000Da的SnakeSkin管對相同的緩沖劑透析。用抗-FLAG M2親和凝膠純化FLAG標記的脂聯(lián)素，用150μg/ml的FLAG肽洗脫抗體制備——從大腸桿菌中制備的His標記的重組脂聯(lián)素與Freund完全佐劑混合，然后腹膜內(nèi)注射給雌性Wistar大鼠(50μg/鼠)或者皮下注射給雌性新西蘭兔(100μg/鼠)。用等量的與Freund不完全佐劑混合的蛋白強化動物兩次，并在最后一次強化的1周后收集血液。
分離初級大鼠肝細胞和測定肝臟葡萄糖生成——如先前描述[27]，采用兩步膠原酶灌流方法從雄性Wistar大鼠(200g)中制備初級肝細胞。分離后，細胞在具有10％胎牛血清、10mM HEPES(pH7.4)、2mML-谷氨酰胺、100nM地塞米松和1mM胰島素的DMEM中洗滌3次。在每次洗滌之間在200g離心細胞2min。通過臺盼藍(trypan blue)排除(exclusion)評估，經(jīng)過這些操作后細胞生存力一般超過80％。細胞以0.5百萬細胞/孔被加載到上述培養(yǎng)物中的抗原I型覆蓋的12孔平板上。使細胞附著細胞培養(yǎng)皿24hr，然后在具有5.5mM葡萄糖和無胰島素或地塞米松的DMEM中溫育過夜。接著，再用不同濃度胰島素或/和脂聯(lián)素刺激24hr。然后培養(yǎng)物用0.5ml無葡萄糖和酚紅、添加了5mM的丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙酮酸和乳酸中的每一種的DMEM替換。溫育6hr后，用葡萄糖Trinder檢測試劑盒測定培養(yǎng)物中的葡萄糖水平。
動物和食物——按照人道對待試驗動物的公共規(guī)定，重25-30g的雄性FVB/N小鼠飼養(yǎng)在金屬絲底網(wǎng)的不銹鋼鼠籠中，處于12小時光照/黑暗循環(huán)中。給小鼠飼喂改進的高脂肪/低碳水化合物的液體食物21，含有44％脂肪、16％蛋白質(zhì)、5.5％碳水化合物，加上34.5％乙醇或等熱量的麥芽糖糊精作為對照。在第一周飼喂期間，乙醇濃度從17％到34％逐步增加，然后在另外5周保持在相同濃度。
測定血漿脂聯(lián)素、TNF-α和ALT水平——采用兔多克隆抗體抗脂聯(lián)素19，用內(nèi)部RIA(in-house RNA)測定血清脂聯(lián)素水平。用市售的ELISA試劑盒(Chemico)量化循環(huán)TNF-α。用購自Sigma的劑測定血清ALT活性。
RNA提取和RNA印跡——用Trizol試劑(Invitrogen)從肝臟組織中提取總RNA。20μg來自各個樣本的總RNA用變性瓊脂糖凝膠分離，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，分別用編碼小鼠TNF-α、FAS或CD36的33P標記的cDNA片段探查。這些cDNA片段用特異性引物通過PCR擴增來源于小鼠肝臟組織的cDNA來獲得。各個基因的相對mRNA豐度用磷光成像儀量化。
組織分析——肝臟樣本在緩沖的甲醛(10％)中固定過夜并包埋在石蠟中。蘇木精-cosin染色的切片根據(jù)脂肪變化、炎癥和壞死的程度隨機分級。檢查每個肝臟的10個功能低下的區(qū)域。脂類浸潤程度分為0-4級，0級表示無脂肪存在，4表示≥75％的細胞含有脂肪。
統(tǒng)計分析——通常以每組5-6只小鼠進行試驗，數(shù)值表示為平均數(shù)±SE。以所示的代表性的數(shù)據(jù)重復所有的試驗。通過單向(one-way)ANOVA確定統(tǒng)計學顯著性。在所有統(tǒng)計比較中，P值＜0.05表示顯著差異。
實施例2脂肪細胞分泌的脂聯(lián)素以多種同工型存在2-DE分析確定8個蛋白質(zhì)斑點，它們優(yōu)先地由脂肪細胞表達和分泌，而不是來自未分化的3T3-L1前脂肪細胞(圖1，A和B)。為了鑒定這些蛋白質(zhì)的性質(zhì)，500μg從脂肪細胞收集的分泌性蛋白通過制備型2-DE分離，涂點到PVDF膜上，用考馬斯亮蘭染色。N末端氨基酸測序表明所有這些蛋白質(zhì)(斑點1-8)具有相同的N末端序列(EDDVTTTE)，該序列顯然與脂肪細胞專一地表達的分泌性蛋白質(zhì)，即小鼠脂聯(lián)素的18到25之間的氨基酸殘基匹配[5，7]。該序列片段(EDDVTTTE)緊連在假定的信號肽裂解位點之后，表明脂聯(lián)素的異源同工型不是在其分泌過程中由不同蛋白酶裂解產(chǎn)生的。將這些蛋白質(zhì)鑒定為脂聯(lián)素進一步通過蛋白質(zhì)印跡分析來證實，這表明所有8種蛋白質(zhì)與抗小鼠脂聯(lián)素的抗體發(fā)生免疫反應(圖1，組C)。2-DE分離大腸桿菌生產(chǎn)的重組脂聯(lián)素，僅檢測到一個斑點(數(shù)據(jù)未顯示)，表明存在多種由脂肪細胞生成的脂聯(lián)素同工型是由于在分泌過程中發(fā)生的翻譯后修飾。2-DE分析由COS-7和HEK-293細胞瞬時表達和分泌的重組脂聯(lián)素，也觀察到這種蛋白質(zhì)的多種同工型，與來自脂肪細胞那些的模式相似(數(shù)據(jù)未顯示)。
由2-DE分離的蛋白質(zhì)的糖檢測表明6種來源于脂肪細胞的脂聯(lián)素同工型(斑點3-8)被糖基化(圖2)，而由大腸桿菌生產(chǎn)的脂聯(lián)素沒有檢測到糖類(數(shù)據(jù)未顯示)，表明糖基化至少部分地賦予了脂聯(lián)素的異質(zhì)性。雖然存在兩個共有的N連接糖基化位點(Asn53和233)，用N-連糖基化的抑制劑衣霉素[28]處理不影響糖基化的模式(數(shù)據(jù)未顯示)，從而排除了脂聯(lián)素上N-連糖基化的可能性。先前采用內(nèi)H處理的研究也表明在脂聯(lián)素上沒有發(fā)生N-糖基化[5]。采用NetOGlyc 2.0預測服務器(2.0 prediction server)[29]，其產(chǎn)生哺乳動物蛋白質(zhì)中的粘蛋白O-糖基化位點的中性網(wǎng)絡預測，不存在預期被O-糖基化的潛在絲氨酸和蘇氨酸殘基。
實施例3脂聯(lián)素糖基化發(fā)生在膠原域的多個保守賴氨酸殘基上為了進一步表征糖基化的性質(zhì)和繪制脂聯(lián)素的糖基化位點，來源于脂肪細胞或瞬時轉(zhuǎn)染的COS-7細胞或來自大腸桿菌的各種脂聯(lián)素同工型的胰蛋白酶肽混合物通過MALDI-TOF MS分析。這些樣本的質(zhì)譜光譜比較檢測到三種主要的肽片段(分別具有1679Da、4260Da和4276Da分子量)，其僅存在于六種糖基化的同工型中，而不存在于兩種未糖基化的同工型或大腸桿菌生產(chǎn)的脂聯(lián)素中(圖3)。而且，這三種胰蛋白酶肽片段的分子量不能與任何脂聯(lián)素的未被修飾的胰蛋白酶片段匹配，表明在這三種片段中可能發(fā)生脂聯(lián)素的糖基化。
為了分離這三種肽片段，收集來自所有糖基化的同工型的胰蛋白酶肽混合物，用RP-HPLC分離，每一個餾分用MALDI-TOF MS分析(圖4)。這種分析表明用16.4％乙腈洗脫的餾分A含有分子量為1679Da的肽。在餾分B和餾分C中檢測到分子量為4276Da和4260Da的肽，餾分B和餾分C分別用18％和18.4％乙腈洗脫。氨基酸序列分析鑒定分子量為1679Da的肽為KGEPGEAAYVYR，該片段對應于小鼠脂聯(lián)素的104和115之間的氨基酸殘基。具有分子量為4260Da和4276Da的肽來源于相同的片段(DGTPGEKGEKGDAGLLGPKGETGDVGMTGAEGPR)，該片段與脂聯(lián)素的62和95之間的氨基酸殘基匹配。特別地，氨基酸序列分析容易檢測這三種肽片段中的所有氨基酸殘基，除了四個賴氨酸殘基(分子量為1679Da的肽中的賴氨酸104和分子量分別為4260和4276的肽中的賴氨酸68、71和80)。這些結果表明這些賴氨酸殘基可能被親水基團如糖類修飾，親水氨基酸衍生物不能通過常規(guī)液相測序在非極性溶劑有效地被提取。這四個賴氨酸殘基抵抗被特異性地在精氨酸或賴氨酸的C末端裂解的蛋白酶，即胰蛋白酶消化，該觀察結果進一步支持這四種賴氨酸殘基被修飾的結論。有意思的是，所有這四個賴氨酸(Lys68，71，80和104)位于脂聯(lián)素的膠原域內(nèi)，具有GXKGE(D)的周邊序列。序列排列表明這四個賴氨酸及其周邊序列在所有脂聯(lián)素種類中都非常保守(圖5)。
為了證實這四個賴氨酸被修飾，如上純化的三種肽在用6N HCl在110℃下水解24hr后，進一步進行氨基酸分析。這些結果表明雖然所有其他氨基酸殘基以預期的摩爾比被檢測到，但是在預期的位置上不存在賴氨酸殘基，(圖6)。進一步分析這些光譜，表明這三種肽上的所有賴氨酸殘基都被羥基化。在肽B中也檢測到羥基化的脯氨酸殘基。該羥基脯氨酸接著被指定為Pro94(見如下描述)。
由于羥基化和接著糖基化羥基賴氨酸來形成α-1，2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸(GG-Hyl)已經(jīng)在多種具有膠原樣域的分泌性蛋白中被描述[30，31]，因此，申請推測相同類型的修飾可能發(fā)生在上述分離的三種胰蛋白酶肽中的四個賴氨酸(Lys68，71，80和104)上。通過分析這三種肽的MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)，支持了這種推測(圖4)。對于肽A，試驗觀察到的分子量(1679)及其理論分子量(1339)之間的差別為340Da，這正好與葡糖基半乳糖基羥基(GG-Hyl)的分子量相同。肽C的試驗觀察到的分子量與其預期分子量相差1020Da，這是可能結合到肽C中的三個賴氨酸殘基(68，71和80)上的三個GG-Hyl基團的預期分子量。肽B(4276Da)的試驗觀察到的分子量與其預期分子量相差1036Da，是三個GG-Hyl基團加上圖6中檢測的羥基基團的預期大小。
用特異地裂解天冬酰胺的N末端的內(nèi)切蛋白酶Asp-N消化肽B和C，進一步證實肽B和肽C中的每個賴氨酸具有340Da的附著糖苷基的假設。MALDI-TOF分析表明含有Lys80的片段的試驗觀察到的分子量比其理論分子量大340Da，而含有Lys68和71的片段的實際分子量與其理論分子量相差680Da(圖7)。這些結果也表明在肽B中，額外的羥基化發(fā)生在脯氨酸94上。還通過氨基酸分析和氨基酸測序證實脯氨酸94的羥基化。
為了進一步證實附著到四個賴氨酸殘基的糖苷是葡糖基半乳糖基基團，用3H-半乳糖或3H-葡萄糖放射性標記COS-7細胞瞬時表達的FLAG-標記的脂聯(lián)素。從這些細胞培養(yǎng)物中純化的放射性標記脂聯(lián)素的胰蛋白酶混合物通過RP-HPLC分餾來分離圖4中的肽A、B和C。液體閃爍計數(shù)表明3H-半乳糖或3H-葡萄糖都結合到這三種肽上(圖8)。
實施例5脂聯(lián)素膠原域的四個賴氨酸(68、71、80和104)的取代降低其胰島素致敏活性為了探討四個羥基化賴氨酸的糖基化是否影響脂聯(lián)素的生物活性，制備編碼脂聯(lián)素變體的構建物(pcDNA-Ad(K→R)-F)，其中該變體中的四個賴氨酸被精氨酸取代。用35S甲硫氨酸脈沖追蹤標記被轉(zhuǎn)染的細胞，表明脂聯(lián)素變體(K→R)以與野生型脂聯(lián)素相似的速度被分泌到細胞培養(yǎng)物中(數(shù)據(jù)未顯示)，說明對膠原域的四個賴氨酸的修飾對于其分泌不是必須。SDS-PAGE分析表明從COS-7細胞分泌的野生型脂聯(lián)素以三個稍微不同的分子量的條帶移動(圖9)。上面兩個條帶占總脂聯(lián)素的～85％，它們被糖基化。相反，脂聯(lián)素變體(K→R)主要構成單個未被糖基化的條帶，它比野生型脂聯(lián)素的兩個主要糖基化條帶移動得稍微快些。這些結果進一步證實脂聯(lián)素的糖基化主要地發(fā)生在膠原域的四個賴氨酸殘基上。
最近的研究已經(jīng)證明脂聯(lián)素能夠在初級大鼠肝細胞中增強胰島素抑制葡萄糖生成的作用[9]。與該報道一致，本發(fā)明的結果表明濃度為50pM的胰島素不能顯著地影響初級大鼠肝細胞中葡萄糖的生成(圖10)。在200pM的濃度下觀察到半數(shù)最大抑制。由哺乳動物細胞生成的脂聯(lián)素顯著地增強亞生理濃度的胰島素抑制肝葡萄糖生成的能力。存在20μg/ml脂聯(lián)素時，50pM胰島素使葡萄糖生成顯著地降低～40％。濃度依賴研究表明脂聯(lián)素的EC50為～4μg/ml，該濃度在脂聯(lián)素的生理范圍內(nèi)[15，16]。與野生型脂聯(lián)素比較，脂聯(lián)素變體(K→R)對肝糖原異生的胰島素致敏能力顯著地減弱。存在4μg/ml脂聯(lián)素變體時，50pM胰島素對葡萄糖生成不具有顯著作用，存在20μg/ml這種蛋白時，僅導致下降～13％。細菌產(chǎn)生的全長脂聯(lián)素(圖10)和球形區(qū)對提高胰島素抑制糖原異生的肝臟作用不具有生物效果。
實施例6脂聯(lián)素的體內(nèi)生物學功效采用酒精誘導的肝臟損傷的小鼠模型來評價如本文所述分離的脂聯(lián)素被施用給哺乳動物時的效果。
長期攝食乙醇導致小鼠中循環(huán)脂聯(lián)素的顯著下降。
飼喂改進的高脂肪液體-對照(HF/LC)食物和高脂肪液體乙醇(HF/LE)食物的小鼠32，在6周的處理時期內(nèi)體重增加。雖然HF/LC小鼠的體重增加(7.2±0.6g)稍微大些，其與食用HF/LE食物的小鼠的體重增加(6.8±0.5g)沒有顯著差異。飼喂LE食物的小鼠消耗約17-19g/kg體重/天的乙醇。尸檢時，攝食乙醇的小鼠的肝與體重比(8.3±0.6％)顯著高于飼喂對照食物的小鼠(6.2±0.4％)(p＜0.05)。
長期攝食乙醇導致脂聯(lián)素的循環(huán)濃度顯著下降。血漿脂聯(lián)素在飼喂HF/LE食物后，三周后下降32.1±2.9％，四周后下降40.3±4.6％(圖11A)。脂聯(lián)素下降與肝臟損傷進展密切相關，這通過血漿水平的丙氨酸轉(zhuǎn)氨霉(ALT)活性來判斷(圖11B)。本發(fā)明人觀察到，在長期攝食HF/LE食物后，脂聯(lián)素循環(huán)濃度與TNF-α水平之間成反比(圖11C)。特別地，已經(jīng)證明用TNF-α培養(yǎng)脂肪細胞引起3T3L1脂肪細胞中脂聯(lián)素表達的顯著下降33。因此，酒精性肝臟損傷早期的TNF-α生成至少部分地引起酒精性肝臟損傷的發(fā)病過程中的脂聯(lián)素生成下降。
為了探討脂聯(lián)素對酒精誘導的肝臟損傷的作用，如在別處所描述34，從用編碼FLAG表位標記的小鼠脂聯(lián)素的載體瞬時轉(zhuǎn)染的HEK293細胞表達和純化全長的重組脂聯(lián)素。在飼喂HF/LE食物后三周，給小鼠手術植入滲透泵(Alzet，Newark，DE)，該泵遞送30μg/天的重組脂聯(lián)素或生理鹽水(對照)。以該劑量遞送脂聯(lián)素使脂聯(lián)素的循環(huán)濃度比未處理的LE小鼠增加2.7±0.3倍。脂聯(lián)素處理不會顯著影響食物攝取、脂肪組織量或體重增加。但是，持續(xù)施用脂聯(lián)素兩周會顯著地降低肝臟與體重的比(圖12A)。它還顯著地降低乙醇誘導的血清ALT活性的升高(圖12B)。
肝臟樣本的組織評價證實了在僅飼喂HF/LE的小鼠中存在大規(guī)模的全腺泡(panlobular)微泡和大泡脂肪變性和炎癥臨時病灶(occasionalfoci)(圖13)。施用脂聯(lián)素顯著地將脂類累積降低到自然背景值，極大地消除炎癥(通過在顯微鏡觀察炎癥病灶的消失來判斷)。因此，本發(fā)明結果證明了脂聯(lián)素在小鼠的酒精誘導的肝臟損傷中的保護作用。
施用脂聯(lián)素抑制肝臟中TNFα的生成和脂肪酸合酶以及脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白CD36的表達。
本發(fā)明人認為(不受假設的約束)肝臟組織中Kupffer細胞的TNFα生成的增加是早期酒精誘導的肝臟損傷的關鍵介質(zhì)35。本發(fā)明人假設所試驗的是脂聯(lián)素可能部分地通過抑制酒精誘導的TNF-α生成的增加來減輕酒精誘導的肝臟損傷。在驗證該假設中，用重組脂聯(lián)素處理HF/LE小鼠阻斷了肝臟中酒精誘導的循環(huán)TNF-α的升高以及這種細胞因子的mRNA的生成(圖14)。
不受理論的約束，本發(fā)明人認為除了抑制TNF-α生成，脂聯(lián)素可直接對抗肝臟組織中TNF-α的破壞作用。脂聯(lián)素和TNF-α產(chǎn)生許多相反效果。TNF-α是胰島素耐受的誘因而脂聯(lián)素提高胰島素靈敏性36。脂聯(lián)素具有抗動脈粥樣化的活性37，38，而TNF-α導致抗動脈粥樣硬化形成(atherosclerosis)的起始39。最近，在肌肉細胞中證實這兩種激素之間的拮抗作用，它們在葡萄糖和脂類代謝調(diào)控中相互抑制彼此的作用40。在肝組織中，TNF-α已經(jīng)被證實降低胰島素靈敏性和提高糖原異生，而脂聯(lián)素具有完全相反的功能9。
酒精通過抑制線粒體脂肪酸β-氧化或者通過增強肝臟脂肪生成路徑，誘導肝臟的脂類浸潤。乙醇氧化提高NADH/NAD+比，其隨即抑制線粒體β-氧化中需要NAD+的步驟41。此外，在人和嚙齒類中，長期攝食乙醇會通過誘導脂肪生成路徑中關鍵酶的表達，增加脂肪酸合成42，43。接著，本發(fā)明人通過干擾任何這些過程，探討脂聯(lián)素是否抑制肝臟脂類累積。與先前報道41一致，長期攝食HF/LE食物引起肝的NADH/NAD+比的顯著提高，還顯著地提高脂肪酸合酶(FAS)mRNA的豐度(圖14)。脂聯(lián)素處理對NADH/NAD+比升高不起作用，但是顯著地降低FAS mRNA的表達(圖14)。而且，用脂聯(lián)素處理后，脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白CD36的表達被顯著地抑制。
應當指出，脂聯(lián)素的其他代謝作用也對抑制酒精誘導的肝臟脂肪累積起作用。例如，已經(jīng)證明體內(nèi)施用平截的COOH封端的脂聯(lián)素球形區(qū)片段能夠增強清除循環(huán)的游離脂肪酸和甘油三酯4，這接著減少匯流進入肝臟的脂肪酸來源。雖然不作用于酒精損傷后的NADH/NAD+比的升高，但是脂聯(lián)素可能通過其他機制直接增加肝臟線粒體β-氧化。事實上，較近的研究已經(jīng)證明了全長的脂聯(lián)素能夠激活大鼠脂肪細胞中的5’-AMP-活化激酶，其接著將磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(ACC)并減弱這種酶的活性30。肝臟細胞中ACC失活將導致其產(chǎn)物丙二酸單酰輔酶A的濃度降低，從而在該組織中誘導脂肪酸β-氧化31。這些結果共同地說明脂聯(lián)素通過調(diào)控多種協(xié)同代謝路徑，消除酒精誘導的脂肪肝(圖15)。
脂聯(lián)素消耗大量肝脂肪累積的顯著作用與脂聯(lián)素缺乏與胰島素耐受的患者中的肝脂類累積密切相關是一致的44。特別地，在四氯化碳處理的小鼠的肝臟中，發(fā)現(xiàn)大量脂聯(lián)素累積并結合到與肝細胞鄰近的細胞外基質(zhì)上45，表明這種激素還作為參與CCl4-誘導的肝臟損傷的修復過程的抗炎因子。
因此，除了其抗糖尿病和抗動脈粥樣化形成功能外1，脂聯(lián)素或其激動劑是用于治療肝臟疾病的新試劑。
實施例7討論雖然一些最新報道都獨立地證明了脂聯(lián)素抗糖尿病的作用，但是對于哪種形式的脂聯(lián)素有功能活性仍存在爭議。Lodish小組和Kadowaki小組的研究發(fā)現(xiàn)對應于脂聯(lián)素球形域的平截片段對于降低高血糖癥和恢復胰島素耐受是有效的，而細菌生產(chǎn)的全長脂聯(lián)素不具有活性[10，11]。雖然這些發(fā)現(xiàn)的確具有藥學意義，但是生理相關性仍不清楚。血漿脂聯(lián)素主要部分以具有表觀分子量為30kDa的全長蛋白形式存在[5，6]。采用免疫沉淀法和蛋白質(zhì)印跡分析由2-DE分離的蛋白，不能在人和小鼠血清中檢測到任何脂聯(lián)素的蛋白水解片段(數(shù)據(jù)未顯示)。而且，氨基末端序列分析表明由脂肪細胞分泌的所有主要脂聯(lián)素同工型具有相同的N末端(圖1)，說明該蛋白不是在其分泌過程中被細胞內(nèi)裂解。雖然Lodish及其同事提出了25kDa的模糊條帶，該試驗在免疫沉淀法和蛋白質(zhì)印跡分析中采用相同抗體，這還可視化具有～25kDa的MW的抗體輕鏈。重要的是，在Lodish和Kadowaki小組采用的用于功能分析的脂聯(lián)素都是從細菌中產(chǎn)生的，細菌中通常缺少進行各種分泌性蛋白的生物學功能所需的適當?shù)姆g后修飾。
與這些報道相反，Scherer及其同事證實從哺乳動物細胞中生產(chǎn)從全長脂聯(lián)素實際上降低多種糖尿病動物模型的高血糖癥，而來自大腸桿菌的全長脂聯(lián)素或其球形區(qū)不具有這種活性[9]。該研究還提供表明肝細胞是脂聯(lián)素可能的生理學靶點之一的證據(jù)。與該報道一致，本發(fā)明人證明在增強亞生理濃度胰島素抑制初級大鼠肝細胞中的葡萄糖生成中，由哺乳動物細胞生產(chǎn)的全長脂聯(lián)素比細菌生產(chǎn)的脂聯(lián)素更有效(圖10)。這些觀察結果表明至少對于其作為與肝臟作用相關的胰島素致敏劑的作用，脂聯(lián)素的翻譯后修飾在功能上是重要的。
本發(fā)明的2-DE分析表明，由脂肪細胞分泌的脂聯(lián)素被專一地修飾成具有不同pI和MW的多種同工型，其異源性至少部分地通過糖基化來解釋(圖1和圖2)。未被糖基化的和糖基化的同工型之間的質(zhì)譜光譜比較可以確定膠原域內(nèi)的四個賴氨酸(68、71、80和104)是可能的糖基化位點(圖3)。這四個賴氨酸被糖基化的結論進一步得到如下證據(jù)的支持。第一，這四個賴氨酸不能被測序，并且還抵抗胰蛋白酶的裂解，表明它們可能被修飾。第二，氨基酸分析表明所有這四個賴氨酸被羥基化(圖6)。第三，在用精氨酸取代這四個賴氨酸后(圖9)，或者用羥化酶抑制劑α，α’-雙吡啶處理后(未公開的觀察值)，脂聯(lián)素的糖基化大基本下降。特別地，在所有六種主要的糖基化同工型上檢測到這四個位點上的羥基賴氨酰糖基化，這些同工型占從脂肪細胞分泌的總脂聯(lián)素的85％以上，說明這種糖基化是脂聯(lián)素上發(fā)生的主要的翻譯后修飾之一。有意義的是，所有這四個賴氨酸殘基都位于共同序列GXKGE(D)中，其在迄今鑒定的所有脂聯(lián)素種類中非常保守(圖5)。
賴氨酸羥基化和接著用半乳糖和葡萄糖糖基化來形成葡糖基半乳糖基羥基賴氨酸(GlcGalHyl-Lys)已經(jīng)在許多具有膠原樣域的分泌性蛋白中被觀察到，包括補體成分Clq和肺部表面活性蛋白[30]。當前這種修飾的功能相關性還是未知的。本發(fā)明人已經(jīng)獲得了表明附著到這四個賴氨酸上的糖苷可能是葡糖基半乳糖基基團的證據(jù)。質(zhì)譜分析表明賴氨酸80和104上的糖苷基團的分子量為340Da，為GlcGalHyl殘基的預期大小(圖7)。放射性標記試驗也表明糖苷含有3H-半乳糖和3H-葡萄糖(圖8)。
這四個羥基化賴氨酸上糖基化的生理學重要性通過用脂聯(lián)素變體(K→R)的功能分析來說明，它表明用精氨酸取代這些賴氨酸顯著地減弱亞生理濃度的脂聯(lián)素增強胰島素抑制葡萄糖生成的肝臟作用的能力(圖10)。這些結果還證實了膠原域還與脂聯(lián)素的胰島素致敏功能相關。糖苷附著到膠原域中的這四個賴氨酸殘基上增強脂聯(lián)素的胰島素致敏作用的機制還有待于被闡述。其中僅四個賴氨酸殘基之一被精氨酸取代的脂聯(lián)素變體的胰島素致敏能力比野生型脂聯(lián)素低得多，但是顯著地高于全部四個位點發(fā)生突變的變體(數(shù)據(jù)未顯示)，說明附著到每個賴氨酸上的糖苷可能以協(xié)同的方式起作用。這些糖苷可能直接參與了配體-受體相互作用。另外，這對于其生物學功能所需的正確折疊及穩(wěn)定其三維結構可能是重要的。目前本實驗室正在探討這些可能性。
總之，本研究證明了從哺乳動物細胞生成的全長脂聯(lián)素作為胰島素致敏劑是有功能活性的，四個賴氨酸(68、71、80和104)的羥基化和隨后的糖基化產(chǎn)生這種活性。本發(fā)明人已經(jīng)證明了在長期攝食高脂肪含乙醇的食物后，小鼠中小鼠脂聯(lián)素的循環(huán)濃度顯著地下降。將重組的小鼠脂聯(lián)素遞送給這些小鼠顯著地緩解肝腫大和脂肪變性(脂肪肝)，還顯著地減弱炎癥和提高的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平。發(fā)現(xiàn)小鼠脂聯(lián)素處理降低肝臟的TNF-α生成，以及脂肪酸合酶和脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白CD36的表達。
這些結果還表明膠原域在功能上對于脂聯(lián)素的胰島素致敏作用是重要的。對于由脂肪細胞中分泌的脂聯(lián)素的多種同工型，翻譯后的修飾也是功能相關的。
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權利要求
1.一種脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽被糖基化和其中它是重組的、分離的、純化的或合成的。
2.根據(jù)權利要求1所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。
3.根據(jù)權利要求1或權利要求2所述的脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化或未被羥基化。
4.根據(jù)權利要求3所述的脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化。
5.根據(jù)權利要求4所述的脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化。
6.根據(jù)權利要求5所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
7.根據(jù)權利要求4所述的脂聯(lián)素多肽，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化。
8.根據(jù)權利要求7所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
9.根據(jù)權利要求4所述的脂聯(lián)素多肽，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化。
10.根據(jù)權利要求9所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
11.根據(jù)權利要求4所述的脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基中的全部四個都被糖基化。
12.根據(jù)權利要求11所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
13.根據(jù)權利要求5所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
14.根據(jù)權利要求13所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基68的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
15.根據(jù)權利要求13所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
16.根據(jù)權利要求13所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
17.根據(jù)權利要求14所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
18.根據(jù)權利要求17所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
19.根據(jù)權利要求14所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
20.根據(jù)權利要求15所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
21.根據(jù)權利要求5所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基68的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
22.根據(jù)權利要求21所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
23.根據(jù)權利要求22所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
24.根據(jù)權利要求21所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
25.根據(jù)權利要求5所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
26.根據(jù)權利要求25所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
27.根據(jù)權利要求5所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
28.根據(jù)權利要求3所述的脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基未被羥基化。
29.根據(jù)權利要求28所述的脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化。
30.根據(jù)權利要求29所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
31.根據(jù)權利要求28所述的脂聯(lián)素多肽，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化。
32.根據(jù)權利要求31所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
33.根據(jù)權利要求28所述的脂聯(lián)素多肽，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化。
34.根據(jù)權利要求33所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
35.根據(jù)權利要求28所述的脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基中的全部四個都被糖基化。
36.根據(jù)權利要求35所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
37.根據(jù)權利要求29所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
38.根據(jù)權利要求37所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基68的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
39.根據(jù)權利要求37所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
40.根據(jù)權利要求37所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
41.根據(jù)權利要求38所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
42.根據(jù)權利要求41所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
43.根據(jù)權利要求38所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
44.根據(jù)權利要求39所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
45.根據(jù)權利要求29所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基68的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
46.根據(jù)權利要求45所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
47.根據(jù)權利要求46所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
48.根據(jù)權利要求45所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
49.根據(jù)權利要求29所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
50.根據(jù)權利要求49所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
51.根據(jù)權利要求29所述的脂聯(lián)素多肽，其中該脂聯(lián)素多肽在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸殘基。
52.根據(jù)權利要求2所述的脂聯(lián)素多肽，其中Lys-65、68、77和101都被糖基化。
53.根據(jù)權利要求2所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述脂聯(lián)素多肽在每個賴氨酸殘基65、68、77和101上至少具有一個糖部分。
54.根據(jù)權利要求52所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有單一的糖部分。
55.根據(jù)權利要求52所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有多種糖部分。
56.根據(jù)權利要求2所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述脂聯(lián)素多肽在每個賴氨酸殘基65、68、77和101上至少具有一個葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。
57.根據(jù)權利要求1所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述脂聯(lián)素多肽在至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一上具有結構X1，和其中每個X1單獨選自葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基半乳糖基部分、半乳糖基葡糖基部分的一種或多種。
58.根據(jù)權利要求57所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述脂聯(lián)素多肽在全部賴氨酸殘基65、68、77和101上具有結構X1。
59.根據(jù)權利要求1所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述脂聯(lián)素多肽是同工型3。
60.根據(jù)權利要求1所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述脂聯(lián)素多肽是同工型4。
61.根據(jù)權利要求1所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述脂聯(lián)素多肽是同工型5。
62.根據(jù)權利要求1所述的脂聯(lián)素多肽，其中所述脂聯(lián)素多肽是同工型6。
63.根據(jù)權利要求1所述的脂聯(lián)素多肽，其與藥學上可接受的賦形劑、共活性劑或稀釋劑的一種或多種一起配制以適合于施用給哺乳動物患者。
64.一種脂聯(lián)素多肽，其在對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的位置上具有羥基脯氨?；鶜埢?，并且它是重組的、分離的、純化的或合成的。
65.根據(jù)權利要求64所述的脂聯(lián)素多肽，其與藥學上可接受的賦形劑、共活性劑或稀釋劑的一種或多種一起配制以適合于施用給哺乳動物患者。
66.作為藥物組合物的脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的每個殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸。
67.作為藥物劑量單位的脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的每個殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
68.一種包括脂聯(lián)素多肽的組合物，其中所述脂聯(lián)素多肽被糖基化和其中所述脂聯(lián)素多肽是重組的、分離的、純化的或合成的。
69.根據(jù)權利要求68所述的組合物，其中所述脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。
70.根據(jù)權利要求68或權利要求69所述的組合物，其與或不與其他藥學上可接受的賦形劑、共活性劑、稀釋劑等的一種或多種一起配制以適合于施用給哺乳動物患者。
71.根據(jù)權利要求70所述的組合物，其中對應于人脂聯(lián)素殘基91的脂聯(lián)素多肽的殘基是羥基脯氨酸。
72.根據(jù)權利要求71所述的組合物，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101賴氨酸殘基之一被糖基化。
73.根據(jù)權利要求72所述的組合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
74.根據(jù)權利要求71所述的組合物，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化。
75.根據(jù)權利要求74所述的組合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
76.根據(jù)權利要求71所述的組合物，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化。
77.根據(jù)權利要求76所述的組合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
78.根據(jù)權利要求71所述的組合物，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基中的全部四個都被糖基化。
79.根據(jù)權利要求78所述的組合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
80.根據(jù)權利要求71所述的組合物，其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸。
81.根據(jù)權利要求70所述的組合物，其中對應于人脂聯(lián)素的殘基91的脂聯(lián)素多肽的殘基不是羥基脯氨酸。
82.根據(jù)權利要求81所述的組合物，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化。
83.根據(jù)權利要求82所述的組合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
84.根據(jù)權利要求81所述的組合物，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化。
85.根據(jù)權利要求84所述的組合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
86.根據(jù)權利要求81所述的組合物，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化。
87.根據(jù)權利要求86所述的組合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
88.根據(jù)權利要求81所述的組合物，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基中的全部四個都被糖基化。
89.根據(jù)權利要求88所述的組合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種。
90.根據(jù)權利要求81所述的組合物，其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸。
91.根據(jù)權利要求68所述的組合物，其中Lys-65、68、77和101全被糖基化。
92.根據(jù)權利要求68所述的組合物，其中所述脂聯(lián)素多肽在每個賴氨酸殘基65、68、77和101上至少包括一個糖部分。
93.根據(jù)權利要求91所述的組合物，其中所述糖基化具有單一的糖部分。
94.根據(jù)權利要求91所述的組合物，其中所述糖基化具有多種糖部分。
95.根據(jù)權利要求68所述的組合物，其中所述脂聯(lián)素多肽在每個賴氨酸殘基65、68、77和101上至少具有一個葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。
96.根據(jù)權利要求68所述的組合物，其中所述脂聯(lián)素多肽在至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一上具有結構X1，和其中每個X1單獨選自葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基半乳糖基部分、半乳糖基葡糖基部分的一種或多種。
97.根據(jù)權利要求96所述的組合物，其中所述脂聯(lián)素多肽在全部賴氨酸殘基65、68、77和101上包含結構X1。
98.根據(jù)權利要求68所述的組合物，其中所述脂聯(lián)素多肽具有天然的哺乳動物脂聯(lián)素多肽的序列。
99.一種包含脂聯(lián)素多肽的組合物，其基本上不含至少一個未被糖基化的脂聯(lián)素多肽同工型。
100.根據(jù)權利要求99所述的組合物，其中該組合物基本上不含同工型1。
101.根據(jù)權利要求99所述的組合物，其中該組合物基本上不含同工型2。
102.根據(jù)權利要求99所述的組合物，其中該組合物基本上不含任何未被糖基化的脂聯(lián)素多肽同工型。
103.一種包含脂聯(lián)素多肽的組合物，其中主要的脂聯(lián)素多肽種類完全被糖基化。
104.根據(jù)權利要求103所述的組合物，其中Lys-65、68、77和101全都被糖基化。
105.根據(jù)權利要求103所述的組合物，其中該組合物包含超過一種脂聯(lián)素多肽同工型。
106.根據(jù)權利要求103所述的組合物，其中同工型3是組合物中主要的脂聯(lián)素多肽。
107.根據(jù)權利要求103所述的組合物，其中同工型4是組合物中主要的脂聯(lián)素多肽。
108.根據(jù)權利要求103所述的組合物，其中同工型5是組合物中主要的脂聯(lián)素多肽。
109.根據(jù)權利要求103所述的組合物，其中同工型6是組合物中主要的脂聯(lián)素多肽。
110.根據(jù)權利要求68所述的組合物，其中將該組合物施用給哺乳動物增強胰島素的作用。
111.根據(jù)權利要求68所述的組合物，其中所述組合物有效使亞生理血液胰島素濃度產(chǎn)生正常生理血液胰島素濃度的生物學效果。
112.根據(jù)權利要求110或權利要求111所述的組合物，其還包含胰島素。
113.根據(jù)權利要求112所述的組合物，其中所述胰島素的存在量或濃度足以產(chǎn)生在約50pM到約400pM之間的血液胰島素濃度。
114.根據(jù)權利要求113所述的組合物，其中所述胰島素的存在量或濃度足以產(chǎn)生在約100pM到約300pM之間的血液胰島素濃度。
115.根據(jù)權利要求114所述的組合物，其中所述胰島素的存在量或濃度足以產(chǎn)生約200pM的血液胰島素濃度的存在量或濃度。
116.一種糖基化脂聯(lián)素多肽的組合物，其中當該組合物被施用給個體時抑制糖原異生。
117.根據(jù)權利要求68所述的組合物，其有效產(chǎn)生在1microg/mL和20microg/mL之間的血漿脂聯(lián)素多肽濃度。
118.根據(jù)權利要求117所述的組合物，有效產(chǎn)生在1.9microg/mL和17microg/mL之間的血漿脂聯(lián)素多肽濃度。
119.根據(jù)權利要求1所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約50％。
120.根據(jù)權利要求1所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約80％。
121.根據(jù)權利要求1所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約90％。
122.根據(jù)權利要求1所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約95％。
123.根據(jù)權利要求1所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約99％。
124.根據(jù)權利要求66所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約50％。
125.根據(jù)權利要求66所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約80％。
126.根據(jù)權利要求66所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約90％。
127.根據(jù)權利要求66所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約95％。
128.根據(jù)權利要求66所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約99％。
129.根據(jù)權利要求67所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約50％。
130.根據(jù)權利要求67所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約80％。
131.根據(jù)權利要求67所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約90％。
132.根據(jù)權利要求67所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約95％。
133.根據(jù)權利要求67所述的脂聯(lián)素多肽，其純度為至少約99％。
134.一種在個體中診斷存在或傾向于產(chǎn)生疾病狀態(tài)的方法，其包括確定特定脂聯(lián)素多肽同工型的水平或者該個體中至少兩種糖基化的脂聯(lián)素多肽同工型的表達模式，以及比較該表達模式與表征未患有該疾病狀態(tài)的個體的表達模式，其中表達模式的差異指示存在或傾向于產(chǎn)生該疾病。
135.根據(jù)權利要求134所述的方法，其中所用的任何一種或多種脂聯(lián)素多肽同工型是根據(jù)權利要求1所述的糖基化的脂聯(lián)素多肽。
136.根據(jù)權利要求134所述的方法，其中所用的任何一種或多種脂聯(lián)素多肽同工型是人脂聯(lián)素。
137.根據(jù)權利要求135或權利要求136所述的方法，其中該個體是人。
138.根據(jù)權利要求134所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)是高血糖癥、胰島素耐受、與胰島素耐受相關的代謝綜合征、2型糖尿病或肥胖癥、代謝綜合征包括高血壓、動脈硬化形成、冠心病、缺血性心臟病、或多囊卵巢綜合征。
139.根據(jù)權利要求134所述的方法，其中所述脂聯(lián)素多肽從生物樣本中獲得。
140.根據(jù)權利要求134所述的方法，其中所述水平或表達模式通過量化或評價糖基化的脂聯(lián)素多肽同工型的表達模式獲得。
141.根據(jù)權利要求134所述的方法，其中所述評價方法采用電泳、HLPC，或質(zhì)譜分析。
142.根據(jù)權利要求140所述的方法，其中采用特異性抗糖基化脂聯(lián)素多肽同工型的抗體來量化或評價所述水平或表達模式。
143.一種在個體中診斷存在或傾向于產(chǎn)生疾病狀態(tài)的方法，其包括確定特定脂聯(lián)素多肽同工型的水平或者該個體中至少兩種糖基化的脂聯(lián)素多肽同工型的表達模式，并且比較該表達模式與表征患有該疾病狀態(tài)的個體的表達模式，其中表達模式相似表示存在或傾向于產(chǎn)生該疾病。
144.根據(jù)權利要求143所述的方法，其中所用的任何一種或多種脂聯(lián)素多肽同工型是根據(jù)權利要求1所述的糖基化的脂聯(lián)素多肽。
145.根據(jù)權利要求143所述的方法，其中所用的任何一種或多種脂聯(lián)素多肽同工型是人脂聯(lián)素。
146.根據(jù)權利要求144或權利要求145所述的方法，其中該個體是人。
147.根據(jù)權利要求143所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)是高血糖癥、胰島素耐受、與胰島素耐受相關的代謝綜合征、2型糖尿病、或肥胖癥、代謝綜合征包括高血壓、動脈硬化形成、冠心病、缺血性心臟病、或多囊卵巢綜合征。
148.根據(jù)權利要求143所述的方法，其中所述脂聯(lián)素多肽從生物樣本中獲得。
149.根據(jù)權利要求143所述的方法，其中所述水平或表達模式通過量化或評價糖基化的脂聯(lián)素多肽同工型的表達模式獲得。
150.根據(jù)權利要求143所述的方法，其中所述評價方法采用電泳、HLPC，或質(zhì)譜分析。
151.根據(jù)權利要求149所述的方法，其中采用特異性抗糖基化脂聯(lián)素多肽同工型的抗體來量化或評價所述水平和表達模式。
152.一種用于治療與脂聯(lián)素多肽調(diào)控或異常胰島素靈敏性相關的疾病狀態(tài)的方法，其包含施用有效量的糖基化的脂聯(lián)素多肽，并且伴隨有或沒有藥學上可接受的賦形劑、共活性劑、稀釋劑等。
153.根據(jù)權利要求152所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)是高血糖癥、胰島素耐受、與胰島素耐受相關的代謝綜合征、2型糖尿病、或肥胖癥、代謝綜合征包括高血壓、動脈硬化形成、冠心病、缺血性心臟病、或多囊卵巢綜合征。
154.根據(jù)權利要求152所述的方法，其中所述糖基化的脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。
155.根據(jù)權利要求152所述的方法，其中所述脂聯(lián)素多肽是選自以下的一種或多種i)一種脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化，ii)如i)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一種或多種，iii)一種脂聯(lián)素多肽，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，iv)如iii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，v)一種脂聯(lián)素多肽，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，vi)如v)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，vii)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的全部四個賴氨酸殘基都被糖基化，viii)如vii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，ix)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸，其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸，和x)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
156.根據(jù)權利要求152所述的方法，其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸。
157.根據(jù)權利要求152所述的方法，其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
158.一種用于治療與脂聯(lián)素調(diào)控或異常胰島素靈敏性相關的疾病狀態(tài)的方法，其包括施用有效量的權利要求68的組合物，并且伴隨有或沒有藥學上可接受的賦形劑、共活性劑、稀釋劑等。
159.根據(jù)權利要求158所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)是高血糖癥、胰島素耐受、與胰島素耐受相關的代謝綜合征、2型糖尿病、或肥胖癥、代謝綜合征包括高血壓、動脈硬化形成、冠心病、缺血性心臟病、或多囊卵巢綜合征。
160.糖基化的脂聯(lián)素多肽(可選與藥學上可接受的賦形劑、共活性劑、稀釋劑和包裝容器)在制備用于哺乳動物患者的藥物組合物或藥劑或劑量單位的用途，其用于i)治療與脂聯(lián)素多肽調(diào)控相關的疾病狀態(tài)；或ii)增強胰島素作用；或iii)抑制糖原異生。
161.根據(jù)權利要求160所述的用途，其中所述藥物組合物或藥劑或劑量單位還包含胰島素。
162.根據(jù)權利要求161所述的用途，其中所述胰島素的濃度足以產(chǎn)生在約50pM到約400pM之間的血液胰島素濃度。
163.根據(jù)權利要求161所述的用途，其中所述胰島素的濃度足以產(chǎn)生在約100pM到約300pM之間的血液胰島素濃度。
164.根據(jù)權利要求163所述的用途，其中所述胰島素的濃度足以產(chǎn)生200pM的血液胰島素濃度。
165.根據(jù)權利要求160所述的用途，其中所述糖基化的脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。
166.根據(jù)權利要求160所述的用途，其中所述脂聯(lián)素多肽選自以下的一種或多種i)一種脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化，ii)如i)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一種或多種，iii)一種脂聯(lián)素多肽，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，iv)如iii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，v)一種脂聯(lián)素多肽，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，vi)如v)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，vii)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的全部四個賴氨酸殘基都被糖基化，viii)如vii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，ix)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸，和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸，和x)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
167.根據(jù)權利要求160所述的用途，其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸。
168.根據(jù)權利要求160所述的用途，其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
169.一種制品，其包含或包括含有至少糖基化的脂聯(lián)素多肽的容器或呈遞單元和所述脂聯(lián)素多肽或糖基化的脂聯(lián)素多肽的使用說明書，其在哺乳動物患者中有效用于i)治療與脂聯(lián)素多肽調(diào)控相關的疾病狀態(tài)；或ii)增強胰島素作用；或iii)抑制糖原異生。
170.根據(jù)權利要求169所述的產(chǎn)品，其中所述糖基化的脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。
171.根據(jù)權利要求169所述的產(chǎn)品，其中脂聯(lián)素多肽選自以下的一種或多種i)一種脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化，ii)如i)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一種或多種，iii)一種脂聯(lián)素多肽，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，iv)如iii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，v)一種脂聯(lián)素多肽，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，vi)如v)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，vii)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的全部四個賴氨酸殘基都被糖基化，viii)如vii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，ix)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸，其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸，和x)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
172.根據(jù)權利要求169所述的制品，其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸。
173.一種配方或劑量形式，當被施用給或自動施用給人類或其他哺乳動物時，能夠遞送有效量的糖基化脂聯(lián)素多肽其足以有效地用于治療哺乳動物患者中與脂聯(lián)素多肽調(diào)控相關的疾病狀態(tài)。
174.根據(jù)權利要求173所述的配方或劑量形式，其中所述配方或劑量形式還含有胰島素。
175.根據(jù)權利要求174所述的配方或劑量形式，其中胰島素的濃度足以產(chǎn)生在約50pM到約400pM的血液胰島素濃度。
176.根據(jù)權利要求174所述的配方或劑量形式，其中所述胰島素的濃度足以產(chǎn)生在約100pM到約300pM的血液胰島素濃度。
177.根據(jù)權利要求176所述的配方或劑量形式，其中所述胰島素的濃度足以產(chǎn)生約200pM的血液胰島素濃度。
178.根據(jù)權利要求173所述的配方或劑量形式，其中所述糖基化的脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。
179.根據(jù)權利要求173所述的配方或劑量形式，其中所述脂聯(lián)素多肽選自以下的一種或多種i)一種脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化，ii)如i)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一種或多種，iii)一種脂聯(lián)素多肽，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，iv)如iii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，v)一種脂聯(lián)素多肽，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，vi)如v)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，vii)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的全部四個賴氨酸殘基都被糖基化，viii)如vii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，ix)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸，和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸，和x)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
180.根據(jù)權利要求173所述的配方或劑量形式，其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸。
181.根據(jù)權利要求173所述的配方或劑量形式，其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
182.一種配方或劑量形式，當被施用給或自動施用給人類或其他哺乳動物時，能夠遞送有效量的糖基化脂聯(lián)素多肽其足以有效地增強胰島素的作用。
183.根據(jù)權利要求182所述的配方或劑量形式，其中所述脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。
184.根據(jù)權利要求183所述的配方或劑量形式，其中所述脂聯(lián)素多肽選自以下的一種或多種i)一種脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化，ii)如i)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一種或多種，iii)一種脂聯(lián)素多肽，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，iv)如iii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，v)一種脂聯(lián)素多肽，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，vi)如v)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，vii)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的全部四個賴氨酸殘基都被糖基化，viii)如vii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，ix)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸，其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸，和x)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
185.一種配方或劑量形式，當被施用給或自動施用給人類或其他哺乳動物時，其能夠遞送有效量的糖基化脂聯(lián)素多肽其足以有效地增強胰島素的作用，其中所述脂聯(lián)素多肽被糖基化。
186.根據(jù)權利要求185所述的配方或劑量形式，其中所述配方或劑量形式還包含胰島素。
187.根據(jù)權利要求186所述的配方或劑量形式，其中所述胰島素的濃度足以產(chǎn)生在約50pM到約400pM的血液胰島素濃度。
188.根據(jù)權利要求187所述的配方或劑量形式，其中所述胰島素的濃度足以產(chǎn)生約200pM的血液胰島素濃度。
189.一種配方或劑量形式，當被施用給或自動施用給人類或其他哺乳動物時，它能夠遞送有效量的糖基化脂聯(lián)素多肽其足以有效地抑制糖原異生。
190.根據(jù)權利要求189所述的配方或劑量形式，其中所述脂聯(lián)素多肽是重組的、分離的、純化的、或合成的。
191.根據(jù)權利要求190所述的配方或劑量形式，其中所述脂聯(lián)素多肽是人脂聯(lián)素。
192.根據(jù)權利要求191所述的配方或劑量形式，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化。
193.一種配方或劑量形式，當被施用給或自動施用給人類或其他哺乳動物時，它能夠遞送有效量的糖基化脂聯(lián)素多肽其足以增強胰島素的作用，其中所述脂聯(lián)素多肽被糖基化。
194.根據(jù)權利要求193所述的配方或劑量形式，其中所述配方或劑量形式還包含胰島素。
195.根據(jù)權利要求194所述的配方或劑量形式，其中所述胰島素的濃度足以產(chǎn)生在約50pM到約400pM的血液胰島素濃度。
196.根據(jù)權利要求195所述的配方或劑量形式，其中所述胰島素的濃度足以產(chǎn)生約200pM的血液胰島素濃度。
197.一種對哺乳動物個體的治療的監(jiān)控方法，該個體易感或患有以下癥狀d.與脂聯(lián)素多肽調(diào)控相關；e.需要增強胰島素，或f.需要抑制糖原異生，所述方法包含或包括監(jiān)控個體中糖基化脂聯(lián)素多肽的存在提高的步驟，其中糖基化的脂聯(lián)素多肽具有如下之一(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化。(C)(A)和(B)。
198.根據(jù)權利要求197所述的方法，其中任何一種或多種所用的脂聯(lián)素多肽同工型是具有(C)(即具有(A)和(B))的糖基化脂聯(lián)素多肽。
199.根據(jù)權利要求197所述的方法，其中任何一種或多種所用的脂聯(lián)素多肽同工型是人脂聯(lián)素。
200.根據(jù)權利要求199所述的方法，其中個體是人。
201.根據(jù)權利要求197所述的方法，其中所述癥狀可以是高血糖癥、胰島素耐受、與胰島素耐受相關的代謝綜合征、2型糖尿病、或肥胖癥、代謝綜合征包括高血壓、動脈硬化形成、冠心病、缺血性心臟病、或多囊卵巢綜合征。
202.根據(jù)權利要求197所述的方法，其中所述脂聯(lián)素多肽得自生物樣本。
203.根據(jù)權利要求197所述的方法，其中所述水平或表達模式通過量化或評價糖基化脂聯(lián)素多肽同工型的表達模式來獲得。
204.根據(jù)權利要求197所述的方法，其中所述評價方法采用電泳、HLPC，或質(zhì)譜分析。
205.根據(jù)權利要求203所述的方法，其中所述水平或表達模式采用特異性抗糖基化的脂聯(lián)素多肽同工型的抗體來量化或評價。
206.一種制備含有糖基化的脂聯(lián)素多肽的組合物的方法，其包括步驟；(a)獲得包括至少兩種形式的糖基化程度或類型不同的脂聯(lián)素多肽的第一組合物；和(b)區(qū)分脂聯(lián)素多肽的各形式至少到一定程度，使得這種區(qū)分基于糖基化程度或類型，從而產(chǎn)生在脂聯(lián)素多肽模式上區(qū)別于第一組合物的第二組合物。
207.根據(jù)權利要求206所述的方法，其在第二組合物中富含或至少主要分離出脂聯(lián)素多肽，其具有(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化，和(C)(A)和(B)。
208.根據(jù)權利要求206所述的方法，其中所述脂聯(lián)素多肽是通過在哺乳動物細胞中表達編碼脂聯(lián)素多肽的重組多核苷酸得到。
209.根據(jù)權利要求206所述的方法，其中所述重組多核苷酸編碼具有圖5中描述的序列的多肽或其生物活性片段或其變體。
210.根據(jù)權利要求206所述的方法，其中所述脂聯(lián)素多肽從動物組織中純化。
211.根據(jù)權利要求206所述的方法，其中所述動物是人、小鼠、大鼠、狗、?；蚍侨说撵`長類。
212.根據(jù)權利要求206所述的方法，其中所述組織是血清或脂肪細胞。
213.根據(jù)權利要求206所述的方法，其中所述分離包括電泳步驟。
214.根據(jù)權利要求206所述的方法，其中所述分離不包括電泳步驟。
215.根據(jù)權利要求206所述的方法，其中所述分離包括層析步驟。
216.根據(jù)權利要求206所述的方法，其中所述分離不包括層析步驟。
217.根據(jù)權利要求206所述的方法，其中所述第二組合物是脂聯(lián)素多肽的組合物或含有脂聯(lián)素多肽的組合物，該脂聯(lián)素多肽至少具有如下之一(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化，和(C)(A)和(B)。
218.一種組合物，其通過包含如下步驟的制備包括糖基化的脂聯(lián)素多肽的方法制備(a)獲得包含至少兩種形式的糖基化程度或類型不同的脂聯(lián)素多肽的第一組合物；(b)區(qū)分脂聯(lián)素多肽的各個形式至少到一定程度，使得這種區(qū)分基于糖基化程度或類型，從而產(chǎn)生在脂聯(lián)素多肽模式上區(qū)別于第一組合物的第二組合物。
219.一種抗體，其特異性抗選自如下的脂聯(lián)素多肽的糖基同工型(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化，和(C)(A)和(B)。
220.根據(jù)權利要求219所述的抗體，其為單克隆抗體。
221.根據(jù)權利要求219所述的抗體，所述抗體能夠雙位點捕獲。
222.一種組合物，其包含特異性抗選自如下的脂聯(lián)素多肽的糖基同工型的抗體(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化，和(C)(A)和(B)。
223.一種雜交瘤，其特別用于生產(chǎn)特異性抗選自如下的脂聯(lián)素多肽的糖基同工型的抗體(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化，和(C)(A)和(B)。
224.一種方法，其用于篩選一種試劑或用于在哺乳動物中用以提高具有如下之一的糖基化脂聯(lián)素多肽的水平的試劑(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化，和(C)(A)和(B)，該方法包括給予哺乳動物或其組織或一種或多種細胞或使哺乳動物任何通過這些哺乳動物或哺乳動物組織或一種或多種細胞提高這種糖基化的脂聯(lián)素多肽的生成。
225.一種試劑，其用于提高具有如下之一的糖基化脂聯(lián)素多肽的水平(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化，(C)(A)和(B)，通過篩選的方法來確定，該方法包括給予哺乳動物或其組織或通過這些哺乳動物或哺乳動物組織提高哺乳動物這種糖基化的脂聯(lián)素多肽產(chǎn)品。
226.一種脂聯(lián)素多肽同工型的混合物，其通過去除、轉(zhuǎn)化或合成，基本含有或富含具有至少一個或多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化的同工型。
227.一種脂聯(lián)素多肽同工型的混合物，其通過去除、轉(zhuǎn)化或合成，基本含有或富含具有至少一個或多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基未被羥基化的同工型。
228.脂聯(lián)素多肽同工型，其基本含有或富含(無論是通過去除、轉(zhuǎn)化或合成)至少一個或多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化的同工型。
229.脂聯(lián)素多肽同工型，其基本含有或富含(無論是通過去除、轉(zhuǎn)化或合成)至少一個或多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化和在對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的位置上具有羥基脯氨酰基殘基的同工型。
230.脂聯(lián)素多肽同工型，其基本含有或富含(通過去除、轉(zhuǎn)化或合成)至少一個或多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化和在對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的位置上不具有羥基脯氨?；鶜埢耐ば?。
231.一種用于篩選一種或多種能夠表達糖基化脂聯(lián)素多肽的細胞的方法，其包含鑒定和/或確定特異的脂聯(lián)素多肽同工型的水平或至少兩種由所述細胞表達的糖基化脂聯(lián)素多肽同工型的表達模式和/或純化和/或分離所述細胞。
232.根據(jù)權利要求231所述的方法，其中所述糖基化的脂聯(lián)素多肽為人脂聯(lián)素。
233.根據(jù)權利要求231所述的方法，其中所述脂聯(lián)素多肽選自以下的一種或多種i)一種脂聯(lián)素多肽，其中至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基之一被糖基化，ii)如i)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一種或多種，iii)一種脂聯(lián)素多肽，其中兩個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，iv)如iii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，v)一種脂聯(lián)素多肽，其中三個或更多個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的賴氨酸殘基被糖基化，vi)如v)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，vii)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的全部四個賴氨酸殘基都被糖基化，viii)如vii)中定義的脂聯(lián)素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一種或多種，ix)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸，和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸，和x)一種脂聯(lián)素多肽，其中對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
234.根據(jù)權利要求231所述的方法，其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸。
235.根據(jù)權利要求231所述的方法，其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
236.根據(jù)權利要求231所述的方法，其中采用特異性抗選自下列的脂聯(lián)素多肽的糖基同工型來鑒定和/或確定任何一種或脂聯(lián)素多聚體(A)至少對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的賴氨酸殘基之一被糖基化，(B)對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的脯氨酰殘基被羥基化，和(C)(A)和(B)。
237.根據(jù)權利要求236所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
238.根據(jù)權利要求236所述的方法，其中所述抗體特異性抗脂聯(lián)素多肽，其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基是羥基脯氨酸。
239.根據(jù)權利要求236所述的方法，其中所述抗體特異性抗脂聯(lián)素多肽，其中每個對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸殘基65、68、77和101的脂聯(lián)素多肽的殘基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羥基賴氨酸和其中對應于人脂聯(lián)素的脯氨酸殘基91的殘基不是羥基脯氨酸。
240.通過篩選一種或多種能夠表達糖基化的脂聯(lián)素多肽的方法鑒定和/或分離和/或純化的任何一種或多種細胞，該方法包括鑒定和/或確定特異的脂聯(lián)素多肽同工型的水平或至少兩種由所述細胞表達的糖基化脂聯(lián)素多肽同工型的表達模式以及鑒定和/或純化和/或分離所述細胞。
241.一種治療遭受或患有肝臟疾病和/或具有任何肝臟疾病特征的哺乳動物患者的方法，其包含或包括給該患者施用脂聯(lián)素和/或其激動劑。
242.根據(jù)權利要求241所述的方法，其中所述哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
243.根據(jù)權利要求241或242所述的方法，其中所述脂聯(lián)素是全長的。
244.根據(jù)權利要求241所述的方法，其中所述脂聯(lián)素被糖基化。
245.根據(jù)權利要求241所述的方法，其中所述脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的一個或多個殘基被糖基化的人脂聯(lián)素。
246.根據(jù)權利要求245所述的方法，其中所述脂聯(lián)素制劑以適合于腸胃外施用的方式配制。
247.一種治療遭受或患有酒精性肝臟疾病和/或具有任何酒精性肝臟疾病特征的哺乳動物患者的方法，其包含或包括給該患者施用所述脂聯(lián)素和/或其激動劑。
248.一種治療哺乳動物患者以預防和/或反轉(zhuǎn)肝臟疾病和/或具有任何肝臟疾病特征的的方法，其包含或包括給該患者施用所述脂聯(lián)素和/或其激動劑。
249.一種治療正患肝臟疾病和/或具有任何肝臟疾病特征的人的方法，其包含或包括給該患者施用有效量的脂聯(lián)素和/或其激動劑。
250.一種治療哺乳動物患者以預防和/或反轉(zhuǎn)酒精性肝臟疾病和/或具有任何酒精性肝臟疾病特征的的方法，其包含或包括給該患者施用脂聯(lián)素和/或其激動劑。
251.一種治療正患酒精性肝臟疾病和/或具有任何酒精性肝臟疾病特征的人的方法，其包含或包括給該患者施用有效量的脂聯(lián)素和/或其激動劑。
252.一種治療遭受肝臟脂肪變性(脂肪浸潤)、肝臟炎癥、肝壞死、肝纖維化、肝硬化、和/或肝功能紊亂的任何一種或多種的哺乳動物患者的方法，其包含或包括給該患者施用脂聯(lián)素和/或其激動劑。
253.一種制品，其包含或包括含有脂聯(lián)素、和/或脂聯(lián)素激動劑的容器；和脂聯(lián)素或脂聯(lián)素激動劑(如，含在容器中的)用于治療、預防或反轉(zhuǎn)肝臟疾病和/或肝臟疾病的任何特征的使用說明書。
254.一種制品，其包含或包括含有脂聯(lián)素、和/或脂聯(lián)素激動劑的容器；和脂聯(lián)素或脂聯(lián)素激動劑(如，含在容器中的)和/或這種劑量單位用于治療、預防或反轉(zhuǎn)酒精性肝臟疾病和/或酒精性肝臟疾病的任何特征的使用說明書。
255.一種制品，其包含或包括含有脂聯(lián)素、和/或脂聯(lián)素激動劑的包裝材料；脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素激動劑(如，含在包裝材料中的)用于治療、預防或反轉(zhuǎn)肝臟疾病和/或肝臟疾病的任何特征的使用說明書。
256.一種制品，其包含或包括含有脂聯(lián)素、和/或脂聯(lián)素激動劑的包裝材料；和脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素激動劑(如，含在包裝材料中的)用于治療、預防或反轉(zhuǎn)酒精性肝臟疾病和/或酒精性肝臟疾病的任何特征的使用說明書。
257.脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素激動劑在與其他材料(無論受體、共活性劑、稀釋劑等和/或無論劑量單位定義的容器)加工有效用于在哺乳動物患者(人或其他動物)中治療、預防或反轉(zhuǎn)疾病和/或肝臟疾病的任何特征的劑量單位或藥物組合物中的用途。
258.有效量的脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素激動劑在與其他材料(無論受體、共活性劑、稀釋劑等和/或無論劑量單位定義的容器)加工有效用于在哺乳動物患者(人或其他動物)中治療、預防或反轉(zhuǎn)酒精性疾病和/或酒精性肝臟疾病的任何特征的劑量單位或藥物組合物中的用途。
259.一種治療哺乳動物患者的方法，其以任何順序包含或包括，監(jiān)測哺乳動物患者中的脂聯(lián)素和/或給該哺乳動物施用脂聯(lián)素和或其激動劑，這種治療的目的在于治療、反轉(zhuǎn)或預防肝臟疾病和或肝臟疾病(和包括酒精性肝臟疾病)的任何特征。
260.根據(jù)權利要求259所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
261.一種治療哺乳動物患者的方法，其以任何順序包含或包括，監(jiān)測哺乳動物患者中的脂聯(lián)素mRNA，和或給該哺乳動物施用脂聯(lián)素和或其激動劑，這種治療的目的在于治療、反轉(zhuǎn)或預防肝臟疾病和/或肝臟疾病(和包括酒精性肝臟疾病)的任何特征。
262.根據(jù)權利要求261所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
263.一種測定哺乳動物患者中脂聯(lián)素的方法，其包含或包括檢測血液或組織中的脂聯(lián)素濃度。
264.根據(jù)權利要求263所述的方法，其中該濃度通過免疫學方法如放射免疫檢測(RIA)，和/或BLISA確定。
265.根據(jù)權利要求263所述的方法，其中所述組織是脂肪組織。
266.一種測定哺乳動物患者中的脂聯(lián)素的方法，其包含或包括檢測血液或組織中的脂聯(lián)素mRNA的濃度。
267.根據(jù)權利要求266所述的方法，其中所述脂聯(lián)素mRNA的濃度可以通過RT-PCR、Northern分析、原位雜交和/或放射免疫檢測(RIA)測定。
268.根據(jù)權利要求266所述的方法，其中所述組織是脂肪組織。
269.一種能夠測定哺乳動物患者的脂聯(lián)素的檢測方法，其包含或包括從哺乳動物患者中分離血液或組織樣本，制備樣本，檢測血液或組織中的脂聯(lián)素濃度。
270.根據(jù)權利要求269所述的方法，其中該濃度通過免疫學方法如放射免疫檢測(RIA)，和/或BLISA確定。
271.一種治療哺乳動物患者的方法，該患者遭受或患有選自急性肝臟疾病、慢性肝臟疾病、肝臟炎癥、肝臟功能紊亂、脂肪肝(肝臟脂肪變性)、肝臟纖維化、肝臟硬化、肝臟壞死、肝細胞壞死、酒精性肝臟疾病、酒精性肝脂肪變性、酒精性肝炎、酒精性肝壞死、酒精性肝硬化、肝壞死、肝脂肪變性、與糖尿病相關的肝脂肪變性、與富含脂類的飲食相關的肝脂肪變性、與脂類代謝異常相關的肝脂肪變性、由任何情況引起的肝炎、由任何情況導致的肝壞死、急性肝炎、慢性肝炎、慢性自發(fā)性肝炎、肝臟的病毒感染或發(fā)炎繼發(fā)的肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、任何藥物或毒素作用繼發(fā)的肝炎、膽汁郁積隨之發(fā)生的肝炎或肝功能紊亂、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肝臟肉芽腫病，和/或其中腫瘤壞死因子的組織或血液濃度升高起致病作用的情況的任何癥狀，其包含或包括給該患者施用脂聯(lián)素和/或其激動劑。
272.根據(jù)權利要求271所述的方法，其中所述患者是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
273.根據(jù)權利要求271所述的方法，其中所述脂聯(lián)素是全長的。
274.根據(jù)權利要求271所述的方法，其中所述脂聯(lián)素被糖基化。
275.一種治療其自身還能夠編碼脂聯(lián)素的哺乳動物患者的方法，其包含向該患者施用足量的脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點的激動劑來將TNF-α水平抑制為低于沒有這種施用時存在或可能存在的水平。
276.根據(jù)權利要求275所述的方法，其中這種施用是為了治療、改善、預防和/或反轉(zhuǎn)TNT-α疾病或紊亂和/或TNF-α疾病或紊亂的任何特征。
277.根據(jù)權利要求275所述的方法，其中所述哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
278.根據(jù)權利要求275所述的方法，其中所述脂聯(lián)素是全長的。
279.根據(jù)權利要求275所述的方法，其中所述脂聯(lián)素被糖基化。
280.根據(jù)權利要求279所述的方法，其中所述脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基的一個或多個被糖基化的人脂聯(lián)素。
281.一種治療其自身還能夠編碼脂聯(lián)素的哺乳動物患者的方法，其包含或包括給該患者施用足量的脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點的激動劑來將TNF-α水平抑制為低于沒有這種施用時存在或可能存在的水平，從而對于如下的任何一種或多種的癥狀產(chǎn)生有利反應炎癥性疾病、循環(huán)疾病、門脈高壓、肺動脈高壓、變應性疾病、克隆病、自體免疫溶血性貧血、牛皮癬、肝臟疾病、胰腺病、神經(jīng)變性疾病、中樞神經(jīng)衰竭、毒血癥、更年期衰退、妊娠中毒、肥胖病、高脂血癥、高膽固醇血癥、異常葡萄糖耐受、實體瘤、腫瘤和伴隨的惡病質(zhì)、內(nèi)分泌疾病、Creutzfeldt-Jakob病、病毒感染、經(jīng)皮冠狀動脈成形、血管肥大或閉塞、PTCA/支架/旁路手術后的血管再閉塞/再狹窄、干預后的血管肥大或閉塞、抑制植入誘導的血管衰退和排斥、器官或組織移植后的排斥和自體免疫疾病、在新型治療過程中TNF生成相關的負作用，還消除和改善與治療或預防移植排斥相關的休克相關綜合癥、透析性低血壓、青光眼、眼壓高、重癥肌無力、長期脫脂癥、骨病、神經(jīng)紊亂、TNF-α誘導的胰島素耐受、異常凋亡、糖尿病或應激高血糖癥的并發(fā)癥、慢性阻塞性肺疾病、慢性支氣管炎和肺氣腫。
282.一種治療其自身還能夠編碼脂聯(lián)素的哺乳動物患者的方法，其包含向該患者施用足量的脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點的激動劑來將TNF-α的mRNA水平抑制為低于沒有這種施用時存在或可能存在的水平。
283.根據(jù)權利要求282所述的方法，其中這種施用用于治療、改善、預防和/或反轉(zhuǎn)TNF-α疾病或紊亂和/或TNF-α疾病或紊亂的任何特征。
284.根據(jù)權利要求282所述的方法，其中所述哺乳動物是人和脂聯(lián)素是人脂聯(lián)素。
285.根據(jù)權利要求282所述的方法，其中所述脂聯(lián)素是全長的。
286.權利要求282所述的方法，其中所述脂聯(lián)素被糖基化。
287.權利要求286所述的方法，其中所述脂聯(lián)素是對應于賴氨酸殘基65、68、77和101的殘基的一個或多個被糖基化的人脂聯(lián)素。
288.脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點激動劑的用途，其與其他材料(σ)制造(ωηετηερ ρεχιπιευτσ，χο-αχτιωεσ，διλυευτσ ορ τηελικε ανδ/ορωηετηερ αδοσαγευνιτ δεφινινγ ωεσσελ)οφα δοσαγε υνιτ ορ πηαρμαχευτιχαλ χομποσιτιον εφφεχτιωε φορ υσε το συππρεσσ TNφ-α)低于沒有這種施用時存在或可能存在的水平。
289.脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點激動劑與其他材料(無論是受體、共活性劑、稀釋劑或等等和/或劑量單位定義的容器)在加工有效用于治療、預防和/或反轉(zhuǎn)TNF-α疾病或紊亂和/或TNF-α疾病或紊亂的劑量單位或藥物組合物中的用途。
290.一種有效用于將TNF-α水平抑制為低于沒有這種施用時存在或可能存在的水平的制品，其包含或包括含有脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點激動劑的容器；脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點激動劑(例如，含在容器中)的使用說明書。
291.一種用于治療、預防或反轉(zhuǎn)TNF-□疾病或紊亂和/或TNF-α疾病或紊亂的任何特征的制品，其包含或包括含有脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點激動劑的容器；脂聯(lián)素和/或脂聯(lián)素作用位點激動劑(例如，含在容器中)的使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及脂聯(lián)素多肽(特別是優(yōu)選在對應于人脂聯(lián)素的賴氨酸位點65、68、77和101上被糖基化的那些和特別是在脯氨酸91上被羥基化的那些)被證明有效用于治療各種癥狀。本發(fā)明公開了相關的組合物、用途和方法。
文檔編號A61P1/00GK1886423SQ03806207
公開日2006年12月27日 申請日期2003年1月17日 優(yōu)先權日2002年1月18日
發(fā)明者徐愛民, 汪玉, G·J·S·庫珀 申請人:普羅特米克斯公司