當(dāng)歸多糖的分離提取工藝及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種當(dāng)歸多糖的分離提取工藝及其應(yīng)用，包括如下步驟：當(dāng)歸粗粉直接用水提取，提取液濃縮后用95%乙醇沉淀得粗多糖，粗多糖經(jīng)水溶解后，加飽和Ca（OH）2除蛋白，分別經(jīng)過強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂（SACER）和強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂（SBAER）處理，濃縮后用透析袋透析，濃縮后即可得到當(dāng)歸多糖。本發(fā)明公開的提取分離純化方法簡單易行，所得到的中性當(dāng)歸多糖純度高，當(dāng)歸多糖對小鼠外周血WBC、LC數(shù)有明顯升高作用，為進(jìn)一步研究當(dāng)歸多糖對HSPC的動員作用提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【專利說明】當(dāng)歸多糖的分離提取工藝及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于天然藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種當(dāng)歸多糖的分離提取工藝及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)歸是傘型科植物當(dāng)歸(angelica sinensis diel)的干燥根，主產(chǎn)于我國甘肅岷縣、云南、四川、陜西、湖北等地。當(dāng)歸味甘、辛、性溫，為著名常用中藥，有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便之效，用于血虛萎黃，眩暈心悸，月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，腸燥便秘等病癥。隨著對當(dāng)歸越來越深入的研究和新技術(shù)的應(yīng)用，已經(jīng)分離得到了多種化學(xué)活性成分:藁本內(nèi)酯、阿魏酸、當(dāng)歸多糖、微量元素、維生素、氨基酸，查耳酮、倍半萜烯、炔類化合物。近年來，植物多糖的促進(jìn)造血作用、免疫調(diào)節(jié)作用在抗腫瘤、對黏膜損傷有直接的治療作用、對肝臟的保護(hù)作用，能夠調(diào)節(jié)肝藥酶的活性、抗衰老方面表現(xiàn)出了良好效果，當(dāng)歸多糖(angelica polysaccharides,當(dāng)歸多糖)也引起了人們的興趣。目前多糖研究發(fā)展迅速，形成了空前的趨勢，研究范圍涉及多糖的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)分析、生物學(xué)活性、藥理學(xué)作用、新藥評價及臨床應(yīng)用等各個方面。目前造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stemcell transplantation, HSCT)是治療白血病和實(shí)體瘤的有效方法,外周血干細(xì)胞移植(peripheral blood stem cell transplantation,PBSCT)因其具有米集細(xì)胞方便、供者痛苦少、以及移植后造血和免疫重建快等優(yōu)點(diǎn)，被臨床廣泛接受，已有替代骨髓移植之趨勢。正常情況下外周血干細(xì)胞(peripheral blood stem cell, PBSC)的數(shù)量很少,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足造血干細(xì)胞移植時所需的數(shù)量，因此需要進(jìn)行動員才能獲取足夠數(shù)量的PBSC以保證移植成功。所以，外周血干細(xì)胞動員劑的研究與應(yīng)用是PBSCT是否成功的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)之一。而目前所采用的外周血干細(xì)胞動員劑都有其局限性，從而限制了 PBSCT的廣泛開展。所以尋找新的PBSC動員劑成為PBSCT領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題之一。
[0003]當(dāng)歸為中醫(yī)“補(bǔ)`血、活血”的要藥，當(dāng)歸多糖是其主要有效成分之一，現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究證明:當(dāng)歸多糖對正?；蜇氀∈蟮乃柘翟煅婕?xì)胞(BFU-E、CFU-E、CFU-GM和CFU-MK)的增殖分化有顯著的促進(jìn)作用；同時當(dāng)歸多糖在體外可促進(jìn)人紅系、粒單系及混合系造血組細(xì)胞的增殖分化。但由于以往提取的當(dāng)歸多糖的含量低(30%~60%)給其生物活性的判斷造成了一定的影響，所以如何通過提取、分離純化以獲得糖含量高的當(dāng)歸多糖是研究其藥理效應(yīng)的重要前提。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種納豆解酒口服液及其應(yīng)用，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案。
[0005]本發(fā)明涉及一種當(dāng)歸多糖的的分離提取工藝，其特征在于包括如下步驟:當(dāng)歸粗粉直接用水提取，提取液濃縮后用95%乙醇沉淀得粗多糖，粗多糖經(jīng)水溶解后，加飽和Ca(OH)2除蛋白，分別經(jīng)過強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(SACER)和強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂(SBAER)處理，濃縮后用透析袋透析，濃縮后即可得到當(dāng)歸多糖，
[0006]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的分離提取工藝為:每500g當(dāng)歸粗粉，用蒸餾水5000ml煮提3次，每次2h，合并水提取液，濃縮后加95%乙醇沉淀得到粗多糖，粗多糖用蒸餾水溶解后，加入飽和Ca(OH)2液，將溶液調(diào)節(jié)pH至10除蛋白，離心后上清液用H2SO4 (3mol.L1)調(diào) pH 至 4，過 SACER ；SACER 交換液用 NaOH (4mo1.L1)調(diào) pH 為 10 ~11，過SBAER，交換液調(diào)pH至7~8，濃縮后用透析袋透析3天，透析袋內(nèi)液濃縮后加95%乙醇沉淀得到純度高當(dāng)歸多糖，在真空干燥器內(nèi)(溫度40°C，真空度為-0.09)干燥48h，所得當(dāng)歸多糖為白色粉狀物。
[0007]本發(fā)明另一方面還涉及采用上述分離提取工藝得到的當(dāng)歸多糖。
[0008]在本發(fā)明的另一方面還涉及上述當(dāng)歸多糖作為外周血干細(xì)胞動員劑中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明公開的提取分離純化方法簡單易行，所得到的中性當(dāng)歸多糖純度高，當(dāng)歸多糖對小鼠外周血WBC、LC數(shù)有明顯升高作用，為進(jìn)一步研究當(dāng)歸多糖對HSPC (造血干細(xì)胞)的動員作用提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】:[0010]1.材料
[0011]1.1藥材:去皮當(dāng)歸頭中國甘肅岷縣購于重慶市中藥材市場
[0012]1.2 試劑:
[0013]959ffitOH:醫(yī)用酒精重慶北碚酒廠
[0014]透析袋(截留分子量10000):華美生物工程公司
[0015]氫氧化鈣:AR重慶東方試劑廠
[0016]732型強(qiáng)酸性陽離子樹脂:上海振光樹脂廠
[0017]717型強(qiáng)堿性陰離子樹脂:上海振光樹脂廠
[0018]H2SO4:AR國營重慶無機(jī)化學(xué)試劑廠
[0019]鹽酸:AR國營重慶無機(jī)化學(xué)試劑廠
[0020]氫氧化鈉:AR北京紅星化工廠
[0021]三氯乙酸:AR上海三愛思試劑有限公司
[0022]pH試紙:天津化學(xué)試劑廠
[0023]1.3 儀器
[0024]電子調(diào)溫電熱套:天津市泰斯特儀器有限公司
[0025]旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:RE_52型上海青浦瀘西儀器廠
[0026]離心機(jī):LD4_2型北京醫(yī)用離心機(jī)廠
[0027]電子天平:MP400-1型上海分析天平廠
[0028]微型循環(huán)真空水泵:SHB-D型鄭州市上街區(qū)儀器廠
[0029]-20°C冰箱:長嶺冰箱廠
[0030]真空干燥器:DZF_1型上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠
[0031]磨口層析柱:配套的球型漏斗500ml 45cmX4cm重慶高教玻璃儀器廠
[0032]2.方法
[0033]1.當(dāng)歸多糖提取條件[0034]1.1常規(guī)當(dāng)歸多糖提取方法
[0035]稱取當(dāng)歸粗粉，加95%乙醇回流2次，過濾，殘?jiān)鼡]去乙醇，用蒸餾水提取2次，濃縮,加95%乙醇沉淀得到粗多糖，用水溶解粗多糖，用10%三氯乙酸(Trichloroaceticacid, TCA)或飽和Ca(OH)2除蛋白，結(jié)果多糖純度分別為:32.8%和38.5% ;將上述粗多糖溶解透析3天后純度分別為:37.7%和42.8%。結(jié)果表明采用常規(guī)方法得到的當(dāng)歸多糖的純度不高，必須進(jìn)一步純化。
[0036]1.2對常規(guī)方法改進(jìn)
[0037]當(dāng)歸粗粉直接用水提取，濃縮后加95%乙醇沉淀粗多糖，加飽和Ca(OH)2除蛋白，結(jié)果所得多糖的純度為:38.5% ;將上述粗多糖溶解，用稀硫酸調(diào)pH至酸性后過SACER，結(jié)果所得多糖純度為68.7% ;將過SACER的溶液用NaOH調(diào)節(jié)pH為堿性，過SBAER，結(jié)果所得多糖純度為:78.3% ;再將過SBAER的交換液濃縮，用透析袋透析后所得多糖純度為:87.2%。
[0038]通過對上述方法的比較，確定當(dāng)歸多糖提取分離純化基本路線，即:當(dāng)歸粗粉直接用水提取，提取液濃縮后用95%乙醇沉淀得粗多糖，粗多糖經(jīng)水溶解后，加飽和Ca(OH)2除蛋白，分別經(jīng)過SACER和SBAER處理，濃縮后用透析袋透析，濃縮后即可得到純度較高的當(dāng)歸多糖，并且對當(dāng)歸多糖分離純化條件進(jìn)行優(yōu)化。
[0039]2.當(dāng)歸多糖提取工藝的優(yōu)化
[0040]采用直接用蒸餾水提取，每次稱取當(dāng)歸粗粉500g進(jìn)行提取，對提取時間、提取次數(shù)和水的用量三個因素按L9 (34)進(jìn)行正交試驗(yàn)以確定最佳提取條件。蒸餾水的用量分別為3000ml、4000ml，5000ml，提取時間分別為lh、2h、3h，提取次數(shù)分別為2次、3次、4次。正交試驗(yàn)因素和水平見表1-1，提取工藝方案見表1-2。
[0041]表1-1試驗(yàn)因素與水平
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種當(dāng)歸多糖的分離提取工藝，其特征在于包括如下步驟:當(dāng)歸粗粉直接用水提取，提取液濃縮后用95%乙醇沉淀得粗多糖，粗多糖經(jīng)水溶解后，加飽和Ca (OH)2除蛋白，分別經(jīng)過強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(SACER)和強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂(SBAER)處理，濃縮后用透析袋透析，濃縮后即可得到當(dāng)歸多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離提取工藝，所述的分離提取工藝為:每500g當(dāng)歸粗粉，用蒸餾水5000ml煮提3次，每次2h，合并水提取液，濃縮后加95%乙醇沉淀得到粗多糖，粗多糖用蒸餾水溶解后，加入飽和Ca(OH)2液，將溶液調(diào)節(jié)pH至10除蛋白，離心后上清液用H2SO4 (3mol.L-1)調(diào) pH 至 4，過 SACER ；SACER 交換液用 NaOH (4mo1.L-1)調(diào) pH 為 10 ~11，過SBAER，交換液調(diào)pH至7~8，濃縮后用透析袋透析3天，透析袋內(nèi)液濃縮后加95%乙醇沉淀得到純度高當(dāng)歸多糖，在真空干燥器內(nèi)(溫度40°C，真空度為-0.09)干燥48h，所得當(dāng)歸多糖為白色粉狀物。
3.采用權(quán)利要求1或2所述的分離提取工藝得到的當(dāng)歸多糖。
4.權(quán)利要求3所述的當(dāng)歸多糖作為外周血干細(xì)胞動員劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/02GK103864947SQ201410097326
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月17日
【發(fā)明者】尚京川, 辜鵬程, 封家福, 張夢 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)