專利名稱：一種治療性乙型肝炎的疫苗制劑、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療性乙型肝炎的疫苗制劑、制備方法及其用途，具體是指采用基因重組技術(shù)，通過酵母發(fā)酵的乙肝表面抗原制劑，屬于生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
慢性乙型肝炎(CHB)是我國的常見病、多發(fā)病，而探索其治療方法，主要從以下幾個方面入手抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能、護肝(促進肝細胞再生)、抗肝纖維化，防止癌變等，但抗病毒治療是攻克本病的關(guān)鍵，這已形成共識。目前國內(nèi)外公認的抗HBV藥物是干擾素-α(IFN-α)和拉米呋啶。IFN-α的抗病毒機理包括免疫調(diào)節(jié)和直接抗病毒作用，而拉米呋啶則為抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，兩者的治療適應(yīng)癥均為SALT升高的HBsAg、HBeAg、HBV DNA陽性病人。IFN-α的常規(guī)應(yīng)用為3～5mL，3/周×6個月，HBV DNA及HBeAg陰轉(zhuǎn)、SALT復(fù)常者僅為30％左右，尚有副作用較多的缺點。拉米呋啶為核苷類似物，國內(nèi)臨床應(yīng)用已有幾年，能使血清HBV DNA迅速降低，有效率達90％，但停藥后HBV又重新復(fù)制，反跳率達80％，且HBeAg陰轉(zhuǎn)率很低，在用藥6個月以上病例，容易出現(xiàn)P基因區(qū)“YMDD”變異。拉米呋啶的作用機制是抑制逆轉(zhuǎn)錄酶，阻斷由mRNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA的第一條鏈及由第一條鏈合成的第二條鏈，從而抑制病毒復(fù)制。但由于其對病毒復(fù)制的原始模板共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)并無影響，且對mRNA轉(zhuǎn)譯為各種病毒蛋白(包括HBeAg)也無作用，因此，決定了該藥不能徹底清除HBV。最近，國外又報道新的嘌呤類核苷類似物—阿地福韋雙脂，已在臨床試驗，對拉米呋啶治療出現(xiàn)YMDD變異而耐藥的病人有效，推薦劑量為10mg/d，但劑量＞30mg/d時可引起腎毒性。由于IFN-α及拉米呋啶對SALT正常的CHB患者(無癥狀HBV攜帶者)的臨床療效無顯著性差異，已有學者將此類型病人列為不適合治療對象，這使眾多的CHB病人感到失望。但是否HBV攜帶者必須等待發(fā)展至肝細胞的免疫損害、SALT升高時才進行治療呢？這是當前肝病研究者不能回避的一個重要問題。
目前公認的抗病毒藥物之所以被限定于慢性乙肝轉(zhuǎn)氨酶升高病例(免疫清除期)，究其原因并非完全歸于感染病毒類型的不同(HBV基因型)或出現(xiàn)病毒的變異，而在很大程度上與患者處于免疫應(yīng)答的不同狀態(tài)(完全免疫耐受或部分免疫耐受)有關(guān)，從而導(dǎo)致抗病毒藥物不能發(fā)揮作用，假如我們能夠深入研究慢性乙肝患者不同階段的免疫應(yīng)答狀態(tài)，并預(yù)先進行免疫調(diào)節(jié)治療，恢復(fù)或啟動免疫應(yīng)答機制，同時聯(lián)合抗病毒藥物的應(yīng)用，可能會提高臨床治療效果，這也是值得我們當前應(yīng)該積極探索的問題。
2000年6月在日本召開的亞太國際肝病學術(shù)會議上已形成共識，把慢性乙肝免疫病理分為三個連續(xù)階段，即免疫耐受期、免疫清除期和病毒殘留期。這是HBV感染后，由宿主T細胞介導(dǎo)的感染肝細胞表面所表達的抗原決定簇在不同階段的免疫反應(yīng)的結(jié)果，在臨床上，可根據(jù)這三種不同時期的免疫應(yīng)答而制訂相應(yīng)的治療方案和措施，有可能更有利于機體清除HBV感染和促進肝細胞功能的恢復(fù)。
SALT正常而HBV DNA高水平復(fù)制者可視為處于免疫耐受期，免疫耐受期患者的免疫系統(tǒng)對病毒的高度耐受，呈現(xiàn)高滴度的血清HBeAg和HBV DNA，而宿主T細胞不產(chǎn)生免疫應(yīng)答，故在臨床上不出現(xiàn)肝病體征、癥狀和肝功能損傷，由于處于免疫不應(yīng)答狀態(tài)，對任何抗病毒治療療效均很差。有的學者主張此時期不適應(yīng)或不需要抗病毒治療，即等待患者演變或進入免疫清除期才進行治療。
而SALT明顯升高或反復(fù)波動，HBV中度復(fù)制可視為宿主免疫系統(tǒng)已識別并開始攻擊肝靶細胞，得以清除HBV而在一定程度可導(dǎo)致肝細胞損傷，即免疫清除期。免疫清除期患者由于對免疫耐受逐漸減弱，出現(xiàn)HBeAg、HBV DNA滴度下降，血清SALT水平升高，提示宿主已出現(xiàn)免疫應(yīng)答，不斷清除感染的肝細胞內(nèi)的HBV。臨床實踐已證明此時期是抗病毒治療的最佳時間。
病毒殘留期則為未被清除HBV整合形成潛在感染，正常SALT，低水平病毒復(fù)制。
目前已有充分實驗資料及臨床證據(jù)提示，CHB患者存在不同程度的免疫耐受，其具體表現(xiàn)為DC及T細胞的功能不足。
乙型肝炎病毒(HBV)感染慢性化的主要原因是宿主細胞免疫功能缺陷，對HBV產(chǎn)生了不同程度的免疫耐受。雖然已有一些抗HBV藥物，但HBV的最終清除要依靠機體的主動免疫。因而尋找免疫調(diào)節(jié)藥物，增強細胞免疫應(yīng)答，上調(diào)特異性免疫，主動清除HBV是治療CHB的重要環(huán)節(jié)。目前國內(nèi)外研制的特異性免疫調(diào)節(jié)藥物主要有HBsAg疫苗、HBsAg/前S2疫苗、HBsAg復(fù)合疫苗和HBV DNA疫苗等，這些疫苗多以HBsAg為主要免疫原。
國內(nèi)應(yīng)用乙肝疫苗治療CHB已有多年歷史，早在“七.五”、“八.五”期間已提出乙肝疫苗聯(lián)合豬苓多糖的治療方案。但多年來對乙肝疫苗的臨床應(yīng)用缺乏規(guī)范化，治療劑量、療程均不統(tǒng)一，總的來說是劑量偏小，療程偏短，并沒有達到促進或恢復(fù)免疫調(diào)節(jié)的作用。因此，研制一種既能對HBV起到良好的預(yù)防作用，又能用來治療HBV感染引起的疾病的疫苗，成為國內(nèi)外疫苗療法研究的方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種治療性乙型肝炎的疫苗制劑，該制劑可誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答而有利機體清除HBV，能增加Balb/c小鼠的細胞免疫功能，促Th1類細胞因子高水平表達，提高特異性T細胞增殖的水平，同時促進特異性CTL活性的提高。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種治療性乙型肝炎的疫苗制劑的制備方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種治療性乙型肝炎的疫苗制劑的用途。
本發(fā)明的一種治療性乙型肝炎的疫苗制劑，其特征在于包括重組(酵母)乙肝疫苗(HBsAg)40～80μg/ml，含鋁0.5mg/ml。
本發(fā)明的一種治療性乙型肝炎的疫苗制劑的其余成分為生理鹽水。
本發(fā)明的一種治療性乙型肝炎的疫苗制劑，優(yōu)選為重組(酵母)乙肝疫苗(HBsAg)60～80μg/ml，含鋁0.5mg/ml。
其中最優(yōu)選的為重組(酵母)乙肝疫苗(HBsAg)60μg/ml，含鋁0.5mg/ml。
本發(fā)明的一種用于治療性乙型肝炎疫苗制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟a)選用表達乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的酵母工程菌，菌種經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵后采集得細胞懸液；b)從細胞中提取抗原，并將抗原進行初步純化得澄清抗原；c)澄清抗原經(jīng)疏水層析純化，得純III型抗原；d)純III型抗原經(jīng)稀釋、除菌過濾得無菌抗原，將無菌抗原合并液經(jīng)滅活吸附，得疫苗原液，即得成品。
其中步驟b)所述的初步純化包括細胞破碎、過濾、通過硅膠處理去除親脂性雜質(zhì)。
本發(fā)明硅膠處理過程中，可將硅膠沉淀經(jīng)磷酸溶液洗滌2～3次，用硼酸鈉溶液洗脫，超濾并離心后得澄清抗原；步驟c)所述的疏水層析純化是將抗原在疏水層析柱上吸附和解析。所述的疏水層析柱可采用丁基瓊脂糖。
步驟d)所述的滅活吸附為先經(jīng)福爾馬林處理再經(jīng)氫氧化鋁原位吸附，即加入1∶40福爾馬林至終濃度為100μg/ml，加熱至34～38℃，保溫24～96小時，再冷卻到2～8℃，得到滅活抗原；按0.085ml/g的滅活抗原的比例加0.2～0.3M硫酸鉀鋁溶液，用1N氫氧化鈉調(diào)PH值為7.0～7.2，攪拌2～3小時，得到汞前PH抗原；然后沉降18～24小時，棄去上清液，再用生理鹽水清洗3次后，將清洗液加生理鹽水至滅活吸附前的體積，最后加防腐劑進行攪拌得疫苗原液，所述的防腐劑為硫柳汞，所得疫苗原液的抗原濃度為40～80μg/ml，即為成品。
所得成品中含鋁濃度為0.5mg/ml。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)、發(fā)酵、采集和提取抗原為本領(lǐng)域公知技術(shù)。
醫(yī)學上已證實，過多的注射鋁對人體有害，因此本發(fā)明采用了新的制備方法，在提高疫苗抗原濃度的同時，并不改變鋁在成品中的濃度，即本發(fā)明的一種用于治療性乙型肝炎疫苗制劑中鋁的含量不變，也就是雖然增加了抗原的注射量，但鋁的量并未增加。而且經(jīng)表面抗原吸附實驗證明該濃度的鋁含量能保證表面抗原的完全吸附。
根據(jù)患者的不同程度的免疫耐受狀態(tài)，可將本發(fā)明所述乙肝疫苗制劑與不同的藥物進行組合，形成不同組合物進行治療。
比如針對患者在免疫清除期的免疫耐受狀態(tài)，可采用如下組合物進行治療本發(fā)明的一種含有治療性乙型肝炎疫苗的組合物，其特征在于包括乙型肝炎疫苗制劑和抗病毒藥物，其中所述的抗病毒藥物可為拉米呋啶和/或干擾素-α。乙型肝炎疫苗制劑含量為40～80μg，所述的拉米呋啶為90×30～110×30mg，所述的干擾素-α為12×3萬單位～12×5萬單位。
該組合物還包括護肝藥物，比如促肝細胞生長素，所述的促肝細胞生長素80×30～160×30mg。
該組合物進一步還可包括綠膿桿菌制劑注射液或胸腺肽，所述的綠膿桿菌制劑注射液0.8×4～1×4ml，所述的胸腺肽120×4～160×4mg。
針對患者免疫耐受期的免疫耐受狀態(tài)，可采用如下組合物進行治療本發(fā)明的一種含有治療性乙型肝炎疫苗的組合物，其特征在于包括乙型肝炎疫苗制劑、胸腺肽和黃芪注射液，其中乙型肝炎疫苗制劑含量為40～80μg，胸腺肽120×4～160×4mg，黃芪注射液為35×4～40×4ml。
在免疫耐受期也可采用包括乙型肝炎疫苗制劑、綠膿桿菌制劑和胸腺肽的組合物，其中乙型肝炎疫苗制劑含量為40～80μg，所述的綠膿桿菌制劑注射液0.8×4～1×4ml，所述的胸腺肽120×4～160×4mg。
為了使臨床療效更明顯，本發(fā)明所述的組合物中的各種組分可分別進行包裝，分別對患者進行給藥，進行治療。
本發(fā)明的一種治療性乙型肝炎的疫苗制劑在制備治療慢性乙型肝炎及HBV攜帶者藥劑中的應(yīng)用。
按患者免疫應(yīng)答狀態(tài)將CHB分為三個不同階段，亦即免疫耐受期、免疫清除期、病毒殘留期，根據(jù)不同的應(yīng)答狀態(tài)，可采用含有本發(fā)明所述乙肝疫苗制劑的不同組合物進行治療。
CHB的免疫病理特點及免疫應(yīng)答分期，提示患者存在不同程度的免疫耐受狀態(tài)。因此，恢復(fù)或啟動免疫應(yīng)答功能可能是抗HBV治療獲得成效的重要前提，而恢復(fù)細胞免疫功能則要依賴免疫療法。免疫療法系指通過特異性和非特異性免疫治療，使患者上調(diào)或恢復(fù)特異性DC及T細胞功能，對HBV抗原產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答，從而為配合抗病毒藥物抑制或清除HBV創(chuàng)造條件。免疫療法是以促進和活化體內(nèi)DC及T細胞為始動，上調(diào)恢復(fù)細胞免疫應(yīng)答為過渡，清除肝內(nèi)HBV為目的。
針對現(xiàn)狀，采用免疫辯證方法指導(dǎo)臨床治療，按患者免疫應(yīng)答狀態(tài)將CHB分為三個不同階段，亦即免疫耐受期、免疫清除期、病毒殘留期，據(jù)此而制定相應(yīng)不同的治療方案；采用針對性的聯(lián)合用藥方案，廢棄單用抗病毒藥的輪換戰(zhàn)術(shù)，病毒復(fù)制指標采用定量分析，如HBV DNA采用熒光PCR方法，HBeAg和HBsAg應(yīng)用免疫分析定量法(雅培試劑)。以上的改進措施落實在以下的CHB抗病毒“三結(jié)合”方案上。
抗HBV治療“三結(jié)合”方案是指免疫療法與抗病毒藥物相結(jié)合；特異性免疫治療與非特異性免疫治療相結(jié)合；增強DC與T細胞功能的藥物相結(jié)合?！叭Y(jié)合”治療方案是根據(jù)急性乙型肝炎免疫應(yīng)答過程、步驟和HBV被清除的各個環(huán)節(jié)而提出來的，其主要內(nèi)容是積極調(diào)動內(nèi)因，促進和活化DC及T細胞功能，通過調(diào)節(jié)和恢復(fù)機體細胞免疫功能，并發(fā)揮以非細胞溶解為主的清除HBV機制，配合使用抑制HBV復(fù)制的藥物(如拉米呋啶或干擾素)，達到完全清除肝內(nèi)HBV。本方案的免疫療法應(yīng)包括特異性免疫治療和非特異性免疫治療，而特異性免疫治療系指能產(chǎn)生特異性細胞免疫應(yīng)答的治療性乙肝疫苗，非特異性免疫治療包括多組分胸腺肽、胸腺肽α1、IL-2、綠膿桿菌制劑和其它免疫調(diào)節(jié)劑以及與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的中草藥，如黃芪注射液和當歸注射液等。特異性免疫治療以促進DC功能為主，非特異性免疫治療以促進T細胞功能為主。本發(fā)明是以發(fā)揮免疫療法和抗病毒藥物療法各自的優(yōu)點，體現(xiàn)抗病毒治療的多途徑、多位點、主動和被動、抑制加清除等綜合因素，以清除肝內(nèi)HBV為總目的，達到臨床治療上的高效和低復(fù)發(fā)。
特異性免疫治療主要指治療性乙肝疫苗，包括HBV DNA疫苗、多肽疫苗、HBsAg復(fù)合物疫苗和HBsAg蛋白疫苗(前S2基因和S基因蛋白疫苗)，對CHB免疫清除期、SALT明顯增高的病例，兩者可聯(lián)合應(yīng)用，而對免疫耐受期病例，本發(fā)明認為應(yīng)先進行免疫療法(治療性乙肝疫苗+免疫調(diào)節(jié)劑，如胸腺肽靜脈點滴、IL-2肌注)3～6個月，當患者細胞免疫功能恢復(fù)到正常應(yīng)答狀態(tài)后，再進行抗病毒藥物治療，不僅使后者更好發(fā)揮抗病毒效果，而且可減少停藥后HBVDNA反跳。
1.免疫耐受期治療原則先應(yīng)用免疫療法3～6個月后，再應(yīng)用抗病毒治療。
免疫療法方案乙肝疫苗+胸腺肽+黃芪注射液或乙肝疫苗+綠膿桿菌制劑+胸腺肽乙肝疫苗60μg，肌注，每月一次×12月胸腺肽120mg加入10％葡萄糖液，靜滴，每周3次×3～6個月，或胸腺肽40mg，肌注，每周2～3次×3～6個月黃芪注射液40ml加入10％葡萄糖液，靜滴，每周3次×2～3個月綠膿桿菌制劑注射液1ml，皮下注射，每周一次×3～6個月抗病毒藥物IFN-α或拉米呋啶(常規(guī)劑量及用法IFN-α3萬～5萬單位，肌注，每周3次，拉米呋啶100mg，口服，每天1次)2.免疫清除期治療原則免疫療法+抗病毒藥物+護肝方案乙肝疫苗+綠膿桿菌制劑注射液或胸腺肽+IFN-α或拉米呋啶+促肝細胞生長素3.病毒殘留期乙肝疫苗60μg，肌注，每月一次×12～24個月。
本發(fā)明所述的治療性乙型肝炎的疫苗制劑可誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答而有利機體清除HBV，能增加Balb/c小鼠的細胞免疫功能，促進Th1類細胞因子高水平表達，提高特異性T細胞增殖的水平，同時促進特異性CTL活性的提高。采用本發(fā)明的制備方法提高了單批產(chǎn)量，在不影響產(chǎn)品質(zhì)量的前提下提高了配制工序的生產(chǎn)能力，而且在提高疫苗濃度的同時，保持了鋁稀釋劑在成品中的濃度，減少了鋁稀釋劑對人體的毒副作用。本發(fā)明所述的治療性乙型肝炎的疫苗制劑可用于治療慢性乙型肝炎及HBV攜帶者。


圖1為實施例3用藥前后對照組與HBsAg疫苗組血清中HBsAg含量比較圖具體實施方式
下面實施例進一步描述本發(fā)明，但所述實施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
實施例1本實施例涉及乙型肝炎疫苗(HBsAg)急性毒性實驗研究1材料與方法1.1儀器與藥品、稀釋劑治療性乙肝疫苗每支1ml，含HBsAg 60μg，含鋁0.5mg，批號T010702、鋁稀釋劑含鋁0.5mg/ml、日立7020自動生化分析儀、AC920EO血球分析儀(瑞典)、ELISA檢測儀及試劑(美國HELIX)。
1.2實驗動物清潔級SD大鼠、SPF級NIH小鼠均由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。大鼠體重為200-240克，小鼠雌20-23克，雄23-27克。健康食蟹猴由廣東省順德實驗動物研究所提供，年齡2-3歲。
1.3小鼠急毒實驗方法NIH小鼠按性別體重隨機分為三組，即注射用生理鹽水組(0.5ml/只)，治療性乙肝疫苗組(0.5ml/只)，鋁稀釋劑組(0.5ml/只)。每組10只，雌雄各半。皮下給藥后立即觀察動物的反應(yīng)情況，并繼續(xù)觀察4周，在第7、14、21、28天稱量動物體重，于給藥后28天取血檢測生化指標(ALT、AST、BUN、Crea、GLU、GGT)。處死動物，進行剖檢，取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺，稱重。
1.4大鼠急毒實驗方法取SD大鼠隨機分為三組，即注射用生理鹽水組(1ml/只)，治療性乙肝疫苗組(1ml/只)，鋁稀釋劑組(1ml/只)。余下方法同小鼠急毒實驗。
1.5小鼠長毒實驗方法取NIH小鼠160只，分為高劑量組(12μg/只)、中劑量組(6μg/只)、低劑量組(3μg/只)，生理鹽水對照組，每組30只。另設(shè)兩個衛(wèi)星組高劑量組(12μg/只)，生理鹽水對照組，每組20只，供免疫學檢測用。頸背部皮下每天一次，連續(xù)3周，停藥后觀察4周。檢測指標參考文獻[4]，分為一般觀察、血液學檢測、血液生化學檢測、病理學檢查、組織學檢查、恢復(fù)期觀察、系統(tǒng)解剖觀察及稱臟器重量及計算臟器系數(shù)。對于免疫學指標檢測分別取兩個衛(wèi)星組雌雄動物各5只的血樣，檢測抗-HBs及其亞型IgG2a，檢測時間為末次給藥后第二天及恢復(fù)期結(jié)束。
1.6猴長毒實驗方法取24只食蟹猴隨機分為4組，雌雄各半。高劑量組(42μg/Kg)，中劑量組(21μg/Kg)，低劑量組(10.5μg/Kg)，注射用生理鹽水對照組。皮下給藥每天一次，連續(xù)21天，停藥后連續(xù)觀察4周。檢測指標參考文獻，基本上同小鼠長毒實驗檢測項目，增加心電圖、尿液、免疫學檢測。
2結(jié)果2.1小鼠急毒實驗結(jié)果動物的外觀、活動未見異常變化及死亡。各組動物體重均有增加，沒有顯著性差異(P＞0.05)；各組間食量沒有顯著性差異(P＞0.05)。四周后用0.5％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉取血，檢測血生化指標(ALT、AST、BUN、Crea、GLU、GGT)，各組間沒有顯著性差異(P＞0.05)；肉眼剖檢各組未見異常，心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺的重量和臟器系數(shù)各組間沒有顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論小鼠注射治療性乙肝疫苗的LD50＞30μg/只。
2.2大鼠急毒實驗結(jié)果與小鼠急毒實驗檢測指標的結(jié)果基本相同，在增加的血液學指標中(紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、血小板、白細胞計數(shù)及分類)也沒有顯著性差異。只是治療性乙肝疫苗組肝臟臟器的重量和系數(shù)比生理鹽水組，差異有顯著性(P＜0.05＝，其它臟器無顯著差異。結(jié)論大鼠注射治療性乙肝疫苗的LD50＞30μg/只。
2.3小鼠長毒實驗結(jié)果一般觀察實驗期間，各組動物外觀、行為活動未見異常，食量及體重增加無顯著性差異(P＞0.05)。給藥組第三周起個別動物注射部位有硬結(jié)。
血液學檢查末次給藥后24小時，高劑量組雌性動物的白細胞計數(shù)與空白對照組比較，有非常顯著減少(P＜0.01)，中劑量組雄性動物的白細胞計數(shù)與空白對照組比較，有顯著性減少(P＜0.05＝，但都沒有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，且在正常范圍內(nèi)波動；給藥組雌性動物的血紅蛋白量與空白對照組比較，有顯著性減少(P＜0.05)，其中高劑量組有非常顯著性減少(P＜0.01)，并有一定的劑量反應(yīng)。其它血液學指標與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。
停藥后4周(即首次給藥后49天)，高劑量級雌性動物的紅細胞計數(shù)升高，與空白對照組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)。其它血液學指標與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。
血液生化學檢查末次給藥后24小時(即首次給藥后21天)，低劑量組雌性動物的血糖(GLU)水平升高，與空白對照組比較，有非常顯著意義(P＜0.01)，但沒有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，并在正常參考值范圍內(nèi)；中劑量級雌性動物的總膽固醇(TCHO)水平升高，與空白對照組比較，差異有非常顯著性意義(P＜0.01)；中劑量雄性動物有兩只丙氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)明顯升高(分別為183和138U/L)，其它血液生化學指標與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。
停藥后4周(即首次給藥后49天)，高劑量組有一只雄性動物的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)較高(210U/L)，高劑量雌性和低劑量雄性的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)升高，與空白對照組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)。
病理學檢查末次給藥后24小時(即首次給藥后21天)及停藥后4周(即首次給藥后49天)，各組動物的主要器官均末見明顯病理性改變，但頸背部有硬結(jié)的動物解剖見皮下有黃豆大小的黃色硬結(jié)。
臟器重量及臟器系數(shù)末次給藥后24小時(即首次給藥后21天)，中低劑量組雄性動物的肝臟重量和臟器系數(shù)增大，與空白對照組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)；給藥各組動物脾臟的臟器重量和臟器系數(shù)增大，其中高劑量的臟器重量、低劑量的雌與雄的臟器重量和臟器系數(shù)與空白對照組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)。給藥組其他的臟器重量及臟器重量及臟器系數(shù)與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。
停藥后4周(即首次給藥后49天)，給藥各組的主要臟器重量及臟器系數(shù)與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。
組織學檢查末次給藥后24小時(即首次給藥后21天)組織學檢查，心臟在給藥組與空白對照組均出現(xiàn)輕微出血，且無明顯差異。高劑量組肝臟以肝細胞輕到中度顆粒變性和空泡變性為主，偶見輕微小灶性壞死，空白對照組病變以肝細胞顆粒變性為主，但程度稍輕。高劑量組腎臟可見間質(zhì)出血，偶見炎性細胞浸潤和腎小管管型，腎小球病變均不明顯，空白對照組與給藥組病變類似。高劑量組和空白對照組多數(shù)以肺泡毛細胞血管充血、出血及輕度的間質(zhì)性肺炎為主，且程度相似。高劑量組和空白對照組脾白髓均可見濾泡輕度增生。高劑量組多數(shù)可見腸道粘膜下層淋巴細胞浸潤。中低劑量組肝臟以輕度到中度的顆粒變性為主，側(cè)有間質(zhì)的炎性細胞浸潤。腎臟可見間質(zhì)出血，偶有炎性細胞浸潤，腎小管和腎小球病變不明顯。綜上所述，高劑量組除引起注射部位輕微炎性反應(yīng)外，未發(fā)現(xiàn)與藥物毒性相關(guān)的其它特征性病變。中、低劑量組也未見與藥物毒性相關(guān)的其它特征性病變。
停藥后4周(即首次給藥后49天)組織學檢查，心臟在高劑量與空白對照組均出現(xiàn)輕度出血和炎性細胞浸潤，且無明顯差異。高劑量組肝臟以輕度到中度的顆粒變性為主，未見明顯炎性反應(yīng)和壞死，空白對照組病變也以輕度的顆粒變性為主，但程度較輕。高劑量組和空白對照組多數(shù)以肺泡毛細胞血管充血、出血和輕度的間質(zhì)性肺為主，且程度相似。高劑量組和對照組脾白髓可見濾泡輕度增生。高劑量組注射部位偶見輕度水腫和炎性細胞浸潤。中低劑量組肝臟以輕度的顆粒變性為主，偶有間質(zhì)的炎性細胞浸潤。腎臟可見間質(zhì)出血，腎小管和腎小球病變不明顯。綜上所述，高劑量組僅引起輕微的肝細胞顆粒變性和腎間質(zhì)的出血外，未發(fā)現(xiàn)與藥物毒性相關(guān)的其它特征性病變。中、低劑量組也未見與藥物毒性相關(guān)的其它特征性病變。
綜上所述，在本試驗條件下給藥組第三周起有個別動物頸背部皮下(注射部位)有硬結(jié)，臨床長期使用時應(yīng)引起注意。給藥組動物可對受試疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，血清中可檢到對應(yīng)的抗體，部分動物可檢測到IgG2a；停藥后4周，抗HBs仍存，IgG2a水平升高，陽性率升高。劑量達6μg/只(約相當于300μg/kg，單次劑量給為單次人臨床擬用量的300倍，以體表面積計，約為單次人臨床擬用理的24倍)，可對動物的肝功能有一定的影響。未見明顯的遲發(fā)性毒性反應(yīng)。
本品多次給予小鼠(連續(xù)21次)的最大無毒作用劑量為3μg/只(約相當于150μg/kg，單次劑量約為單次人臨床擬用量的150倍；以體表面積計，約為單次人臨床擬用量的12倍)。
2.4猴長毒實驗結(jié)果一般觀察試驗期間，各組動物外觀、行為活動未見異常，未見死亡；在給藥第15天，高、低劑量組各有一只動物的大腿內(nèi)側(cè)皮膚出現(xiàn)紅斑，持續(xù)3天后消退；給藥組的動物體重及體溫變化不大，與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。
抗體檢測結(jié)果抗體和補體試驗前、給藥3周、恢復(fù)期結(jié)束，各給藥組猴血清的IgM、IgG、IgA、C3水平與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)抗HBs給藥后2、3周，各給藥組猴血清中均可檢測出高水平的抗HBs，與空白對照組比較，差異有非常顯著性意義(P＜0.01)；給藥食蟹猴的抗HBs陽性率，與空白對照組比較，差異有非常顯著性意義(P＜0.01)。停藥后4周，給藥食蟹猴血清中可檢測出較高水平的抗HBs陽性率，與空白對照組比較，差異有非常顯著性意義(P＜0.01)。
心電圖檢測給藥前、給藥3周及停藥后4周，各組動物心電圖均為竇性心律，各項指標均在正常范圍內(nèi)；各給藥組動物的各項心電圖指標與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。
血液學檢查給藥3周，給藥組動物的白細胞計數(shù)升高，與空白對照組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)；高、中劑量組的血小板升高，與空白對照組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)；其它血液學指標與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。停藥后4周，給藥組動物的血液學指標與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。
血液生化學檢查給藥3周，高劑量組動物的ALT、AST、BUN、LDH升高，ALB下降，與空白對照組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)；中劑量的TP下降，與空白對照組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)，但沒有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系；其中血液生化指標與空白對照組比較，差異無顯著意義(P＞0.05)。停藥后4周，給藥組動物的血液生化學指標與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。
尿常規(guī)檢查給藥前、藥期3周及恢復(fù)期4周，各組動物尿常規(guī)的各項指標均在正常范圍內(nèi)，給藥組與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)；尿蛋白、亞硝酸鹽、紅細胞、白細胞等指標各組動物均出現(xiàn)個別的陽性，無劑量反應(yīng)關(guān)系，且空白對照組也有類似的情況，故實際意義不大。
病理學檢查系統(tǒng)解剖給藥后3周及停藥后4周，各組動物的主要器官均未見明顯病理性改變。
臟器重量及臟器系數(shù)給藥后3周及停藥后4周，各給藥組動物的臟器重量及臟器系數(shù)與空白對照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。
組織學檢查給藥后3周，心臟在給藥組與空白對照組均出現(xiàn)輕度出血和炎性細胞浸潤，且無明顯差異。高劑量組肝臟以肝細胞輕到中度顆粒變性為主，偶見輕微炎性細胞浸潤和點狀壞死；中低劑量組也以輕度的顆粒性為主，壞死和血管的變化不明顯；空白對照組病變以輕度的肝細胞顆粒變性為主，但程度稍輕，其余病變不明顯。高劑量組腎臟主要表現(xiàn)為間質(zhì)出血，偶見腎小管變性和管型，腎小球的病變不明顯；中低劑量組與此類似，但程度較輕；空白對照組以間質(zhì)的出血性炎癥為主，其它病變不明顯。給藥組肺部多數(shù)以不同程度的間質(zhì)性肺炎為主，其它病變少見；空白對照組與此類似，但程度較低。給藥組和空白對照組脾白髓均可見局部濾泡輕度增生。給藥組胃腸道常見淋巴細胞等炎性細胞浸潤性增生，且隨劑量降低而減輕；空白對照組胃腸道的炎性反應(yīng)較輕。此外，高劑量組注射部位可見輕度水腫和炎性細胞浸潤，中低劑量組也有類似變化。綜上所述，高劑量組除引起輕度的肝細胞變性、腎小管的輕微變性、腸道有炎性細胞增生性變化以及引起注射部位輕微炎性反應(yīng)外，未發(fā)現(xiàn)與藥物毒性相關(guān)的其它特征性病變。
停藥后4周，心臟在給藥組與空白對照組均出現(xiàn)輕度出血和炎性細胞浸潤，且無明顯差異。給藥組(高、中、低劑量組)肝臟以肝細胞輕到中度顆粒變性為主，壞死和血管的變化不明顯；空白對照組病變以輕度有肝細胞顆粒變性為主，但程度稍輕，其余病變不明顯。高劑量組腎臟主要表現(xiàn)為間質(zhì)出血，偶見腎小管變性和管型，腎小球的病變不明顯；中低劑量組與此類似，但程度較輕；空白對照組以間質(zhì)的出血性炎癥為主，其它病變不明顯。給藥組肺部多數(shù)以不同程度的間質(zhì)性肺炎為主，其它病變少見；空白對照組與此類似，但程度較輕。給藥組和空白對照組脾白髓均可見局部濾泡輕度增生。高劑量組胃腸道常見淋巴細胞等炎性細胞浸潤性增生，中、低劑量組反應(yīng)輕微；空白對照組胃腸道的炎性反應(yīng)不明顯。綜上所述，高劑量組除引起輕度的肝細胞變性、腸道的炎性細胞增生性變化，未發(fā)現(xiàn)與藥物毒性相關(guān)的其它特征性病變。
3.討論在小鼠長毒實驗中給藥組第三周起有個別動物頸背部皮下(注射部位)有硬結(jié)，臨床長期使用時應(yīng)引起注意。給藥組動物可對受試疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，血清中可檢到對應(yīng)的抗體，部分動物可檢測到IgG2a；停藥后4周，抗HBs仍存，IgG2a水平升高，陽性率升高。劑量達6μg/只(約相當于300μg/kg，單次劑量給為單次人臨床擬用量的300倍，以體表面積計，約為單次人臨床擬用量的24倍)，可對動物的肝功能有一定的影響。未見明顯的遲發(fā)性毒性反應(yīng)。本品多次給予小鼠(連續(xù)21次)的最大無毒作用劑量為3μg/只(約相當于150μg/kg，單次劑量約為單次人臨床擬用量的150倍；以體表面積計，約為單次人臨床擬用量的12倍。
在食蟹猴長毒實驗中，給藥組動物可對受試疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，高、低劑量組各有一動物出現(xiàn)皮膚紅斑，血清中可檢到對應(yīng)的抗體，血白細胞計數(shù)升高。劑量過42μg/kg(約為人臨床擬用劑量的42倍)；以體面積計，約為單次人臨床擬用量的17倍)經(jīng)皮下注射給予食蟹猴(每天一次，連續(xù)3周)，對肝、腎功能指標有一定的影響，停藥后可恢復(fù)。提示臨床試驗進行監(jiān)測病人的肝、腎功能。未見明顯的遲發(fā)性毒性反應(yīng)。本品對食蟹猴的最大無毒作用劑量為21μg/kg(約為人臨床擬周量的21倍；以體面積計，約為單次人臨床擬用量的8倍)。
總之，本實驗結(jié)果提示本發(fā)明乙型肝炎疫苗在擬定的臨床方案中是安全的。
實施例2本實施例涉及乙型肝炎疫苗(HBsAg)對小鼠細胞免疫應(yīng)答的影響1.1.材料重組(酵母)乙型肝炎疫苗[Recombinant Hepatitis B Vaccine(yeast)，以下均簡稱RHBV]，每支1ml，主要含重組(酵母)HBsAg亞單位60μg，溶劑均用鋁稀釋劑0.5mg/ml(深圳康泰生物制品股份有限公司產(chǎn)品)。實驗動物用6～8周齡的SPF級別Balb/c小鼠，雌雄各半，體重16～18g(購自華中科技大學同濟醫(yī)院實驗動物部)。主要試劑和儀器有RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma公司)，小牛血清(四季青生物公司)，氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR，北京原子能研究所)，IL-2，IFN-γ檢測試劑盒(深圳晶美生物工程公司)，乙型肝炎表面抗體檢測試劑盒(上海實業(yè)科華生物技術(shù)公司)，HRP標記羊抗鼠(Serotec公司)，特異性HBsAg-T細胞表位短肽(賽百盛生物工程公司)，P815細胞(中科院上海細胞所)，乳酸脫氫酶檢測試劑盒(Sigma公司)，液體閃爍儀(Beckman公司)，全自動酶標儀550型(Bio-RAD公司)。
2.2.方法(1)分組和給藥方法設(shè)RHBV單次免疫和加強免疫(在單次免疫后4周時進行)兩組，均采用右下肢肌肉注射給藥。于單次免疫后4周和加強免疫后2周分別觀察RHBV對鼠T淋巴細胞增殖，IL-2、IFN-γ及抗HBs IgG2a產(chǎn)生的影響。并觀察加強免疫后對CTL活化的影響。每大組均隨機分為以下四組，每組鼠數(shù)見各表。
空白對照組注射同量生理鹽水RHBV低劑量組注射RHBV 30/μg/kg(0.5μg/只)/次RHBV中劑量組注射RHBV 90/μg/kg(1.5μg/只)/次RHBV高劑量組注射RHBV 270/μg/kg(4.5μg/只)/次(2)檢測方法①無菌取小鼠脾臟，置1640培養(yǎng)基中制備細胞懸液，2000r/min離心30min后棄上清，加0.75％NH4Cl 2ml，3min時加1640培養(yǎng)基至10ml，1500r/min離心5min，棄上清，加10％小牛血清1640培養(yǎng)基1ml，調(diào)整細胞終濃度5×106/ml，加入培養(yǎng)板200ul/孔。實驗孔加終濃度為5μg/ml的無鋁佐劑的HBsAg疫苗(17μl/孔)，對照孔加等量生理鹽水，一式三復(fù)孔，此后分二份操作。一份置37℃、5％CO2培養(yǎng)56h，每孔加3H-TdR 20μl，繼續(xù)同法培養(yǎng)16h后用細胞收集儀將細胞收集于玻璃纖維濾紙上，濾紙片干燥后置測量瓶中，加入2ml閃爍液，用液閃儀測定每分鐘脈沖數(shù)(cpm)。以每分鐘脈沖數(shù)代表淋巴細胞增殖程度。②另一份，37℃、5％CO2培養(yǎng)48h，收集上清200μl/管，凍存于-20℃冰箱待測。檢測嚴格按IL-2、IFN-γ檢測試劑盒使用說明書操作，用酶標儀讀取各孔OD值，在標準曲線上核算出IL-2和IFN-γ濃度值。以上兩項實驗統(tǒng)計學用SPSS10.0分析軟件進行方差齊性檢驗，因方差不齊均用秩和檢驗。③抗HBs IgG2a檢測時，先將小鼠待測血清加入96孔培養(yǎng)板，50μl/孔(空白孔不加)，37℃30min后洗板5次，每孔加入1∶4000HRP標記的羊抗鼠IgG2a，37℃30min時，再洗板5次后加顯色劑，用酶標儀讀各孔OD值。以空白對照作為陰性對照，樣品OD值/陰性對照OD平均值≥2.1判為陽性，陰性對照OD值＜0.05按0.05計算，高于0.05按實際OD值計算，統(tǒng)計學采用X2檢驗。④CTL功能檢測采用乳酸脫氫酶(LDH)分析法[3]取小鼠脾淋巴細胞，用含5μg/ml特異性短肽的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，第二天加IL-2 1000U/ml、ConA5μg/ml。至淋巴細胞成簇生長，有多個核淋巴細胞時，收集、計數(shù)、調(diào)整細胞數(shù)至106/ml，作為CTL反應(yīng)的效應(yīng)細胞。胰酶消化對數(shù)生長期的P815細胞，用含10μg/ml短肽的1640培養(yǎng)液懸浮P815細胞，培養(yǎng)過夜。加絲裂霉素至25μg/ml，溫育45min，用1640培養(yǎng)基洗滌4次后觀察。若細胞成活率在95％以上，調(diào)整細胞數(shù)至104/ml，作為CTL反應(yīng)的靶細胞。按效應(yīng)細胞∶靶細胞1000∶1比例，加入96細胞培養(yǎng)板，并補加1640培養(yǎng)基至100μl，同時設(shè)靶細胞的最大釋放孔以10％Triton X-100代替效應(yīng)細胞；自然釋放孔以1640代替效應(yīng)細胞；培養(yǎng)基本底只含100μl培養(yǎng)基；校正本底含100μl培養(yǎng)基及10％的Triton X-100。每個樣本作3個重復(fù)孔。4h后觀察靶細胞，若最大釋放孔靶細胞未完全破壞，再加TritonX-100至20％，待靶細胞完全破壞，200g離心2min，吸出上清，與LDH反應(yīng)液反應(yīng)20min后，加入終止液，在酶標儀492波長上讀取每孔OD值，檢出特異性CTL活化過程中LDH釋放量。按下式計算特異CTL釋放率自然釋放自然釋放—培養(yǎng)基的本底最大釋放最大釋放—校正本底自然釋放率自然釋放/最大釋放最大釋放率最大釋放/培養(yǎng)基的本底校正的最大最大釋放/校正本底特異CTL釋放率(試驗—自然釋放—培養(yǎng)基的本底)/(最大釋放—自然釋放)。
計算特異CTL釋放率，＞60％者為有特異性CTL活化統(tǒng)計學處理特異性CTL活化鼠數(shù)量組間差別用Fisher’s確切概率法檢驗。
結(jié)果分析1.1不同劑量RHBV對小鼠T淋巴細胞增殖的影響見表1表1不同劑量RHBV對小鼠T淋巴細胞增殖影響(X±S)分組鼠數(shù)3H-TdR(cpm)(只) 單次免疫后4周 加強免疫后2周空白對照組 12702.5±184.6 559.1±307.8RHBV低劑量組121132.3±593.7 1265.3±186.7**RHBV中劑量組122449.4±989.5**2884.4±352.7**RHBV高劑量組121980.5±971.5**2076.6±253.5**與空白對照組比**P＜0.01結(jié)果提示RHBV中、高劑量免疫小鼠后，T淋巴細胞3H-TdR摻入量比對照組顯著增高(P均＜0.01)；加強免疫后增高更明顯，且低劑量組也有顯著增高(P＜0.01)。
2.2不同劑量RHBV誘生小鼠Il-2、IFN-γ的比較見表2表2不同劑量RHBV誘生小鼠IL-2、IFN-γ的比較(X±S)分組 鼠數(shù) 單次免疫后4周 加強免疫后2周(只) IL-2(pg/ml) (pg/ml)L-2(pg/ml) IFN-γ(pg/ml)空白對照組125.48±8.888.22±8.61 5.75±5.04 3.63±4.42RHBV低劑量組12 9.28±6.98 9.89±9.34102.53±67.52*28.33±13.04*RHBV中劑量組12 28.53±14.32*20.27±15.50*177.13±91.12**59.66±25.75**RHBV高劑量組12 64.69±20.88*30.77±22.12*332.10±124.31**80.73±19.30**與空白對照組比*P＜0.05**P＜0.01結(jié)果提示中、高劑量RHBV單次免疫后四周，T淋巴細胞產(chǎn)生IL-2和IFN-γ顯著增多(P均＜0.05)。加強免疫后，兩者增高更顯著(P均＜0.01)，且低劑量組IL-2、IFN-γ濃度增高也有顯著意義(P均＜0.05)。
3.3.不同劑量RHBV對小鼠抗HBs IgG2a產(chǎn)生的影響見表3表3不同劑量RHBV對小鼠抗HBs IgG2a產(chǎn)生的影響(X±S)分組鼠數(shù) 抗HBs IgG2a陽轉(zhuǎn)率(只) 單次免疫后4周 加強免疫后2周空白對照組 240/24(0％) 0/24(0％)RHBV低劑量組248/24(33.3％) 15/24(62.5％)ΔRHBV中劑量組2420/24(83.3％)**22/24(91.7％)RHBV高劑量組2422/24(91.7％)**24/24(100％)*與低劑量組比P＜0.01 Δ與單次免疫比P＜0.05結(jié)果提示RHBV單次免疫后4周，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生與細胞免疫有關(guān)的抗HBs亞類IgG2a，中劑量與高劑量組陽轉(zhuǎn)率顯著高于低劑量組(P＜0.01)，加強免疫后，低劑量組陽轉(zhuǎn)率明顯高于單次免疫(P＜0.05)。
4.4.不同劑量RHBV對小鼠特異性CTL活化的影響見表4表4不同劑量RHBV免疫6周時對小鼠CTL活化的影響(％)分組鼠數(shù)(只) 特異性TCL活化鼠量空白對照組 100/10(0％)RHBV低劑量組106/10(60％)**RHBV中劑量組106/10(60％)**RHBV高劑量組9 5/9(56％)****與空白對照組比P＜0.01，高劑量組用藥4周時，死亡1只鼠，原因不明。
結(jié)果提示HBIR免疫小鼠達到一定劑量時，可使部分鼠特異性CTL釋放率＞60％，達到特異性CTL活化。
實施例3本實施例涉及乙型肝炎疫苗(HBsAg)對HBV基因小鼠HBV標志的影響1.材料和方法1.1HBsAg疫苗深圳康泰生物制品股份有限公司提供，批號T010702，每支1ml，含重組(酵母)HBsAg亞單位60μg，溶劑均用鋁稀釋劑(0.5mg/ml)，批號A010621。
1.2實驗動物HBV轉(zhuǎn)基因小鼠SPF級，合格證為粵檢證字2002A001號，雌雄各半，體重16～18克。本中心自行構(gòu)建，飼養(yǎng)繁殖。
1.3主要檢測試劑 HBsAg EIA檢測試劑盒上海實業(yè)科華生物技術(shù)有限公司，HBsAg固相快速法定量藥盒中國原子能研究院同位素研究所，HBsAg免疫組化試劑Dako公司，美國公司HBV DNA熒光定量PCR試劑盒美國AmgGen公司1.4小鼠分組及給藥方法選HBsAg陽性HBV轉(zhuǎn)基因小鼠30只，分為兩組，鋁稀釋劑對照組15只，HBsAg疫苗組15只，劑量為300μg/Kg，用鋁稀釋劑稀釋至200μl，每周皮下注射1次，12周改為每2周注射1次，24周后又改為每4周注射1次，注射前采血，注射后每4周采血1次，分離血清，置-20℃保存檢測定量HBsAg和HBV DNA含量。36周時各處死8只，取肝組織，用常規(guī)免疫組化法，檢測肝組織HBsAg表達。
1.5統(tǒng)計學處理球型檢驗，廣義線性模型重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析2.結(jié)果表5用藥前后兩組小鼠血清中HBsAg含量比較(X±S，ng/ml)組別 n 用藥前 3個月 6個月9個月對照組 15806±246.2 915.2±288.3 859.8±236.1 832.1±251.1HBsAg161010±352.2 812.7±302.6 748.3±318.9 619.4±368.6疫苗組球型檢驗P＜0.01，表明時間與用藥有交互作用多元方差分析(1)時間效應(yīng)P＜0.01，表明用藥前后有不同；(2)時間×分組II III表5與圖1結(jié)果提示用藥前兩組小鼠血清中HBsAg含量無明顯差別，有可比性。接種HBsAg疫苗后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清中HBsAg含量雖在3個月時降低不明顯，但6個月時明顯降低，9個月時顯著降低；而鋁稀釋劑未使HBV轉(zhuǎn)基因鼠血清中HBsAg含量降低。
2.2肝組織HBsAg免疫組化檢測結(jié)果表明用藥9個月時HBsAg疫苗組肝組織HBsAg表達量少于對照組。
2.3血清中HBV DNA檢測結(jié)果表6用藥前后對照組與HBsAg疫苗組血清中HBV DNA含量比較

結(jié)果提示HBsAg疫苗可降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中HBV DNA的復(fù)制和表達。
實施例4本實施例涉及HBsAg疫苗對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠細胞免疫調(diào)節(jié)的影響1.材料1.1實驗藥品基因重組(酵母)乙肝疫苗(含HBsAg，60μg/ml/支；含鋁0.5mg/ml/支，批號T010702)。鋁稀釋劑含鋁0.5mg/ml/支(批號A010621)。
1.2實驗動物HBV轉(zhuǎn)基因小鼠由本中心自行構(gòu)建、飼養(yǎng)、繁殖。
1.3主要試劑3H-TdR(1mci/ml)購自中國原子能研究所；PPO，POPOP購自廣州醫(yī)藥公司；小鼠IL-2、IFNγ檢測的ELISA試劑盒購自Med Systems DiagnosisGmbH，Vienna。
2.方法2.1不同免疫次數(shù)的實驗動物分組及免疫方案取8周齡雌性HBV轉(zhuǎn)基因小鼠32只，隨機分為兩組，每組16只，對照組每只注射鋁稀釋劑200μl，乙肝疫苗組每只注射用鋁稀釋劑稀釋的HBsAg 200μl(含HBsAg 6μg)。一周后每組各處死8只，檢測細胞因子及T細胞增殖，余下的動物每周同法注射一次，12周后改為2周一次，24周后改為4周一次，8個月后處死作同法檢測。
2.2不同免疫劑量的實驗動物分組及按常規(guī)免疫取130只HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為兩大組，每組65只。第一大組又隨機分為5組鹽水組，鋁稀釋劑組，乙肝疫苗低劑量組(0.6μg/只)，中劑量組(1.8μg/只)，高劑量組(5.4μg/只)。初次免疫后9周處死小鼠進行細胞因子誘生實驗。第二大組分組及免疫劑量同上，只是免疫方案改為經(jīng)初次免疫4周后，加強免疫一次，同樣于初次免疫后9周處死小鼠進行細胞因子誘生實驗。
2.3細胞因子誘生實驗取受檢小鼠脫頸椎處死，取脾，按常規(guī)制備濃度為5×106/ml的細胞懸液，分別加入24孔培養(yǎng)板(1ml/孔)，加不含鋁佐劑HBsAg疫苗刺激(5μg/ml)，37℃、5％CO2培養(yǎng)48h后，收集培養(yǎng)上清置于-20℃待檢。
2.4T淋巴細胞增殖實驗取5×106/ml脾淋巴細胞，加入U型96孔培養(yǎng)板(200ul/孔)，實驗孔加不含鋁佐劑的HBsAg疫苗(5μg/ml)，對照孔加等量生理鹽水，同一實驗為一式三分復(fù)管，置37℃、5％CO2培養(yǎng)56h后，每孔加3H-TdR 20μl，繼續(xù)同法培養(yǎng)16h后，用細胞收集儀將細胞取集于玻璃纖維濾紙上，濾紙片充分干燥后置測量瓶中，加入2ml閃爍液，用液閃儀測定每分鐘脈沖數(shù)(cpm)。
3.結(jié)果3.1HBV轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)不同免疫次數(shù)后Th1類細胞因子水平的比較表7.兩組小鼠經(jīng)免疫1周及8個月后誘生細胞因子的水平對比(pg/ml)1周8個月分組 動物數(shù)IL-2 IFNγ IL-2 IFNγ鋁佐劑 8 100.9±65.2 25.6±32.7 163.8±138.3 142.5±52.5疫苗 8 156.1±78.7 58.3±49.5 462.4±122.5**976.1±544.1**注**P＜0.01
表7結(jié)果說明，免疫一周時疫苗組與鋁佐劑組所誘生的Th1類細胞因子(IL-2、IFNγ)的水平有增高的趨勢，但無顯著性。而免疫8個月后疫苗組的IL-2、IFNγ的水平較鋁佐劑組有顯著增加，分別是鋁佐劑組的2.8倍和6.8倍，與一周時所誘生的IL-2、IFNγ水平相比也同樣有顯著性升高，分別是2倍和17倍。而免疫8個月后鋁佐劑組的IL-2的水平較一周時無顯著性變化，但IFNγ的水平提高了近5倍。
3.2不同免疫次數(shù)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠T細胞增殖水平的比較表8、免疫1周及8個月HBV轉(zhuǎn)基因小鼠T細胞增殖水平的結(jié)果組別 n一周(cpm，x±s) 8個月(cpm，x±s)鋁劑組 86478.71±3365.73 5866.21±4407.36乙肝疫苗組 85329.14±3086.03 10077.2±8574.02*注*P＜0.05表8結(jié)果表明免疫8個月后，乙肝疫苗組的T細胞增殖顯著高于鋁劑組，同樣顯著高于免疫1周時的疫苗組。但一周時兩組T細胞增殖無顯著性差別?？梢奣細胞增殖的結(jié)果與細胞因子的檢測結(jié)果是一致的。
3.3不同劑量的乙肝疫苗按計劃免疫誘生IL-2的水平比較表9不同劑量的乙肝疫苗計劃免疫誘生IL-2的水平比較

表9結(jié)果說明按常規(guī)免疫后無論單次免疫還是加強免疫，各劑量組之間及其與鋁佐劑和鹽水組的IL-2的水平都無顯著差別。說明單次免疫后9周及9周內(nèi)免疫兩次不足以顯著激發(fā)免疫耐受小鼠的細胞免疫應(yīng)答。
實施例5本實施例涉及含有治療性乙型肝炎疫苗的組合物對CHB的抗病毒治療的研究一、病例選擇病例來源均為中國人民解放軍第四五八醫(yī)院肝炎?？崎T診和部份住院病人，觀察時間自2000年10月～2002年10月。診斷符合2000年9月第十次全國病毒性肝炎會議修訂的診斷標準。觀察CHB病例分為免疫耐受期、免疫清除期、殘余整合期(2)。根據(jù)三種不同免疫應(yīng)答狀態(tài)制定不同治療方案，觀察病例按2∶1比例，隨機分為治療組和對照組。
本組分期標準免疫耐受期ALT基本正常，高復(fù)制水平HBeAg和HBV DNA。
免疫清除期ALT反復(fù)異常，即在正常值1倍以上、10倍以下、中等或低復(fù)制水平的HBeAg和HBV DNA。
殘余整合期ALT恢復(fù)正常，HBsAg仍陽性，但無HBeAg及HBV DNA復(fù)制。
觀察病例基本情況見表9表9兩組病人的基本情況

二、藥物1.重組(酵母)乙型肝炎疫苗系由重組酵母表達的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)經(jīng)純化、加佐劑吸附后制成，每安瓿1.0ml，HBsAg含量10μg，深圳康泰生物制品股份有限公司生產(chǎn)提供。
2.佰安注射液。系含I、II、IV型菌毛的綠膿桿菌經(jīng)殺滅后制成，濃度為每毫升含菌18億±10％混懸液水針劑。每安瓿1ml。海南微克西藥業(yè)有限公司生產(chǎn)提供。
3.胸腺肽注射液免疫調(diào)節(jié)藥，每安瓿2ml含20mg，肌注或靜脈點滴。廣東宏遠集團藥業(yè)有限公司生產(chǎn)提供。
4.拉米呋啶葛蘭素—史克公司生產(chǎn)提供。
三、治療分組和方法1.治療組 免疫療法聯(lián)合拉米呋啶。特異性免疫療法采用乙肝疫苗，而非特異性免疫治療分別用胸腺肽、佰安注射液。
具體方案(1)免疫耐受期先進行免疫療法3～6個月，繼而應(yīng)用拉米呋啶抗病毒治療6～12個月。
免疫療法所用特異免疫制劑為乙肝疫苗40～80μg，肌注，每月一次×12月。非特異性制劑為胸腺肽40mg，肌注，每周二次×6個月或胸腺肽120mg加入10％葡萄糖液250ml，靜滴，每周3～5次×3個月。其后3個月改為胸腺肽40mg肌注。佰安注射液，2ml，皮下注射，每周1～2次×3～6個月。
(2)免疫清除期免疫療法聯(lián)合拉米呋啶同時應(yīng)用。方法同免疫耐受期。
(3)殘余整合期單用特異性免疫療法—乙型肝炎疫苗，每月一次×12個月。
2.對照組 免疫耐受期及免疫清除期均單用拉米呋啶，療程同治療組。殘留整合期未設(shè)對照組。
四、實驗檢查及判斷血清ALT按賴氏法。HBsAg及HBeAg定量分析采用全自動快速微粒子酶免分析系統(tǒng)1MX檢測HBsAg、HBeAg滴度。儀器及試驗盒均為美國雅培公司產(chǎn)品，實際可檢測滴度范圍為0.5～800.0 S/N，滴度＞2.1為陽性。
HBV DNA定量檢測使用AG-9600熒光DNA分析檢測儀，采用美國Biotronics公司生產(chǎn)的熒光標記法HBV DNA定量試劑盒進行定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測。實際檢測HBV DNA含量范圍在104至1011拷貝/ml之間。
結(jié)果一、免疫清除期治療效果治療組34例，其中應(yīng)用乙肝疫苗6～19月，平均12.7月，拉米呋啶6～15個月，平均10.6月，胸腺肽3～8個月，平均5.2月。
1.對ALT影響表10兩組治療對ALT影響

2.對HBeAg影響表11兩組治療對HBeAg影響

*P＜0.053.對HBV DNA影響表12兩組治療對HBV DNA影響

4.對HBsAg影響治療組和對照組于治療前后均未發(fā)現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)病例。
二、免疫耐受期治療效果治療組觀察42例，其中應(yīng)用乙肝疫苗42例(6～19個月，平均13.0月)；胸腺肽40例(3～12個月，平均7個月)，佰安30例(4～8個月，平均6.3月)，拉米呋啶42例(6～15個月，平均11.0月)。
1.對ATL影響治療組42例，在治療過程中出現(xiàn)短暫ALT升高10例(23.8％)，約持續(xù)4～6周后恢復(fù)正常，對照組未出現(xiàn)此現(xiàn)象。
2.對HBeAg影響表13兩組治療對HBeAg影響

*P＜0.053.對HBV DNA影響表14兩組治療對HBV DNA影響

*P＜0.054.對HBsAg影響治療組與對照組于治療前后均未發(fā)現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)病例。
三、殘留整合期治療效果本組12例患者，應(yīng)用乙型肝炎疫苗60&micro；g，肌注，每月一次共連續(xù)12個月，未采用其它抗病毒藥或免疫調(diào)節(jié)劑，治療期間每隔3個月檢測HBsAg滴度，于治療9～12個月后，HBsAg滴度較治療前下降1/3以上者5例，但未見陰轉(zhuǎn)病例，其余7例未見變化。
討論對慢性乙肝免疫耐受期的42例患者應(yīng)用免疫療法3～6個月后，再進行拉米呋啶抗病毒治療(平均13個月)，HBeAg陰轉(zhuǎn)率、HBeAg/抗HBe血清轉(zhuǎn)換率和HBV DNA陰轉(zhuǎn)率分別為26.2％、19.1％和54.8％，較單用拉米呋啶對照組HBeAg陰轉(zhuǎn)率4.8％、血清轉(zhuǎn)換率為0％和HBV DNA陰轉(zhuǎn)率28.6％有明顯提高，P＜0.05，提示免疫療法對免疫耐受期病人提高免疫應(yīng)答率有一定作用。
治療前ALT水平＜2倍及＞2倍以上病例各為17例。ALT＜2倍者HBeAg陰轉(zhuǎn)率為29.4％(5/17)，ALT＞2倍以上者為82.4％(14/17)。兩組比較差異非常顯著，P＜0.01。提示治療前ALT升高病例確與免疫應(yīng)答率明顯相關(guān)。對免疫清除期治療組與對照組比較，治療組HBeAg陰轉(zhuǎn)率明顯高于對照，P＜0.05。提示免疫療法有助于提高臨床療效。
實施例6本實施例涉及治療性乙型肝炎的疫苗制劑的劑量研究。
一、動物實驗結(jié)果根據(jù)實施例2的研究結(jié)果，不同劑量的乙肝疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的細胞免疫效果，無論是T淋巴細胞增殖實驗、誘生小鼠IL-2、IFN，還是小鼠抗HBsAg IgG2a的影響，中劑量組(1.5ug/只)與高劑量組(4.5ug/只)都比對照組和低劑量組有顯著性增高，而兩者之間無顯著性差異。另外，根據(jù)小鼠長期毒性實驗結(jié)果，反復(fù)給藥后最大無毒劑量為3ug/只，因此，太高的劑量不僅沒有能明顯地提高細胞免疫功能，反而會帶來毒副作用。在小鼠實驗中1.5ug/只的劑量是合適的。
二、治療性乙肝疫苗治療慢性乙型肝炎臨床研究(一)病例選擇1.診斷標準參照2000年9月，西安中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》標準。
1)病原學診斷標準臨床符合慢性肝炎，血清HBsAg陽性，或兼并有一種以上HBV感染標志陽性(HBeAg，抗HBe，抗HBc，HBV-DNA)。
2)臨床診斷病史超過半年，目前仍有肝炎癥狀、體征及肝功能異常者，診斷為慢性肝炎。發(fā)病日期不明或雖無肝炎病史，但影像學、腹腔鏡或肝活體組織病理檢查符合慢性肝炎改變或根據(jù)癥狀、體征、化驗綜合分析亦可做出相應(yīng)判斷。
2.癥狀、體征分級脘腹脹滿0分無1分偶有腹脹，程度輕2分經(jīng)常腹脹，尚可忍受，可自行緩解3分持續(xù)腹脹，難以忍受，難以自行緩解倦怠乏力0分無1分稍倦，不耐勞力2分倦怠較甚，可堅持輕體力勞動3分四肢無力，勉強支持日常活動脅肋疼痛0分無1分偶爾痛，程度輕2分經(jīng)常痛，疼痛尚能忍受3分時常痛，疼痛難以忍受納差0分無1分較正常，食量略有減少2分較正常，食量減少近二分之一3分較正常，食量減少二分之一以上惡心0分無1分偶有，癥狀較輕2分經(jīng)常惡心，尚可忍受3分頻頻惡心，難以忍受3.入選病例標準1)符合慢性乙型肝炎的診斷標準。
2)HBsAg、HBeAg、HBV-DNA持續(xù)陽性6個月以上。
3)SALT升高超過正常值2.0倍(即賴氏120單位)，最高值6.0倍(賴氏240單位)以內(nèi)。
4)年齡在20-50歲之間。
5)男、女不限。
6)自愿參加臨床試驗，已簽署知情同意書者。
4.排除病例標準1)不符合上述診斷標準者。
2)年齡在20歲以下或50歲以上。
3)妊娠或哺乳期婦女。
4)已知對本藥組成成分過敏者。
5)合并心血管、肺、腎及造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾病、精神障礙患者。
(二)試驗方法1、分組方法治療組病例數(shù)為每個劑量100例，對照組病例數(shù)為100例，可為住院病人和門診病人，按受試者的就診順序發(fā)給相應(yīng)藥物編碼的藥。
藥品來源治療組藥物名稱治療性乙肝疫苗來源深圳康泰生物制品股份有限公司規(guī)格60μg/支，40μg/支，80μg/支。
對照組藥物名稱治療性乙肝疫苗安慰劑(注射用生理鹽水)來源深圳康泰生物制品股份有限公司規(guī)格1ml/支用藥方法治療組藥物治療性乙肝疫苗用法肌肉注射(前臂三角肌)用藥劑量每次60μg，第1、2次注射為每隔2周1次，從第3次開始為每4周1次，連續(xù)5次，總劑量為注射7次。
對照組藥物治療性乙肝疫苗安慰劑(注射用生理鹽水)用法肌肉注射(前臂三角肌)用藥劑量每次60μg，第1、2次注射為每隔2周1次，從第3次開始為每4周1次，連續(xù)5次，總劑量為注射7次。
5.療程24周為一療程，停藥后兩組均隨訪6個月6.觀察項目及觀察指標(1)、安全性觀測
①、一般體格檢查。
②、血、尿、便常規(guī)化驗。
③、心電圖。
④、腎功能檢查(BUN、Cr)。
(2)、療效性觀測④、臨床癥狀脘腹脹滿，倦怠乏力，脅肋疼痛，納呆，惡心。
②、體征肝脾觸診③、血清膽紅素測定、ALT、AST、總蛋白(TP)、A/G檢測；④、血清病原學檢測HBsAg，抗-HBs，HBeAg，抗HBe，抗-HBc，抗-HBc-IgM(以上用ELISA)。測定HBV-DNA(熒光PCR法)。
注測定HBV-DNA需留1.5ml的血清。
(3)、觀察指標及時間點①、癥狀、體征初診，用藥后每個月各觀察記錄1次，隨訪3、6個月各記錄1次，共記錄9次。
②、一般理化檢查及安全性檢查治療前、用藥3個月、以及用藥6個月后、各做1次，共3次。
③、肝功能治療于治療前、用藥3個月、以及用藥6個月后、隨訪3個月、6個月各做1次，共5次。
④、血清病原學檢查于治療前、用藥3個月、以及用藥6個月后、隨訪3個月、6個月各做1次，各做1次，共5次。
(三)療效標準本藥物療效判斷均分顯效、有效、無效三項。
1.病毒學應(yīng)答顯效HBV DNA(熒光PCR)于治療后陰轉(zhuǎn)者。
有效未達顯效標準，但定量下降大于2個對數(shù)級者。
無效未達到上述標準者，停藥后出現(xiàn)反跳者，另統(tǒng)計反跳率。
2.血清免疫學應(yīng)答顯效HBeAg于治療后陰轉(zhuǎn)者。
有效未達到顯效標準，但HBeAg定量下降，較治療前下降50％以上者。
無效未達到上述標準者。
3.綜合評價標準顯效(1)自覺癥狀消失。
(2)肝脾腫大縮小或穩(wěn)定不變者，其它慢肝體征減輕或穩(wěn)定不變。
(3)肝功能檢查ALT恢復(fù)正常。
(4)乙型肝炎病人乙肝病毒復(fù)制標記物轉(zhuǎn)陰。
(5)一般健康狀況好轉(zhuǎn)，能勝任原職工作。
上述指標穩(wěn)定6個月者。
有效(1)自覺癥狀好轉(zhuǎn)或消失。
(2)肝脾腫大及其它慢肝體征穩(wěn)定不變。
(3)肝功能檢查，ALT恢復(fù)正常。
(4)乙型肝炎病人血清乙肝病毒復(fù)制標記物轉(zhuǎn)陰。
上述指標穩(wěn)定6個月者。
無效未達到上述標準者。
(四)結(jié)果40ug治療組中顯效為4例，有效為6例，總有效率為10％。60ug治療組中顯效為10例，有效為15例，總有效率為25％。80ug治療組中顯效為11例，有效為15例，總有效率為26％。對照組中顯效為1例，有效為2例，總有效率為3％。從以上結(jié)果來看，治療組與對照組比較有顯著性差異，而且高、中劑量組與低劑量比較同樣有顯著性差異，但高、中劑量組比較無顯著性差異。綜合以上動物實驗的結(jié)果，臨床選擇60ug/劑是切實可行的，而且是最佳的。
實施例7選用表達乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的酵母工程，菌種采用常規(guī)方法，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵后采集得細胞懸液；然后從細胞中提取抗原，并將抗原進行細胞破碎、勻漿，經(jīng)孔徑為0.45μm的過濾器過濾后，再經(jīng)超濾并濃縮，加入硅膠溶液，保溫3小時，3600rpm離心25分鐘，將硅膠沉淀經(jīng)磷酸溶液洗滌3次，用硼酸鈉溶液洗脫，超濾并離心后得澄清抗原；澄清抗原經(jīng)丁基瓊脂糖疏水層析柱上吸附和解析，得純III型抗原；純III型抗原經(jīng)稀釋、除菌過濾得60μg/ml無菌抗原；將無菌抗原合并液加入1∶40福爾馬林至終濃度為100μg/ml，加熱至36℃，保溫24小時，再冷卻到4℃，得到滅活抗原；按0.085ml/g的滅活抗原的比例加0.21M硫酸鉀鋁溶液，用1N氫氧化鈉調(diào)PH值為7.2，攪拌2小時，得到汞前PH抗原；然后沉降24小時，棄去上清液，再用生理鹽水清洗3次后，將清洗液加生理鹽水至滅活吸附前的體積，最后加硫柳汞防腐劑進行攪拌得60μg/ml疫苗原液，即為成品；其中重組(酵母)乙肝疫苗(HBsAg)60μg/ml，含鋁0.5mg/ml。
實施例8選用表達乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的酵母工程，菌種采用常規(guī)方法，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵后采集得細胞懸液；然后從細胞中提取抗原，并將抗原進行細胞破碎、勻漿，經(jīng)孔徑為0.45μm的過濾器過濾后，再經(jīng)超濾并濃縮，加入硅膠溶液，保溫2.5小時，3000rpm離心30分鐘，將硅膠沉淀經(jīng)磷酸溶液洗滌2次，用硼酸鈉溶液洗脫，超濾并離心后得澄清抗原；除菌抗原經(jīng)丁基瓊脂糖疏水層析柱上吸附和解析，得純III型抗原；純III型抗原經(jīng)稀釋、除菌過濾得40μg/ml無菌抗原；將無菌抗原合并液加入1∶40福爾馬林至終濃度為100μg/ml，加熱至36℃，保溫76小時，再冷卻到6℃，得到滅活抗原；按0.085ml/g的滅活抗原的比例加0.22M硫酸鉀鋁溶液，用1N氫氧化鈉調(diào)PH值為7.0，攪拌3小時，得到汞前PH抗原；然后沉降20小時，棄去上清液，再用生理鹽水清洗3次后，將清洗液加生理鹽水至滅活吸附前的體積，最后加硫柳汞防腐劑進行攪拌得40μg/ml疫苗原液，即得成品，其中重組(酵母)乙肝疫苗(HBsAg)40μg/ml，含鋁0.5mg/ml。
實施例9選用表達乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的酵母工程，菌種采用常規(guī)方法，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵后采集得細胞懸液；然后從細胞中提取抗原，并將抗原進行細胞破碎、勻漿，經(jīng)孔徑為0.45μm的過濾器過濾后，再經(jīng)超濾并濃縮，加入硅膠溶液，保溫2小時，3600rpm離心20分鐘，將硅膠沉淀經(jīng)磷酸溶液洗滌3次，用硼酸鈉溶液洗脫，超濾并離心后得澄清抗原；澄清抗原經(jīng)丁基瓊脂糖疏水層析柱上吸附和解析，得純III型抗原；純III型抗原經(jīng)稀釋、除菌過濾得80μg/ml無菌抗原；將無菌抗原合并液加入1∶40福爾馬林至終濃度為100μg/ml，加熱至38℃，保溫82小時，再冷卻到2℃，得到滅活抗原；按0.085ml/g的滅活抗原的比例加0.2M硫酸鉀鋁溶液，用1N氫氧化鈉調(diào)PH值為7.2，攪拌3小時，得到汞前PH抗原；然后沉降18小時，棄去上清液，再用生理鹽水清洗3次后，將清洗液加生理鹽水至滅活吸附前的體積，最后加硫柳汞防腐劑進行攪拌得80μg/ml疫苗原液，即得成品，集中重組(酵母)乙肝疫苗(HBsAg)80μg/ml，含鋁0.5mg/ml。
盡管對本發(fā)明已作了詳細的說明并引證了一些具體實例，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，只要不離開本發(fā)明的精神和范圍可作各種變化或修正是顯然的。
權(quán)利要求
1.一種治療性乙型肝炎的疫苗制劑，其特征在于包括重組酵母乙肝疫苗40～80μg/ml，含鋁0.5mg/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療性乙型肝炎的疫苗制劑，其特征在于其余成分為生理鹽水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種治療性乙型肝炎的疫苗制劑，其特征在于重組酵母乙肝疫苗60～80μg/ml，含鋁0.5mg/ml；優(yōu)選的為重組酵母乙肝疫苗60μg/ml，含鋁0.5mg/ml。
4.一種制備權(quán)利要求1所述的治療性乙型肝炎疫苗制劑的方法，其特征在于包括以下步驟a)選用表達乙型肝炎表面抗原的酵母工程菌，菌種經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵后采集得細胞懸液；b)然后再從細胞中提取抗原，并將抗原進行初步純化得澄清抗原；c)澄清抗原經(jīng)疏水層析純化，得純III型抗原；d)純III型抗原經(jīng)稀釋、除菌過濾得無菌抗原，將無菌抗原合并液經(jīng)滅活吸附，得疫苗原液，即得成品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于治療性乙型肝炎疫苗制劑的制備方法，其特征在于其中步驟b)所述的初步純化包括細胞破碎、過濾、通過硅膠處理去除親脂性雜質(zhì)，過濾又分為微孔過濾和超濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于治療性乙型肝炎疫苗制劑的制備方法，其特征在于步驟c)所述的疏水層析純化是將抗原在疏水層析柱上吸附和解析。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于治療性乙型肝炎疫苗制劑的制備方法，其特征在于步驟d)所述的滅活吸附為先經(jīng)福爾馬林處理再經(jīng)氫氧化鋁原位吸附，即加入1∶40福爾馬林至終濃度為100μg/ml，加熱至34～38℃，保溫24～96小時，再冷卻到2～8℃，得到滅活抗原；按0.085ml/g的滅活抗原的比例加0.2～0.3M硫酸鉀鋁溶液，用1N氫氧化鈉調(diào)PH值為7.0～7.2，攪拌2～3小時，得到汞前PH抗原；然后沉降18～24小時，棄去上清液，再用生理鹽水清洗3次后，將清洗液加生理鹽水至滅活吸附前的體積，最后加防腐劑進行攪拌得疫苗原液，所述的防腐劑為硫柳汞。
8.一種含有權(quán)利要求1所述的治療性乙型肝炎的疫苗制劑的組合物，其特征在于包括乙型肝炎疫苗制劑和抗病毒藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種含有治療性乙型肝炎疫苗的組合物，其特征在于所述的抗病毒藥物可為拉米呋啶和/或干擾素-α，其中所述的抗病毒藥物可為拉米呋啶和/或干擾素-α，乙型肝炎疫苗制劑含量為40～80μg，所述的拉米呋啶為90×30～110×30mg，所述的干擾素-α為12×3萬單位～12×5萬單位。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的一種含有治療性乙型肝炎疫苗的組合物，其特征在于還包括護肝藥物，比如促肝細胞生長素，所述的促肝細胞生長素80×30～160×30mg。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種含有治療性乙型肝炎疫苗的組合物，其特征在于還包括一些免疫調(diào)節(jié)類藥物綠膿桿菌制劑或胸腺肽，所述的綠膿桿菌制劑注射液0.8×4～1×4ml，所述的胸腺肽120×4～160×4mg。
12.一種含有權(quán)利要求1所述的治療性乙型肝炎的疫苗制劑的組合物，其特征在于包括乙型肝炎疫苗制劑、胸腺肽和黃芪注射液，其中乙型肝炎疫苗制劑含量為40～80μg，胸腺肽120×4～160×4mg，黃芪注射液為35×4～40×4ml。
13.一種含有權(quán)利要求1所述的治療性乙型肝炎的疫苗制劑的組合物，其特征在于包括乙型肝炎疫苗制劑、綠膿桿菌制劑和胸腺肽，其中乙型肝炎疫苗制劑含量為40～80μg，所述的綠膿桿菌制劑注射液0.8×4～1×4ml，所述的胸腺肽120×4～160×4mg。
14.一種權(quán)利要求1～13中任意一項所述的治療性乙型肝炎的疫苗制劑在制備治療慢性乙型肝炎及HBV攜帶者藥劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療性乙型肝炎的疫苗制劑，其特征在于包括重組(酵母)乙肝疫苗(HBsAg)40～80μg/ml，含鋁0.5mg/ml。還公開了一種治療性乙型肝炎的疫苗制劑的制備方法及其用途，以及含有治療性乙型肝炎疫苗的組合物。該制劑可誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答而有利機體清除HBV，能增加Balb/c小鼠的細胞免疫功能，促Th1類細胞因子高水平表達，提高T增殖的水平，并且促特異性CTL活性提高。
文檔編號A61P31/00GK1548156SQ0312356
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月13日
發(fā)明者范力, 汪恩浩, 曾瀅, 朱征宇, 甘建輝, 范 力 申請人:深圳康泰生物制品股份有限公司