專利名稱：化合物7-羰基表雄酮對慢性輕度應(yīng)激balb/c小鼠抑郁癥的改善作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通過建立慢性輕度應(yīng)激抑郁癥模型，研究7-羰基脫氫表雄酮對抑郁抑郁癥的改善作用，涉及生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)中新藥物的開發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
世界衛(wèi)生組織曾發(fā)表過一項關(guān)于“疾病負(fù)擔(dān)”的調(diào)查，以因病造成“傷殘”——功能缺損統(tǒng)計，抑郁癥位居第二，僅次于慢性阻塞性肺部疾患，占全部疾病總負(fù)擔(dān)的6.2％；如果加上居第13位的雙相情感性疾病(躁狂——抑郁狀態(tài)交替發(fā)作)，則達8.0％。隨著現(xiàn)代化的進程，抑郁癥的重要性還將繼續(xù)增加，估計在25年后，將占疾病總負(fù)擔(dān)10％左右。從某種意義上來說，抑郁癥將是跨世紀(jì)的挑戰(zhàn)。在焦慮抑郁的發(fā)病機理上，認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)生化功能異常與之密切相關(guān)，并主要涉及NE、5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)。早在20世紀(jì)50年代，就有單胺氧化酶抑制劑(MAOIS)應(yīng)用于抑郁癥的治療，因其嚴(yán)重的毒副反應(yīng)后被三環(huán)類抗抑郁劑(TCAS)取代，TCAS療效較好，延用至今。但臨床發(fā)現(xiàn)，TCAS仍有許多使患者難以忍受而終斷使用的不良反應(yīng)。同時他們對與抑郁癥伴發(fā)的免疫功能低下和學(xué)習(xí)記憶功能障礙沒有作用。因此選擇毒副作用小，治療效果好且能改善抑郁伴發(fā)癥的化合物成為精神藥理學(xué)家追求的目標(biāo)。
發(fā)明目的通過對BALB/C小鼠使用多種以不可預(yù)見方式安排的多種應(yīng)激原，在建立與人抑郁癥相似動物模型基礎(chǔ)上，研究7-羰基脫氫表雄酮對抑郁小鼠抑郁癥狀的改善作用，并評價7-羰基脫氫表雄酮對抑郁癥并發(fā)的免疫功能低下和學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用，為7-羰基脫氫表雄酮在臨床應(yīng)用奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
內(nèi)容與要求建立慢性輕度應(yīng)激抑郁動物模型，給抑郁小鼠補充7-羰基脫氫表雄酮，測定小鼠2％蔗糖溶液飲用量變化，觀察7-羰基脫氫表雄酮對逆轉(zhuǎn)抑郁導(dǎo)致的欣快感情況。同時觀察7-羰基脫氫表雄酮抑郁小鼠自發(fā)活動的影響。結(jié)合淋巴細(xì)胞增殖實驗和自然細(xì)胞(NK)殺傷實驗分析，評價7-羰基脫氫表雄酮對抑郁導(dǎo)致免疫低下功能的影響。應(yīng)用Morris水迷宮方法，評價7-羰基脫氫表雄酮補充后，對抑郁小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
該化合物達到的技術(shù)指標(biāo)為1. 7-羰基脫氫表雄酮補充后能恢復(fù)抑郁癥小鼠減少的2％蔗糖溶液飲用量，改善抑郁小鼠欣快感缺失癥狀。
2. 7-羰基脫氫表雄酮補充后能逆轉(zhuǎn)抑郁小鼠自發(fā)活動減少，恢復(fù)小鼠自發(fā)活動。
3. 7-羰基脫氫表雄酮補充后逆轉(zhuǎn)抑郁引起的小鼠免疫功能低下，增強抑郁小鼠免疫功能。
4. 7-羰基脫氫表雄酮補充后改善抑郁小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，增強抑郁小鼠學(xué)習(xí)能力。


圖1. 7-羰基脫氫表雄酮結(jié)構(gòu)式分子式C19H27O3，分子量302.4圖2. 7-羰基脫氫表雄酮對抑郁小鼠2％蔗糖溶液飲用量Control為對照組，Stress為模型組，Stress+7OD-L為5mg/kg劑量組，Stress+7OD-H為15mg/kg劑量組。
圖3. 7-羰基脫氫表雄酮對抑郁小鼠自發(fā)活動的影響Control為對照組，Stress為模型組，Stress+7OD-L為5mg/kg劑量組，Stress+7OD-H為15mg/kg劑量組。
圖4. 7-羰基脫氫表雄酮對抑郁小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響Control為對照組，Stress為模型組，Stress+7OD-L為5mg/kg劑量組，Stress+7OD-H為15mg/kg劑量組。
圖5. 7-羰基脫氫表雄酮對抑郁小鼠T淋巴細(xì)胞Con A刺激增殖反應(yīng)的影響Control為對照組，Stress為模型組，Stress+7OD-L為5mg/kg劑量組，Stress+7OD-H為15mg/kg劑量組。
圖6. 7-羰基脫氫表雄酮對抑郁小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響Control為對照組，Stress為模型組，Stress+7OD-L為5mg/kg劑量組，Stress+7OD-H為15mg/kg劑量組。
實施例1.合成制備7-羰基脫氫表雄酮將DHEA(10g，0.0255mol)溶于12ml吡啶和8ml乙酸酐的混合溶液中，室溫下攪拌過夜。TLC法監(jiān)測反應(yīng)進行程度(展開劑為乙酸乙酯∶石油醚＝1∶3)，254nm紫外檢測后，用5％硫酸/乙醇溶液浸潤后加熱后顯色。(DHEA及3β-Acetoxyandrost-5-ene-17-one均無熒光，但能顯色。)將反應(yīng)混合物倒入100ml冰水中，用2M HCl溶液調(diào)節(jié)pH為6-7，抽濾收集析出物，并將固體物用冰水洗滌多次至濾液中性。于紅外燈箱干燥10hr。得到白色固體10.5g，m.p.171-173℃，收率為92％。重結(jié)晶(丙酮/石油醚)，得到白色結(jié)晶，m.p.172-173℃。
在三口瓶裝置回流管、冷凝管及通氣管，將2.5g N-羥基鄰苯二甲酰亞胺溶于丙酮/乙酸乙酯(1∶1)的55ml的混合溶液中，加入3β-乙酸氧DHEA 5g和偶氮環(huán)己晴0.5g。將反應(yīng)加熱回流，并持續(xù)通入空氣，并在反應(yīng)中分批加入偶氮環(huán)己晴(約每次50mg×15次)。反應(yīng)50小時后，將溶劑蒸干。加入甲苯40ml，在50℃恒溫攪拌1h后放置至室溫。過濾除去固體(N-羥基鄰苯二甲酸亞胺)，可重復(fù)使用，并用少量甲苯洗滌。將濾液用飽和的碳酸氫鈉的水溶液洗滌至水層無色。減壓除去甲苯。用硅膠層析法純化(柱5×15cm，展開劑乙酸乙酯∶石油醚＝1∶4)收集含產(chǎn)物的濾液段，得到粗品1.5g。柱層析純化(柱20×3cm，洗脫劑 石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)，收集洗脫液，濃縮，得到220mg淡黃色固體。m.p.185-187℃，收率為31％。用丙酮/甲醇重結(jié)晶，得到白色晶體，熔點186-187℃。
將約2g甾體溶于90ml甲醇中，向其中加入氫氧化鉀500mg溶于2.5ml的水溶液，反應(yīng)液室溫攪拌1小時(TLC展開劑 石油醚∶乙酸乙酯＝3∶2)。減壓除去甲醇至一半體積，倒入100ml水中，置于0℃約1小時，過濾收集固體，并用水洗滌多次，得到干燥固體1.7g。熔點檢測為212-217℃。
重結(jié)晶 先將固體溶于氯仿中，并用棉花過濾一次。將濾液收集濃縮，加入石油醚后使晶體析出，收集固體，并用少量的氯仿∶石油醚約為1∶5的液體洗滌，干燥固體，得到針狀結(jié)晶1.55g。m.p.219-222℃。結(jié)構(gòu)見圖1。
2. 7-羰基脫氫表雄酮懸液配制稱取7-羰基脫氫表雄酮，用芝麻油(Sigma公司產(chǎn)品)配制成2mg/ml和6mg/ml兩種懸液。
3.建立慢性輕度應(yīng)激抑郁癥動物模型本發(fā)明采用Monleon等建立的小鼠應(yīng)激程序并稍加改動，每周應(yīng)激程序包括以下應(yīng)激原內(nèi)容兩次食物剝奪，每次12h；兩次飲水剝奪，每次14h；兩次徹夜光照；兩次濕籠飼養(yǎng)，每次14h；兩次冰水游泳，每次5min；兩次倒懸，每次30min；兩次配對飼養(yǎng)，每次17h。上述之應(yīng)激原隨機組合實施，每天兩種應(yīng)激原處理，連續(xù)進行4周。對照小鼠也飼養(yǎng)于同樣環(huán)境中，但不接觸處理組動物和應(yīng)激原。
4.動物補充7-羰基脫氫表雄酮懸液應(yīng)激動物分為模型組、7-羰基脫氫表雄酮低劑量(5mg/kg)、7-羰基脫氫表雄酮高劑量(15mg/kg)三組。7-羰基脫氫表雄酮低劑量、7-羰基脫氫表雄酮高劑量三組小鼠每天早晨8:00按每kg體重5ml腹腔注射2mg/ml或6mg/ml 7-羰基脫氫表雄酮懸液；對照組和模型組動物腹腔注射芝麻油代替7-羰基脫氫表雄酮懸液。
5. 7-羰基脫氫表雄酮對抑郁小鼠2％蔗糖溶液飲用量的影響應(yīng)激處理4周后，先將小鼠禁食禁水3h，然后將飲用水換成2％蔗糖溶液，測定1h內(nèi)2％蔗糖溶液飲用量，并經(jīng)過體重校正。7-羰基脫氫表雄酮能增加抑郁小鼠蔗糖溶液飲用量，逆轉(zhuǎn)抑郁導(dǎo)致的欣快感缺失(圖2)。
6. 7-羰基脫氫表雄酮對抑郁小鼠自發(fā)活動的影響4周慢性應(yīng)激處理結(jié)束后，在安靜環(huán)境中將各組BALB/C小鼠分別放入小鼠自發(fā)活動箱內(nèi)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制)，觀察7-羰基脫氫表雄酮對抑郁小鼠自發(fā)活動的影響。7-羰基脫氫表雄酮能增加抑郁小鼠自發(fā)活動(圖3)。
7. 7-羰基脫氫表雄酮對抑郁小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響水迷宮實驗在自發(fā)活動測定后進行。水迷宮裝置包括一直徑90cm的圓桶及運動視頻捕捉系統(tǒng)組成(北京杰日歐科技公司產(chǎn)品)。實驗開始前，向桶內(nèi)注入清水，水深15cm，調(diào)節(jié)水溫20℃，然后在桶內(nèi)放置一直徑7cm圓形實臺，臺面沒水1cm左右，用碳素墨水將水調(diào)黑，以免動物看到實臺。開啟水迷宮測試程序，標(biāo)定捕捉視野、實臺、虛臺及入水點等參數(shù)，將動物頭朝桶壁放入水中。小鼠在桶中自由游動尋找實臺，水桶上方的視頻系統(tǒng)捕捉其泳動軌跡。第一次實驗時，如果小鼠在120s內(nèi)找到實臺并在臺上停留2s，將小鼠迅速取出，用毛巾擦干放回飼養(yǎng)籠；如果小鼠在120s未能找到實臺，將小鼠放置臺上15s，然后取出擦干放回籠中。水迷宮實驗共進行3天，每天上午下午各進行一次。7-羰基脫氫表雄酮能增強抑郁小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力(圖4)。
8. 7-羰基脫氫表雄酮對抑郁小鼠T淋巴細(xì)胞Con A刺激增殖能力的影響自發(fā)活動測定結(jié)束后，將小鼠斷頭處死。按常規(guī)制備小鼠脾臟單細(xì)胞懸液在96孔培養(yǎng)板每孔加入細(xì)胞懸液(2×106個/ml)100μl和Con A 2μg/ml，對照孔用完全培養(yǎng)基代替Con A。實驗和對照均設(shè)4復(fù)管。培養(yǎng)板置37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)72h，培養(yǎng)終止前8h，每孔加入37kBq3H-TdR(放射比活度0.93TBq·mmol-1)，隨后于細(xì)胞收集器上收獲細(xì)胞，濾膜烘干，加入5ml液閃液置于液閃計數(shù)儀上測定。7-羰基脫氫表雄酮能增強抑郁小鼠T淋巴細(xì)胞對Con A刺激的增殖能力(圖5)。
9. 7-羰基脫氫表雄酮對抑郁小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度4×106個ml-1，以小鼠淋巴瘤YAC-1細(xì)胞為靶細(xì)胞，在96孔培養(yǎng)板上每孔加入75μl脾細(xì)胞懸液，按效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞＝50∶1加入75μl YAC-1靶細(xì)胞懸液，另設(shè)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞對照。每孔150μl，設(shè)4平行管，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)10h，采用MTT法測定A值。7-羰基脫氫表雄酮能增強抑郁小鼠NK細(xì)胞殺傷活性(圖6)。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及合成的能改善慢性輕度應(yīng)激小鼠抑郁癥狀的化合物7-羰基表雄酮，其特征在于分子量302.4，分子式為C19H27O3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之7-羰基表雄酮，其特征在于能顯著增加抑郁小鼠蔗糖溶液飲量，逆轉(zhuǎn)欣快感缺失；能顯著增加抑郁小鼠自發(fā)活動，從而改善小鼠抑郁癥狀。改善抑郁癥小鼠伴發(fā)的免疫功能紊亂及學(xué)習(xí)記憶下降。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述之7-羰基表雄酮，其特征在于可以作為新的抗抑郁藥候選藥物，并可作為抑郁癥伴發(fā)的免疫功能低下的免疫增強劑和學(xué)習(xí)記憶障礙的促進劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個合成的化合物7－羰基脫氫表雄酮。該化合物可以在慢性輕度應(yīng)激抑郁動物模型上增加抑郁小鼠蔗糖溶液飲用量，增加抑郁小鼠自發(fā)活動，具有抗抑郁作用。此外，7－羰基脫氫表雄酮可以使抑郁癥導(dǎo)致的免疫低下功能增強，改善抑郁癥小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。7－羰基脫氫表雄酮可用于抑郁癥及抑郁癥引起的免疫功能低下和學(xué)習(xí)記憶下降的侯選藥物。
文檔編號A61P25/00GK1552331SQ0312385
公開日2004年12月8日 申請日期2003年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月4日
發(fā)明者左萍萍, 劉雁勇, 楊楠 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所