專利名稱：當(dāng)歸多糖作為制備治療肝損傷病的藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及當(dāng)歸多糖作為制備治療肝損傷病的藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多種因素引起的肝損傷目前尚無(wú)療效確切的藥物予以治療，且從分子水平對(duì)其作用機(jī)制和靶點(diǎn)的研究極少，影響了臨床合理安全用藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是針對(duì)上述問題提供當(dāng)歸多糖作為制備治療肝損傷病的藥物的應(yīng)用，用當(dāng)歸多糖制備的治療肝損傷病的藥物對(duì)肝損傷具有較好的療效，且副作用少。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是當(dāng)歸多糖作為制備治療肝損傷病的藥物的應(yīng)用。將當(dāng)歸多糖和藥用載體和/或賦形劑制得藥用組合物。所制得的藥用組合物用于肝損傷的治療，具有療效好，副作用少等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為當(dāng)歸多糖對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的影響圖；圖2為當(dāng)歸多糖對(duì)免疫性肝損傷肝組織中MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響圖；圖3為當(dāng)歸多糖對(duì)免疫性肝損傷肝組織中NFkappaBp65、STAT1、c-fos、c-Jun表達(dá)的影響圖；圖4為當(dāng)歸多糖對(duì)免疫性肝損傷肝組織中cNOS，iNOS，COX-2，PKA表達(dá)的影響圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1當(dāng)歸多糖組合物由當(dāng)歸多糖2～10克、纖維素490～498克制成1000粒。其制備方法為將當(dāng)歸水提取，乙醇沉淀，離心，沉淀為多糖。濾液濃縮，加入3倍量體積乙醇再沉淀，得多糖。將多糖與纖維素制粒，然后壓片或灌裝膠囊，每粒(片)含多糖5mg。
實(shí)施例2當(dāng)歸多糖組合物由1～5克當(dāng)歸多糖加注射用水至1升，分裝成1000支制得。其制法為將當(dāng)歸多糖溶于注射用水中，加至1升，滅菌，分裝。每支含2mg當(dāng)歸多糖。
當(dāng)歸多糖對(duì)免疫性肝損傷的保護(hù)作用動(dòng)物試驗(yàn)雄性昆明種小鼠，體重18-24g，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，用顆粒型普通鼠飼料喂養(yǎng)，飲用自來(lái)水，飼養(yǎng)2d后隨機(jī)分為5組空白對(duì)照組；Model(肝損傷組)一次ip(腹腔注射)給予BCG 1.5mg.10g-1，7d后ip(腹腔注射)給予LPS2μg.10g-1；Model+ASP1(肝損傷+小劑量當(dāng)歸多糖組)、Model+ASP2(肝損傷+大劑量當(dāng)歸多糖組)給予BCG的同時(shí)，ig(經(jīng)口給予)ASP(當(dāng)歸多糖)30mg.kg-1、60mg.kg-1，qd*7d(一天一次，連續(xù)給藥7天)。于給予LPS 6h后，小鼠斷頭處死，分離血清，測(cè)定ALT、GST、GSH，數(shù)據(jù)以x±S表示，組間差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果當(dāng)歸多糖對(duì)免疫性肝損傷小鼠sALT，sGST and GSH含量的影響見下表，Group sALT sGSTGSH(mmol·min-1·L-1) (μmol·min-1·L-1) (μmol·mg-1·pro.)Control 1.29±0.1421±323±7Model4.02±0.27**30±6**9.3±2.9**Model+ASP1 3.0±0.4**ΔΔ17.7±2.6ΔΔ15±5**ΔΔModel+ASP2 2.55±0.29*ΔΔ20±9Δ13±5**Δ結(jié)論當(dāng)歸多糖對(duì)免疫性肝損傷具有保護(hù)作用。
當(dāng)歸多糖對(duì)免疫性肝損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響動(dòng)物試驗(yàn)動(dòng)物處理方法同前。原位雜交法觀察NFkappaBp65、STAT1 mRNA表達(dá)；免疫組化染色觀察結(jié)構(gòu)型、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(cNOS、iNOS)、誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶(COX-2)、蛋白激酶A(PKA)及凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、早期反應(yīng)基因c-fos、c-Jun、表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR、原癌基因ras的表達(dá)。Griess法測(cè)定NO含量；放射免疫法測(cè)定PGE2、cAMP含量。
結(jié)果表明1.對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的影響見圖1，當(dāng)歸多糖可明顯上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)。2.對(duì)免疫性肝損傷肝組織中MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響見圖2，當(dāng)歸多糖能激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使EGFR、ras、Erk1的表達(dá)上調(diào)。3.對(duì)免疫性肝損傷肝組織中NFkappaBp65、STAT1、c-fos、c-Jun表達(dá)的影響見圖3，當(dāng)歸多糖僅能減少c-fos在肝組織中的表達(dá)。4.對(duì)免疫性肝損傷肝組織中cNOS，iNOS，COX-2，PKA表達(dá)的影響見圖4，當(dāng)歸多糖能顯著上調(diào)PKA的表達(dá)，同時(shí)可增加cNOS的表達(dá)。5.對(duì)免疫性肝損傷肝組織中第二信使NO、PGE2、cAMP含量的影響見下表，Group NOPGE2cAMP(pmol·mg-1·pro.-1)(pg·mg-1·pro.-1)(pmol·mg-1·pro.-1)Control 2.5±0.4 7.8±1.4 0.158±0.015Model3.9±0.4**13±3**0.126±0.020**Model+ASP1 3.13±0.13ΔΔ10.2±1.0Δ0.151±0.022ΔModel+ASP2 3.2±0.3ΔΔ10.9±2.5 0.20±0.04ΔΔ結(jié)論當(dāng)歸多糖可顯著增加NO、cAMP含量，減少PGE2含量。
利用基因芯片技術(shù)篩選當(dāng)歸多糖護(hù)肝相關(guān)基因動(dòng)物試驗(yàn)動(dòng)物處理方法同前，小鼠處死后，取肝臟，立即液氮凍存?zhèn)溆谩?br> 總RNA抽提及mRNA分離純化一步法提取肝組織總RNA。將液氮凍存組織放在陶瓷碾缽(RNase free)中徹底碾碎成粉末狀，加入溶液D(3mol/L NaAc，10％SDS，1mol/L Tris-HCl)和1％巰基乙醇，勻漿，離心后上清液經(jīng)1∶1酚∶氯仿兩次抽提后，經(jīng)NaAc和5∶1酸性酚-氯仿兩次抽提后，再經(jīng)等體積異丙醇沉淀，離心后，用Milli-Q水溶解沉淀，紫外分析顯示獲得了高純度總RNA。按Oligotex mRNA spin-column protocal(Qiagen)分離純化mRNA，紫外分析。
探針制備在50μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入3μg mRNA，參照Schena的方法，逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記及純化mRNA，用Cy3-dUTP標(biāo)記正常組織mRNA，用Cy5-dUTP標(biāo)記損傷組織或經(jīng)藥物處理的組織mRNA，乙醇沉淀后將Cy3-dUTP、Cy5-dUTP標(biāo)記的探針混合溶解在20μl 5×SSC+0.2％SDS雜交液中。
芯片雜交 將芯片和雜交探針分別置于95℃水浴變性5min，立即將探針加在基因芯片上，蓋玻片封片，置于密封艙內(nèi)60℃雜交15-17h。揭開蓋玻片，用SSC和SDS溶液洗滌10min，室溫晾干。
檢測(cè)與分析 用ScanArray5000掃描儀掃描芯片，得到Cy3/Cy5圖像文件，通過(guò)劃格，確定雜交點(diǎn)范圍，過(guò)濾背景噪聲，提取基因表達(dá)的熒光強(qiáng)度值。用預(yù)先選定的內(nèi)參照基因(42個(gè)管家基因)對(duì)Cy3和Cy5的原始提取信號(hào)進(jìn)行均衡和修正。用ImaGene 3.0軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值。用以下三個(gè)條件作為判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)(1)Cy3和Cy5信號(hào)比值的自然對(duì)數(shù)的絕對(duì)值＞0.69(基因的表達(dá)變化在2倍以上)；(2)Cy3和Cy5信號(hào)值之一＞600；(3)PCR結(jié)果良好。
結(jié)果當(dāng)歸多糖 對(duì)免疫性肝損傷差異表達(dá)基因的調(diào)控見下表

Ratio is Cy5/Cy3high expression(ratio＞2.0)，low expression(ratio＜0.5)
結(jié)論與正常肝組織相比，經(jīng)當(dāng)歸多糖預(yù)處理的免疫性肝損傷小鼠肝組織內(nèi)顯示7個(gè)差異表達(dá)基因，其中6個(gè)下調(diào)表達(dá)，1個(gè)上調(diào)表達(dá)。
本發(fā)明采用分子生物學(xué)方法(基因芯片技術(shù)、原位雜交技術(shù)等)，從分子水平表明了當(dāng)歸多糖護(hù)肝作用的靶點(diǎn)當(dāng)歸多糖可顯著上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2表達(dá)、下調(diào)c-fos(早期反應(yīng)基因)基因的表達(dá)，減少肝細(xì)胞的凋亡；明顯升高cAMP(3‘5’-cyclic adenosinemonophosphate，3’5’-環(huán)腺甘酸)、NO(一氧化氮)含量、減少PGE2(前列腺素)含量、增加cAMP依賴型蛋白激酶PKA及增加cNOS(結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶)的表達(dá)、上調(diào)MAPK(mitogenactivatedprotein kinase，有絲分裂原激活的蛋白激酶)信號(hào)級(jí)聯(lián)通路中EGFR(epidermal growth factorreceptor，內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體)、ras(原癌基因)、Erk1(extracellular signal-regulatedkinase，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶)的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生與修復(fù)；并對(duì)經(jīng)卡介苗處理的免疫性肝損傷基因編碼(Genbank-ID)為Humscp2a、Humoat、Hsngmrna、humpafaa、humhbgfb、Hsu83843的基因表達(dá)明顯下調(diào)、對(duì)humnlk基因明顯上調(diào)。
權(quán)利要求
當(dāng)歸多糖作為制備治療肝損傷病的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及當(dāng)歸多糖作為制備治療肝損傷病的藥物的應(yīng)用。將當(dāng)歸多糖和藥用載體和/或賦形劑制得藥用組合物。所制得的藥用組合物用于肝損傷的治療，具有療效好，副作用少等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K31/715GK1481807SQ0311848
公開日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2003年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月20日
發(fā)明者丁虹, 丁 虹 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)