專利名稱：一種抗肺肝纖維化的積雪草苷中藥制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥制劑技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種抗肺肝纖維化的積雪草苷中藥制劑。
導(dǎo)致肺纖維化的許多因素均是常見(jiàn)的，其基礎(chǔ)病因的治療當(dāng)然是預(yù)防肺纖維化的最佳的途徑，但是導(dǎo)致肺纖維化的這些因素在患者身上常常是因主、客觀因素不易消除，因此如何抑制肺的纖維化形成是一個(gè)非常迫切的研究課題。
許多肝臟疾病例如病毒性肝炎，化學(xué)藥品的中毒酒精及脂肪肝均可發(fā)生肝纖維化，并最終導(dǎo)致肝硬化而嚴(yán)重影響肝功能。目前對(duì)肝纖維化疾病除了對(duì)其病因進(jìn)行防治外，對(duì)纖維化本身的病理過(guò)程尚無(wú)明確的藥物可以抑制其發(fā)展。
盡管現(xiàn)在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)對(duì)纖維化疾病傾注了大量的人力、物力，對(duì)膠原蛋白代謝和纖維母細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展等做了大量的研究，對(duì)膠原蛋白代謝途徑中的各個(gè)環(huán)節(jié)以及影響纖維化的許多細(xì)胞因子均有了深入的認(rèn)識(shí)。其中尤以TGF-β、TNFα、PDGF、IL-1、IL-6、FGF、EGF，目前最為重視的似乎是TGF-β，因?yàn)門GF-β可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)成分顯著增加，例如I、III型膠原、板層素、纖維連接素等而可抑制膠原酶的合成及從而阻斷了膠原降解。目前抗TGF-β的單抗對(duì)實(shí)驗(yàn)性皮膚損傷、急性腎小球腎炎及PTCA后的動(dòng)脈損傷均有相當(dāng)?shù)寞熜?，TGF-β受體的小分子藥物研究正在進(jìn)行。其他細(xì)胞因子及內(nèi)皮素的拮抗劑也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。膠原生物合成抑制劑，其中以膠原蛋白翻譯后加工修飾的二個(gè)關(guān)鍵酶，即脯氨酸-4-羥化酶抑制劑和賴氨酰氧化酶抑制劑研究較多。由于膠原酶等基質(zhì)金屬蛋白酶可以降解膠原，所以促進(jìn)這類酶活性的藥物也是抗纖維化藥物研究的靶點(diǎn)。
至于目前臨床應(yīng)用的一些藥物，例如秋水仙堿、r-干擾素、前列腺素E類似物馬洛替酯、熊去氫膽酸等藥，作用機(jī)制不明，療效也不夠確切。激素作為針對(duì)特發(fā)性肺纖維化疾病的用藥，在部分病例取得一定的療效。目前在國(guó)外臨床試驗(yàn)的藥物中，吡啡尼酮和松弛素是非常引入注意的，在部分病例，特別是硬皮病及其肺纖維化，僅是近來(lái)的臨床研究似乎不支持它們的治療效果。中醫(yī)中藥對(duì)一些疑難疾病常有其獨(dú)特的治療方法，常取得令人可喜的結(jié)果。
但能抗肺纖維化的中藥制劑尚未發(fā)現(xiàn)有報(bào)道，抗肝纖維化的中藥也很少。
本發(fā)明提供了一種抗肺肝纖維化的積雪草苷中藥制劑，該制劑是以積雪草苷作為活性成份與藥用輔料組成的。
本發(fā)明的活性成份積雪草苷同時(shí)具有抗肝纖維化作用。
試驗(yàn)結(jié)果如下1、試驗(yàn)?zāi)康倪x用四氯化碳引起的大鼠肝纖維化模型，測(cè)試積雪苷對(duì)肝纖維化的治療作用。
2、受試藥物名稱積雪苷來(lái)源上海醫(yī)藥工業(yè)研究院性狀白色粉末配制方法用0.5％CMC配制成混懸液3、陽(yáng)性對(duì)照藥名稱地塞米松磷酸鈉來(lái)源上海信誼制藥有限公司批號(hào)020507規(guī)格5mg/ml4、其它四氯化碳(分析純)來(lái)源上海化學(xué)試劑有限公司批號(hào)991201配制方法將四氯化碳成40％濃度的精制植物油溶液5、動(dòng)物品系SD大鼠體重230-250g性別雄性來(lái)源由中科院動(dòng)物中心提供合格證號(hào)中科動(dòng)管會(huì)第005號(hào)每組動(dòng)物數(shù)20只6、試驗(yàn)方法設(shè)積雪苷4、12、36mg/kg劑量組，造模組，地塞米松磷酸鈉組(0.6mg/kg)，另設(shè)正常對(duì)照組。
將四氯化碳配成40％濃度的精制植物油溶液，除正常對(duì)照組動(dòng)物外，其他動(dòng)物每周2次(周一、四)皮下注射，1ml/kg，連續(xù)3個(gè)月，同時(shí)，喂以高脂飼料和含5％酒精的水。治療組同時(shí)給予受試藥物或陽(yáng)性對(duì)照藥。給藥4、12周每組隨機(jī)取8只大鼠取血，稱體重，測(cè)定血清ALT、AST、ALP、TP、ALB、T-BIL。取肝臟稱重，每個(gè)動(dòng)物取同一葉肝臟部位大致相同的一塊肝組織固定于10％福爾馬林做病理切片檢查。
7.試驗(yàn)結(jié)果模型組動(dòng)物的ALT、AST、ALP、T-BIL明顯高于正常大鼠，肝臟萎縮，體積變小，發(fā)黃，造模成功。
給藥4周時(shí)病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)模型組動(dòng)物肝細(xì)胞呈重度彌漫性脂肪變性，中度水樣變性，尤以小葉中央病變較為嚴(yán)重。肝臟輕度纖維化，主要表現(xiàn)在匯管區(qū)纖維母細(xì)胞增加較為明顯，肝小葉周邊膠元纖維略有增加，肝細(xì)胞再生不明顯；地塞米松組動(dòng)物肝細(xì)胞輕度脂肪變性，小葉中央病變較重，未見(jiàn)肝纖維化形成；積雪苷三個(gè)劑量組動(dòng)物肝細(xì)胞呈中度至重度彌漫性脂肪變性，中度水樣變性，未見(jiàn)肝纖維化形成。給藥3個(gè)月病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)模型組動(dòng)物肝細(xì)胞水樣變性明顯，有明顯的肝細(xì)胞壞死和肝脂肪變性，有明顯的肝纖維化，屬肝硬化(+～++)；地塞米松組動(dòng)物肝細(xì)胞有較明顯的脂肪變性和水樣變性，僅有輕度的肝纖維化；積雪苷三個(gè)劑量組動(dòng)物肝細(xì)胞仍有較明顯的脂肪變性和水樣變性，僅有輕度的肝纖維化，高、中劑量組纖維化程度與地塞米松組相似或略輕，低劑量組纖維化程度也較模型組輕。肝功能檢查各項(xiàng)指標(biāo)積雪苷三個(gè)劑量組也較模型組低。結(jié)果見(jiàn)表1-2。表1積雪苷給藥4周對(duì)四氯化碳引起的大鼠慢性肝損傷的治療作用(X±SD)組別 劑量 AST ALT ALP T-BILTPALPBUNCRE體重 肝重 系數(shù)mg/kg正常對(duì)照210±38 49±4.2 107±43 2.9±3.3 81.7±1.8 38.7±1.5 7.6±0.5 36±2.6271±8.2 39.6±1.40.15±0.00模型組 10ml/kg 861±421 441±260 464±88 3.2±1.9 72.9±4.3 36.7±0.6 13.4±3.0 38.7±6.0 300±9.7 70.7±6.10.24±0.02地塞米松 0.6 999±435 535±263 236±33 1.6±0.6 70.7±2.4 37.7±0.6 13.0±1.5 31.7±0.6 271±9.5 50.6±2.90.19±0.014712±336 339±159 580±208 2.2±0.8 68.7±7.2 34.3±2.5 13 2±2.9 42.7±6.7 313±2.7 77.8±5.50.25±0.02積雪苷 12 893±377 477±256 416±176 3.9±1.7 64.3±4.7 33.7±2.3 12 9±3.4 39.7±4.0 399±24 71.0±16.7 0.18±0.0736 719±386 374±229 505±235 3.0±2.7 66.3±1.1 34.7±0.6 13.6±0.8 42.0±4.4 301±42 74.6±5.50.25±0.05與生理鹽水組比較*P＜0.05，**P＜0.01。表2積雪苷給藥3個(gè)月對(duì)四氯化碳引起的大鼠慢性肝損傷的治療作用(X±SD)組別 劑量 ASTALT ALP T-BIL TP ALP CHO 體重 肝重系數(shù)mg/kg正常對(duì)照 10ml/kg 1017±493 269±143 734±2877±461±823±32±1242±428±30.03±0.00地塞米松 0.6 238±2553±24394±4381±071±334±13±0219±589±50.04±0.004792±713 114±31 781±1402±174±531±12±0264±2377.8±5.5 0.25±0.02積雪苷12 234±2662±1 470±58 1±167±134±12±1373±7571.0±16.7 0.18±0.0736 387±141 118±41 743±2874±165±11 27±74±1239±527±30.03±0.00與生理鹽水組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
本發(fā)明研究了積雪草苷抗肺肝纖維化的動(dòng)物試驗(yàn)，其結(jié)果如下一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察積雪草苷對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化的治療作用。
二、動(dòng)物大鼠SD，雌性，180-200g中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
三、樣品名稱積雪草苷上海醫(yī)藥工業(yè)研究院提供，含量92.72％。
陽(yáng)性藥地塞米松磷酸納注射液，上海信誼藥廠生產(chǎn)，批號(hào)010402，5mg支。
四、染毒劑注射用鹽酸博萊霉素(平陽(yáng)霉素)天津太河制藥有限公司生產(chǎn)。針劑，8mg/Amp。造模時(shí)用5mg/kg劑量，即每200g大鼠用1mg溶于0.4ml生理鹽水中氣管注入。
五、劑量積雪草甙設(shè)2、6、18mg/kg po×28及2、6、18mg/kg ip×28。
地塞米松設(shè)0.6mg/kg po×28。
六、實(shí)驗(yàn)方法SD大鼠，30％速可眠麻醉平放于手術(shù)臺(tái)上，做氣管皮下切開(kāi)，分出氣管，以1mg/200大鼠/0.4ml生理鹽水溶液氣管內(nèi)注入，隨即旋轉(zhuǎn)片刻使溶液均勻分布于肺內(nèi)，縫合。待大鼠清醒后隨機(jī)分組。次日起給藥，即積雪草甙2、6、18、18mg/kg po×28，積雪草甙2、6、18mg/kg ip×28，地塞米松0.6mg/kg po×28。及模型對(duì)照組和空白對(duì)照組。模型對(duì)照組給予生理鹽水，給藥結(jié)束后用3％速可眠醉，然后取出每只大鼠的肺臟，立即作CT造影，造影結(jié)束立即冷干燥作羥脯氨酸含量測(cè)定，一部分用3％福爾馬林固定做病理切片觀察肺臟的病理變化。結(jié)果如下1.積雪草甙對(duì)博萊霉素引起的肺纖維化有一定的治療作用，表明與肺臟羥脯氨酸含量有不同程度降低，見(jiàn)表3。
表3.積雪草甙對(duì)博萊霉素引起肺纖維化時(shí)羥脯氨酸含量變化


2.博萊霉素病理組織學(xué)檢查大體觀察對(duì)照組雙肺呈粉紅色，灌洗時(shí)彈性回縮良好。實(shí)驗(yàn)組在第3、7天雙肺可見(jiàn)散在點(diǎn)、灶狀出血，第14、28天雙肺蒼白，硬度增加，灌洗時(shí)彈性差，體積縮小。
光鏡下所見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠，體重減輕。雙肺出現(xiàn)由肺泡炎逐漸向間質(zhì)纖維化過(guò)渡的病變。實(shí)驗(yàn)第3天可見(jiàn)肺內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中性粒細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞增多。肺泡壁水腫，肺泡腔內(nèi)見(jiàn)游離的AM和PMN。第7天，以肺泡炎病變?yōu)橹?，多為大片狀炎性?xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔開(kāi)始增寬，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管增生，病灶間、病灶內(nèi)肺泡萎縮，其中纖維組織易見(jiàn)。第14天-28天肺泡炎逐漸減輕，肺泡隔及小血管、支氣管周圍纖維化病變加重。肺泡間隔內(nèi)成纖維細(xì)胞明顯增多，基質(zhì)明顯增多。第28天，肺纖維化程度加重，肺間質(zhì)大量成纖維細(xì)胞，大片纖維結(jié)締組織沉積，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，部分肺泡腔消失形成蜂窩肺。
對(duì)照組大鼠為正常肺組織結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)明顯病變。
激素治療組第7天見(jiàn)肺泡炎減輕，第28天纖維結(jié)締組織沉積較少，肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞也較對(duì)照組少。
積雪苷治療組對(duì)第3、7天肺泡炎無(wú)明顯影響。第14天、28天肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞減少，第28天纖維結(jié)締組織減少，效果與激素組相似。
綜上所述，博萊霉素形成肺纖維化后肺臟的空腔面積減少，間質(zhì)面積增大，但用積雪草甙治療后均有一定程度的增加空腔面積及減少間質(zhì)面積的現(xiàn)象，表示積雪草甙有改善肺纖維化的作用，其療效至少不低于地塞米松。見(jiàn)表4。
表4積雪草甙對(duì)博萊霉素致肺纖維化治療病理切片的圖象分析

3.CT造影結(jié)果顯示積雪草甙對(duì)肺纖維化有一定的改善作用。
CT表現(xiàn)第3、7天以周圍肺野為主，呈彌漫性斑片狀影，與正常組織區(qū)混合存在，或密度增深的模糊陰影(磨砂玻璃樣陰影)，為活動(dòng)性肺泡炎階段。第14天彌漫性密度增深的斑片影及模糊影減少，表現(xiàn)為網(wǎng)格狀陰影，位于肺外周和胸膜下區(qū)，為纖維結(jié)締組織表現(xiàn)。第28天除網(wǎng)格狀陰影外，還可見(jiàn)囊性或蜂窩樣改變，呈環(huán)狀低密度陰影，囊壁厚且清晰。
激素治療組第7天見(jiàn)肺泡炎表現(xiàn)減輕，第28天網(wǎng)格狀陰影及囊性或蜂窩狀改變減少。
積雪苷組見(jiàn)第28天網(wǎng)格狀陰影及囊性或蜂窩樣改變較少。
在急性炎癥期期，地塞米松有明顯的減輕肺部炎癥作用，而積雪草甙無(wú)減輕炎癥的效果。
但是在后期，地塞米松組的肺纖維化有明顯減輕，考慮為地塞米松抑制了炎癥反映的后果。而積雪草甙無(wú)論口服還是腹腔注射組，療效明顯，說(shuō)明積雪草甙減輕肺纖維化不是由于抑制炎癥，而是由壓蒸餾于抑制纖維化過(guò)程所致。
本發(fā)明的另一目的是提供了上述一種抗肺肝纖維化的積雪草苷中藥制劑的制備方法，該方法包括下列步驟(1)制備積雪草苷積雪草粉碎后用水滲漉，滲漉液用大孔樹(shù)脂吸附，吸附樹(shù)脂用去離子水洗后，70％乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮至干，真空干燥，干燥物用95％乙醇加熱溶解后放置結(jié)晶，結(jié)晶濾得后再用95％乙醇重結(jié)晶，過(guò)濾析出的結(jié)晶，用少量95％乙醇洗后抽干，真空干燥，粉碎，裝袋；質(zhì)控鑒 別(TLC)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，在相同Rf值為單一斑點(diǎn)(2μg)重金屬＜20ppm砷＜10ppm含 量(HPLC)＞90％(以積雪草甙計(jì))干燥失重≤5％(2)積雪草苷的純化A、取定量積雪草甙粗品，加入30倍水，加熱至60℃使溶，溶液不澄清。
B、溶液冷卻至0-5℃，放置24小時(shí)，有白色沉淀析出，過(guò)濾。白色沉淀為積雪草甙，干燥后得率約2.6％。
C、濾液上柱，按每克粗品1.5升樹(shù)脂上大孔樹(shù)脂柱，流穿液棄去。
D、以30倍樣品量蒸餾水洗脫，收集水洗液。加50％乙醇洗脫，洗脫量為30倍樣品量，單獨(dú)收集前1/3洗脫液，回收乙醇至樣品量的5倍體積，置0-5℃放24小時(shí)，有白色沉淀析出，過(guò)濾得白色固體，干燥后得率約6.7％。
E、兩部分固體合并以95％乙醇重結(jié)晶即得。含量在90％以上積雪草甙；(3)積雪苷制劑制備按配方比例取純化后的積雪苷與藥用輔料，按常規(guī)方法制成制劑。
用本發(fā)明方法制得的積雪苷制劑對(duì)抗肺肝纖維化有顯著療效，在臨床上有廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了積雪草苷作為制備治療抗肺肝纖維化藥物中的應(yīng)用，為積雪草中藥制劑的開(kāi)發(fā)提供新的途徑。
積雪草總苷500g制法積雪草總苷500g加水溶解，過(guò)濾，沉淀干燥，以含水乙醇溶解，結(jié)晶，過(guò)濾，殘?jiān)院掖既芙猓亟Y(jié)晶，過(guò)濾，殘?jiān)?0℃干燥，粉碎即得。本品積雪草苷含量大于90％。
權(quán)利要求
1.一種抗肺肝纖維化的積雪草苷中藥制劑，其特征在于該制劑包括作為活性成份的積雪草苷和藥用輔料組成。
2.一種如權(quán)利要求1所述的一種抗肺肝纖維化的積雪草苷中藥制劑的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)制備積雪草苷積雪草粉碎后用水滲漉，滲漉液用大孔樹(shù)脂吸附，吸附樹(shù)脂用去離子水洗后，70％乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮至干，真空干燥，干燥物用95％乙醇加熱溶解后放置結(jié)晶，結(jié)晶濾得后再用95％乙醇重結(jié)晶，過(guò)濾析出的結(jié)晶，用少量95％乙醇洗后抽干，真空干燥，粉碎，裝袋；質(zhì)控鑒 別TLC與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，在相同Rf值為單一斑點(diǎn)2μg重金屬＜20ppm砷＜10ppm含 量HPLC＞90％ 以積雪草甙計(jì)干燥失重≤5％(2)積雪草苷的純化A、取定量積雪草甙粗品，加入30倍水，加熱至60℃使溶，溶液不澄清，B、溶液冷卻至0-5℃，放置24小時(shí)，有白色沉淀析出，過(guò)濾，白色沉淀為積雪草甙，干燥后得率約2.6％，C、濾液上柱，按每克粗品1.5升樹(shù)脂上大孔樹(shù)脂柱，流穿液棄去，D、以30倍樣品量蒸餾水洗脫，收集水洗液，加50％乙醇洗脫，洗脫量為30倍樣品量，單獨(dú)收集前1/3洗脫液，回收乙醇至樣品量的5倍體積，置0-5℃放24小時(shí)，有白色沉淀析出，過(guò)濾得白色固體，干燥后得率約6.7％，E、兩部分固體合并以95％乙醇重結(jié)晶即得，含量在90％以上積雪草甙(3)積雪苷制劑制備按配方比例取純化后的積雪苷與藥用輔料，按常規(guī)方法制成制劑。
3.一種如權(quán)利要求1所述的一種積雪草苷中藥制劑作為制備治療抗肺肝纖維化藥物應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬中藥制劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種抗纖維化的積雪草苷制劑。本發(fā)明的制劑在大鼠博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化的治療作用的試驗(yàn)中證實(shí)了有一定的治療作用，有較好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P11/00GK1439376SQ0311610
公開(kāi)日2003年9月3日 申請(qǐng)日期2003年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月1日
發(fā)明者劉全海, 戴靜芝, 吳威巍, 陳秀華, 劉 英, 沈龍海 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院