專利名稱：球形氨基酸吸附劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用吸附材料，特別是一種球形氨基酸吸附劑及其制備方法，應(yīng)用于血液灌流治療疑難疾病。將多種氨基酸分別以化學(xué)鍵連方式固定到球形天然高分子載體上，成為帶有氨基酸配基的醫(yī)用吸附劑，可用于血液灌流療法治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無(wú)力、及內(nèi)毒素血癥和感染性休克等疾病。
腫瘤壞死因子α(TNFα)是內(nèi)毒素休克致病機(jī)理中最重要的炎癥介質(zhì)，是內(nèi)毒素血癥和膿毒癥中介導(dǎo)組織損傷的主要介質(zhì)之一，感染死亡率較高。利用吸附劑從血液或血漿中選擇性吸附清除TNFα，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型治療方法。Howard Levy等[ASAIOJ.1998，44659-665]應(yīng)用活性炭和活性炭聯(lián)合二氧化硅吸附劑血液凈化系統(tǒng)共治療8例病人，結(jié)果表明所有的病人均有癥狀的改善，血漿細(xì)胞因子水平在治療過(guò)程中穩(wěn)定或降低。多器官衰竭明顯好轉(zhuǎn)，2例病人存活時(shí)間超過(guò)28天，2例超過(guò)14天。龍海波等[中華腎臟病雜志1998，14(4)225-228；中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)1999，11(8)477-480]研究免疫吸附劑特異性清除循環(huán)TNFα對(duì)內(nèi)毒素休克兔心臟損害的影響，結(jié)果表明經(jīng)免疫吸附治療后動(dòng)物低血壓狀態(tài)明顯改善，血漿TNFα水平迅速下降，延緩和顯著減輕了肝腎功能損害及心肌、細(xì)胞膜和溶酶體損傷的發(fā)生，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率明顯提高。
血液灌流治療是一種非藥物療法，這種療法是基于病人血液通過(guò)含有能與血液中有害成分發(fā)生吸附作用的吸附柱過(guò)濾而達(dá)到治療目的的。Jones，F(xiàn)rank R(EP 0 272 792A1，1987)對(duì)這種方法曾做過(guò)詳細(xì)說(shuō)明。治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的血液灌流療法始于二十世紀(jì)八十年代初期，日本學(xué)者Yamazaki等(Biomater Artif Cells Artif Organs1989；17(2)117-24)研制成功聚乙烯醇凝膠-色氨酸免疫吸附劑(IM-TR)和聚乙烯醇凝膠-苯丙氨酸免疫吸附劑(TM-PH)，并將IM-TR用于臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，治療后患者關(guān)節(jié)疼痛減輕，類風(fēng)濕因子(RF)也有不同程度的降低，取得了較好的療效。1990年，Kold用戊二醛溶液對(duì)IgG進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，合成IgG聚合體。體外吸附實(shí)驗(yàn)表明，該聚合體對(duì)RF的清除率高達(dá)94％。由于形成的聚合物過(guò)于細(xì)小，該吸附劑不適于臨床應(yīng)用。1997年，Ramlow報(bào)導(dǎo)了以瓊脂糖凝膠為載體，化學(xué)鍵連蛋白A制備RA免疫吸附劑的研究及其臨床應(yīng)用。目前臨床上使用較多的是將蛋白A共價(jià)鍵連到硅膠球上，制成RA免疫吸附劑，通過(guò)血漿灌流吸附清除類風(fēng)濕因子。
美國(guó)的Terman DS等[Lancet，1979，2(8147)824-7]，首次使用活性炭為載體材料，采用火棉膠包膜固定DNA，得到的DNA免疫吸附劑用于血液灌流治療一名重度SLE患者，使患者生命延長(zhǎng)了31天。俞耀庭等[美國(guó)專利US 6,262,172 B1，中國(guó)專利CN1111430C]曾在臨床上采用炭化樹脂或纖維素為載體的DNA免疫吸附劑治療或緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人的病情，取得了較好的療效。Nagasawa采用葡聚糖凝膠共價(jià)鍵連DNA，制備得到化學(xué)鍵連的免疫吸附劑(Journal of Applied Biochemistry，1985，7296-302)。
文獻(xiàn)中曾報(bào)道采用瓊脂糖偶聯(lián)蛋白A或聚乙烯醇偶聯(lián)色氨酸作為吸附劑治療重癥肌無(wú)力患者，治療后臨床癥狀即有明顯改善[J.Neuroimmunology，1989，22123-127；J.Neuro Neurosur.Psychia，1994，57578-581；Trans.Prac.，1999，39682-687]。
血液灌流的關(guān)鍵技術(shù)之一是吸附劑的制備，吸附劑的載體是吸附器件的重要原材料，配基則決定著吸附劑的性能。目前臨床上普遍使用的血液灌流吸附劑是以硅膠為載體、以蛋白A為配基的合成樹脂。作為配基的蛋白A，其價(jià)格較為昂貴，使得吸附劑的制作成本較高；同時(shí)這類吸附劑的血液相容性較差，在使用中必須首先將病人的血液進(jìn)行血漿分離后才能進(jìn)行吸附灌流的治療。這就造成目前臨床上血液灌流治療費(fèi)用較高，盡管其具有明確的療效但卻不能為大多數(shù)患者所接受。
本發(fā)明是以天然高分子為載體，粒度0.45-0.9mm，經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化后固定有效量的氨基酸配基的樹脂構(gòu)成，其中，氨基酸含量為12.5-39.7μmol/ml樹脂。
所述的天然高分子載體是球形纖維素、瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、阿拉伯膠、明膠或淀粉。
所述的載體是球形纖維素。
所述的配基為氨基酸、聚氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)；所述的氨基酸是精氨酸、賴氨酸、谷氨酸、谷胺酰胺、絲氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸或組氨酸；所述的聚氨基酸是聚賴氨酸；所述的多肽是2-14個(gè)氨基酸的肽；所述的蛋白質(zhì)是IgG或熱聚IgG。
所述的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸或賴氨酸。
球形氨基酸吸附劑的制備方法是經(jīng)過(guò)下述步驟合成的1)制備纖維素載體的球形氨基酸吸附劑(1)精制棉或脫脂棉在室溫下用10-20％氫氧化鈉水溶液堿化1-2小時(shí)以后，除去堿液，于25-80℃條件下密封放置老化24-72h。
(2)在上述堿化棉中加入二硫化碳，25℃震蕩反應(yīng)5-10h得到橙色粘膠液，根據(jù)堿化棉花的重量用3-6％NaOH稀釋上述粘膠液至6％-15％，室溫下放置備用。
(3)以氯苯和油酸鉀，或/和四氯化碳為分散介質(zhì)，向其中加入粘膠液，升溫至80-95℃，保溫1-3h，傾出有機(jī)溶劑，洗滌合成的球形纖維素載體；收集粒度在0.45-0.9mm范圍內(nèi)的組份，置于水中4℃保存?zhèn)溆谩?br> (4)將載體置于0.5-5M NaOH溶液中，加入環(huán)氧氯丙烷，于25-60℃條件下反應(yīng)1-4小時(shí)，得到活化后的球形纖維素載體，環(huán)氧基含量達(dá)61.7μmol/ml。
(5)氨基酸配基的偶聯(lián)環(huán)氧氯丙烷活化的球形纖維素載體與氨基酸在pH大于8的介質(zhì)中，于25-80℃條件下反應(yīng)5-24小時(shí)。水洗后，加入兩倍體積的1M乙醇胺溶液在室溫下反應(yīng)1-3h以封閉殘留的環(huán)氧基，得到球形纖維素載體成品吸附劑，氨基酸含量達(dá)39.7μmol/ml。氨基酸吸附劑經(jīng)過(guò)淋洗、滅菌、包裝等處理后可直接用于臨床。
2)制備瓊脂、瓊脂糖、明膠載體的球形氨基酸吸附劑(1)將瓊脂、瓊脂糖或明膠加入到水中，加熱至60-90℃使之溶解，將此溶液轉(zhuǎn)移至由甲苯、三氯甲烷和吐溫80，或液體石蠟和司班80組成的分散相中，攪拌0.5小時(shí)以上至液滴分散均勻后，冷卻至室溫，傾出有機(jī)溶劑，洗滌合成的樹脂，收集粒度在0.45-0.9mm范圍內(nèi)的組份，置于水中4℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)采用步驟1)中的(4)和(5)，得到上述載體的球形氨基酸吸附劑。
3)制備葡聚糖或淀粉載體的球形氨基酸吸附劑(1)在葡聚糖或淀粉的水溶液中加入環(huán)氧氯丙烷，以液體石蠟和司班80為分散相，堿性條件下于25-40℃反應(yīng)6-16小時(shí)。傾出有機(jī)溶劑，洗滌合成的樹脂，收集粒度在0.45-0.9mm范圍內(nèi)的組份，置于水中4℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)采用步驟1)中的(4)和(5)，得到上述載體的球形氨基酸吸附劑。
4)制備殼聚糖或阿拉伯膠載體的球形氨基酸吸附劑(1)在殼聚糖的酸性水溶液或阿拉伯膠的水溶液中加入甲醛或戊二醛，以液體石蠟和司班80為分散相，25-60℃反應(yīng)2-24小時(shí)。傾出有機(jī)溶劑，洗滌合成的樹脂，收集粒度在0.45-0.9mm范圍內(nèi)的組份，置于水中4℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)采用步驟1)中的(4)和(5)，得到上述載體的球形氨基酸吸附劑。
所述的二硫化碳與棉花的體積/質(zhì)量比是1-2∶3。
所述的分散介質(zhì)與粘膠液的體積/質(zhì)量比是3-5∶1。
所述的活化載體的環(huán)氧氯丙烷的加入量為0.5-5ml/g載體；所述的氨基酸加入量為0.001g-1g/g。
所述的天然高分子為載體的氨基酸吸附劑的應(yīng)用，它可用于臨床上血液灌流療法治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無(wú)力、內(nèi)毒素血癥及感染性休克等疾病。
本發(fā)明以球形纖維素、瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、阿拉伯膠、明膠及淀粉等天然高分子為載體，經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化后，固定氨基酸配基，得到可用于血液灌流的吸附劑。球形纖維素載體固定化苯丙氨酸吸附劑對(duì)類風(fēng)濕因子的吸附量為116.1IU/ml，對(duì)重癥肌無(wú)力患者血液中乙酰膽堿受體抗體的吸附率為16.6％；球形纖維素載體固定化色氨酸吸附劑對(duì)類風(fēng)濕因子的吸附量為122.4IU/ml，對(duì)重癥肌無(wú)力患者血液中乙酰膽堿受體抗體的吸附率為44.8％；球形纖維素載體固定化賴氨酸吸附劑對(duì)內(nèi)毒素的吸附量為1.67EU/ml；球形瓊脂載體固定化苯丙氨酸吸附劑對(duì)類風(fēng)濕因子的吸附量為183.8IU/g；球形瓊脂載體固定化苯丙氨酸吸附劑對(duì)重癥肌無(wú)力抗體的吸附率為13.0％；球形瓊脂載體固定化色氨酸吸附劑對(duì)類風(fēng)濕因子的吸附量為155.0IU/g；球形瓊脂載體固定化色氨酸吸附劑對(duì)重癥肌無(wú)力患者血液中乙酰膽堿受體抗體的吸附率為34.5％。
本發(fā)明使用天然高分子材料作為吸附劑的載體，具有良好的生物相容性，在使用中無(wú)需進(jìn)行血漿分離，可采用全血灌流方式，大大降低了治療成本；而氨基酸作為一類廉價(jià)的配基不僅使吸附劑具有較好的吸附性能，同時(shí)在實(shí)際應(yīng)用中不會(huì)產(chǎn)生因配基泄漏帶來(lái)的危害，具有極高的安全性。本發(fā)明涉及的多種氨基酸吸附劑可以以同種天然高分子為載體，偶聯(lián)不同的氨基酸，使得吸附劑的生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單易行，生產(chǎn)成本低廉；不同的吸附劑對(duì)特定疾病的治療又具備特異性的特點(diǎn)?？梢垣@得更高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
本發(fā)明得到的固定化氨基酸生物醫(yī)用吸附劑可直接用于全血灌流法治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無(wú)力、內(nèi)毒素血癥及感染性休克，通過(guò)清除患者體內(nèi)有毒物質(zhì)達(dá)到治療目的。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，此類吸附劑無(wú)毒副作用，無(wú)熱源，是一種良好的醫(yī)用血液凈化吸附材料。吸附劑的制備簡(jiǎn)單，成本低廉，易于推廣應(yīng)用。
本發(fā)明突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，可通過(guò)下述實(shí)施例予以證明，但它們不是對(duì)本發(fā)明作任何限制。
(a)纖維素載體的制備精制棉10g在室溫下用19％氫氧化鈉水溶液堿化棉花兩小時(shí)以上，除去堿液后，于28℃密封放置老化三天。
加入6g CS2，于25℃震蕩反應(yīng)10h得到橙色粘膠液。加入6％NaOH使上述粘膠液的重量達(dá)到100g，備用。
以氯苯300ml和油酸鉀1.2g為分散介質(zhì)，向其中加入粘膠液，采用懸浮聚合法合成球形纖維素。升溫至80℃，保溫3h，之后，傾出有機(jī)溶劑，洗滌合成的載體。收集粒度在0.45-0.9mm范圍內(nèi)的組份，置于水中4℃保存?zhèn)溆谩．a(chǎn)率大于80％。
(b)纖維素載體的活化將載體置于3M NaOH溶液中，加入環(huán)氧氯丙烷，于40℃條件下反應(yīng)2小時(shí)，得到活化后的纖維素載體。環(huán)氧值采用酸堿滴定法測(cè)得，環(huán)氧值為54.7μmol/ml。
(c)氨基酸配基的固定化環(huán)氧氯丙烷活化的球形載體與氨基酸的堿性溶液在50℃條件下反應(yīng)15h。之后，加入150ml乙醇胺溶液在室溫下反應(yīng)2h。采用茚三酮法測(cè)定氨基酸的固定量，苯丙氨酸的固定量為35.5μmol/ml。
(d)吸附劑對(duì)類風(fēng)濕患者血清中類風(fēng)濕因子的吸附在3ml帶塞離心管中，加入0.5ml吸附劑和1.0ml類風(fēng)濕患者血清，于恒溫?fù)u床中37℃振蕩吸附2h。酶聯(lián)免疫法分別測(cè)定吸附前后血清中類風(fēng)濕因子的濃度(試劑盒為上海德波生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，計(jì)算吸附量。
按照上述步驟合成的球形纖維素載體固定化苯丙氨酸吸附劑對(duì)類風(fēng)濕因子的吸附量為116.1IU/ml。
實(shí)施例2.按照實(shí)施例1進(jìn)行色胺酸的固定量為36.4μmol/ml。對(duì)類風(fēng)濕因子的吸附量為122.4IU/ml。
實(shí)施例3.按照實(shí)施例1進(jìn)行亮胺酸的固定量為30.6μmol/ml。對(duì)類風(fēng)濕因子的吸附量為61.0IU/ml。
實(shí)施例4.按照實(shí)施例1進(jìn)行谷胺酸的固定量為34.5μmol/ml。對(duì)類風(fēng)濕因子的吸附量為36.0IU/ml。
實(shí)施例5.按照實(shí)施例1進(jìn)行絲胺酸的固定量為33.6μmol/ml。對(duì)類風(fēng)濕因子的吸附量為23.4IU/ml。
實(shí)施例6.按照實(shí)施例1進(jìn)行酪胺酸的固定量為35.1μmol/ml。對(duì)類風(fēng)濕因子的吸附量為17.4IU/ml。
實(shí)施例7.按照實(shí)施例1進(jìn)行賴胺酸的固定量為39.1μmol/ml。對(duì)類風(fēng)濕因子的吸附量為16.0IU/ml。
實(shí)施例8.按照實(shí)施例1進(jìn)行精胺酸的固定量為39.7μmol/ml。對(duì)類風(fēng)濕因子的吸附量為10.4IU/ml。
實(shí)施例9.
(a)纖維素載體的制備精制棉10g在室溫下用19％氫氧化鈉水溶液堿化漂白的棉花兩小時(shí)，除去堿液后于25℃密封放置老化三天。
加入5ml CS2，于28℃反應(yīng)5h得到橙色粘膠液。加入6％NaOH使上述粘膠液的重量達(dá)到120g，攪拌均勻，28℃反應(yīng)5h，放置備用。
以氯苯360ml、油酸鉀0.7g和四氯化碳60ml為分散介質(zhì)，向其中加入粘膠液，采用懸浮聚合法合成球形纖維素。升溫至90℃，保溫2h，傾出有機(jī)溶劑，洗滌合成的載體。收集粒度在0.45-0.9mm范圍內(nèi)的組份，置于水中4℃保存?zhèn)溆?。產(chǎn)率大于80％。
(b)纖維素載體的活化將10g載體置于1M NaOH溶液中，加入環(huán)氧氯丙烷10ml，于25℃條件下反應(yīng)2小時(shí)，得到活化后的纖維素載體。
(c)氨基酸配基的固定化環(huán)氧氯丙烷活化的球形載體與氨基酸的堿性溶液在37℃條件下反應(yīng)18h。之后，加入乙醇胺溶液20ml在室溫下反應(yīng)6h。
(d)吸附劑對(duì)重癥肌無(wú)力病人血液中乙酰膽堿受體的吸附在3ml帶塞離心管中，加入0.5g吸附劑和1.5ml重癥肌無(wú)力病人血清，于恒溫?fù)u床中37℃振蕩吸附2h。ELISA法測(cè)定吸附前后血清中重癥肌無(wú)力抗體的濃度，計(jì)算吸附量。
按照上述步驟合成的球形纖維素載體固定化苯丙氨酸吸附劑對(duì)重癥肌無(wú)力抗體的吸附率為16.6％。
實(shí)施例10.按照實(shí)施例9進(jìn)行色胺酸的固定化。所得吸附劑對(duì)重癥肌無(wú)力抗體的吸附率為44.8％。
實(shí)施例11.按照實(shí)施例9進(jìn)行酪胺酸的固定化。所得吸附劑對(duì)重癥肌無(wú)力抗體的吸附率為13.1％。
實(shí)施例12.按照實(shí)施例9進(jìn)行半胱胺酸的固定化。所得吸附劑對(duì)重癥肌無(wú)力抗體的吸附率為19.5％。
實(shí)施例13.按照實(shí)施例9進(jìn)行賴胺酸的固定化。所得吸附劑對(duì)重癥肌無(wú)力抗體的吸附率為15.4％。
實(shí)施例14.按照實(shí)施例9進(jìn)行谷胺酸的固定化。所得吸附劑對(duì)重癥肌無(wú)力抗體的吸附率為14.4％。
實(shí)施例15.取30克優(yōu)質(zhì)精制棉，加入300ml 15％NaOH水溶液，室溫下浸泡堿化2小時(shí)，除去堿液，室溫下密閉放置老化2天。在裝有堿化棉的錐形瓶中加入15ml CS2，于25℃反應(yīng)5小時(shí)，得到深紅色粘膠液。加入350ml 5％NaOH溶液稀釋纖維素粘膠液。在2000ml三口瓶中，加入氯苯800g，四氯化碳200g，油酸鉀2g。將300g粘膠液加入到三口瓶中，室溫?cái)嚢?0分鐘后升溫至90℃，保溫2.5小時(shí)。傾到出上層有機(jī)溶劑，依次用水、乙醇和水洗滌至無(wú)分散劑，標(biāo)準(zhǔn)篩篩選出粒度0.45-0.9mm的樹脂備用，約250ml。
在25ml錐形瓶中加入1.0ml球狀纖維素樹脂，3.0ml 1.25mol/L NaOH溶液和1.0ml環(huán)氧氯丙烷，30℃反應(yīng)2小時(shí)，用水洗滌至中性。活化的樹脂環(huán)氧基含量在92.6μmol/ml。
在25ml錐形瓶中加入1.0ml環(huán)氧氯丙烷活化的樹脂，3.0ml 10％L-Lys溶液，30℃反應(yīng)10小時(shí)。水洗后，加入1.0mol/L乙醇胺溶液2.0ml，室溫下反應(yīng)2小時(shí)。再用水淋洗，制得成品吸附劑，Lys配基固定量在17.6μmol/ml。吸附劑對(duì)內(nèi)毒素的吸附量為1.67EU/ml?；疾?dòng)物經(jīng)血液灌流治療后血液生化指標(biāo)改善的結(jié)果見(jiàn)表1。
表1.患病動(dòng)物經(jīng)血液灌流治療血液生化指標(biāo)改善

實(shí)施例16.采用實(shí)施例15的方法和步驟，L-Lys溶液濃度為1％，Lys固定量12.5μmol/ml。
實(shí)施例17.采用實(shí)施例15的方法和步驟，反應(yīng)時(shí)間為5小時(shí)，Lys固定量14.6μmol/ml。
實(shí)施例18.采用實(shí)施例15的方法和步驟，pH6.85的L-Lys磷酸鹽緩沖液，Lys固定量14.3μmol/ml。
實(shí)施例19.將50ml6％瓊脂水溶液加熱至90℃。將此溶液加入到由150ml甲苯，50ml三氯甲烷，1ml吐溫80組成的分散相中，攪拌0.5小時(shí)。傾出上層有機(jī)溶劑，依次用水、乙醇和水洗滌至無(wú)分散劑，標(biāo)準(zhǔn)篩篩選出粒度0.45-0.9mm的樹脂備用。
實(shí)施例20.將50ml 6％瓊脂水溶液加熱至90℃。將此溶液加入到由150ml液體石蠟和1.5ml司班80組成的分散相中，攪拌2小時(shí)。傾出上層有機(jī)溶劑，依次用水、乙醇和水洗滌至無(wú)分散劑，標(biāo)準(zhǔn)篩篩選出粒度0.45-0.9mm的樹脂備用。
實(shí)施例21.按照實(shí)施例19所得的樹脂1g，加入1ml環(huán)氧氯丙烷，2ml 1.25M NaOH溶液于30℃反應(yīng)3小時(shí)。水洗至中性。所得載體的環(huán)氧基團(tuán)含量為112.4mg/ml。
實(shí)施例22.按照實(shí)施例21的樹脂1g，加入4ml 10g/L pH＝10.87的苯丙氨酸溶液，于70℃下反應(yīng)5小時(shí)。所得吸附劑對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體的吸附量達(dá)183.8IU/g。
實(shí)施例23.按照實(shí)施例22，采用色氨酸為配基的吸附劑對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體的吸附量達(dá)155.0IU/g。
實(shí)施例24.按照實(shí)施例19所得的樹脂1g，加入1ml環(huán)氧氯丙烷，2ml 1.0M NaOH溶液于25℃反應(yīng)2小時(shí)。水洗至中性。再加入2ml pH＝9的1M乙醇胺溶液室溫下振蕩反應(yīng)6小時(shí)。產(chǎn)物用水洗滌至中性。
實(shí)施例25.取實(shí)施例24的樹脂1g，加入2ml pH＝9.2的苯丙氨酸飽和溶液，于37℃下反應(yīng)18小時(shí)。所得吸附劑可使重癥肌無(wú)力患者血清中的抗體水平下降13.0％。
實(shí)施例26.按照實(shí)施例25，采用色氨酸為配基的吸附劑可使重癥肌無(wú)力患者血清中的抗體水平下降34.53％。
實(shí)施例27.按照實(shí)施例25進(jìn)行酪胺酸的固定化。所得吸附劑對(duì)重癥肌無(wú)力抗體的吸附率為9.6％。
實(shí)施例28.按照實(shí)施例25進(jìn)行半胱胺酸的固定化。所得吸附劑對(duì)重癥肌無(wú)力抗體的吸附率為11.0％。
實(shí)施例29.按照實(shí)施例25進(jìn)行賴胺酸的固定化。所得吸附劑對(duì)重癥肌無(wú)力抗體的吸附率為11.8％。
實(shí)施例30.按照實(shí)施例25進(jìn)行谷胺酸的固定化。所得吸附劑對(duì)重癥肌無(wú)力抗體的吸附率為17.6％。
實(shí)施例31.按照實(shí)施例19制備瓊脂凝膠。取1ml濕態(tài)瓊脂載體加入2ml 1.25M NaOH溶液和1ml的環(huán)氧氯丙烷，37℃反應(yīng)2h，水洗至中性。再加入4ml 10g/L pH＝10.87的苯丙氨酸溶液，于70℃下反應(yīng)5小時(shí)。所得吸附劑對(duì)1000u/ml的腫瘤壞死因子(TNFα)血漿進(jìn)行靜態(tài)吸附，夾心法ELISA檢測(cè)吸附前后的TNFα濃度。其對(duì)TNFα的吸附率達(dá)41.2％。
實(shí)施例32.按照實(shí)施例31進(jìn)行色胺酸的固定化。吸附劑對(duì)腫瘤壞死因子的吸附率為37.1％。
實(shí)施例33.按照實(shí)施例31進(jìn)行亮胺酸的固定化。吸附劑對(duì)腫瘤壞死因子的吸附率為37.6％。
實(shí)施例34.按照實(shí)施例31進(jìn)行谷胺酸的固定化。吸附劑對(duì)腫瘤壞死因子的吸附率為32.5％。
實(shí)施例35.按照實(shí)施例31進(jìn)行谷胺胺酸的固定化。吸附劑對(duì)腫瘤壞死因子的吸附率為8.9％。
實(shí)施例36.按照實(shí)施例31進(jìn)行組胺酸的固定化。吸附劑對(duì)腫瘤壞死因子的吸附率為24.2％。
實(shí)施例37.按照實(shí)施例31進(jìn)行異亮胺酸的固定化。吸附劑對(duì)腫瘤壞死因子的吸附率為40.1％。
實(shí)施例38.按照實(shí)施例31進(jìn)行半胱胺酸的固定化。吸附劑對(duì)腫瘤壞死因子的吸附率為41.9％。
實(shí)施例39.按照實(shí)施例19制備瓊脂凝膠。取lml濕態(tài)瓊脂載體加入2ml 1.25M NaOH溶液和1ml的環(huán)氧氯丙烷，37℃恒溫振蕩反應(yīng)2h，水洗至中性。再加入10g/L的人IgG溶液，繼續(xù)反應(yīng)，IgG配基最大固定量達(dá)3524.48ug/ml gel。所得吸附劑對(duì)3000u/ml的腫瘤壞死因子(TNFα)血漿進(jìn)行靜態(tài)吸附，夾心法ELISA檢測(cè)吸附前后的TNFα濃度。其對(duì)TNFα的最大吸附容量達(dá)3586.45u/ml。
權(quán)利要求
1.一種球形氨基酸吸附劑，其特征在于它是以天然高分子為載體，粒度0.45-0.9mm，經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化后固定有效量的氨基酸配基的樹脂構(gòu)成，其中，氨基酸含量為12.5-39.7μmol/ml樹脂。
2.按照權(quán)利要求1所述的球形氨基酸吸附劑，其特征在于所述的天然高分子載體是球形纖維素、瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、阿拉伯膠、明膠或淀粉。
3.按照權(quán)利要求2所述的球形氨基酸吸附劑，其特征在于所述的載體是球形纖維素。
4.按照權(quán)利要求1所述的球形氨基酸吸附劑，其特征在于所述的配基為氨基酸、聚氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)；所述的氨基酸是精氨酸、賴氨酸、谷氨酸、谷胺酰胺、絲氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸或組氨酸；所述的聚氨基酸是聚賴氨酸；所述的多肽是2-14個(gè)氨基酸的肽；所述的蛋白質(zhì)是IgG或熱聚IgG。
5.按照權(quán)利要求4所述的球形氨基酸吸附劑，其特征在于所述的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸或賴氨酸。
6.權(quán)利要求1所述的球形氨基酸吸附劑的制備方法，其特征在于它是經(jīng)過(guò)下述步驟合成的1)制備纖維素載體的球形氨基酸吸附劑(1)精制棉或脫脂棉在室溫下用10-20％氫氧化鈉水溶液堿化1-2小時(shí)以上，除去堿液，于25-80℃條件下密封放置老化24-72h；(2)在上述堿化棉中加入棉花重量的1/3至2/3體積的二硫化碳，于25℃反應(yīng)5-10h得到橙色粘膠液，根據(jù)堿化棉花的重量用3-6％NaOH稀釋上述粘膠液至6％-15％；(3)以氯苯和油酸鉀，或/和四氯化碳為分散相，向其中加入粘膠液，升溫至80-95℃，保溫1-3h，傾出有機(jī)溶劑，依次用水、乙醇和水洗滌至無(wú)分散劑，標(biāo)準(zhǔn)篩篩選出粒度0.45-0.9mm的樹脂備用；(4)將載體置于0.5-5M NaOH溶液中，加入環(huán)氧氯丙烷，于25-60℃條件下反應(yīng)1-4小時(shí)，得到活化后的球形纖維素載體；(5)氨基酸配基的的偶聯(lián)環(huán)氧氯丙烷活化的球形載體與氨基酸在pH大于8的堿性溶液中，于25-80℃條件下反應(yīng)5-24小時(shí)。水洗后，加入乙醇胺溶液在室溫下反應(yīng)1-6h以封閉未反應(yīng)的環(huán)氧基團(tuán)，得到球形纖維素載體成品吸附劑；2)制備瓊脂、瓊脂糖、明膠載體的球形氨基酸吸附劑(1)將瓊脂、瓊脂糖或明膠加入到水中，加熱至60-90℃使之溶解，將此溶液轉(zhuǎn)移至由甲苯、三氯甲烷和吐溫80，或液體石蠟和司班80組成的分散相中，攪拌0.5小時(shí)以上至液滴分散均勻后，冷卻至室溫，傾出有機(jī)溶劑，洗滌合成的樹脂，收集粒度在0.45-0.9mm范圍內(nèi)的組份，置于水中4℃保存?zhèn)溆谩?2)采用步驟1)中的(4)和(5)，得到上述載體的球形氨基酸吸附劑。3)制備葡聚糖或淀粉載體的球形氨基酸吸附劑(1)在葡聚糖或淀粉的水溶液中加入環(huán)氧氯丙烷，以液體石蠟和司班80為分散相，堿性條件下于25-40℃反應(yīng)6-16小時(shí)。傾出有機(jī)溶劑，洗滌合成的樹脂，收集粒度在0.45-0.9mm范圍內(nèi)的組份，置于水中4℃保存?zhèn)溆谩?2)采用步驟1)中的(4)和(5)，得到上述載體的球形氨基酸吸附劑。4)制備殼聚糖或阿拉伯膠載體的球形氨基酸吸附劑(1)在殼聚糖的酸性水溶液或阿拉伯膠的水溶液中加入甲醛或戊二醛，以液體石蠟和司班80為分散相，25-60℃反應(yīng)2-24小時(shí)。傾出有機(jī)溶劑，洗滌合成的樹脂，收集粒度在0.45-0.9mm范圍內(nèi)的組份，置于水中4℃保存?zhèn)溆谩?2)采用步驟1)中的(4)和(5)，得到上述載體的球形氨基酸吸附劑。
7.按照權(quán)利要求6所述的球形氨基酸吸附劑的制備方法，其特征在于所述的二硫化碳與棉花的體積/質(zhì)量比是1-2∶3。
8.按照權(quán)利要求6所述的球形氨基酸吸附劑的制備方法，其特征在于所述的分散介質(zhì)與粘膠液的體積/質(zhì)量比是3-5∶1。
9.按照權(quán)利要求6所述的球形氨基酸吸附劑的制備方法，其特征在于所述的活化載體的環(huán)氧氯丙烷的加入量為0.5-5ml/g載體；所述的氨基酸加入量為0.001g-1g/g。
10.權(quán)利要求1所述的天然高分子為載體的氨基酸吸附劑的應(yīng)用特征在于，它可用于臨床上血液灌流療法治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無(wú)力、內(nèi)毒素血癥及感染性休克等疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種球形氨基酸吸附劑及其制備方法，它是以天然高分子為載體，粒度為0.45－0.9mm，經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化后固定有效量的氨基酸配基的樹脂構(gòu)成，其中，氨基酸含量為12.5－39.7μmol/ml樹脂。所述的配基為氨基酸、聚氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)；本發(fā)明可直接用于血液灌流法治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無(wú)力、內(nèi)毒素血癥和感染性休克，通過(guò)清除患者體內(nèi)有毒物質(zhì)達(dá)到治療目的。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，此類吸附劑無(wú)毒副作用，無(wú)熱源，是一種良好的醫(yī)用血液凈化吸附材料。
文檔編號(hào)A61M1/34GK1476908SQ0313040
公開(kāi)日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2003年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月15日
發(fā)明者俞耀庭, 王永健, 魏佼 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)