專利名稱：腫瘤特異性單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及癌癥，并且更具體而言涉及用于治療和診斷癌癥的人單克隆抗體。
背景技術(shù)：
在美國(guó)癌癥是導(dǎo)致死亡的主要原因之一。每年超過(guò)五十萬(wàn)的美國(guó)人死于癌癥，并且有超過(guò)一百萬(wàn)人新近診斷出患有此疾病。在癌癥中，贅生性細(xì)胞從其正常生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制中逃離出來(lái)并以不受控制的方式增生，導(dǎo)致發(fā)展成惡性腫瘤。如果對(duì)原發(fā)腫瘤的治療不徹底在該疾病的實(shí)質(zhì)發(fā)展前或還沒(méi)開始，那么腫瘤細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)移到第二位點(diǎn)上。因而早期診斷和有效治療惡性腫瘤因而對(duì)存活十分必要。
治療癌癥的現(xiàn)有方法包括外科手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法。這些治療法中的每一個(gè)的主要問(wèn)題是它們對(duì)癌細(xì)胞缺乏特異性。例如，外科手術(shù)移除腫瘤往往不徹底。即使幾個(gè)殘留的贅生性細(xì)胞也能致命，因?yàn)樗鼈兡芸焖僭錾⑥D(zhuǎn)移到其他位置。放射療法和化學(xué)療法也有嚴(yán)重的局限性。這些療法瞄準(zhǔn)身體中所有的生長(zhǎng)細(xì)胞，包括正常的細(xì)胞和贅生性細(xì)胞。由于這些療法對(duì)正常組織的毒性，可安全使用的放射量或化療劑量往往不足以殺死所有贅生性細(xì)胞。此外，它們對(duì)正常組織的毒性由包括惡心和脫發(fā)的令人不快的副作用表現(xiàn)出來(lái)，這些副作用嚴(yán)重降低了接受這些治療的癌癥患者的生活質(zhì)量。顯然需要更具選擇性和有效性的治療癌癥的方式。
單克隆抗體是特異性識(shí)別并結(jié)合到其相應(yīng)抗原的區(qū)域或表位免疫球蛋白的同種制備。贅生性細(xì)胞選擇性地表達(dá)不呈現(xiàn)于正常細(xì)胞中的抗原。因此，可產(chǎn)生出針對(duì)腫瘤特異性抗原的單克隆抗體。此等腫瘤特異性抗原可被連接到殺死或阻止贅生性細(xì)胞的生長(zhǎng)的治療部分上。另外，所述腫瘤特異性抗原可被連接到允許贅生性細(xì)胞成像的診斷部分上。因此，針對(duì)由腫瘤細(xì)胞(與正常細(xì)胞相比)選擇性表達(dá)的抗原的單克隆抗體可有利的用于早期檢測(cè)和有效治療癌癥。
對(duì)癌癥最流行的免疫治療策略由于其對(duì)小鼠單克隆抗體的依賴而具有有限的效用。利用雜交瘤技術(shù)可很容易并且數(shù)量上實(shí)際不受限制地來(lái)制造小鼠單克隆抗體。然而，當(dāng)施加到人體時(shí)，它們可被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別為異質(zhì)的并且在對(duì)患病組織發(fā)揮其治療作用前被中和。而且，鼠科免疫系統(tǒng)往往優(yōu)先識(shí)別存在于腫瘤細(xì)胞中的正常人體抗原的免疫優(yōu)勢(shì)表位(immunodominant epitope)。因此，人體腫瘤特異性抗原往往不能產(chǎn)生治療上有益的鼠科抗體。
人單克隆抗體能克服所有這兩種局限性。最重要的是，人單克隆抗體不如鼠科抗體那樣致免疫。因此，腫瘤特異性人單克隆抗體能更有效的瞄準(zhǔn)及消除贅生性細(xì)胞。而且，人體免疫系統(tǒng)針對(duì)存在于正常細(xì)胞的表位而產(chǎn)生抗原的可能性更小，增加了產(chǎn)生和成功地鑒別腫瘤特異性抗原的幾率。此外，人體免疫系統(tǒng)的組成部分不同于老鼠的組成部分，潛在地含有新穎的抗體特異性。
目前用以產(chǎn)生腫瘤特異性人單克隆抗體的程序一般以從荷瘤患者身上獲得的淋巴細(xì)胞開始。這些程序依賴于活體內(nèi)刺激和放大在腫瘤-反應(yīng)性淋巴細(xì)胞。這些程序受到癌癥患者的激活的B-細(xì)胞的抗原特異性的狹窄范圍的嚴(yán)重限制。由于顯然不可能在活體內(nèi)以腫瘤細(xì)胞使個(gè)體免疫，而對(duì)小鼠卻可以，因此還不可能很容易的產(chǎn)生對(duì)任何給定抗原或腫瘤細(xì)胞類型的腫瘤特異性人單克隆抗體。用來(lái)產(chǎn)生任何想要的特異性的腫瘤特異性抗體的程序?qū)⒖赡苁钟欣谟行У拿庖忒煼ê兔庖咴\斷。
因此，存在對(duì)用于癌癥的治療和診斷中的改進(jìn)的腫瘤特異性人單克隆抗體的需要。本發(fā)明滿足這一需要并且還提供相關(guān)的優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供分離的人單克隆抗體或其功能片斷，包括一個(gè)具有大體上選自由以下SEQ ID NO組成的群組的CDR的氨基酸序列的互補(bǔ)決定區(qū)10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44，其中人單克隆抗體或其功能片斷特異地結(jié)合到贅生性細(xì)胞或其抗原上。
本發(fā)明還提供了一種編碼人單克隆抗體或其功能片斷的分離的核酸，包括一個(gè)對(duì)下述CDR的氨基酸序列進(jìn)行編碼的核苷酸序列，該CDR由大體上選自由以下SEQ ID NO組成的群組的核苷酸序列進(jìn)行編碼9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45。
本發(fā)明還提供了一種用于減少贅生性細(xì)胞增生的方法。所述方法由投以有效量的本發(fā)明的人單克隆抗體或功能片斷而組成。還提供了一種檢測(cè)樣品中的贅生性細(xì)胞的方法。所述方法由使細(xì)胞和本發(fā)明的單克隆抗體或功能片斷相接觸并檢測(cè)人單克隆抗體或功能片斷對(duì)樣品的特異性結(jié)合而組成。與正常細(xì)胞相比，有單克隆抗體或功能片斷的存在或增高的含量說(shuō)明樣品中存在贅生性細(xì)胞。


圖1顯示LH11238和LH13抗體對(duì)活的H3464細(xì)胞表面的結(jié)合。圖1A顯示利用LH11238抗體所作的熒光激活的細(xì)胞分類法(fluorescent activated cellsorting，F(xiàn)ACS)分析。圖1B顯示利用LH13抗體所作的FACS分析。
圖2說(shuō)明LH13抗原由H3396細(xì)胞分泌。圖2A顯示來(lái)自H3396(實(shí)心環(huán))細(xì)胞的條件培養(yǎng)基競(jìng)爭(zhēng)LH13抗體對(duì)固定細(xì)胞單層的結(jié)合。圖2B顯示LH13抗原由H3396細(xì)胞分泌出來(lái)并且結(jié)合到培養(yǎng)皿上。
圖3顯示通過(guò)陰離子交換色譜法在Q瓊脂糖凝膠柱上提純LH13抗原。
圖4說(shuō)明LH13抗原易受到胰蛋白酶和糖苷內(nèi)切酶-F/肽-N-糖苷酶(lycosidase)F治療的影響。
圖5顯示以ELISA格式的重組體LH13、LH11238與變體Fab的表征。畫面A顯示LH13抗體(空心環(huán))、HCDR3變體S97N(填充環(huán))、LCDR3變體R91Y(空心方塊)、及組合的突變體4H7(填充方塊)各自經(jīng)部分濃縮的LH13抗原滴定并以山羊抗-人K堿性磷酸酶共軛進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。畫面B顯示LH11238抗體(空心環(huán))和LCDR3突變體Q89W(空心方塊)、N93C(空心三角)、N94C(填充方塊)、以及P95aR(填充環(huán))各自經(jīng)H3396腫瘤細(xì)胞系的固定單層滴定并以山羊抗-人K堿性磷酸酶進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明針對(duì)腫瘤特異性人單克隆抗體及其功能片斷。本發(fā)明之人單克隆抗體及其功能片斷特異性結(jié)合到與正常細(xì)胞相比較而言的贅生性細(xì)胞上，而且可用于選擇性地瞄準(zhǔn)腫瘤。這些抗體來(lái)源于人體，而且在投藥到人體目標(biāo)時(shí)不可能產(chǎn)生免疫響應(yīng)。因此，可以使它們共軛于細(xì)胞毒素劑或抑制細(xì)胞劑并且為消除腫瘤而用于選擇性地瞄準(zhǔn)癌細(xì)胞。腫瘤特異性人單克隆抗體也可被用在診斷程序中來(lái)鑒別贅生性細(xì)胞。及早檢測(cè)到癌癥大大提高了個(gè)體幸免于該疾病的機(jī)會(huì)。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了用來(lái)生成產(chǎn)生腫瘤特異性人單克隆抗體的雜交瘤的方法。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，用腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞膜在活體外使正常人體脾細(xì)胞免疫。接著使所述免疫脾細(xì)胞無(wú)限增生化來(lái)產(chǎn)生提供無(wú)限供應(yīng)的腫瘤特異性人單克隆抗體的雜交瘤。使用正常細(xì)胞作為雜交瘤來(lái)源極大放大了對(duì)治療癌癥所能獲得的不同腫瘤特異性抗體的組成部分。另外，在本發(fā)明的方法中用作抗原的細(xì)胞或細(xì)胞膜類型可視需要進(jìn)行變動(dòng)以便有效生產(chǎn)用于不同人體治療和診斷應(yīng)用的抗體。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)編碼人體腫瘤特異性單克隆抗體的核酸。這些核酸可用來(lái)表達(dá)經(jīng)編碼的人體抗體或其片斷。另外，編碼核酸可被重組工程來(lái)產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞展示出更高的親合性或更高的選擇性的經(jīng)改質(zhì)的人體抗體或功能片斷，或增大經(jīng)編碼的抗體的其他功能特征。所述經(jīng)改質(zhì)的抗體可以被額外構(gòu)造以含有其他治療上有利的改質(zhì)，例如與細(xì)胞毒素劑的關(guān)聯(lián)性得到提升或免疫系統(tǒng)的刺激得到增強(qiáng)。
在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明針對(duì)由腫瘤特異性人單克隆抗體識(shí)別的抗原。該抗原可以用在癌癥診斷程序中并生長(zhǎng)出用于癌癥治療的特異性細(xì)胞毒素劑。腫瘤特異性抗原也可用作疫苗并投藥到具有患癌癥的個(gè)體上以發(fā)展出針對(duì)贅生性細(xì)胞的有效免疫響應(yīng)。編碼腫瘤特異性抗原的核酸可用作診斷程序中的探針，或由重組法加以改質(zhì)來(lái)發(fā)展出抗原的特定抑制劑。
免疫球蛋白或抗體分子的基本結(jié)構(gòu)由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成，它們以非共價(jià)相關(guān)聯(lián)而且也可以通過(guò)二硫鍵來(lái)連接。每一條重鏈和輕鏈含有約110個(gè)氨基酸的胺基-末端可變區(qū)和在鏈的剩余部分中的恒定序列?？勺儏^(qū)包括幾個(gè)高變區(qū)、或形成抗體分子的抗原-結(jié)合位點(diǎn)并決定其特異性的互補(bǔ)-決定區(qū)(CDR)。在重鏈和輕鏈的CDR任一側(cè)為骨架區(qū)，即錨定和定向CDR的相對(duì)保守的氨基酸序列。恒定區(qū)由五條重鏈序列(μ、γ、δ、α、或ε)中的一條和兩條輕鏈中的一條(κ或λ)組成。重鏈恒定區(qū)序列決定該抗體的同型和該分子的效應(yīng)物功能。
本文所用術(shù)語(yǔ)“人單克隆抗體”用來(lái)指單克隆抗體，其包含的重鏈和輕鏈CDR氨基酸序列與特定人體免疫球蛋白中所發(fā)現(xiàn)的重鏈和輕鏈CDR氨基酸序列大體相同。與重鏈或輕鏈CDR大致相同的氨基酸序列與參考序列相比展示出相當(dāng)量或程度的序列同一性并且有利的促進(jìn)被具有參考序列的抗體所特異性結(jié)合的抗原進(jìn)行特異性結(jié)合。所述同一性在描繪特定人單克隆抗體的氨基酸序列時(shí)為確定已知的或可識(shí)別的。只要保留了結(jié)合特定抗原的能力，大體相同的重鏈和輕鏈CDR氨基酸序列可以進(jìn)行(例如)氨基酸的微小改質(zhì)或保守取代。術(shù)語(yǔ)“人單克隆抗體”用來(lái)包括用淋巴細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞(例如)通過(guò)重組法來(lái)產(chǎn)生的具有大體的人CDR氨基酸序列的單克隆抗體。
本文所用術(shù)語(yǔ)“大體上相同”當(dāng)用于指氨基酸序列時(shí)用來(lái)指一個(gè)具有與參考氨基酸序列充足的結(jié)構(gòu)同一性或相似性以被所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)為具有參考氨基酸序列所編碼的多肽或其片斷的特定功能的氨基酸序列。該術(shù)語(yǔ)可以包括初級(jí)結(jié)構(gòu)的同一性或相似性，其在所屬領(lǐng)域中也分別稱為序列同一性或序列相似性。與抗體或其功能片斷之參考序列大體上相同的氨基酸序列可以具有與參考序列至少70％相同的初級(jí)結(jié)構(gòu)，其包括(例如)與參考序列至少80％、至少83％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％相同的序列。所述術(shù)語(yǔ)可以包括三級(jí)結(jié)構(gòu)同一性或相似性，其中把三級(jí)結(jié)構(gòu)理解為指功能活性抗體或其片斷的三維結(jié)構(gòu)。所述術(shù)語(yǔ)中包括的特定功能可為特定于通過(guò)參考氨基酸序列來(lái)編碼的多肽或其片斷的任何生物活性，其包括(例如)對(duì)贅生性細(xì)胞或其抗原的特異性結(jié)合。
與參考序列大體上相同的核酸序列包括對(duì)相同的多肽氨基酸序列進(jìn)行編碼的核酸序列。在所屬領(lǐng)域中一般把彼此互不相同但編碼相同的氨基酸序列的核酸序列稱為由于遺傳密碼退化而具有不活動(dòng)的差異性(silent difference)。所細(xì)胞群。在隨后的傳代中，通常為7天的間隔，hMSC生長(zhǎng)為緊密堆積的紡錘狀細(xì)胞輪。在5周末(第4代)，hMSC產(chǎn)生5.4-6.6×107的細(xì)胞(表2)。
表2 hMSC生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

體外大鼠脾細(xì)胞和hMSC之間的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)以及細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答與未刺激的脾細(xì)胞相比，hMSC顯著增強(qiáng)健康大鼠脾細(xì)胞的增殖(刺激指數(shù)＝18.8)(圖2A)。注射了hMSC的大鼠的脾細(xì)胞增殖在體外由hMSC再刺激后也增加(刺激指數(shù)＝15.6)；不過(guò)，這些細(xì)胞中的增殖應(yīng)答與健康大鼠脾細(xì)胞的沒(méi)有顯著差異。這些數(shù)據(jù)顯示雖然hMSC能夠誘導(dǎo)大鼠脾淋巴細(xì)胞的初級(jí)增殖應(yīng)答，向大鼠給藥hMSC未能在體內(nèi)致敏淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外的次級(jí)增殖應(yīng)答。
圖8A顯示了大鼠脾細(xì)胞和人類骨髓基質(zhì)細(xì)胞(hMSC)之間的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)2×105健康大鼠脾細(xì)胞(N-Spl)或者2周前用hMSC靜脈內(nèi)處理的大鼠脾細(xì)胞(T-Spl)以10∶1的應(yīng)答細(xì)胞∶刺激細(xì)胞比和或不和輻射的(20Gy)hMSC一式三份培養(yǎng)96小時(shí)。培養(yǎng)物由3H-脫氧胸苷(0.25μCi/孔)脈沖16小時(shí)，然后由自動(dòng)細(xì)胞收集器收集。并通過(guò)液閃測(cè)量3H-脫氧胸苷的摻入。在由hMSC處理和未處理的大鼠獲得的脾細(xì)胞之間未檢測(cè)到差異。SI＝刺激指數(shù)。(B)大鼠脾細(xì)胞(1×107)域。所述術(shù)語(yǔ)描述于(例如)Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989)；Molec.Biology andBiotechnologyA Comprehensive Desk Reference(Myers，R.A.(ed.)，New YorkVCH Publisher，Inc.)；Huston等人，Cell Biophysics.22189-224(1993)；Plückthun和Skerra，Meth.Enzymol..178497-515(1989)以及Day，E.D.，Advanced Immunochemistry，第二版，Wiley-Liss，Inc.，New York，NY(1990)，它們以引用的方式并入本文中。術(shù)語(yǔ)功能片斷用以包括(例如)通過(guò)蛋白酶消化或減少人單克隆抗體并通過(guò)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的重組DNA方法所產(chǎn)生的片斷。
本文所用術(shù)語(yǔ)“VL片斷”是指包括所有或部分的輕鏈可變區(qū)(其包括CDR)的人單克隆抗體的輕鏈片斷。VL片斷可進(jìn)一步包括輕鏈恒定區(qū)序列。
本文所用術(shù)語(yǔ)“Fd片斷”是指包括所有或部分的重鏈可變區(qū)(其包括CDR)的人單克隆抗體的重鏈片斷。Fd片斷可以進(jìn)一步包括重鏈恒定區(qū)序列。
本文所用術(shù)語(yǔ)“Fv片斷”是指人單克隆抗體的單價(jià)抗原-結(jié)合片斷，其包括重鏈和輕鏈的所有或部分可變區(qū)，而且缺少重鏈和輕鏈的恒定區(qū)。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包括(例如)CDR。例如，F(xiàn)v片斷包括重鏈和輕鏈兩者的約110個(gè)氨基酸的所有或部分胺基末端可變區(qū)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“Fab片斷”是指大于Fv片斷的人單克隆抗體的單價(jià)抗原-結(jié)合性片斷。例如，F(xiàn)ab片斷包括重鏈和輕鏈的可變區(qū)、以及所有或部分的第一恒定域。因此，F(xiàn)ab片斷額外包括(例如)重鏈和輕鏈的約110到約220的氨基酸殘基。
本文所用術(shù)語(yǔ)“Fab′片斷”是指大于Fv片斷的人單克隆抗體的單價(jià)抗原-結(jié)合片斷。例如，F(xiàn)ab′片斷包括所有輕鏈、重鏈的所有可變區(qū)、以及重鏈的所有或部分的第一和第二恒定域。例如，F(xiàn)ab′片斷可以額外包括一些或所有的重鏈的220到330氨基酸殘基。
本文所用術(shù)語(yǔ)“F(ab′)2片斷”是指人單克隆抗體的二價(jià)抗原-結(jié)合片斷。F(ab′)2片斷包括(例如)兩條重鏈和兩條輕鏈的所有或部分可變區(qū)，而且可以進(jìn)一步包括兩條重鏈和兩條輕鏈的所有或部分的第一恒定域。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員知道人單克隆抗體片斷的確切邊界會(huì)有變動(dòng)，只要所述片斷保持功能活性。利用熟知的重組法，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)核酸來(lái)表達(dá)具有用于特定用途的想要端點(diǎn)的功能片斷。
本文所用術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”用以指可被附著于本發(fā)明的人單克隆抗體或其他分子的部分。可將部分用于(例如)治療或診斷程序。
治療標(biāo)記物包括(例如)可被附著于本發(fā)明的分子并用來(lái)減少贅生性細(xì)胞不受控制的增生或存活能力的部分。能降低細(xì)胞增生或存活的標(biāo)記物可以是(例如)細(xì)胞毒素劑或細(xì)胞抑制劑、增長(zhǎng)因子、細(xì)胞死亡受體收縮劑或免疫調(diào)諧劑。
診斷標(biāo)記物包括(例如)可通過(guò)分析方法檢測(cè)的部分。分析方法包括(例如)定性和定量程序。定性分析方法包括(例如)免疫組織化學(xué)和間接免疫熒光法。定量分析方法包括(例如)免疫親合程序，如放射免疫分析、ELISA或FACS分析。分析方法還包括活體外和活體內(nèi)的成像程序?？赏ㄟ^(guò)分析方法檢測(cè)的診斷標(biāo)記物的具體實(shí)例包括酶、放射性同位素、發(fā)色團(tuán)、熒光染料、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、及生物素。
標(biāo)記物可以直接附著于本發(fā)明的分子上，或附著于特異性結(jié)合本發(fā)明的分子的二級(jí)結(jié)合劑上。所述二級(jí)結(jié)合劑可以為(例如)二級(jí)抗體。二級(jí)抗體可為多克隆或單克隆的，而且來(lái)源于人類、嚙齒動(dòng)物或嵌合體。
本文所用術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒素劑或細(xì)胞抑制劑”用以指減少細(xì)胞的存活能力或增生潛力的藥劑。所述藥劑可以附著于(例如)本發(fā)明的人單克隆抗體或其他分子上并且用來(lái)瞄準(zhǔn)細(xì)胞或組織。被瞄準(zhǔn)的細(xì)胞和組織可以包括(例如)贅生性細(xì)胞和腫瘤。被瞄準(zhǔn)的細(xì)胞和組織的實(shí)例包括衍生自乳房、肺部及卵巢組織的細(xì)胞和組織。細(xì)胞毒素劑或細(xì)胞抑制劑能夠以多種方式發(fā)揮作用來(lái)減少細(xì)胞的存活能力或增生能力。所述功能包括(例如)抑制DNA合成、抑制細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、或誘導(dǎo)非凋亡性殺死細(xì)胞。細(xì)胞毒素劑和細(xì)胞抑制劑的具體實(shí)例包括美洲商陸抗病毒蛋白、相思豆毒素、蓖麻蛋白和它們的A鏈、亞德里亞霉素(doxorubicin)、順鉑、碘-131、釔-90、錸-188、.鉍-212、紅豆杉醇、5-氟尿嘧啶VP-16、博萊霉素、氨甲喋呤、去乙酰長(zhǎng)春酰胺、阿霉素(adriamycin)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、BCNU、絲裂霉素及環(huán)磷酰胺以及例如TNF-α和TNF-β的某些細(xì)胞因子。細(xì)胞毒素劑或細(xì)胞抑制劑可以包括(例如)放射性核、化療藥物、蛋白質(zhì)及凝集素。
本文所用術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”用以指人單克隆抗體或其功能片斷與抗原的選擇性交互作用。由于所述交互作用具有選擇性，人單克隆抗體不會(huì)大體上結(jié)合、或被制成不會(huì)大體上結(jié)合到除特定抗原以外的標(biāo)記上。特異性結(jié)合可以包括(例如)約105M-1或更高的相關(guān)常數(shù)(Ka)。因此，特異性結(jié)合可包括至少約1×106M-1、1×107M-1、或1×108M-1、1×109M-1、1×1010M-1、1×1011M-1或1×1012M-1的相關(guān)常數(shù)。特異性結(jié)合還可包括(例如)高活性交互作用。
本文所用術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指一種病理狀況，其特征在于存在贅生性細(xì)胞。贅生性細(xì)胞是展示出非正常形態(tài)學(xué)或增生顯型的細(xì)胞。所述細(xì)胞的特征在于(例如)不依賴于錨基的細(xì)胞生長(zhǎng)、在減少的血清培養(yǎng)基中增生、并且喪失接觸抑制。所述細(xì)胞還以(例如)組織的非正常更新生長(zhǎng)(如腫瘤、促使血管新生的脈管系統(tǒng))、及入侵到周圍組織為特征。贅生性細(xì)胞也可以從原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移到人體中的其他位置。例如，乳房、肺部或卵巢細(xì)胞的腫瘤雖然仍可識(shí)別為由乳房、肺部或卵巢細(xì)胞來(lái)組成的，但會(huì)轉(zhuǎn)移到其他器官上。因此，涉及乳房、肺部或卵巢時(shí)術(shù)語(yǔ)“腫瘤”或“癌癥”用以包括這些腫瘤向身體的其它器官的轉(zhuǎn)移。
本文所用術(shù)語(yǔ)“有效量”用來(lái)指可以減少贅生性細(xì)胞增生的本發(fā)明的分子的量?？杀徽J(rèn)為是對(duì)于一個(gè)具體應(yīng)用的有效量的實(shí)際量可能取決于(例如)一些因素，如親合性、活動(dòng)性、穩(wěn)定性、分子的生物利用率或選擇性、附著于分子上的部分、藥物載劑以及投藥途徑。利用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法可以決定或推斷出有效量。所述方法包括(例如)用經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞或組織活體切片以及可靠的動(dòng)物模型所作的活體外分析。
本文所用術(shù)語(yǔ)“經(jīng)分離的”當(dāng)用于指抗體時(shí)，是指從一種或多種化合物中分離出來(lái)，所述化合物被發(fā)現(xiàn)本質(zhì)上具有抗體或在合成反應(yīng)中用來(lái)產(chǎn)生抗體，包括(例如)反應(yīng)物、前驅(qū)體或其它反應(yīng)產(chǎn)物。經(jīng)分離的試劑也可包括大體上純凈的試劑。該術(shù)語(yǔ)可以包括自然產(chǎn)生的分子(如生物合成反應(yīng)的產(chǎn)物)或合成分子。
本發(fā)明提供人單克隆抗體或功能片斷，其具有的至少一個(gè)CDR大體上為SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的CDR的氨基酸序列。本發(fā)明也提供人單克隆抗體或功能片斷，其具有的至少一個(gè)CDR大體上為SEQ ID NO6或SEQ IDNO8的CDR的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供由雜交瘤細(xì)胞系H1140、H2420及H935產(chǎn)生的人單克隆抗體或功能片斷。也提供雜交瘤細(xì)胞系H1140、H2420及H935。
由雜交瘤細(xì)胞系LH11238、LH13、H1140、H2420及H935產(chǎn)生的人單克隆抗體都展示出(與正常細(xì)胞相比)對(duì)贅生性細(xì)胞的特異性結(jié)合，而因此成為腫瘤特異性人單克隆抗體。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的人單克隆抗體都選擇性的結(jié)合乳癌細(xì)胞并且顯示出相對(duì)而言幾乎不結(jié)合正常纖維。例如，與正常纖維原細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞或肺部癌細(xì)胞相比，LH11238抗體特異性結(jié)合出現(xiàn)在乳房和卵巢癌細(xì)胞的表面和溶酶體間室的抗原。與正常纖維原細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞相比，LH13抗體特異性結(jié)合由乳房、肺部及卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生的產(chǎn)物。
由雜交瘤系H1140、H2420、H935及LH13產(chǎn)生的人單克隆抗體是IgM同型和λ輕鏈類的，但是由雜交瘤系LH11238產(chǎn)生的人單克隆抗體是IgM同型和K輕鏈類的。在以下實(shí)例中描述了腫瘤特異性人單克隆抗體進(jìn)一步的特性。
對(duì)由LH11238細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體的重鏈可變區(qū)(VH)進(jìn)行編碼的核苷酸序列已經(jīng)被測(cè)定并指定為SEQ ID NO1。將由LH11238細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體的VH氨基酸序列指定為SEQ ID NO2。對(duì)由LH11238細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)(VL)進(jìn)行編碼的核苷酸序列也已經(jīng)被測(cè)定并指定為SEQ ID NO3。將由LH11238細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體的VL氨基酸序列指定為SEQ ID NO4。
編碼由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體的重鏈可變區(qū)(VL)的核苷酸序列也已經(jīng)被測(cè)定并指定為SEQ ID NO5。由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體的VL氨基酸序列被指定為SEQ ID NO6。編碼由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)(VL)的核苷酸序列也已經(jīng)被測(cè)定并指定為SEQ ID NO7。由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體的VL氨基酸序列被指定為SEQ ID NO8。
本發(fā)明進(jìn)一步提供經(jīng)分離的人單克隆抗體或其功能片斷，其具有的至少一個(gè)CDR大體上具有選自由以下SEQ ID NO組成的群組的序列的CDR氨基酸序列10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44，其中人單克隆抗體或其功能片斷特異性結(jié)合贅生性細(xì)胞或其抗原。
由本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞系(如LH13和LH11238細(xì)胞系)產(chǎn)生的人單克隆抗體的變體能展示出(與正常細(xì)胞相比)對(duì)贅生性細(xì)胞的特異性結(jié)合，而且因此成為腫瘤特異性人單克隆抗體。在實(shí)例VIII和表5中描述了由雜交瘤細(xì)胞系LH13和LH11238產(chǎn)生的人單克隆抗體的功能變體和生產(chǎn)它們的方法。
由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生、特異性結(jié)合于贅生性細(xì)胞的抗原的人單克隆抗體的功能變體列于表5中而且包括(例如)由克隆體S97G、S97T或S97N產(chǎn)生的抗體片斷，其每一個(gè)具有未經(jīng)改質(zhì)的VL和在SEQ ID NO6中所設(shè)定的序列的101位點(diǎn)上加以改質(zhì)的VH，根據(jù)Kabat等人的編號(hào)系統(tǒng)所述改質(zhì)在HCDR3的97位點(diǎn)上。由克隆體S97G產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQ ID NO10的VH氨基酸序列中所設(shè)定的Kabat HCDR3的97位點(diǎn)上具有一個(gè)甘氨酸，SEQ ID NO10的VH氨基酸序列由在SEQ ID NO9中所設(shè)定的核苷酸序列來(lái)編碼。由克隆S97T產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQ ID NO12的VH氨基酸序列中所設(shè)定的KabatHCDR3的97位點(diǎn)上具有一個(gè)蘇氨酸而且由如在SEQ ID NO11中所設(shè)定的核苷酸序列來(lái)編碼。由克隆體S97N產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQ ID NO14的VH氨基酸序列中所設(shè)定的Kabat HCDR3的97位點(diǎn)上具有一個(gè)天冬酰胺而且由如在SEQ ID NO13中所設(shè)定的核苷酸序列來(lái)編碼。
由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體的其它功能變體也包括由克隆體R91Y或R91F產(chǎn)生的抗體片斷，其每一個(gè)具有未經(jīng)改質(zhì)的VH和在SEQ IDNO8中所設(shè)定的序列的90位點(diǎn)上加以改質(zhì)的VL，根據(jù)Kabat等人的編號(hào)系統(tǒng)所述改質(zhì)在LCDR3的91位點(diǎn)上。由克隆體R91Y產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQID NO16的VL氨基酸序列中所設(shè)定的Kabat LCDR3的91位點(diǎn)上具有一個(gè)酪氨酸，SEQ ID NO16的VL氨基酸序列由在SEQ ID NO15中所設(shè)定的核苷酸序列來(lái)編碼。由克隆體R91F產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQ ID NO18的VL氨基酸序列中所設(shè)定的Kabat LCDR3的91位點(diǎn)上具有一個(gè)苯基丙氨酸，SEQ IDNO18的VL氨基酸序列由在SEQ ID NO17中所設(shè)定的核苷酸序列來(lái)編碼。
如由克隆體V97Y和V97F產(chǎn)生的抗體片斷所例示，由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體的其它功能變體可以在SEQ ID NO8中所設(shè)定的VL序列的98位點(diǎn)上加以改質(zhì)，同時(shí)保留一個(gè)未經(jīng)改質(zhì)的VH，根據(jù)Kabat等人的編號(hào)系統(tǒng)所述改質(zhì)在LCDR3的97位點(diǎn)上。由克隆體V97Y產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQ IDNO20的VL氨基酸序列中所設(shè)定的Kabat LCDR3的97位點(diǎn)上具有一個(gè)酪氨酸，SEQ ID NO20的VL氨基酸序列由在SEQ ID NO19中所設(shè)定的核苷酸序列來(lái)編碼。由克隆體V97Y產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQ ID NO22的VL氨基酸序列中所設(shè)定的Kabat LCDR3的97位點(diǎn)上具有一個(gè)酪氨酸，SEQ ID NO22的VL氨基酸序列由在SEQ ID NO21中所設(shè)定的核苷酸序列來(lái)編碼。
由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的、特異性結(jié)合到贅生性細(xì)胞的抗原上的人單克隆抗體的組合變體也列在表5中，而且包括(例如)由克隆體4D5、4E2、4H7、4G11或3G4產(chǎn)生的抗體片斷。與由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體相比，把由克隆體4D5產(chǎn)生的抗體片斷加以改質(zhì)以在Kabat LCDR3的97位點(diǎn)上具有一個(gè)蘇氨酸且在Kabat LCDR3的91位點(diǎn)上具有一個(gè)酪氨酸。4D5 VH的氨基酸序列設(shè)定于SEQ ID NO12中并且由設(shè)定于SEQ ID NO11的核苷酸序列來(lái)編碼，而且VL氨基酸序列設(shè)定于SEQ ID NO16中并且由設(shè)定于SEQ IDNO15的核苷酸序列來(lái)編碼。
與由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體相比，把由克隆體4E2產(chǎn)生的組合變體加以改質(zhì)以在Kabat HCDR3的97位點(diǎn)上具有一個(gè)蘇氨酸、在KabatLCDR3的91位點(diǎn)上具有一個(gè)酪氨酸、以及在Kabat LCDR3的97位點(diǎn)上具有一個(gè)苯基丙氨酸。4E2 VH的氨基酸序列設(shè)定于SEQ ID NO12中并由設(shè)定于SEQ ID NO11中的核苷酸序列來(lái)編碼而且VL氨基酸序列設(shè)定于SEQ IDNO24中并由設(shè)定于SEQ ID NO23的核苷酸序列來(lái)編碼。
與由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體相比，把由克隆4H7產(chǎn)生的組合變體加以改質(zhì)以在Kabat HCDR3的97位點(diǎn)上具有一個(gè)蘇氨酸、在Kabat LCDR3的91位點(diǎn)上具有一個(gè)苯基丙氨酸、以及在Kabat LCDR3的97位點(diǎn)上具有一個(gè)苯基丙氨酸。4H7 VH的氨基酸序列設(shè)定于SEQ ID NO12中并由設(shè)定于SEQID NO11中的核苷酸序列來(lái)編碼而且VL氨基酸序列設(shè)定于SEQ ID NO26中并由設(shè)定于SEQ ID NO25的核苷酸序列來(lái)編碼。
與由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體相比，把由克隆4G11產(chǎn)生的組合變體加以改質(zhì)以在在Kabat LCDR3的91位點(diǎn)上具有一個(gè)苯基丙氨酸、以及在Kabat LCDR3的97位點(diǎn)上具有一個(gè)苯基丙氨酸。4G11 VH的氨基酸序列設(shè)定于SEQ ID NO6中并由設(shè)定于SEQ ID NO5中的核苷酸序列來(lái)編碼而且VL氨基酸序列設(shè)定于SEQ ID NO26中并由設(shè)定于SEQ ID NO25的核苷酸序列來(lái)編碼。
與由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體相比，把由克隆3G4產(chǎn)生的組合變體加以改質(zhì)以在在Kabat LCDR3的91位點(diǎn)上具有一個(gè)酪氨酸、以及在KabatLCDR3的97位點(diǎn)上具有一個(gè)苯基丙氨酸。3G4 VH的氨基酸序列設(shè)定于SEQID NO6中并由設(shè)定于SEQ ID NO5中的核苷酸序列來(lái)編碼而且VL氨基酸序列設(shè)定于SEQ ID NO24中并由設(shè)定于SEQ ID NO23的核苷酸序列來(lái)編碼。
由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生、結(jié)合于贅生性細(xì)胞上的人單克隆抗體的功能變體列于表5中且包括(例如)由克隆體Q89L、Q89G、Q89V、Q89F或Q89W產(chǎn)生的抗體片斷，其每一個(gè)具有一個(gè)未經(jīng)改質(zhì)的VH和在設(shè)定于SEQ ID NO4中的序列的97位點(diǎn)上加以改質(zhì)的VL，根據(jù)Kabat等人的編號(hào)系統(tǒng)所述改質(zhì)在LCDR3的89位點(diǎn)上。由克隆體Q89L產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQ ID NO28之VL氨基酸序列中所設(shè)定的Kabat LCDR3的89位點(diǎn)上具有一個(gè)亮氨酸(1uecine)，SEQ ID NO28之VL氨基酸序列由設(shè)定于SEQ ID NO27中的核苷酸序列來(lái)編碼。由克隆Q89G產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQ ID NO30的VL氨基酸序列中所設(shè)定的Kabat LCDR3的89位點(diǎn)上具有一個(gè)甘氨酸，SEQ IDNO30的VL氨基酸序列由設(shè)定于SEQ ID NO29中的核苷酸序列來(lái)編碼。由克隆Q89V產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQ ID NO32的VL氨基酸序列中所設(shè)定的Kabat LCDR3的89位點(diǎn)上具有一個(gè)纈氨酸，SEQ ID NO32的VL氨基酸序列由設(shè)定于SEQ ID NO31中的核苷酸序列來(lái)編碼。由克隆Q89F產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQ ID NO34之VL氨基酸序列中所設(shè)定的Kabat LCDR3的89位點(diǎn)上具有一個(gè)苯基丙氨酸，SEQ ID NO34之VL氨基酸序列由設(shè)定于SEQ IDNO33中的核苷酸序列來(lái)編碼。由克隆Q89W產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQ IDNO36的VL氨基酸序列中所設(shè)定的Kabat LCDR3的89位點(diǎn)上具有一個(gè)色氨酸，SEQ ID NO36的VL氨基酸序列由設(shè)定于SEQ ID NO35中的核苷酸序列來(lái)編碼。
由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體的其他功能變體也包括由克隆P95aF或P95aR產(chǎn)生的抗體片斷，其每一個(gè)具有一個(gè)未經(jīng)改質(zhì)的VH和在設(shè)定于SEQID NO4中的序列的103位點(diǎn)上加以改質(zhì)的VL，根據(jù)Kabat等人的編號(hào)系統(tǒng)所述改質(zhì)在LCDR3的95位點(diǎn)上。由克隆P95aF產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQ IDNO42的VL氨基酸序列中所設(shè)定的Kabat LCDR3的95位點(diǎn)上具有一個(gè)苯基丙氨酸，SEQ ID NO42的VL氨基酸序列由設(shè)定于SEQ ID NO41中的核苷酸序列來(lái)編碼。由克隆P95aR產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQ ID NO44的VL氨基酸序列中所設(shè)定的Kabat LCDR3的95位點(diǎn)上具有一個(gè)苯基丙氨酸，SEQ IDNO44的VL氨基酸序列由設(shè)定于SEQ ID NO43或SEQ ID NO45中的核苷酸序列來(lái)編碼。
如由克隆N93C所產(chǎn)生的抗體片斷所示范，可以把由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體的功能變體在SEQ ID NO4中所設(shè)定的VL序列的100位點(diǎn)上在LCDR3內(nèi)加以改質(zhì)，同時(shí)保留未經(jīng)改質(zhì)的VH。由克隆N93C所產(chǎn)生的抗體片斷在如SEQ ID NO38的VL氨基酸序列中所設(shè)定的Kabat LCDR3的93位點(diǎn)上具有一個(gè)半胱氨酸并且由設(shè)定于SEQ ID NO37中的核苷酸序列來(lái)編碼。如由克隆N94C所產(chǎn)生的抗體片斷所示，由LH13細(xì)胞系產(chǎn)生的人單克隆抗體的功能變體可以保留一個(gè)未經(jīng)改質(zhì)的VH且可以經(jīng)改質(zhì)以便在設(shè)定于SEQ IDNO40中的VL氨基酸序列的101位點(diǎn)(Kabat LCDR3的94位點(diǎn))上具有一個(gè)半胱氨酸并且由設(shè)定于SEQ ID NO39中的核苷酸序列來(lái)編碼。
通過(guò)用乳癌細(xì)胞將人脾細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行活體外免疫來(lái)生成產(chǎn)生本發(fā)明的腫瘤特異性人單克隆抗體的雜交瘤。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，通過(guò)把從異源人脾中分離出來(lái)的單細(xì)胞懸浮液共培養(yǎng)來(lái)建立混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)。隨后通過(guò)用單層或用乳癌細(xì)胞的富集血漿膜培育MLR培養(yǎng)物來(lái)富集腫瘤-反應(yīng)性淋巴細(xì)胞。為了提供本發(fā)明的人單克隆抗體的持久源，通過(guò)用K6H6/B5雜交骨髓瘤細(xì)胞系融合或用EBV轉(zhuǎn)化隨后用K6H6/B5細(xì)胞進(jìn)行融合使經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞無(wú)限增生化。在以下實(shí)例中更全面地描述了抗原的特定來(lái)源和用以產(chǎn)生本發(fā)明的每一種雜交瘤細(xì)胞系的無(wú)限增生化程序。
本發(fā)明的腫瘤特異性人單克隆抗體也可以通過(guò)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法來(lái)生成。這些方法包括(例如)腫瘤-反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的活體內(nèi)和活體外富集。例如，帶有乳房、肺部或卵巢腫瘤的個(gè)體可以擁有表達(dá)特異性結(jié)合腫瘤特異性抗原的抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體包括(例如)LH13、LH11238、H1140、H2420或H935抗原。所述淋巴細(xì)胞可以從(例如)外周血或從患者的脾分離出來(lái)，并且如下文所述被無(wú)限增生化。
所屬領(lǐng)域中也熟知利用腫瘤特異性抗原來(lái)活體外富集腫瘤-反應(yīng)性人類淋巴細(xì)胞的方法?？乖纯梢允?例如)大體上純凈的抗原、腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞餾分?？赏ㄟ^(guò)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的任何方法來(lái)制備大體上純凈的抗原，包括(例如)色譜、電泳分離以及免疫隔離?？捎糜谥苽浔景l(fā)明的人單克隆抗體的抗原可以是(例如)贅生性細(xì)胞。贅生性細(xì)胞可以是(例如)直接從腫瘤獲得的細(xì)胞、經(jīng)培養(yǎng)的原發(fā)腫瘤細(xì)胞或經(jīng)形成的細(xì)胞系。所述細(xì)胞可以發(fā)源于人體的任何器官、組織或液體，包括(例如)乳房、肺部或卵巢。癌癥細(xì)胞可以是未經(jīng)處理的、固定的或被生長(zhǎng)捕獲的?？墒褂冒?例如)化學(xué)固定的被所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的許多方法來(lái)進(jìn)行固定?？捎糜诠潭ǖ幕瘜W(xué)品包括(例如)多具甲醛、戊二醛、甲醇、或丙酮。另一選擇為可使用細(xì)胞抑制劑來(lái)生長(zhǎng)-捕獲細(xì)胞。細(xì)胞抑制劑的具體實(shí)例為絲裂霉素C。
可用于本發(fā)明的制備人單克隆抗體的抗原也可以是腫瘤細(xì)胞的餾分。腫瘤細(xì)胞餾分可以是(例如)細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物、或胞核。用于細(xì)胞分部分離的方法在所屬領(lǐng)域中為人所熟知。用于制備本發(fā)明的單克隆抗體的抗原也可以是由腫瘤細(xì)胞分泌的抗原?？梢酝ㄟ^(guò)(例如)使用所屬領(lǐng)域中已知的領(lǐng)域分離腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或細(xì)胞基質(zhì)來(lái)制備所述抗原。
如上所述來(lái)制備的抗原可以用來(lái)刺激人體淋巴細(xì)胞以生成本發(fā)明的腫瘤特異性人體單克隆抗體?？梢?例如)從活個(gè)體的外周血或從死亡個(gè)體或進(jìn)行外科手術(shù)的個(gè)體的脾來(lái)獲得人體淋巴細(xì)胞?？梢杂每乖苯优囵B(yǎng)淋巴細(xì)胞。另一選擇為，可以在異源淋巴細(xì)胞存在下在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中用抗原培養(yǎng)淋巴細(xì)胞?？梢杂伤鶎兕I(lǐng)域的技術(shù)人員很容易的決定對(duì)特定抗原和淋巴細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)條件。
若有需要，如上所述通過(guò)活體內(nèi)或活體外刺激來(lái)富集的已接觸抗原的(antigen-primed)淋巴細(xì)胞可以通過(guò)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的許多程序來(lái)進(jìn)行無(wú)限增生化。無(wú)限增生化提供了腫瘤特異性人單克隆抗體的持久來(lái)源?？梢酝ㄟ^(guò)(例如)用無(wú)限增生的細(xì)胞系進(jìn)行融合來(lái)完成淋巴細(xì)胞的無(wú)限增生化?？捎糜诩?xì)胞融合的所述無(wú)限增生的細(xì)胞系可以是(例如)人骨髓瘤細(xì)胞或人類淋巴母B細(xì)胞系。融合伙伴也可以是嚙齒動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞或人嚙齒動(dòng)物雜交骨髓瘤細(xì)胞系。雜交骨髓瘤細(xì)胞系可以是(例如)人小鼠異雜交瘤細(xì)胞系K6H6/B5。另一選擇為，可以使用(例如)病毒經(jīng)由轉(zhuǎn)化作用來(lái)把已接觸抗原的淋巴細(xì)胞無(wú)限增生化?？捎糜诮?jīng)由病毒轉(zhuǎn)化作用進(jìn)行無(wú)限增生化的病毒是EBV。已接觸抗原的淋巴細(xì)胞也可以在經(jīng)由病毒轉(zhuǎn)化作用進(jìn)行無(wú)限增生化后進(jìn)行融合。隨病毒轉(zhuǎn)化作用后進(jìn)行融合可以是(例如)隨EBV轉(zhuǎn)化作用后用K6H6/B5細(xì)胞系進(jìn)行融合。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易的確定用于淋巴細(xì)胞融合或病毒轉(zhuǎn)化作用的培養(yǎng)條件。使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的免疫測(cè)定可以篩檢經(jīng)無(wú)限增生化的淋巴細(xì)胞以用來(lái)生產(chǎn)特異性結(jié)合到人體腫瘤細(xì)胞的人單克隆抗體。所述免疫測(cè)定包括(例如)定量和定性免疫測(cè)定。定性免疫測(cè)定包括(例如)沉淀素方法、凝集素反應(yīng)、免疫組織化學(xué)、免疫熒光法、免疫點(diǎn)墨法及免疫沉淀反應(yīng)。定量免疫測(cè)定包括(例如)免疫親合方法，例如放射性免疫測(cè)定、FACS分析、及ELISA分析。ELISA分析可以為直接的、夾層的(sandwich)或競(jìng)爭(zhēng)的。免疫測(cè)定使用(例如)經(jīng)標(biāo)記的人單克隆抗體可以是直接的。另一選擇為所述方法使用(例如)經(jīng)標(biāo)記的抗-人二級(jí)抗體可以是間接的。標(biāo)記物可以是(例如)熒光標(biāo)記物、酶、放射性同位素、或生物素。依免疫測(cè)定而定，可以通過(guò)分光光度法、X光線照相術(shù)或化學(xué)發(fā)光方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。所述方法也可以用來(lái)篩檢經(jīng)改進(jìn)的抗體或其功能片斷，它們對(duì)贅生性細(xì)胞或其抗原具有增強(qiáng)了的親合性。
也可以在篩檢中根據(jù)與贅生性細(xì)胞或其抗原的已接觸抗原來(lái)鑒別經(jīng)改進(jìn)的抗體或其功能片斷。具體來(lái)說(shuō)，可以把經(jīng)改進(jìn)的抗體或其功能片斷鑒別為其與所衍生于的母抗體相比提高了相關(guān)率。使用所述篩檢，由于結(jié)合速率提高而具有改進(jìn)的治療效能的抗體或其功能片斷可以從由于結(jié)合速率降低對(duì)于相同的抗原具有增大Ka的結(jié)合多肽區(qū)別開來(lái)，所述結(jié)合速率降低不與治療效能有相互聯(lián)系。在這點(diǎn)上，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到根據(jù)KA＝kon/koff的關(guān)系，kon增大或koff減小或者兩者同時(shí)進(jìn)行都可以增大KA。
可以在任何非-平衡混合物中測(cè)定結(jié)合速率，所述混合物包括(例如)通過(guò)使抗體或其功能片斷與抗原快速接觸或通過(guò)快速改變含有結(jié)合伙伴的溶液溫度所形成的混合物。非-平衡混合物可以是預(yù)-平衡混合物?？梢酝ㄟ^(guò)(例如)在檢測(cè)箱中的總抗原和總抗體或其功能片斷的量恒定的條件下，使可溶性抗體或其功能片斷與可溶性抗原相接觸來(lái)形成預(yù)平衡混合物。測(cè)量在預(yù)-平衡混合物中的結(jié)合速率可以在格式中進(jìn)行，所述格式提供將抗體或其功能片斷與抗原快速混合并且在毫秒或更快的時(shí)間量程上快速檢測(cè)抗體或其功能片斷或者抗原的特性改變。諸如下文所描述的和停止流動(dòng)和快速猝滅流動(dòng)的儀器提供了測(cè)量非平衡動(dòng)力學(xué)的便利方法。也可以測(cè)量非-平衡混合物中的結(jié)合速率，該非平衡混合物包括(例如)含有可溶性種類的抗體或其功能片斷的溶液、或含有可變濃度的總抗原或者總抗體或其功能片斷的溶液。測(cè)量在非平衡混合物中的結(jié)合速率可以在格式中進(jìn)行，所述格式提供將抗原附著到在表面上含有抗體或其功能片斷的溶液表面及連續(xù)流上，或反過(guò)來(lái)與快速檢測(cè)抗體或其功能片斷、抗原或表面的特性改變相組合，以使得測(cè)量在毫秒或更快的時(shí)間量程上進(jìn)行。
用于在預(yù)平衡混合物中測(cè)量結(jié)合速率的格式包括(例如)停止流動(dòng)動(dòng)力學(xué)儀器和快速猝滅流動(dòng)儀器。停止流動(dòng)儀器可用來(lái)把含有抗體或其功能片斷的溶液和抗原在通過(guò)檢測(cè)池之前從分開的儲(chǔ)槽推到混合箱內(nèi)。接著所述儀器可以檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)上述特性的改變來(lái)監(jiān)控結(jié)合事件的進(jìn)展?？焖兮缌鲃?dòng)儀器可用來(lái)把含有抗體或其功能片斷的溶液與含有抗原的溶液快速混合隨后在經(jīng)過(guò)有限量的時(shí)間后猝滅結(jié)合反應(yīng)。接著可以對(duì)通過(guò)隨混合后在不同時(shí)間猝滅所產(chǎn)生的猝滅混合物檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)上述特性的改變?？梢酝ㄟ^(guò)(例如)冷凍或添加化學(xué)猝滅劑來(lái)進(jìn)行猝滅，只要所述猝滅步驟不會(huì)抑制為結(jié)合率測(cè)量所依賴的特性的檢測(cè)。因此，快速猝滅儀器可用在(例如)不方便進(jìn)行光譜檢測(cè)的情況下?？梢詮睦鏚inTek Corp.(State College，PA)和Hi-Tech Scientific(Salisbury，UK)的供貨商處購(gòu)得多種儀器。
用于在非平衡混合物中測(cè)量結(jié)合速率的格式包括(例如)表面等離子共振和衰減波儀器。表面等離子共振和衰減波技術(shù)利用附著在一個(gè)生物傳感器表面的抗原或者抗體或其功能片斷。使含有各自的結(jié)合伙伴的溶液穿過(guò)生物傳感器表面而且可以用依賴于時(shí)間的方式測(cè)量依據(jù)結(jié)合而發(fā)生在芯片表面的溶液折射率的變化。例如，表面等離子共振基于當(dāng)在金屬/液體界面激發(fā)表面等離子波時(shí)所發(fā)生的現(xiàn)象。光線被不和樣品相接觸的表面定向或從其反射，而且SPR引起在角度和波長(zhǎng)的特定組合處被反射的光強(qiáng)度減少。生物分子結(jié)合事件引起表面層折射率的變化，其作為SPR信號(hào)的變化而被檢測(cè)。結(jié)合事件可以是受體-配位子對(duì)之間結(jié)合的結(jié)合或解離?；旧夏軌蛄⒓礈y(cè)量到折射率的變化而因此允許了測(cè)定親合性常數(shù)的個(gè)體成分。更具體來(lái)說(shuō)，所述方法使得能夠精確測(cè)量結(jié)合速率常數(shù)(kon)和解離速率常數(shù)(koff)。所屬領(lǐng)域中可用的表面等離子共振儀器包括(例如)BIAcore儀器、IBIS系統(tǒng)、SPR-CELLIA系統(tǒng)、Spreeta、而且等離子SPR和共振波技術(shù)可用在Iasys系統(tǒng)中，其描述于(例如)Rich和Myszka，Curr.Qpin.Biotech.1154-61(2000)。
在結(jié)合事件過(guò)程中，使用(例如)上文所述的方法在一個(gè)或多個(gè)離散時(shí)間間隔(discreet time interval)處通過(guò)測(cè)量配位子或結(jié)合多肽的特性來(lái)測(cè)定相關(guān)率。在結(jié)合事件過(guò)程中于離散時(shí)間間隔測(cè)定的測(cè)量可被用來(lái)決定結(jié)合速率的定量測(cè)量或結(jié)合速率的相對(duì)測(cè)量。結(jié)合速率的定量測(cè)量可以包括(例如)結(jié)合速率值或kon值?？梢詮碾S時(shí)間變化的測(cè)量的數(shù)學(xué)分析或圖形分析來(lái)測(cè)定結(jié)合速率或kon的定量值。所述分析在所屬領(lǐng)域中為人所熟知而且包括用于擬合數(shù)據(jù)到指數(shù)或線性項(xiàng)的總和的運(yùn)算法則或用于計(jì)算機(jī)模擬以擬合數(shù)據(jù)到結(jié)合模型，其描述于(例如)Johnson，Cur.Opin.Biotech.987-89(1998)。
如果在反應(yīng)中算入質(zhì)量傳輸?shù)挠绊?，那么使用例如上文所述的?shù)學(xué)分析或圖形分析可以從含有可溶性種類或可變濃度的全部配位子或全部結(jié)合多肽的混合物來(lái)測(cè)定結(jié)合速率。所述領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠通過(guò)比較在具有與質(zhì)量傳輸相似的限制性的條件下的結(jié)合速率或通過(guò)根據(jù)所屬領(lǐng)域中可獲得的模型調(diào)整計(jì)算出的結(jié)合速率來(lái)計(jì)算質(zhì)量傳輸，所述模型包括(例如)描述于Myszka等人，Biophys.J.75583-594(1998)中的模型。
用于針對(duì)腫瘤反應(yīng)性進(jìn)行篩檢單克隆抗體的腫瘤特異性抗原不需要同用于使人淋巴細(xì)胞免疫的抗原相同。用在篩檢中的抗原可以是(例如)大體上經(jīng)提純的抗原、活的或經(jīng)固定的腫瘤細(xì)胞單層、活的或經(jīng)固定的腫瘤細(xì)胞懸浮液、腫瘤細(xì)胞的餾分、或腫瘤活組織檢測(cè)的區(qū)段，其取決于所用的分析程序。腫瘤細(xì)胞可以是(例如)人乳房、卵巢或肺部癌細(xì)胞。
本發(fā)明的腫瘤特異性人單克隆抗體和功能片斷不結(jié)合、或最低限度的結(jié)合、或被制成僅最低限度的結(jié)合到正常細(xì)胞抗原上。正常細(xì)胞或正常細(xì)胞的餾分可被用作對(duì)篩檢人單克隆抗體的對(duì)照。所述正常細(xì)胞可以是(例如)活的或經(jīng)固定的正常組織或經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞系?？杀挥米鲗?duì)照的經(jīng)培養(yǎng)的正常細(xì)胞系包括(例如)人纖維原細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞。雖然任何正常細(xì)胞都可被用作對(duì)照，具體對(duì)照的選擇部分基于被篩檢的具體的腫瘤特異性單克隆抗體的特異性。例如，如果針對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生并篩檢人腫瘤特異性單克隆抗體，接著那么可用作比較的一類正常細(xì)胞是正常上皮細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系。近似的，如果針對(duì)肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生并篩檢人腫瘤特異性單克隆抗體，那么可用作比較的一類正常細(xì)胞是正常纖維原細(xì)胞或細(xì)胞系。來(lái)自相同的組織類型或從相同的個(gè)體的正常細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系也可以提供正常對(duì)照。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)知道什么是合適類型的正常細(xì)胞，其可用作測(cè)定特異性結(jié)合到具體類型的腫瘤細(xì)胞的對(duì)照。
可以提純并定量化腫瘤特異性人單克隆抗體或其功能片斷以用于免疫診斷和免疫治療程序中。所述提純方法為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知而且取決于人單克隆抗體的來(lái)源和具體應(yīng)用。提純方法可包括(例如)沉淀、電泳、色譜、及免疫親合提純?？梢允褂盟鶎兕I(lǐng)域中已知的分光光度法或免疫測(cè)定將經(jīng)提純的抗體定量化與已知的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照相對(duì)比。
為了進(jìn)一步表征腫瘤特異人單克隆抗體，也可通過(guò)免疫測(cè)定法測(cè)量單獨(dú)的重鏈和輕鏈多肽的存在來(lái)測(cè)定它們的種類和亞類。所述免疫測(cè)定法包括ELISA測(cè)定而且為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知。本發(fā)明還包括本發(fā)明的腫瘤特異性人單克隆抗體的功能片斷。人單克隆抗體的功能片斷保持例如特異性結(jié)合或效應(yīng)物功能的生物活性。因此功能片斷可被有利地用來(lái)檢測(cè)和治療癌癥。
功能片斷包括具有與本發(fā)明的腫瘤特異性人單克隆抗體大體相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)的片斷。例如，功能片斷包括其中至少一條CDR序列由與本發(fā)明的腫瘤特異性人單克隆抗體的CDR序列大體上相同的氨基酸序列組成的功能片斷。所述功能片斷包括(例如)VL、Fd、Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fc及CDR片斷。例如，功能片斷可能具有本發(fā)明的人單克隆抗體的VL的三條CDR序列中的一個(gè)或多個(gè)、VH的三條CDR序列中的一個(gè)或多個(gè)、或VL和VH CDR的組合。可以由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員依靠功能片斷的所要親合性和特異性及所希望的用途來(lái)決定VL和VH CDR序列的合適數(shù)量和組合。
使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法可以很容易地產(chǎn)生并分離本發(fā)明的人單克隆抗體的功能片斷。所述方法包括(例如)蛋白水解方法、重組法及化學(xué)合成。用來(lái)分離功能片斷的蛋白水解方法使用人單克隆抗體作為起始材料。適于蛋白水解人單克隆抗體的酶包括(例如)木瓜蛋白酶、胃蛋白酶及彈性蛋白。依(例如)需要單價(jià)片斷還是二價(jià)片斷而定，由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易的選擇適當(dāng)?shù)拿?。例如，木瓜蛋白酶分裂得到兩個(gè)結(jié)合抗原和Fc片斷的單價(jià)Fab1片斷。胃蛋白酶(例如)導(dǎo)致二價(jià)F(ab′)2片斷?？梢允褂?例如)DTT或β-巰基乙醇進(jìn)一步還原本發(fā)明的F(ab′)2片斷亦產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab1片斷。
可以通過(guò)親合性和柱色譜程序來(lái)提純由蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的功能片斷。例如，未經(jīng)消化的抗體和Fc片斷往往通過(guò)結(jié)合到蛋白質(zhì)A來(lái)移除。另外，使用(例如)離子交換和凝膠過(guò)濾色譜利用功能片斷的電荷和尺寸把它們提純。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知所述方法。
用于產(chǎn)生人單克隆抗體的功能片斷的重組法開始于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的所要區(qū)域的經(jīng)分離的核酸。所述區(qū)域可以包括(例如)所有或部分的重鏈和輕鏈的可變區(qū)。所述區(qū)域可以具體包括重鏈和輕鏈的CDR。
本發(fā)明提供編碼人單克隆抗體或其功能片斷的經(jīng)分離的核酸，其具有大體上對(duì)至少一條下述CDR的氨基酸序列進(jìn)行編碼的核苷酸序列，所述CDR通過(guò)選自由以下SEQ ID NO組成的群組的核苷酸序列進(jìn)行編碼1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45。本發(fā)明還包括對(duì)可變區(qū)域編碼的經(jīng)分離的核酸，其具有對(duì)下述CDR的氨基酸序列進(jìn)行編碼的核苷酸序列，該CDR通過(guò)選自由以下SEQ ID NO組成的群組的核苷酸序列進(jìn)行編碼1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45。也提供編碼CDR的經(jīng)分離的核酸，其大體上具有由以下SEQ ID NO編碼的CDR氨基酸序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45。
可以使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法編碼本發(fā)明的人單克隆抗體或其功能片斷的核酸。用來(lái)分離所述DNA的有用程序開始于能夠從產(chǎn)生腫瘤特異性特單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的RNA反向-轉(zhuǎn)錄的cDNA。用于cDNA合成的方法在所屬領(lǐng)域中為人所熟知。使用(例如)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可以放大對(duì)重鏈或輕鏈的功能片斷進(jìn)行編碼的cDNA。PCR技術(shù)是美國(guó)專利第4,683,195、第4,800,159號(hào)、第4,754,065號(hào)、及第4,683,202號(hào)的主題，所述所有專利以引用的方式并入本文中。用于PCR的適當(dāng)引子為人所知并且可以由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員使用位于重鏈或輕鏈的具體功能片斷側(cè)面的保守序列來(lái)決定。適當(dāng)?shù)腜CR條件為人所知并且也可以類似地由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)決定。
也可以通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的低聚核苷酸合成的方法來(lái)直接合成編碼本發(fā)明的人單克隆抗體的功能片斷的核酸。另一選擇為，使用所屬領(lǐng)域中已知的重組法可以合成并連接更小的片斷以形成更大的功能片斷。
編碼本發(fā)明的人單克隆抗體的功能片斷的核酸可以被克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中而且在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜槐磉_(dá)。適當(dāng)?shù)妮d體和宿主細(xì)胞系統(tǒng)可以允許(例如)重鏈和輕鏈的功能片斷的共表達(dá)及裝配。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以決定用于表達(dá)抗體片斷的適當(dāng)系統(tǒng)，且其包括(例如)M13抗菌素免疫表達(dá)載體?？梢允褂盟鶎兕I(lǐng)域中已知的方法來(lái)大體上提純本發(fā)明的重組功能片斷，所述方法取決于所用的具體載體和宿主表達(dá)系統(tǒng)。
也可以調(diào)整編碼腫瘤特異性人單克隆抗體或功能片斷的經(jīng)分離的核酸以產(chǎn)生具有如親合性、選擇性、活動(dòng)性、穩(wěn)定性或生物利用率的最佳特性的抗體。所述改質(zhì)可以包括(例如)氨基酸殘基地添加、刪除、或取代或者D-氨基酸或類氨基酸的取代，只要所述片斷保持(例如)抗原結(jié)合特異性的功能反應(yīng)性。
此外，本發(fā)明提供LH13和LH11238變體的差別庫(kù)(distinct libraries)。LH13庫(kù)可以含有在Kabat輕鏈CDR3(LCDR3)中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO8的88-98位點(diǎn)上具有至少一個(gè)氨基酸變動(dòng)的變體，在Kabat重鏈CDR3(HCDR3)中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO6的99-107位點(diǎn)上具有至少一個(gè)氨基酸變動(dòng)的變體。LH11238庫(kù)可以含有在Kabat輕鏈CDR3中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4的97-106位點(diǎn)上具有至少一個(gè)氨基酸變動(dòng)的變體。雖然上文所示范的庫(kù)是基于Kabat等人的編碼系統(tǒng)，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠根據(jù)包括(例如)Chothia等人或MacCallum等人的任何CDR定義使用先前所設(shè)定的編碼系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生類似的庫(kù)。根據(jù)先前所設(shè)定的編碼系統(tǒng)，本發(fā)明的庫(kù)可以含有在對(duì)應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)LH13或LH11238的CDR的區(qū)域中具有至少一個(gè)氨基酸變動(dòng)的變體，所述CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3?？梢允褂肔H13或LH11238變體的庫(kù)以篩檢具有增加的抗原或贅生性細(xì)胞結(jié)合反應(yīng)性的抗體或功能片斷，其如下文進(jìn)一步詳細(xì)陳述。
可以通過(guò)中此項(xiàng)技術(shù)中熟知的多種方法來(lái)制備具有充足多樣性以含有具有增強(qiáng)的結(jié)合親合性的抗體變體或其片斷的庫(kù)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)知道為達(dá)到預(yù)期的目的，多大的庫(kù)尺寸和多樣性是必需的或充足的。例如，抗體或抗體片斷變體庫(kù)可被制備成含有于母抗體中在一或多條CDR的每一位置上未發(fā)現(xiàn)的19種基礎(chǔ)氨基酸中的每一種，且篩檢出所得群體中具有增強(qiáng)的結(jié)合活性的變體。
另一選擇為，利用與本文所述抗體相關(guān)的結(jié)構(gòu)、生化、及模型信息來(lái)制備經(jīng)集中的庫(kù)。應(yīng)了解相關(guān)于測(cè)定或預(yù)測(cè)對(duì)于本發(fā)明的抗體的結(jié)合活性或結(jié)構(gòu)完整性或穩(wěn)定性十分重要的殘基或區(qū)域的任何信息都可用于設(shè)計(jì)經(jīng)集中的庫(kù)。因此，在經(jīng)測(cè)定或經(jīng)預(yù)測(cè)對(duì)結(jié)合贅生性細(xì)胞活其抗原的抗體的結(jié)合活性或結(jié)構(gòu)完整性或穩(wěn)定性十分重要的一個(gè)或多個(gè)位于一個(gè)區(qū)域中的氨基酸位具體位置上，組成所述庫(kù)的抗體變體可以含有氨基酸變動(dòng)。抗體變體的偏倚組合庫(kù)(focusedlibrary)提供了降低為鑒別具有增強(qiáng)的結(jié)合活性或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的變體而需要篩檢的變體數(shù)量的有利條件。
合成和篩檢偏倚組合庫(kù)的組合途徑可以進(jìn)一步提供鑒別經(jīng)改進(jìn)的抗體變體或其片斷的時(shí)間和效率的有利條件。如實(shí)例VIII所示，LH13變體中的多重變化是附加性的。在其它不相關(guān)的單克隆抗體中氨基酸變化的附加性在先前已經(jīng)有報(bào)道，其如(例如)Yelton等人，J.Immunol.1551994-2004(1995)，Wu等人，supra(1998)，以及Wu等人，supra(1999)中所描述。通過(guò)合成基于從HCDR3庫(kù)和LCDR3庫(kù)發(fā)現(xiàn)的單氨基酸變化的組合庫(kù)來(lái)鑒別附加的氨基酸組合許可了抗體親合性以非常有效的方式快速增強(qiáng)。
如實(shí)例VIII所示，在第一步中合成由171 HCDR3突變體和209 LCDR3突變體組成的僅為416差異蛋白質(zhì)變體隨后在第二步中合成36個(gè)組合變體，由此完成LH13的兩步親合性成熟。相反，證實(shí)以影響活性的LCDR3 S97、HCDR3R91及HCDR3 V97三個(gè)CDR殘基的總隨機(jī)化將需要含有193或6,859個(gè)變體的庫(kù)的表達(dá)。因此，實(shí)例VIII中所描述的組合途徑提供了對(duì)捕獲獨(dú)立突變的附加性的逐步改進(jìn)，其為簡(jiǎn)化親合性成熟過(guò)程的有效方法。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將從實(shí)例VIII的結(jié)果了解到通過(guò)合成對(duì)應(yīng)于HCDR1和HCDR2以及LCDR1和LCDR2的附加LH13庫(kù)可以進(jìn)一步改進(jìn)本發(fā)明的抗體(如經(jīng)增強(qiáng)的類別轉(zhuǎn)換變體(class-switched variant))親合性。而且，以組合的方式可使用從這些庫(kù)中鑒別的有利突變以鑒別對(duì)贅生性細(xì)胞或其抗原具有提高的親合性的經(jīng)改進(jìn)的抗體或抗體片斷變體。
可以通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的多種方法來(lái)測(cè)定或預(yù)測(cè)對(duì)于將本發(fā)明的抗體結(jié)合到贅生性細(xì)胞或其抗原十分重要的單獨(dú)殘基或區(qū)域，而且其可用于集中抗體或抗體片斷變體庫(kù)的合成。可以在結(jié)合相同抗原或近似抗原的抗體之間進(jìn)行序列(初級(jí)結(jié)構(gòu))或三維結(jié)構(gòu)(三級(jí)結(jié)構(gòu))或這兩者組合的結(jié)構(gòu)對(duì)比以鑒別用于突變的單獨(dú)殘基或區(qū)域。例如，基于抗體第三結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)模型能揭示出涉及抗原結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)或具體CDR的拓?fù)鋵W(xué)、靜電學(xué)、疏水性或親水性環(huán)境。對(duì)結(jié)合了普通抗原或結(jié)構(gòu)上相似的抗原的兩個(gè)或兩個(gè)以上抗體的結(jié)合位點(diǎn)的共有特性進(jìn)行比對(duì)可用以鑒別突變形成的位置或區(qū)域。可使用序列對(duì)比方法來(lái)排列序列并鑒別在具有同源殘基或具有分享類似空間、靜電、疏水或親水特性的殘基的兩個(gè)或兩個(gè)以上抗體中的位置?？梢允褂贸跫?jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比的組合來(lái)鑒別被改動(dòng)的位置。例如，可以在三級(jí)結(jié)構(gòu)分析中鑒別在初級(jí)結(jié)構(gòu)中彼此遠(yuǎn)離的對(duì)于結(jié)合十分重要的位置，而且所述位置在初級(jí)序列中加以著重以用來(lái)查詢抗體初級(jí)序列的數(shù)據(jù)庫(kù)或與一種或多種其它抗體初級(jí)序列相對(duì)比。
所屬領(lǐng)域中熟知可用來(lái)決定兩條序列大體上相同的對(duì)比初級(jí)序列結(jié)構(gòu)的方法。例如，一種用來(lái)決定兩條序列是否大體上相同的方法為BLAST，(BasicLocal Alignment Search Tool，局部比對(duì)基本搜索工具)，其可以根據(jù)描述于Tatiana等人，F(xiàn)EMS Microbial Lett.174247-250(1999)中、或在國(guó)家中心關(guān)于生物技術(shù)信息的網(wǎng)頁(yè)上ncbi.nlm.gov/BLAST/的缺省參數(shù)來(lái)使用所述工具。BLAST是一套相似性搜索程序，其被設(shè)計(jì)用來(lái)檢測(cè)所有可獲得的序列數(shù)據(jù)庫(kù)而且可以運(yùn)行以搜索氨基酸或核算序列中的相似性。BLAST搜索提供了具有定義明確的統(tǒng)計(jì)描述的搜索分?jǐn)?shù)。而且，BLAST使用啟發(fā)式運(yùn)算法則，其尋找局部比對(duì)而且因此能夠檢測(cè)僅共享包括(例如)蛋白質(zhì)域的相似性分離區(qū)域的序列間的關(guān)系(Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410(1990))。除了原先所述的BLAST(Altschul等人，supra，1990)，已經(jīng)對(duì)運(yùn)算法則作過(guò)修改(Altschul等人，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))。一種修改是Gapped BLAST，其允許把空隙、插入或刪除兩種中的任一種引入比對(duì)中。在比對(duì)中允許空隙有助于更緊密地反映生物關(guān)系。例如，可以使用gapped BLAST在兩條或兩條以上多肽的相似域內(nèi)鑒別序列同一性。第二種修改是PSI-BLAST，其為搜索序列同系物的靈敏方法。PSI-BLAST執(zhí)行初始的Gapped BLAST搜索而且使用來(lái)自任何重要比對(duì)的信息以構(gòu)造位置特異分?jǐn)?shù)矩陣，其代替用于下一輪數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的查詢序列。PSI-BLAST搜索往往對(duì)微弱但生物學(xué)上相關(guān)的序列相似性更為靈敏。
可用于決定兩個(gè)序列是否大體上相同的第二來(lái)源是可在ExPASy的全球互聯(lián)網(wǎng)上獲得的PROSITE。PROSITE是測(cè)定從染色體組的或cDNA序列翻譯的未經(jīng)特征化的多肽功能的方法(Bairoch等人，Nucleic Acids Res.25217-221(1997))。PROSITE由生物學(xué)上有意義的位點(diǎn)和圖案的數(shù)據(jù)庫(kù)所組成，所述位點(diǎn)和圖案可用來(lái)鑒別新序列屬于哪個(gè)(若存在)已知的多肽家族。使用這個(gè)或類似的運(yùn)算法則，可以通過(guò)在多肽序列中特定簇氨基酸殘基的發(fā)生(此可稱為圖案、花紋、符號(hào)或指印)與在參考多肽中的氨基酸殘基的特定簇(包括，例如在類似域中發(fā)現(xiàn)的那些簇)大體上相同來(lái)鑒別大體上與另一多肽相同的多肽。PROSITE使用計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則以搜索將多肽鑒別為家族成員的圖形。PROSITE還維持先前經(jīng)鑒別的花紋的編輯，其可用以決定一個(gè)最近經(jīng)鑒別的多肽是否為一個(gè)已知家族的成員。
序列對(duì)比可以包括基因、cDNA或其經(jīng)表達(dá)的產(chǎn)物的全部序列或者可以包括其一個(gè)或多個(gè)特定區(qū)域?？梢酝ㄟ^(guò)目測(cè)序列比對(duì)鑒別特定區(qū)域以確定相對(duì)高的同源性或相似性的區(qū)域來(lái)鑒別特定區(qū)域。如上所述，可以用結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)交叉參考哪些區(qū)域以發(fā)現(xiàn)特定結(jié)構(gòu)域和同源性區(qū)域之間的相關(guān)性。也可以在運(yùn)算法則中使用參考抗體或其片斷的結(jié)構(gòu)模型，該運(yùn)算法則將包括有(例如)SCOP、CATH或FSSP(在Hadley和Jones，Structure71099-1112(1999)中有評(píng)述)和具有特定折疊或構(gòu)造作為序列對(duì)比區(qū)域的區(qū)域的多肽結(jié)構(gòu)與第二多肽進(jìn)行對(duì)比，以鑒別大體上相似的區(qū)域。
除抗體的結(jié)構(gòu)模型以外，可以使用生化數(shù)據(jù)來(lái)測(cè)定或預(yù)測(cè)對(duì)于結(jié)合贅生性細(xì)胞或其抗原十分重要的抗體位置或區(qū)域和這些在制備抗體變體的偏倚組合庫(kù)中被瞄準(zhǔn)的位置或區(qū)域。在這點(diǎn)上，關(guān)于結(jié)合率常數(shù)(kon)、解離速率常數(shù)(koff)或平衡結(jié)合親合性常數(shù)(Kd或Ka)的母抗體或其變體的表征可用來(lái)鑒別對(duì)結(jié)合到贅生性細(xì)胞或其抗原十分重要的區(qū)域。為了生成抗體變體庫(kù)，可以單獨(dú)或組合使用不同類型的信息以測(cè)定或預(yù)測(cè)對(duì)結(jié)合到贅生性細(xì)胞或其抗體十分重要的氨基酸序列的區(qū)域。例如，可以把基于結(jié)構(gòu)模型和生化分析的信息(如比較對(duì)于在結(jié)構(gòu)上保守的位置上具有變化的變體的親合性)加以組合以測(cè)定對(duì)結(jié)合活性十分重要的抗體的氨基酸序列區(qū)域。因?yàn)榭梢园淹ㄟ^(guò)多種方法獲得的信息加以組合來(lái)預(yù)測(cè)對(duì)結(jié)合十分重要的區(qū)域，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解到所述區(qū)域自身代表近似而非嚴(yán)格的界線。結(jié)果是可以在被測(cè)定或預(yù)測(cè)為直接與抗原相合的區(qū)域以外的位置改動(dòng)抗體變體庫(kù)。例如，骨架區(qū)可能對(duì)抗體或其片斷的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性十分重要或可能通過(guò)長(zhǎng)程或經(jīng)由影響結(jié)合位點(diǎn)特性的空間相互作用來(lái)影響結(jié)合親合性。類似地，結(jié)合贅生性細(xì)胞或其抗原的抗體或其片斷的變體可以在CDR或本文中所鑒別出直接與結(jié)合有關(guān)的其它區(qū)域之外具有氨基酸變動(dòng)。
應(yīng)進(jìn)一步理解基于所用的預(yù)測(cè)方法和所對(duì)比的結(jié)構(gòu)，被預(yù)測(cè)出對(duì)結(jié)合活性十分重要的氨基酸位置的數(shù)量或所在地會(huì)變動(dòng)。例如，如上文所述，可以使用不同的CDR定義來(lái)對(duì)比抗體序列。所述領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解可以使用相同的CDR定義來(lái)鑒別在兩個(gè)或兩個(gè)以上抗體結(jié)構(gòu)之間所要比較的區(qū)域或位置。例如，可以用實(shí)例VII中所述的Kabat等人的CDR3定義來(lái)對(duì)比兩個(gè)或兩個(gè)以上抗體并示于表V中?？苫诳贵w的初級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)決定用于評(píng)價(jià)抗體的適當(dāng)CDR定義。類似地，可以基于每一抗體結(jié)構(gòu)的最初觀察和對(duì)最適合所對(duì)比的所有結(jié)構(gòu)的定義的鑒別來(lái)決定用于對(duì)比兩個(gè)或兩個(gè)以上抗體結(jié)構(gòu)的CDR定義。在選擇適當(dāng)?shù)腃DR定義中也可能考慮進(jìn)其它因素，包括(例如)母抗體或其變體的功能特性。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用不同的CDR定義來(lái)執(zhí)行相同抗體的分開對(duì)比并且因此根據(jù)在分開對(duì)比中發(fā)現(xiàn)區(qū)域或位置相似或同源的頻率來(lái)鑒別所變動(dòng)的區(qū)域或位置。
用于制作含有多樣化群體的各種類型分子(如肽、peptoid和peptidomimetics)的庫(kù)在所屬領(lǐng)域中已為人所熟知(例如參看Ecker和Crooke，Biotechnology13351-360(1995)，及Blondelle等人，Trends Anal.Chem.1483-92(1995)，以及其中所引用的文獻(xiàn)；還參看Goodman和Ro，Peptidomimetics for Drug Design，于“Burger′s Medicinal Chemistry and DrugDiscovery”中，第1卷(ed.M.E.Wolff；John Wiley & Sons 1995)，第803-861頁(yè)，及Gordon等人，J.Med.Chem.371385-1401(1994))。當(dāng)分子為肽、蛋白質(zhì)或其片斷時(shí)，所述分子可在活體外直接產(chǎn)生或者可以從能在活體外產(chǎn)生的核酸表達(dá)。合成肽化學(xué)的方法在所屬領(lǐng)域中已為人所熟知。
可以(例如)通過(guò)構(gòu)造編碼抗體變體的核酸表達(dá)庫(kù)來(lái)產(chǎn)生抗體變體庫(kù)。用于生產(chǎn)所述庫(kù)的方法在所屬領(lǐng)域中已為人所熟知(例如參看Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Plainview，New York(1989)；Sambrook等人，Molecular CloningA LaboratoryManual.第三版，Cold Spring Harbor Press，Plainview，New York(2001)；Ausubel等人Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47)，JohnWiley & Sons，New York(1999))。編碼抗體變體的核酸庫(kù)可由DNA、RNA或其類似物組成。可以(例如)通過(guò)化學(xué)合成RNA分子來(lái)構(gòu)造含有RNA分子的庫(kù)?？梢酝ㄟ^(guò)使用者想要的任何方式來(lái)生成編碼抗體或抗體片斷變體的核酸庫(kù)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)知道可用何種方法來(lái)生成編碼抗體或抗體片斷變體的核酸庫(kù)。例如，使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法(Sambrook等人，supra(1989)；Sambrook等人，supra(2001)；Ausubel等人，supra(1999))可以通過(guò)對(duì)編碼諸如LH13或LH11238的母抗體的核酸進(jìn)行誘變來(lái)生成抗體變體庫(kù)?？呻S機(jī)化編碼本發(fā)明的抗體或抗體片斷變體的核酸庫(kù)以使其具有充足多樣性以含有在一個(gè)或多個(gè)CDR的每一個(gè)氨基酸位置上的編碼每一個(gè)可能自然發(fā)生的氨基酸的核酸。另一選擇為，可以制作核酸庫(kù)使其含有僅在位于CDR區(qū)域內(nèi)的位置上的每一個(gè)氨基酸處編碼每一個(gè)可能自然發(fā)生的氨基酸的核酸，所述CDR區(qū)域如實(shí)例VIII中所述經(jīng)預(yù)測(cè)或測(cè)定為對(duì)于結(jié)合到贅生性細(xì)胞或其抗原是十分重要的。
使用(例如)位點(diǎn)定點(diǎn)(site-directed)誘變(參看Wu(Ed.)，Meth.In Enzymol.Vol.217，San DiegoAcademic Press(1993)；Higuchi，″Recombinant PCR″inInnis et al.(Ed.)，PCR Protocols.San DiegoAcademic Press，Inc.(1990)，其每一篇以引用的方式并入本文中)可以把一種或多種突變引入編碼抗體或抗體片斷變體的核酸分子中以產(chǎn)生經(jīng)改質(zhì)的核酸分子?？梢允褂盟稣T變以引入特定的、所想要的氨基酸變動(dòng)。因此，可以制作在一個(gè)或多個(gè)經(jīng)測(cè)定對(duì)結(jié)合活性十分重要的區(qū)域中含有氨基酸變動(dòng)的差別庫(kù)以及在幾個(gè)或所有區(qū)域中含有突變的單一庫(kù)。
可如Wu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，956037-6042(1998)；Wu等人，J.Mol.Biol..294151-162(1999)；及Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82488-492(1985)先前所述，使用低聚核苷酸-定向的誘變來(lái)完成抗體或抗體片斷變體的有效合成和表達(dá)。低聚核苷酸-定向誘變?yōu)槿怂熘矣行У挠脕?lái)系統(tǒng)性地引入突變(不依賴于它們的顯型)的程序，且因此理想地適合于蛋白質(zhì)工程的定向進(jìn)化途徑。為了執(zhí)行低聚核苷酸-定向誘變，使編碼想要的突變的核酸庫(kù)雜交到野生型序列的單鏈含尿嘧啶的模板上。所述方法很靈活，允許不使用限制酶而引入精確的突變，而且如果使用基于密碼子的誘變合成低聚核苷酸則所述方法相對(duì)便宜。使用所屬領(lǐng)域中已知的方法，通過(guò)使編碼特定氨基酸的核酸密碼子突變可以引入氨基酸取代。只要片斷保留功能活性，可以改動(dòng)單個(gè)或多個(gè)密碼子。用于制造和篩檢多個(gè)同時(shí)發(fā)生的變化的快速方法在所屬領(lǐng)域中為人所熟知而且可用來(lái)產(chǎn)生對(duì)含有所有可能的或所有想要的變化的核酸進(jìn)行編碼并接著表達(dá)和篩檢保留功能的人單克隆抗體或片斷庫(kù)的庫(kù)。所述方法包括(例如)基于密碼子的誘變、隨機(jī)低聚核苷酸的合成以及部分退化的低聚核苷酸合成。
基于密碼子的誘變是美國(guó)專利第5,264,563號(hào)和第5,523,388號(hào)的主題而且有利于上述程序，因?yàn)樗试S在低聚核苷酸內(nèi)生產(chǎn)在任何以及所有特定密碼子位置上的經(jīng)編碼的氨基酸殘基的基本上任何以及所有想要的頻率。所述想要的頻率包括(例如)所有二十個(gè)氨基酸或其指定的子集真正隨機(jī)的合并以及一個(gè)或多個(gè)特定氨基酸的預(yù)定偏向的合并以合并與其它經(jīng)合并的氨基酸殘基相比所述經(jīng)偏向的殘基的更高或更低頻率。
可近似把隨機(jī)低聚核苷酸的合成用于產(chǎn)生和篩檢功能上等價(jià)的氨基酸變化。然而，由于遺傳密碼的退化，所述方法能在想要的氨基酸位置合并冗余(例如參看美國(guó)專利第5,723,323號(hào))。隨機(jī)低聚核苷酸的合成包括在密碼子內(nèi)于每一個(gè)核苷酸位置處耦合所有四個(gè)核苷酸。也存在其它合成的隨機(jī)方法，其可導(dǎo)致退化的或部分退化的低聚核苷酸或編碼完全隨機(jī)的氨基酸序列的低聚核苷酸(例如參看美國(guó)專利第5,723,323號(hào))。
部分退化的低聚核苷酸合成是耦合在(例如)最初的兩個(gè)核苷酸位點(diǎn)的所有四個(gè)核苷酸的平等部分與在第三位置的兩個(gè)核苷酸的平等部分?？梢园l(fā)現(xiàn)這些后來(lái)的合成方法都描述于(例如)Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA876378-6382，(1990)和Devlin等人，Science249404-406，(1990)。
可對(duì)上文所述的用于產(chǎn)生各種若干變體序列的基于密碼子的合成加以修改，其可用于產(chǎn)生本文所述的抗體或抗體片斷變體庫(kù)。這個(gè)修改是基于使合成偏向于母序列的上述的兩容器方法而且允許使用者將變體分成含有確定數(shù)量密碼子位置(其具有隨機(jī)密碼子變化)的群體。
簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，通過(guò)把反應(yīng)容器在每一個(gè)密碼子位置的合成后分開到兩個(gè)新的容器來(lái)執(zhí)行這項(xiàng)合成。分開后，從第二個(gè)容器開始，混合來(lái)自每一個(gè)連續(xù)對(duì)的反應(yīng)容器的反應(yīng)產(chǎn)物?；旌习丫哂邢嗤瑪?shù)量的帶有隨機(jī)變化的密碼子位置反應(yīng)的混合物帶到一起。通過(guò)接著將第一和最后的容器的產(chǎn)物與來(lái)自每一個(gè)連續(xù)對(duì)的反應(yīng)容器的新被混合的產(chǎn)物分開并且重新分開到兩個(gè)新的容器中來(lái)繼續(xù)進(jìn)行合成。在新容器的其中一個(gè)里合成母密碼子并且在第二個(gè)容器中合成隨機(jī)密碼子。例如，在第一密碼子位置的合成使一個(gè)反應(yīng)容器承擔(dān)母密碼子的合成而且第二個(gè)反應(yīng)容器承擔(dān)隨機(jī)密碼子的合成。對(duì)于在第二密碼子位置的合成而言，最初的兩個(gè)反應(yīng)容器每一個(gè)都被分開到兩個(gè)容器中產(chǎn)生兩對(duì)容器。對(duì)每一對(duì)而言，在其中一個(gè)容器中合成母密碼子而且在第二個(gè)容器中合成隨機(jī)密碼子。當(dāng)按線性排列時(shí)，把第二和第三容器中的反應(yīng)產(chǎn)物混合以將在單一密碼子位置處具有隨機(jī)密碼子序列的那些產(chǎn)物帶到一起。這項(xiàng)混合也使產(chǎn)物群減少到三個(gè)，它們是用在下一輪合成中的起始群。類似地，對(duì)于第三、第四和每一個(gè)殘余的位置，把用于前述位置的每一個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物群分開并合成母密碼子和隨機(jī)密碼子。
隨基于密碼子的合成的上述修改后，可以很方便地分離在一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)及四個(gè)位置以及其它位置上含有隨機(jī)密碼子變化的群，而且所述群可基于個(gè)體的需要來(lái)使用。而且，這項(xiàng)合成流程也允許在母序列上富集用于受隨機(jī)化的序列群，因?yàn)閮H含有母序列合成的容器被類似地從隨機(jī)密碼子合成中分離出來(lái)?？墒褂眠@個(gè)方法來(lái)合成編碼抗體變體的核酸庫(kù)，所述抗體變體在一個(gè)或多個(gè)被預(yù)測(cè)為對(duì)于結(jié)合到贅生性細(xì)胞或其抗原十分重要的CDR中具有氨基酸變動(dòng)。
另一選擇為，也可以使用基因混排來(lái)生成編碼抗體或抗體片斷變體的核酸庫(kù)?；蚧炫呕駾NA混排是用于通過(guò)重組生成多樣性的定向演變的方法(例如參看Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9110747-10751(1994)；Stemmer，Nature370389-391(1994)；Crameri等人，Nature391288-291(1998)；Stemmer等人，美國(guó)專利第5,830,721號(hào)，1998年11月3號(hào)頒發(fā))?；蚧炫呕駾NA混排是使用活體外同源重組經(jīng)選擇的突變基因池的方法。例如，可以使用特定基因的點(diǎn)突變池。例如，使用Dnase將基因隨機(jī)性的打碎，并由PCR重新裝配。若須要，可以使用來(lái)自不同生物體的同源基因進(jìn)行DNA混排以生成多樣性(Crameri等人，supra，1998)。若有須要可以執(zhí)行多輪破碎和重新裝配。所得經(jīng)重新裝配的基因組成可以用在本發(fā)明組合物和方法中的抗體或抗體片斷變體庫(kù)。
對(duì)于某些治療和診斷應(yīng)用而言可能更好使用具有相同的抗原特異性但具有不同的同型或異型決定因素的抗體或其片斷。所述抗體可能具有(例如)降低的致免疫性、增加的穩(wěn)定性、或更多最佳的效應(yīng)物功能。因此，本發(fā)明的功能片斷可能包括那些通過(guò)把本發(fā)明的人單克隆抗體的CDR序列克隆到不同的骨架區(qū)所獲得的功能片斷?？梢詮牟煌N類、不同人個(gè)體、或來(lái)自相同或不同個(gè)體的重鏈或輕鏈類來(lái)獲得所述不同的骨架區(qū)。所述CDR移植法為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。在實(shí)例VIII中描述了從IgM免疫球蛋白移植CDR序列到IgG骨架區(qū)的一個(gè)實(shí)例。如實(shí)例VIII所示，活體外親合性成熟可以允許實(shí)質(zhì)上任何抗體的改進(jìn)，包括具有基本上胚系序列的低親合性IgMs。
可以通過(guò)上述用于測(cè)定人單克隆抗體的免疫活性的方法來(lái)評(píng)價(jià)本發(fā)明的抗體或抗體片斷變體的功能活性。用于測(cè)定片斷功能活性的特別有用的方法包括競(jìng)爭(zhēng)放射性免疫測(cè)定和競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定。所述方法可用于篩檢對(duì)贅生性細(xì)胞或其抗原親合性經(jīng)改進(jìn)的變體。依所篩檢的變體數(shù)量而定，可以不同的嚴(yán)格度使用所述方法。也可基于篩檢所進(jìn)行的循環(huán)次數(shù)或反復(fù)次數(shù)來(lái)調(diào)整嚴(yán)格度。例如，在早期篩檢步驟中可使用低嚴(yán)格度且在稍后的篩檢步驟中提高嚴(yán)格度?？梢栽诤Y檢抗體庫(kù)中使用低嚴(yán)格度的親合性標(biāo)準(zhǔn)以放大所探測(cè)的多樣性而不需創(chuàng)作更大的庫(kù)或篩檢更大數(shù)量的克隆而且可以導(dǎo)致從先前所篩檢的Ig組成部分中發(fā)現(xiàn)新穎的抗體。
本發(fā)明提供含有本發(fā)明的人單克隆抗體或功能片斷和醫(yī)藥載劑的醫(yī)藥組合物?？捎盟鼋M合物以投予人單克隆抗體或片斷以減少贅生性細(xì)胞的增生或存活能力。也可以使用所述組合物以檢測(cè)贅生性細(xì)胞。用于本發(fā)明方法的適當(dāng)醫(yī)藥載劑為人所熟知且包括(例如)諸如生理學(xué)緩沖鹽水的水溶液，以及其他溶劑或培養(yǎng)基，如乙二醇、甘油、油類或可注射的有機(jī)酯。醫(yī)藥載劑可含有生理學(xué)上可接受的化合物，其用作穩(wěn)定或增加醫(yī)藥組合物的可溶性。所述生理學(xué)上可接受的化合物可以是(例如)碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或右旋糖苷；抗氧化劑，如抗壞血酸或谷光甘肽；螯合劑；低分子量蛋白質(zhì)；或另一種穩(wěn)定劑或賦形劑。包括穩(wěn)定劑和防腐劑在內(nèi)的醫(yī)藥載劑描述于(例如)Martin，Remington′s Pharm.Sci..第15版(Mack Publ.Co.，Easton，1975)，其以引用的方式并入本文。所有上述的醫(yī)藥載劑和培養(yǎng)基可能為在所屬領(lǐng)域中定義為醫(yī)藥級(jí)，其意味著它們具有充足的純度和質(zhì)量以用于人體中并且區(qū)別于研究級(jí)劑型中的可比試劑。
所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)知道選擇醫(yī)藥培養(yǎng)基和適當(dāng)制備所述組合物將取決于想要的用途和投藥的模式。
本發(fā)明提供具有CDR的多種重鏈域或其功能片斷，所述CDR具有選自由以下SEQ ID NO組成之群組的序列的CDR的實(shí)質(zhì)性CDR序列2、6、10、12、和14。本發(fā)明還提供具有CDR的可變輕鏈域或其功能片斷，所述CDR具有選自由以下SEQ ID NO組成之群組的序列的CDR的大體CDR序列4、8、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44。本發(fā)明也提供具有實(shí)質(zhì)上為選自由以下SEQ ID NO組成之群組的CDR的氨基酸序列的CDR或其功能片斷2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44。
可以通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知且如上文所述的方法來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的CDR或其功能片斷。例如，可通過(guò)重組法或化學(xué)合成來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的CDR?？捎欣氖褂帽景l(fā)明的CDR(例如)以生成選擇性地結(jié)合本發(fā)明的腫瘤特異性人單克隆抗體的抗獨(dú)特型抗體。產(chǎn)生和使用用于診斷和治療目的的抗獨(dú)特型抗體的方法在所屬領(lǐng)域中為人所熟知。
本發(fā)明的抗體片斷可以是可變重鏈域或可變輕鏈域。使用本文所述的方法或各種所屬領(lǐng)域中已知的其他方法可以在重組系統(tǒng)中表達(dá)所述片斷。例如，對(duì)蛋白質(zhì)抗原具有親合性的可變重鏈域(其類似于那些所期望的單克隆抗體對(duì)于蛋白質(zhì)抗原的親合性)的表達(dá)在所屬領(lǐng)域中已知如在(例如)Ward等人，Nature341544-546(1989)和Williams等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA865537-5541(1989)。中的描述?？梢?例如)通過(guò)合并能在兩個(gè)所述經(jīng)改質(zhì)的片斷之間形成分子間交聯(lián)的半胱氨酸殘基來(lái)改質(zhì)本發(fā)明的片斷以產(chǎn)生多化合價(jià)的結(jié)合片斷，其針對(duì)可變重鏈域描述于williams等人，supra(1989)。也可以(例如)通過(guò)表達(dá)CDR域使其在構(gòu)象上受限制來(lái)產(chǎn)生具有結(jié)合活性的CDR片斷。在(例如)Ditzel等人，The J.Immunol.157739-749(1996)中描述了對(duì)構(gòu)象上受限制的CDR的表達(dá)，所述CDR是通過(guò)添加能形成二硫鍵并對(duì)母抗體的抗原具有特異性的兩個(gè)半胱氨酸來(lái)形成的?？赏ㄟ^(guò)本文中所述的對(duì)氨基酸或其它部分(如標(biāo)記物)的各種添加、刪除或取代中的任何一種來(lái)改質(zhì)本發(fā)明的抗體片斷。
本發(fā)明還提供通過(guò)向細(xì)胞投予有效量的人單克隆抗體或功能片斷(其由選自由H1140、H2420及H935組成的群組中的細(xì)胞系來(lái)產(chǎn)生)來(lái)減少贅生性細(xì)胞增生的方法。還提供通過(guò)向細(xì)胞投予有效量的人單克隆抗體或功能片斷來(lái)減少贅生性細(xì)胞增生的方法，所述人單克隆抗體或功能片斷具有至少一個(gè)CDR，其大體上具有選自由以下SEQ ID NO組成的群組中的序列的CDR的氨基酸序列2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44。用于減少贅生性細(xì)胞增生的人單克隆抗體或功能片斷可以進(jìn)一步包括如細(xì)胞毒素劑或細(xì)胞抑制劑的標(biāo)記物，而且可與醫(yī)藥載劑相組合。
用于減少贅生性細(xì)胞增生的抗體或其功能片斷的有效量為已知的或者可以由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員使用活體外方法或可靠的動(dòng)物模型來(lái)很容易的決定?；铙w外方法可以包括(例如)決定用于減少贅生性細(xì)胞生長(zhǎng)或贅生性細(xì)胞轉(zhuǎn)移的組合物的有效量。在用于檢測(cè)生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的減少的活體外方法中所用的贅生性細(xì)胞可以是(例如)腫瘤細(xì)胞系或腫瘤的體外(ex vivo)培養(yǎng)物。細(xì)胞系或腫瘤可以是(例如)起源于乳房、肺部或卵巢組織的細(xì)胞系或腫瘤。用于抑制贅生性細(xì)胞生長(zhǎng)的有效量可以為(例如)抑制DNA合成、抑制細(xì)胞分裂、誘發(fā)凋亡、誘發(fā)非凋亡性滅活、或抑制血管生成的有效量。用于抑制贅生性細(xì)胞轉(zhuǎn)移的有效量可為(例如)用于抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞遷移、細(xì)胞附著、細(xì)胞入侵或細(xì)胞增生。
也可以從嚙齒動(dòng)物中人腫瘤的異種移植物來(lái)決定用于減少贅生性細(xì)胞增生的抗體或其功能片斷的有效量。所述嚙齒動(dòng)物可以是(例如)大鼠或小鼠。小鼠可以是(例如)正常的或免疫失調(diào)的。免疫失調(diào)的小鼠可以是(例如)裸鼠或重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠(scid mouse)。所述種類在所屬領(lǐng)域種為人所熟知而且可以從商業(yè)來(lái)源獲得。可以通過(guò)包括經(jīng)皮下、經(jīng)靜脈、及經(jīng)腹腔的大量路線將人癌細(xì)胞引入動(dòng)物中。
隨著腫瘤確立后，可將所述動(dòng)物用不同劑量的本發(fā)明的一種分子來(lái)治療，而且可以決定腫瘤質(zhì)量或體積。功效可以作為腫瘤的部分或完全衰退來(lái)測(cè)量。用于治療癌癥的有效劑量導(dǎo)致腫瘤更多的部分及完全衰退。
可以通過(guò)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)決定本發(fā)明分子的有效量，而且所述有效量將取決于如個(gè)體的年齡、體重、性別及醫(yī)療狀況、以及投予治療劑的特定路線的因素。投予本發(fā)明的組合物以治療癌癥的有用路線包括(例如)肌肉、腫瘤內(nèi)、血管內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或鼻內(nèi)路線。可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)決定對(duì)癌癥患者的具體治療的功效。例如，可使用如下文所述的活體內(nèi)或活體外診斷方法來(lái)測(cè)定腫瘤已經(jīng)復(fù)原或接受治療后被消除了。此外，可使用正常的預(yù)兆性標(biāo)志，如對(duì)于癌癥患者的存活率和增加的生命質(zhì)量。
本發(fā)明提供通過(guò)使樣品與人單克隆抗體或功能片斷(其由選自由H1140、H2420及H935所組成的群組的細(xì)胞系來(lái)產(chǎn)生)相接觸來(lái)檢測(cè)贅生性細(xì)胞，并檢測(cè)人單克隆抗體或功能片斷對(duì)該樣品的特異性結(jié)合的方法，其中與正常細(xì)胞相比較，存在或增加的含量的人單克隆抗體或功能片斷表示存在癌癥或易患癌癥的體質(zhì)。本發(fā)明也提供通過(guò)使樣品與具有選自由SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44所組成的群組中的序列的CDR氨基酸序列的人單克隆抗體或功能片斷相接觸來(lái)檢測(cè)贅生性細(xì)胞，并檢測(cè)人單克隆抗體或功能片斷對(duì)該樣品的特異性結(jié)合的方法，其中與正常細(xì)胞相比較存在或增高的含量的人單克隆抗體或功能片斷的表示存在癌癥或易患癌癥的體質(zhì)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“樣品”用來(lái)指任何生物學(xué)的流體、細(xì)胞、組織、器官或其一部分，其包括或潛在地包括贅生性細(xì)胞。生物學(xué)流體可以是(例如)血液或淋巴液。組織可以是(例如)乳房、卵巢或肺部。樣品可以是活體內(nèi)或活體外樣品?；铙w外樣品可以是(例如)組織切片、由活組織檢測(cè)獲得的標(biāo)本、或替代入或適應(yīng)于組織培養(yǎng)物的細(xì)胞?？梢杂伤鶎兕I(lǐng)域中已知的、適合于檢測(cè)方法的具體格式的方法來(lái)制備樣品。
可以使樣品與本發(fā)明的人單克隆抗體或功能片斷相接觸而且可以檢測(cè)人單克隆抗體對(duì)樣品的特異性結(jié)合。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)所用檢測(cè)方法的格式所決定的，所述連接可以是活體內(nèi)或活體外的。可以由上述的免疫測(cè)定來(lái)測(cè)定人單克隆抗體對(duì)樣品的特異性結(jié)合。所述免疫測(cè)定包括(例如)活體內(nèi)和活體外免疫測(cè)定?；铙w內(nèi)免疫測(cè)定包括(例如)輻射成像(radioimaging)。所述方法包含將個(gè)體內(nèi)的樣品與本發(fā)明的單克隆抗體相接觸，并通過(guò)(例如)射線照相成像來(lái)檢測(cè)特異性結(jié)合?；铙w外免疫測(cè)定及包括定性測(cè)定也包括定量測(cè)定，諸如(例如)上文所述的免疫組織化學(xué)、免疫熒光法、放射性免疫測(cè)定、FACS分析、免疫點(diǎn)墨法、免疫沉淀及ELISA分析。
可以通過(guò)確定本發(fā)明的經(jīng)特異性結(jié)合的人單克隆抗體或功能片斷與正常細(xì)胞相比較存在或處于增加的含量來(lái)確定存在贅生性細(xì)胞。如上所述，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可能會(huì)確定適當(dāng)?shù)恼＜?xì)胞用來(lái)與特定類型的贅生性細(xì)胞相比較。
本發(fā)明進(jìn)一步提供大體上純凈的人腫瘤特異性抗原。術(shù)語(yǔ)“腫瘤特異性抗原”用來(lái)指被人腫瘤細(xì)胞擇優(yōu)表達(dá)的抗原。術(shù)語(yǔ)“被人腫瘤細(xì)胞擇優(yōu)表達(dá)的”用來(lái)指由人腫瘤細(xì)胞表達(dá)并且由正常人體細(xì)胞以大體上更低的水平表達(dá)的腫瘤特異性抗原。所述表達(dá)本發(fā)明的腫瘤特異性抗原的腫瘤細(xì)胞可以是(例如)乳房、肺部或卵巢組織源的腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的人腫瘤特異性抗原與本發(fā)明的人單克隆抗體特定反應(yīng)。所述抗原可與(例如)由LH11238、LH13、H1140、H2420或H935雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的人單克隆抗體或功能片斷進(jìn)行特定反應(yīng)。所述抗原也可以與具有至少一個(gè)具有選自由下列SEQ IDNO組成的群組的序列的CDR氨基酸序列的CDR的人單克隆抗體或功能片斷進(jìn)行特定反應(yīng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44，或者與具有至少一個(gè)大體上具有SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的CDR氨基酸序列進(jìn)行特定反應(yīng)。與LH11238人單克隆抗體或其片斷的變體反應(yīng)的抗原是與正常人纖維原細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞或肺部癌細(xì)胞相比較存在于細(xì)胞表面和在乳房及卵巢癌細(xì)胞的溶酶體間室中的蛋白質(zhì)。與LH13人單克隆抗體反應(yīng)的抗原是由與正常纖維原細(xì)胞或黑素瘤細(xì)胞相比較的乳房、肺部及卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生的分泌型糖蛋白。在實(shí)例中描述了LH11238和LH13抗原進(jìn)一步的特性。
本發(fā)明的人腫瘤特異性抗原可有利地用于癌癥的治療和診斷中。例如，可使用所述抗原以生成用在治療和診斷程序中的特異性結(jié)合人腫瘤特異性抗原的額外結(jié)合劑。所述結(jié)合劑能(例如)抑制或刺激腫瘤特異性抗原的功能、或調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，以使贅生性細(xì)胞受生長(zhǎng)-捕獲或滅活。也可以使所述結(jié)合劑共軛到諸如(例如)細(xì)胞毒素劑或細(xì)胞抑制劑的標(biāo)記物上，其引起腫瘤細(xì)胞的死亡或捕獲。結(jié)合到本發(fā)明的腫瘤特異性抗原的有用試劑包括(例如)配位子、受體拮抗劑及抗體。也可以在癌癥治療中通過(guò)對(duì)患有癌癥或具有發(fā)展出癌癥危險(xiǎn)的患者用有效量的抗原進(jìn)行預(yù)防接種來(lái)使用大體上純凈的腫瘤特異性抗原。隨預(yù)防接種之后，個(gè)體的免疫系統(tǒng)將能夠預(yù)防、減少表達(dá)所述抗原的贅生性細(xì)胞的增生或消除該贅生性細(xì)胞。
也可以在檢測(cè)腫瘤特異性結(jié)合劑(如本發(fā)明的人單克隆抗體或功能片斷)的結(jié)合的方法中有利地使用本發(fā)明大體上純凈的腫瘤特異性抗原。例如，可以在如競(jìng)爭(zhēng)ELISA的免疫測(cè)定中使用所述抗原。
可以使用所屬領(lǐng)域中熟知的免疫親合性程序，通過(guò)(例如)篩檢一板(panel)人腫瘤細(xì)胞來(lái)鑒別出用于分離本發(fā)明大體上純凈的抗原的適當(dāng)起始材料。例如，如實(shí)例II所述，可以使用ELISA分析以確定用于隨后提純作用的抗原的有用細(xì)胞源?？乖挠杏眉?xì)胞源可以是(例如)乳房、卵巢或肺部惡性腫瘤。用于提純腫瘤特異性抗原的特別有用的啟示材料為H3396乳癌細(xì)胞系。
用于分離大體上純凈的抗原的適當(dāng)方法取決于所述抗原的細(xì)胞定位。例如，可以在贅生性細(xì)胞的分泌型培養(yǎng)基、細(xì)胞表面膜、液胞膜、細(xì)胞質(zhì)、或細(xì)胞核中主要表達(dá)本發(fā)明的抗原。可以通過(guò)(例如)所屬領(lǐng)域中的免疫測(cè)定來(lái)確定抗原的細(xì)胞定位。例如，如實(shí)例IV和VI所述，可以使用間接免疫熒光法和ELISA分析來(lái)建立抗原的主要定位。
可以通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的免疫親合性程序來(lái)監(jiān)控對(duì)抗體的提純。監(jiān)控提純的尤其有用的方法包括(例如)ELISA分析和免疫點(diǎn)墨法。
可以通過(guò)所屬領(lǐng)域中熟知的生化程序從特定來(lái)源提純腫瘤特異性抗原。例如，提純可包括離心法、色譜分析法、電泳法及免疫親合性方法，而且其可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員依據(jù)特定抗原的特征來(lái)進(jìn)行選擇。可以使用離心法來(lái)集中或富集含有豐富量的抗體的亞細(xì)胞部分。所述亞細(xì)胞部分程序在所屬領(lǐng)域中為人所熟知。色譜分析法在所屬領(lǐng)域中也為人所熟知，且包括基于抗原的尺寸或?qū)μ囟渲牟煌H合性將其從污染物中分離的方法。所述樹脂可包括(例如)尺寸排斥樹脂、離子交換樹脂、及凝集素柱。如實(shí)例VI所述，用于提純本發(fā)明的抗原的尤其有用的樹脂是Q SEPHAROSE FAST FLOW瓊脂糖樹脂。電泳法在所屬領(lǐng)域中也為人所熟知，且包括經(jīng)由(例如)丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠的一維和二維電泳。免疫親合性方法在所屬領(lǐng)域中也為人所熟知且包括經(jīng)共軛到本發(fā)明的人單克隆抗體的化合物。為免疫親合性提純腫瘤特異性抗原而共軛到抗體上的有用化合物包括色譜樹脂和蛋白質(zhì)A。
因此，跟隨熟知的生化程序，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員能很容易的分離本發(fā)明的大體上純凈的腫瘤特異性抗原以用于治療和診斷程序中。
也可以通過(guò)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的重組法從編碼本發(fā)明的腫瘤特異性抗原的核酸制備本發(fā)明的大體上純凈的腫瘤特異性抗原。
本發(fā)明提供編碼人腫瘤特異性抗原的經(jīng)分離的核酸?？赏ㄟ^(guò)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來(lái)分離編碼人腫瘤特異性抗原的核酸。所述方法包括(例如)使用本發(fā)明的單克隆抗體來(lái)篩檢表達(dá)庫(kù)。
其它方法包括(例如)使用退化的低聚核苷酸作為雜交探針來(lái)篩檢cDNA或染色體組庫(kù)。可通過(guò)將本發(fā)明的經(jīng)分離的腫瘤特異性抗原或其片斷微序列化來(lái)確定所述退化的低聚核苷酸序列。用于產(chǎn)生腫瘤特異性抗原的核酸的所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的其它方法包括(例如)使用從本發(fā)明的腫瘤特異性抗原的氨基酸序列所獲得的退化的低聚核苷酸引子來(lái)進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。可以依靠PCR從僅僅單個(gè)基因拷貝開始按指數(shù)規(guī)律放大想要的序列。上述方法為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知且描述于(例如)Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory，NewYork(1992)以及其中所引用的文獻(xiàn)和Ansubel等人，Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1989)；以及Harlow等人，AntibodiesA Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989)。這些文獻(xiàn)和其中所引用的出版物以引用的方式并入本文中。
應(yīng)理解本文所提供的本發(fā)明的定義范圍內(nèi)也包括大體上不影響本發(fā)明的多種實(shí)施例的活性的改質(zhì)。因此，下列實(shí)例用來(lái)說(shuō)明而非限制本發(fā)明。
實(shí)例I產(chǎn)生腫瘤特異性人單克隆抗體這個(gè)實(shí)例顯示了分泌與腫瘤細(xì)胞特定反應(yīng)的人單克隆抗體的雜交瘤的生產(chǎn)。描述了一種在無(wú)限增生化作用之前用腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞膜使正常淋巴細(xì)胞活體外免疫化的程序。這項(xiàng)程序允許對(duì)產(chǎn)生新穎腫瘤-活性人單克隆抗體的淋巴細(xì)胞進(jìn)行富集。這些人單克隆抗體將有利于癌癥免疫治療和免疫診斷程序。
如下列步驟制備淋巴細(xì)胞。將脾組織從意外受害者分離出來(lái)、打碎、并強(qiáng)行通過(guò)no.50金屬網(wǎng)線篩(Bellco，Vineland，NJ)。通過(guò)在250xg上離心10分鐘來(lái)收集細(xì)胞并由氯化銨溶解來(lái)移除RBC。剩余的細(xì)胞經(jīng)洗滌、在冷凍劑(40％RPMI、50％FCS及10％DMSO)中以100到300×106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度再懸浮、以1.5-ml等分量經(jīng)冷凍，以及在液氮中貯藏。粘附細(xì)胞和淋巴細(xì)胞兩者都通過(guò)這個(gè)程序來(lái)分離。
接著如下述建立經(jīng)混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)。將來(lái)自兩種不同供體的經(jīng)冷凍的單胞脾細(xì)胞制劑(如上所述)通過(guò)在37℃下輕微搖晃來(lái)解凍、用RPMI洗滌兩次、以及通過(guò)在250xg上離心10min來(lái)收集。在第二次洗滌后，將來(lái)自每一個(gè)來(lái)源的3×106個(gè)脾細(xì)胞組合到含有pH 7.4的1.5mM HEPES(FisherScientific)、10％FBS(HyClone)、2mM L-谷氨酰胺、非基礎(chǔ)氨基酸、1mM丙酮酸鈉、及100μg/ml慶大霉素硫酸鹽的2ml RPMI中，并且被放置在24-孔組織培養(yǎng)皿中。這項(xiàng)MLR連同抗原性刺激(如下所述)從內(nèi)部產(chǎn)生了所要的淋巴因子。
接著用經(jīng)絲裂霉素處理的H3396腫瘤細(xì)胞、來(lái)自H3396細(xì)胞的質(zhì)膜制劑、或經(jīng)多聚甲醛固定的H3922腫瘤細(xì)胞刺激MLR培養(yǎng)物。H3922和H3396是從人乳腺癌的移位變化來(lái)建立的經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞系，其可在培養(yǎng)物中移植并保存。每一個(gè)細(xì)胞系都衍生自不同的移植。
按下文制備經(jīng)絲裂霉素處理的H3396細(xì)胞。將H3396細(xì)胞放置到24-孔組織培養(yǎng)皿中、生長(zhǎng)至融合、且用0.1μg/ml絲裂霉素C處理12-15h。這個(gè)濃度用大約幾天來(lái)捕獲腫瘤細(xì)胞系中的細(xì)胞分裂。經(jīng)12-15h培育后，移除含有絲裂霉素C的培養(yǎng)基而且將細(xì)胞用2ml磷酸生理食鹽水(PBS)洗滌。
在移除培養(yǎng)基后，通過(guò)在25℃下在2％多聚甲醛的PBS溶液中培育細(xì)胞15min來(lái)制備經(jīng)多聚甲醛固定的H2922腫瘤細(xì)胞。接著在使用前用PBS洗滌所述細(xì)胞四次。
如下文分離來(lái)自H3396細(xì)胞的質(zhì)膜。將十個(gè)匯合的H3396細(xì)胞的150-mm盤的每一個(gè)用10ml冰凍的(Tris緩沖液)TBS漂洗兩次并在含有1μg/ml亮肽素、1μg/ml抑胃肽、及2mM AEBSF的(Tris生理鹽水)的2ml/150-mm盤中收獲。在15ml杜恩斯均質(zhì)器(Dounce homogenizer)中使用A型搗錘用40次敲擊將細(xì)胞打破。在4℃下以800xg將溶解產(chǎn)物離心5min以移除未被打破的細(xì)胞和細(xì)胞核。保留上清液并將球粒在0.5體積的TS緩沖器中再懸浮、均勻化以及在800xg離心。將上清液與第一上清液組合并在4℃下以10,000xg離心2h。拋棄上清液且將球粒再懸浮于2ml水中。使用2ml杜恩斯均質(zhì)器和B型搗錘以再懸浮薄膜球粒。在6.4％聚合物系統(tǒng)中在冰上通過(guò)將2.56ml20％右旋糖苷、1.28ml 40％的聚乙二醇、pH 7.2的0.20ml 0.2 M磷酸鉀、0.8ml1M蔗糖、2.16ml水進(jìn)行混合來(lái)進(jìn)行膜的相分離。向這個(gè)混合物中添加1ml薄膜而且將試管顛倒翻轉(zhuǎn)20次。通過(guò)在4℃下以800xg離心5min來(lái)分離各相。排出上層相并將其與從空白(水)樣品恢復(fù)的低層相。同樣地，將包括在界面的材料在內(nèi)的低層相與從空白樣品恢復(fù)的上層相混合。將兩相混合、顛倒翻轉(zhuǎn)20次、并在4℃下以800xg離心5min來(lái)進(jìn)行分離。將從兩個(gè)樣品的上層相恢復(fù)的材料組合，用TBS把體積調(diào)整到21ml，通過(guò)在4℃下以10,000xg離心2h來(lái)收集膜。拋棄上層液并用2ml杜恩斯均質(zhì)器和B搗錘在1-2ml含有蛋白酶抑制劑的TS緩沖液中再懸浮球粒。在4℃下貯藏所述膜12h，之后通過(guò)在4℃下以800xg離心10min來(lái)從上層液分離不溶性物質(zhì)。在1-2ml含有蛋白酶抑制劑的TS緩沖液中第二次懸浮所述球粒且將其作為懸浮液在4℃下貯藏。將所述上層液稱為部分1而把經(jīng)再懸浮的微粒物質(zhì)稱為部分2。通過(guò)測(cè)量5′-核苷酸酶或磷酸二酯酶活性來(lái)確定把部分1中的質(zhì)膜富集到大于10倍。所述制劑具有最小的依賴于琥珀酸酯的細(xì)胞色素C還原酶(線粒體)活性、或依賴于NADPH的細(xì)胞色素C還原酶(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))活性。
通過(guò)用以下物質(zhì)中的一種培育三天來(lái)使MLR培養(yǎng)物活體外免疫經(jīng)絲裂霉素C處理的H339S細(xì)胞單層、經(jīng)多聚甲醛固定的H3922細(xì)胞單層、5mg來(lái)自H3396細(xì)胞的質(zhì)膜部分1、或10mg來(lái)自H3396細(xì)胞的質(zhì)膜部分2。
通過(guò)兩種可供選擇的方法中任一種來(lái)使經(jīng)活體外免疫的淋巴細(xì)胞無(wú)限增生化。在第一種方法中，用K6H6/B5雜交瘤細(xì)胞融合淋巴細(xì)胞。在RPMI和DMEM的Iscoves改質(zhì)物的1∶1混合物中攪拌培養(yǎng)來(lái)供養(yǎng)K6H6/B5細(xì)胞，所述混合物用10％FCS、1％非基礎(chǔ)氨基酸、2mM谷氨酰胺、及1mM丙酮酸鈉。將大約4×106個(gè)淋巴細(xì)胞與2×106對(duì)數(shù)相K6H6/B5細(xì)胞組合并用RPMI洗滌兩次。經(jīng)1min添加35％聚乙二醇(大約m.w.1450)和7.5％DMSO的混合物1ml，接著用RPMI逐漸稀釋到4ml且接著用補(bǔ)充了10％FCS的RPMI稀釋到16ml。接著把淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整到5×104個(gè)細(xì)胞/ml，而且在含有HAT(13.6μg/ml次黃嘌呤，3.8μg/ml胸腺嘧啶脫氧核苷，1μg/ml偶氮絲氨酸)和1.0μM烏巴因(ouabain)的雜交瘤培養(yǎng)基(用10％FCS、非基礎(chǔ)氨基酸、2 mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、pH 7.4的15mM HEPES、及0.1mg/ml慶大霉素來(lái)補(bǔ)充的RPMI)中將0.2ml細(xì)胞接種到96-孔培養(yǎng)皿中以挑選出未經(jīng)融合的細(xì)胞如下文所述篩檢的反應(yīng)性，并且放大所關(guān)心的克隆。使用這種一步的無(wú)限增生化方法，每106經(jīng)融合的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生10-50個(gè)雜交瘤細(xì)胞；然而，經(jīng)過(guò)三輪細(xì)胞培養(yǎng)后僅有5％所關(guān)心的克隆是穩(wěn)定的。由這項(xiàng)無(wú)限增生化程序獲得了雜交瘤細(xì)胞克隆H1140、H2420及H935。
在致力于提高克隆穩(wěn)定性的過(guò)程中，評(píng)價(jià)了用于使經(jīng)活體外免疫的淋巴細(xì)胞無(wú)限增生化的第二種兩步方法，其涉及首先用EBV轉(zhuǎn)化細(xì)胞且接著用K6H6/B5雜交瘤細(xì)胞融合所關(guān)心的克隆。將等體積的淋巴細(xì)胞(8×104個(gè)細(xì)胞/ml)和經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化的1A2/C7細(xì)胞(8×106個(gè)細(xì)胞/ml)組合而且通過(guò)添加雜交瘤培養(yǎng)物使總體積加倍。添加次黃嘌呤、胸腺嘧啶脫氧核苷及偶氮絲氨酸以使得它們的最終濃度分別為13.6μg/ml、3.8μg/ml、及1μg/ml。在96-孔細(xì)胞培養(yǎng)皿的每一個(gè)孔中沉積兩百微升的所述細(xì)胞混合物以在每一個(gè)孔中產(chǎn)生最終總共4000個(gè)的淋巴細(xì)胞和1×105個(gè)1A2/C7細(xì)胞。每三天用雜交瘤培養(yǎng)基-HAT飼養(yǎng)所述細(xì)胞且在2周后能看見細(xì)胞群體時(shí)測(cè)定抗體產(chǎn)物(描述于下文)。
用EBV轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞生成比用雜交骨髓瘤細(xì)胞系融合淋巴細(xì)胞所獲得的分泌抗體克隆更高百分比的抗體分泌克隆(每106個(gè)淋巴細(xì)胞50-100個(gè)分泌抗體克隆)。然而，類淋巴母克隆一般分泌更低水平的抗體(小于10μg/ml)，而且如用雜交瘤所觀察到的，其顯示出很差的長(zhǎng)程穩(wěn)定性(經(jīng)過(guò)三輪放大所關(guān)心的初始克隆約5％是穩(wěn)定的)。為處理這些局限性，在多輪放大前，如上所述用K6H6/B5細(xì)胞來(lái)融合腫瘤反應(yīng)性類淋巴母克隆。
從類淋巴母細(xì)胞形成雜交瘤細(xì)胞提高了穩(wěn)定性以使得在融合后經(jīng)過(guò)三輪放大40％的類淋巴母克隆保持穩(wěn)定。跟隨用雜交骨髓瘤細(xì)胞系進(jìn)行的融合作用之后的EBV轉(zhuǎn)化作用的組合導(dǎo)致與單獨(dú)利用任何一個(gè)途徑所獲得相應(yīng)淋巴細(xì)胞的的無(wú)限增生化頻率更高的無(wú)限增生化頻率。此外，這些克隆一般分泌出大于20μg/ml的抗體。通過(guò)這個(gè)兩步無(wú)限增生化方法產(chǎn)生出雜交瘤克隆LH11238和LH13。
用于產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞系H1140、H2420、H935 LH11238及LH13的免疫化和無(wú)限增生化條件總結(jié)于表2中。
表2用于生成產(chǎn)生腫瘤特異性人單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的免疫化和無(wú)限增生化條件

最初使用ELISA測(cè)定篩檢了來(lái)自經(jīng)無(wú)限增生化的淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液對(duì)活的原生腫瘤細(xì)胞單層的反應(yīng)性。這保證了反應(yīng)性抗體識(shí)別出表面抗原，而且也避免了與篩檢固定細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的人工產(chǎn)物。在96-孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中沉積腫瘤細(xì)胞，其細(xì)胞濃度足以在12-24h后產(chǎn)生90-95％的匯合單層。剛好在使用前移除培養(yǎng)基并將來(lái)自雜交瘤細(xì)胞或經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的50μl上清液添加到孔中且在4℃下培育2h。用50μl新鮮的雜交瘤培養(yǎng)基培育對(duì)照孔(背景)。
隨培育之后，吸出上清液且用200μl PBS漂洗細(xì)胞三次。接著用已在1％BSA-PBS中稀釋1000倍的50μl山羊抗-人1g(H+L)堿性磷酸酯共軛體培育細(xì)胞1-2h。吸出檢測(cè)抗體而且如上述輕柔漂洗細(xì)胞四次。在25℃下通過(guò)添加50μl 10mM酚酞單磷酸鹽的0.2 M 2-胺基-2-甲基-1-丙醇溶液、pH 10.2的0.5MTris、0.1％疊氮化鈉調(diào)成來(lái)培養(yǎng)此等盤1h。通過(guò)添加pH 10.2的50μl 30mMTris、15mM EDTA來(lái)終止該反應(yīng)并在560nm處測(cè)定吸光度。這項(xiàng)測(cè)定的背景值一般為A560＜0.060。選擇具有4倍于背景或更大的克隆體用于進(jìn)一步進(jìn)行表征。
還分析了展示出與H3396細(xì)胞的反應(yīng)性的抗體用來(lái)結(jié)合經(jīng)固定的HF235正常人纖維原細(xì)胞。在移除培養(yǎng)基后，在2％多聚甲醛的PBS溶液中在25℃下固定HF235細(xì)胞。接著在使用前用PBS洗滌所述細(xì)胞四次。對(duì)于用經(jīng)固定的纖維原細(xì)胞的ELISA背景值一般為A560＜0.080。把與纖維原細(xì)胞的最小反應(yīng)性定義為在背景上小于2倍的結(jié)合性。
為了確定由雜交瘤產(chǎn)生的同型抗體，用0.5μg/ml的山羊抗-人IgM或山羊抗-人IgG涂覆微量滴定盤。用山羊抗-人Ig堿性磷酸鹽共軛體來(lái)檢測(cè)抗體結(jié)合性。當(dāng)上清液用捕獲抗體的一個(gè)產(chǎn)生一個(gè)正信號(hào)時(shí)終止測(cè)定的進(jìn)行。同樣地，通過(guò)用適當(dāng)?shù)闹劓溤噭┎东@抗體并用山羊抗-人γ或κ鏈特異堿性磷酸酶共軛。
類似地進(jìn)行免疫球蛋白的定量，除了連續(xù)稀釋含有未知量的Ig的上清液直到無(wú)法檢測(cè)出反應(yīng)性。從落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)的稀釋液值來(lái)計(jì)算出Ig濃度，由在0.01到2.0μg/ml范圍內(nèi)使用的經(jīng)提純的多克隆人IgM的標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)定義該標(biāo)準(zhǔn)曲線。
通過(guò)在800xg離心10min和通過(guò)經(jīng)0.45μm醋酸纖維素過(guò)濾器過(guò)濾來(lái)進(jìn)行的分類，從LH11238雜交瘤上清液中沉淀出免疫球蛋白。將上清液放置在透析管(Mr分離點(diǎn)12-14kDa)中并通過(guò)用敵草快(Aquacide)(Calbiochem)涂覆該管并在4℃下放置6-8h將其濃縮兩到四倍。移除多余的敵草快，漂洗透析袋，并相對(duì)冰凍蒸餾水的多重變化而透析樣品12-24h。通過(guò)在10,000xg離心30min來(lái)收集經(jīng)沉淀的抗體。移除上清液并在最小體積的經(jīng)濃縮10倍的暖PBS中再懸浮球粒。在溶解大多數(shù)球粒后，把緩沖液濃度調(diào)整到PBS而且通過(guò)在10,000xg離心30min來(lái)移除不可溶物質(zhì)?？赡茴愃频卦诘碗x子強(qiáng)度緩沖液中沉淀抗體H1140、H2420及H935。因此，為了獲得經(jīng)濃縮的抗體，利用YM-30膜以Amicon儀器來(lái)減少經(jīng)澄清的上清液體積。通過(guò)此項(xiàng)途徑將抗體濃縮大于50倍。
百分之五的經(jīng)篩檢的雜交瘤(372/7216)結(jié)合了大于背景四倍的腫瘤表面抗原。這些372個(gè)克隆體中的55個(gè)(15％)產(chǎn)生了明顯不結(jié)合纖維原細(xì)胞的抗體。雖然從未用腫瘤細(xì)胞或膜部分培育的的對(duì)照MLR中分離出大量分泌抗體的雜交瘤，這些抗體中沒(méi)有一個(gè)顯示出優(yōu)先腫瘤反應(yīng)性。產(chǎn)生出顯示腫瘤特異性的抗體的大約20％(11/55)的雜交瘤經(jīng)過(guò)在培養(yǎng)物中的多重放大是穩(wěn)定的。這些克隆體中的五個(gè)分泌出大于20μg/ml的抗體。表2中總結(jié)了這些克隆體的特性。所有這五個(gè)抗體是IgM同型的而且表現(xiàn)出如測(cè)定在H3396細(xì)胞經(jīng)固定的單層所確定的免疫反應(yīng)性。從所使用的每一個(gè)培養(yǎng)物條件和無(wú)限增生化程序中生成至少一個(gè)抗體。進(jìn)一步(下文)表征了表現(xiàn)出最大免疫反應(yīng)性的兩個(gè)抗體LH13和LH11238。
由雜交瘤細(xì)胞系H1140、H2420、H935 LH11238及LH13所產(chǎn)生的腫瘤特異性人單克隆抗體的特性總結(jié)于表3中。
表3腫瘤特異性人單克隆抗體的特征

a分泌水平為從最終培養(yǎng)物的上清液所獲得的標(biāo)準(zhǔn)值b免疫反應(yīng)性(AA560/[(μg Ig)(min)]在匯合的經(jīng)多聚甲醛固定的H3396單層上測(cè)定并將其規(guī)格化到H1140的免疫反應(yīng)性c沉淀作用表示能(+)或不能(-)在低離子強(qiáng)度緩沖器中沉淀抗體總之，這個(gè)實(shí)例表示未經(jīng)激發(fā)的人免疫組成部分(來(lái)自非荷瘤患者的脾細(xì)胞)可用于生成與新穎的腫瘤抗原反應(yīng)的人單克隆抗體。用全部腫瘤細(xì)胞或衍生自腫瘤細(xì)胞的膜部分的任一種經(jīng)由刺激MLR培養(yǎng)物來(lái)達(dá)到這個(gè)目的。通過(guò)生成腫瘤特異性抗體以及通過(guò)缺乏來(lái)自未經(jīng)腫瘤細(xì)胞或膜部分處理的培養(yǎng)物的腫瘤特異性抗體而展示出抗原刺激的特異性。
實(shí)例IILH13和LH11238抗體的免疫反應(yīng)性這個(gè)實(shí)例顯示了LH13和LH11238抗體與一板人腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)性。
為了將LH13和LH11238抗體用于免疫診斷和免疫治療的目的，需要鑒別表達(dá)相應(yīng)抗體的腫瘤類型的范圍。腫瘤細(xì)胞系為相應(yīng)腫瘤類型的代表，而正常的纖維原細(xì)胞為非-贅生性細(xì)胞組織的代表。從黑素瘤、肺癌、卵巢癌和乳房癌衍生出腫瘤細(xì)胞系。測(cè)試了本發(fā)明的人單克隆抗體與人癌細(xì)胞系和正常纖維原細(xì)胞兩者的免疫反應(yīng)性。
H3396、H3464、H3477及H3922是從人乳腺癌的移位變化建立的經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞系，它們被移植并保存于培養(yǎng)物中。H2981和H2987是從人肺癌建立的經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞系，它們被移植并保存于培養(yǎng)物中。H3639和H3723是從人卵巢癌建立的經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞系，它們被移植并保存于培養(yǎng)物中。每一個(gè)細(xì)胞系衍生自不同的外植體。通過(guò)用經(jīng)固定的腫瘤細(xì)胞單層培育寬范圍的抗體濃度，由上述的ELISA程序來(lái)測(cè)定免疫反應(yīng)性。用飽和量的檢測(cè)抗體來(lái)測(cè)量抗體結(jié)合性。在測(cè)定的線性范圍內(nèi)以AA560/[(μg Ig)(min)]測(cè)量抗體結(jié)合性。腫瘤特異性人單克隆抗體針對(duì)一板腫瘤和正常細(xì)胞的免疫反應(yīng)性示于表4中。
表4針對(duì)腫瘤和正常細(xì)胞的人單克隆抗體LH13和LH11228的免疫活性


a所示大體的免疫反應(yīng)性依據(jù)用0.1％毛地黃皂苷進(jìn)行的細(xì)胞滲透作用如表4中所示，LH13在腫瘤細(xì)胞板上顯示出具有高(H3723和H3396)、中(H2981和H3464)、及低(H3477)免疫反應(yīng)性的寬闊的交叉-反應(yīng)性。LH13抗原在無(wú)損傷的正常纖維原細(xì)胞(HF285)、黑素瘤(H2669和H3774)上缺乏或以無(wú)法檢測(cè)的水平存在，而且測(cè)試了幾個(gè)無(wú)損傷的癌(H3922、H2987、及H3639)。缺乏與H3922細(xì)胞的反應(yīng)性尤其令人吃驚，因?yàn)長(zhǎng)H13是從已經(jīng)用H3922細(xì)胞刺激過(guò)的淋巴細(xì)胞中分離出來(lái)的。為了更進(jìn)一步檢測(cè)這個(gè)結(jié)果，用0.1％毛地黃皂苷滲透每一個(gè)細(xì)胞系并重新檢測(cè)它們的反應(yīng)性。當(dāng)測(cè)定完整細(xì)胞時(shí)完全為陰性的的兩個(gè)細(xì)胞系H3922和H3639在抗體可以到達(dá)細(xì)胞內(nèi)間室的條件下結(jié)合LH13抗體。而且，當(dāng)非-滲透條件下進(jìn)行測(cè)定時(shí)，具有中等LH13免疫反應(yīng)性的H2981細(xì)胞在滲透條件(免疫反應(yīng)性大于7.0)下具有高反應(yīng)性。在0.1％毛地黃皂苷的存在和缺乏下，由于在培育過(guò)程中從細(xì)胞培養(yǎng)皿細(xì)胞損失有差異，所獲關(guān)于免疫反應(yīng)性的數(shù)據(jù)不能直接加以比較。
LH11238顯示出相似的反應(yīng)性分布，雖然它的免疫反應(yīng)性程度總是大大小于LH13抗體的免疫反應(yīng)性程度。用無(wú)損傷的H3396、H3464、H3477、H3639、及H3723觀察反應(yīng)性。其它受測(cè)試的細(xì)胞是陰性的，包括纖維原細(xì)胞和癌細(xì)胞系?；谟肔H13和LH11238對(duì)每一個(gè)細(xì)胞系所制作的免疫反應(yīng)性測(cè)定，這些抗體看起來(lái)不可能識(shí)別出相同的表位。例如，LH13顯示出與H2981肺部癌細(xì)胞系中等的免疫反應(yīng)性而沒(méi)有檢測(cè)出LH11238對(duì)此細(xì)胞系的結(jié)合。同樣地，LH11238結(jié)合了無(wú)損傷的H3639卵巢癌細(xì)胞，雖然不可能在同樣的培育條件下檢測(cè)出LH13的結(jié)合性。
實(shí)例IIILH13和LH11238人單克隆抗體的結(jié)合活性此項(xiàng)實(shí)例顯示了人單克隆抗體LH13和LH11238與正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的結(jié)合活性。
為了測(cè)定人單克隆抗體與腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的免疫反應(yīng)性，使用了流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)(FACS分析)。選擇了H34S4乳癌細(xì)胞是因?yàn)橥ㄟ^(guò)ELISA分析它們既表達(dá)了LH13又表達(dá)了LH11238抗原而且作為單細(xì)胞懸浮液很容易被分離出來(lái)。也檢測(cè)正常的外周血淋巴細(xì)胞來(lái)代表正常組織。Facs分析額外地允許關(guān)于抗原表達(dá)的細(xì)胞群異質(zhì)性。
用胰蛋白酶或乙二胺四乙酸鈉(EDTA)從培養(yǎng)皿中移除H3464細(xì)胞，將其用PBS洗滌、在腫瘤培養(yǎng)基中以2×106個(gè)細(xì)胞/ml再懸浮，且在37℃下恢復(fù)2h。用1×106個(gè)腫瘤細(xì)胞以50μl的總體積于冰塊上在5.0μg/ml培育抗體30min。將細(xì)胞用1.0ml冰凍PBS洗滌一次，用稀釋于1％BSA-PBS的經(jīng)2μg/ml FITC標(biāo)記的山羊抗-人IgM在冰塊上培育30min，并且再用1.0ml冰凍PBS洗滌一次。用Becton Dickinson FACSort分析結(jié)合到細(xì)胞上的抗體。與ELISA結(jié)果相一致，用LH11238和經(jīng)FITC標(biāo)記的抗人IgM來(lái)培育的H3464細(xì)胞表現(xiàn)出相對(duì)于不相干的對(duì)照人IgM移動(dòng)的染色圖案(圖1A)。受測(cè)試的大于90％的細(xì)胞結(jié)合了LH11238，盡管所觀察到的寬范圍熒光強(qiáng)度與抗原在這些腫瘤細(xì)胞的異源表達(dá)水平相一致。用H935、H2420、及H1140也觀察到相似的FACS染色分布。
令人驚訝的是，如ELISA所測(cè)定(表4)在H3464細(xì)胞上比LH11238反應(yīng)性大23倍的LH13抗體幾乎不表現(xiàn)出移位(圖1B)。為了確定LH13抗原是否對(duì)用于分離分析用(胰蛋白酶)的腫瘤細(xì)胞的蛋白水解作用條件尤其敏感，允許細(xì)胞隨分離之后有更長(zhǎng)的恢復(fù)時(shí)期或者利用非-蛋白水解的細(xì)胞分離方法，如乙二胺四乙酸鈉(EDTA)釋放。這兩種方法都沒(méi)有導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞顯著更大的染色。
正常人細(xì)胞的Facs分析(如外周血淋巴細(xì)胞)對(duì)每一個(gè)受測(cè)試的抗體是陰性的，其與用正常纖維原細(xì)胞所獲得的ELISA結(jié)果相一致。
實(shí)例IVLH11238抗原的表征這個(gè)實(shí)例描述了LH11238抗原的亞細(xì)胞表征。上文所述對(duì)活細(xì)胞的ELISA篩檢和FACS分析都表現(xiàn)出LH11238抗原在腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜上的表達(dá)。然而，這些途徑?jīng)]有檢測(cè)抗原在癌衍生細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)上的分布。使用了免疫熒光法分析以檢測(cè)LH11238抗原的細(xì)胞內(nèi)定位。
在使用前一天在12-mm圓蓋玻片上接種了H3464細(xì)胞單層并將其用2％多聚甲醛的PBS溶液在25℃下固定15min。將細(xì)胞用PBS漂洗兩次并用稀釋于1％BSA-PBS(未經(jīng)滲透的)或含有0.1％毛地黃皂苷的1％BSA-PBS(經(jīng)滲透的)的50μl/ml抗體在4℃下來(lái)培育細(xì)胞2h。將細(xì)胞用PBS漂洗兩次并接著在暗處在與原發(fā)抗體相同的緩沖液中以1∶500稀釋的經(jīng)FITC標(biāo)記的山羊抗-人IgM來(lái)培育該細(xì)胞。用PBS漂洗細(xì)胞4次而且將蓋玻片安裝在Fluoromount-G(Southern Biotechnology)。用裝配有表面熒光(epifluorescent)的光學(xué)器件和Olympus Splan 40X(NA 0.70)物鏡的Olympus顯微鏡來(lái)使細(xì)胞顯像。用LH11238抗體染色的未經(jīng)滲透的、經(jīng)多聚甲醛固定的H3464細(xì)胞顯示出與定位到質(zhì)膜相一致的表面染色。與FACS分析相一致，大于70％的經(jīng)固定的H3464細(xì)胞結(jié)合了LH11238。當(dāng)H3464細(xì)胞經(jīng)過(guò)滲透以允許到達(dá)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)時(shí)，觀察到點(diǎn)狀的、細(xì)胞核外周圍的染色。結(jié)合到H3464細(xì)胞的LH11238是特異性的，因?yàn)橛貌幌嚓P(guān)同型和濃度匹配的人抗體進(jìn)行的對(duì)照培育沒(méi)有染色未破損的或經(jīng)0.1％.毛地黃皂苷滲透的細(xì)胞。在經(jīng)滲透的細(xì)胞上觀察到的點(diǎn)狀的、細(xì)胞核外周圍的染色暗示了抗原在溶酶體中的定位。為驗(yàn)證這個(gè)結(jié)論，將細(xì)胞用對(duì)一種已知的溶酶體糖蛋白CD63的抗體染色。用對(duì)CD63的抗體培育H3464細(xì)胞所染色的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)類似于那些用LH11238標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，其與細(xì)胞內(nèi)LH11238的溶酶體定位相一致。
基于這些結(jié)果得出結(jié)論LH11238抗原既存在于質(zhì)膜上又存在于H3464細(xì)胞的溶酶體中。
實(shí)例VLH11238抗原的內(nèi)在化這個(gè)實(shí)例顯示LH11238抗原從質(zhì)膜內(nèi)在化到溶酶體間室。
上文所述的免疫熒光法實(shí)驗(yàn)表明LH11238抗原既存在于細(xì)胞表面又存在于腫瘤細(xì)胞的溶酶體中?？赡苡稍谌苊阁w和細(xì)胞表面共表達(dá)的LH11238抗原或由被內(nèi)在化到核內(nèi)體/溶酶體間室而產(chǎn)生了雙重定位。為了確定LH11238抗原是否被內(nèi)在化，進(jìn)行了免疫熒光定位程序的修改。
把活H3464細(xì)胞單層速凍在冰上30-60min以完全抑制胞吞作用。接著將細(xì)胞洗滌、用LH11238抗體培育、再次洗滌、并用經(jīng)FITC標(biāo)記的山羊抗-人IgM抗體培育。在所有進(jìn)行的步驟中一直保持細(xì)胞的溫度在4℃下以保證完全抑制胞吞作用。接著用預(yù)暖過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到37℃下。在不同的時(shí)間間隔處將細(xì)胞轉(zhuǎn)移回4℃下并用2％多聚甲醛加以固定。最初觀察到擴(kuò)散的表面染色，其與用未經(jīng)滲透的固定細(xì)胞所觀察到的一樣。在37℃下10min后，觀察到LH11238抗體在細(xì)胞表面的多個(gè)位點(diǎn)的簇集。用更長(zhǎng)的培育時(shí)間，LH11238首先定位到細(xì)胞表面的幾個(gè)位點(diǎn)上，且接著開始進(jìn)行內(nèi)在化。如果用不相關(guān)的原發(fā)抗體培育細(xì)胞、僅用二級(jí)抗體培育細(xì)胞，或者如果在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將細(xì)胞維持在4℃下那么沒(méi)有觀察到這些染色圖案。這些結(jié)果與LH11238結(jié)合并通過(guò)H3464細(xì)胞被內(nèi)在化的LH11238相一致。
總的來(lái)說(shuō)，首先基于未破損細(xì)胞的ELISA分析、活細(xì)胞的FACS分析、及使用未經(jīng)滲透的細(xì)胞進(jìn)行的免疫定位來(lái)表征LH11238抗體。然而，用經(jīng)滲透的細(xì)胞進(jìn)行的進(jìn)一步免疫定位研究說(shuō)明這種抗體的一部分還定位于點(diǎn)狀的細(xì)胞核外周圍間室。用經(jīng)抗-CD63抗體(一種溶酶體蛋白質(zhì))培育的細(xì)胞觀察到相似的染色。這個(gè)結(jié)果與LH11238抗原在質(zhì)膜和在溶酶體中的雙重定位相一致，說(shuō)明結(jié)合到活細(xì)胞表面的抗體被內(nèi)在化了。先前已經(jīng)觀察到腫瘤抗原對(duì)質(zhì)膜和溶酶體的雙重定位。例如，BR96抗體在未破損腫瘤細(xì)胞的表面上結(jié)合與溶酶體相關(guān)聯(lián)的膜蛋白質(zhì)lamp-1，盡管lamp-1通常是主要位于溶酶體間室的完整膜蛋白質(zhì)。另外，也已經(jīng)證明了從腫瘤細(xì)胞分泌出升高水平的可溶性蛋白質(zhì)，如組織蛋白酶(cathespin)B、D、及L。分泌出的組織蛋白酶D的一部分被甘露糖6-磷酸鹽受體結(jié)合并內(nèi)在化。目前還不清楚LH11238是否可溶或是完整的膜蛋白質(zhì)。然而，在細(xì)胞抽提物的TX-114相分離的可溶性部分中發(fā)現(xiàn)了該抗原，這和LH11238與膜相關(guān)聯(lián)相一致而與完整的膜蛋白質(zhì)相反。
實(shí)例VILH13抗原的表征這個(gè)實(shí)例顯示了LH13抗原的定位。
當(dāng)如上文所述，在經(jīng)固定的由癌衍生的細(xì)胞系單層上通過(guò)ELISA分析LH13抗體時(shí)，其展示出有效的免疫反應(yīng)性。然而，F(xiàn)ACS分析暗示出LH13僅很少地結(jié)合到細(xì)胞表面上。進(jìn)一步的ELISA分析說(shuō)明LH13抗原主要存在于當(dāng)用0.1％毛地黃皂苷處理細(xì)胞時(shí)僅可到達(dá)抗體的間室內(nèi)。為進(jìn)一步檢測(cè)LH13抗原在亞細(xì)胞間室內(nèi)或在分泌出培養(yǎng)基中的表達(dá)，采用了免疫熒光分析和直接ELISA分析。
為了檢測(cè)LH13抗原的亞細(xì)胞定位，在如上文所述的經(jīng)多聚甲醛固定的H3464細(xì)胞上進(jìn)行免疫熒光法。用未經(jīng)滲透的H3464細(xì)胞培育LH13抗體(如上文所述使用LH11238抗體)導(dǎo)致細(xì)胞表面的輕微染色，其與通過(guò)FACS分析所觀察到的微小移位相一致。用經(jīng)滲透的H3464細(xì)胞通過(guò)免疫熒光法來(lái)培育LH13抗體結(jié)果檢測(cè)不到染色?？赡苁菐缀鯖](méi)有LH13與H3464細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)或是LH13的細(xì)胞內(nèi)形式?jīng)]有被這個(gè)細(xì)胞系中的抗體識(shí)別到。
這些結(jié)果也不能說(shuō)明主要分泌LH13抗原。為了觀察分泌出的LH13抗原，將恒量的LH13抗體(0.01ug/ml)稀釋于已經(jīng)從H3396細(xì)胞的匯合單層中移除出來(lái)的增加量的培養(yǎng)基中(條件培養(yǎng)基)。接著檢驗(yàn)條件培養(yǎng)基對(duì)經(jīng)固定的H3396單層的結(jié)合性。增加條件培養(yǎng)基的濃度觀察到LH13抗體對(duì)該單層的結(jié)合性適當(dāng)減少(大約15％)(圖2A)，其與存在于所述培養(yǎng)基中的LH13抗原相一致。
使用了直接ELISA格式以觀察在H3396細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的LH13抗原。將條件培養(yǎng)基在96-孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中于4℃下培育10-12h、移除出來(lái)，并且對(duì)于LH13抗體結(jié)合性檢驗(yàn)經(jīng)洗滌的孔。存在于從H3396細(xì)胞所獲得的條件培養(yǎng)基中的抗原結(jié)合到培養(yǎng)皿而且很容易檢測(cè)(圖2B)。通過(guò)用細(xì)胞培養(yǎng)孔培育LH13抗體來(lái)展示出抗體結(jié)合的特異性，所述細(xì)胞培養(yǎng)孔已經(jīng)用以下物質(zhì)預(yù)處理過(guò)(1)來(lái)自表達(dá)不可檢測(cè)量的LH13的腫瘤系(H3922)的條件培養(yǎng)基，(2)新鮮培養(yǎng)基(培養(yǎng)基)，或(3)無(wú)物質(zhì)(空白)。這些預(yù)培育條件都沒(méi)有導(dǎo)致結(jié)合到該孔的可檢測(cè)到的LH13(圖2B)。
總之，LH13抗原的表征說(shuō)明這種抗體大多數(shù)被發(fā)現(xiàn)在條件培養(yǎng)基中。基于這一觀察，總結(jié)出LH13是從腫瘤細(xì)胞分泌出來(lái)的。
實(shí)例VII提純和進(jìn)一步表征LH13抗原這個(gè)實(shí)例描述了LH13抗原的提純和進(jìn)一步表征。
如上所述，LH13抗原從乳房腫瘤細(xì)胞分泌出來(lái)并顯示出對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)皿驚人的高親合性。這些觀察說(shuō)明可能會(huì)很容易地從H3396條件培養(yǎng)基中提純LH13抗原，利用其對(duì)培養(yǎng)皿的結(jié)合作為監(jiān)控其提純的方式。一旦LH13抗原經(jīng)提純后，可以很容易測(cè)定其對(duì)各種試劑的敏感性以進(jìn)一步表征其特性。
作為富集LH13抗原的第一步，使H3396細(xì)胞系適應(yīng)于在用最小量的蛋白質(zhì)補(bǔ)充的無(wú)血清的培養(yǎng)基[用TCH(Celox，規(guī)定的血清替代品)、2mM L-谷氨酰胺、非基礎(chǔ)氨基酸、及1mM內(nèi)酮酸鈉補(bǔ)充的Iscove培養(yǎng)基]中生長(zhǎng)。在這些條件下培養(yǎng)的細(xì)胞分泌出與在血清存在下培養(yǎng)的細(xì)胞相當(dāng)水平的抗原。將條件培養(yǎng)基收集、統(tǒng)籌，而且用水把250ml稀釋到1升以減少離子強(qiáng)度。將經(jīng)稀釋的培養(yǎng)基以3ml/min施加到已經(jīng)用經(jīng)濃縮0.25-倍(0.25X)的PBS均衡的Q SEPHAROSE FAST FLOW瓊脂糖樹脂的11cm×1.5cm柱上。由流過(guò)的部分缺乏反應(yīng)性所示，大多數(shù)抗原結(jié)合到柱上。在用200ml 0.25X PBS洗滌該柱后，用從100％0.25X PBS至70％0.5M NaCl的0.25X PBS溶液的線性梯度以6ml/min的流速洗堤蛋白質(zhì)。
用使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)的BCA蛋白質(zhì)測(cè)定來(lái)測(cè)定柱餾分的蛋白質(zhì)濃度。如下測(cè)定柱餾分的LH13抗原。將每個(gè)餾分在水中稀釋10倍并將50μl/孔轉(zhuǎn)移到無(wú)菌96-孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中在4℃下培養(yǎng)12h。用PBS洗滌該盤兩次并用稀釋于1％BSA-PBS中的10μg/ml LH13抗體在37℃下培育2h。接著將該盤用PBS洗滌四次、用稀釋1000倍到1％BSA-PBS中的山羊抗-人Ig堿性磷酸酶共軛在25℃下培育1h，并如上文所述進(jìn)行發(fā)展。
大多數(shù)蛋白質(zhì)在150mM和250mM NaCl中洗堤出來(lái)(圖3，閉合環(huán))，而大多數(shù)LH13抗原在250mM NaCl以上洗堤出來(lái)(圖3，空心環(huán))。頂點(diǎn)抗原餾分的特異活性(ELISA信號(hào)/[蛋白質(zhì)])比起始物質(zhì)大200倍。作為對(duì)照，用NaCl濃度范圍(50mM到400mM)來(lái)稀釋LH13抗原以測(cè)定離子濃度是否影響了對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)皿的結(jié)合。為從柱上結(jié)合并洗堤LH13所施加的NaCl濃度范圍不影響結(jié)合到細(xì)胞培養(yǎng)皿的抗原。因此，直接ELISA精確地反映了抗原在多種柱餾分中的分布。
通過(guò)在4-20％SDS-聚丙烯酰胺梯度凝膠上進(jìn)行電泳來(lái)進(jìn)一步分解柱餾分?？捡R斯亮藍(lán)染色(Coomassie blue staining)揭示出在大多數(shù)反應(yīng)餾分中的單一主要蛋白質(zhì)，但各柱餾分的西方墨點(diǎn)(Western blot)不能將此鑒別為L(zhǎng)H13-反應(yīng)性抗原。
為了進(jìn)一步表征LH13抗原，使用直接ELISA法檢測(cè)其對(duì)各種處理的敏感性。如上所述將LH13抗原涂覆在細(xì)胞培養(yǎng)皿上并將其在各種條件下進(jìn)行培育。用5mg/ml胰蛋白酶在37℃下培育LH13抗原30min。另一選擇為，通過(guò)在用2U/ml唾液酸酶(Oxford GlycoSystems)、400U/ml糖苷內(nèi)切酶-F/肽-N-糖苷酶F(Endo F，PNGase F)(Oxford GlycoSystems)、60mU/ml內(nèi)-α-N-乙?；肴樘前访?O-聚糖酶)(Oxford GlycoSystems)、或2U/ml唾液酸酶加60mU/ml內(nèi)-α-N-乙?；肴樘前访?唾液酸酶，O-聚糖酶)在37℃下處理24h前，用10％SDS+2％β-巰基乙醇在37℃下處理30min使LH13抗原變性。將培養(yǎng)皿用PBS洗滌三次并如上文所述估計(jì)LH13抗體結(jié)合性。將每一次處理的影響與在相同條件下單獨(dú)用緩沖液處理的對(duì)照樣品相比較(圖4)。
用10％SDS+2％β-巰基乙醇、唾液酸酶、或內(nèi)-α-N-乙酰基半乳糖胺酶(O-聚糖酶)處理LH13抗原對(duì)抗體的最終結(jié)合性幾乎沒(méi)有影響。在處理前使抗原變性或同時(shí)用兩種糖苷酶進(jìn)行處理不會(huì)影響抗原對(duì)用唾液酸酶和O-聚糖酶所作的處理的抵抗力。在直接ELISA中通過(guò)用胰蛋白酶(79％，圖4)或用糖苷內(nèi)切酶-F/肽-N-糖苷酶F(36％，未經(jīng)顯示)進(jìn)行處理降低了抗體的結(jié)合性?？贵w對(duì)在用糖苷內(nèi)切酶-F/肽-N-糖苷酶F處理前用10％SDS+2％β-巰基乙醇變性的LH13的結(jié)合被進(jìn)一步減小，與未經(jīng)處理的樣品相比較結(jié)合性減小75％(圖4)。
由于糖苷內(nèi)切酶-F/肽-N-糖苷酶F的特異性范圍寬，不可能根據(jù)碳水化合物的結(jié)構(gòu)來(lái)得到具體的結(jié)論。然而，LH13抗體的結(jié)合性完全不受用唾液酸酶所作的處理(其移除了N-?；騉-?；?，非還原末端唾液酸)的影響。用內(nèi)-α-N-乙?；肴樘前访杆鞯奶幚?其移除與絲氨酸或蘇氨酸相關(guān)聯(lián)的Galβ1-3GalNAc)、或用唾液酸酶和內(nèi)-α-N-乙?；肴樘前访傅慕M合所作的處理也不影響抗體結(jié)合。結(jié)合到抗原的抗體的胰蛋白酶敏感性說(shuō)明該表位與蛋白質(zhì)成分相關(guān)聯(lián)。
總之，使用離子交換色譜法從不含H3396血清的條件培養(yǎng)基中提純大于200倍的LH13抗原。初步研究表明經(jīng)提純的LH13抗原被排除在Superdex 75凝膠過(guò)濾柱外，其與大于70kDa的抗原相一致。用各種試劑處理結(jié)合到細(xì)胞培養(yǎng)皿的LH13抗原提供了證明說(shuō)明碳水化合物和蛋白質(zhì)成分都存在，且與表位對(duì)LH13抗體的結(jié)合或?qū)H13抗原結(jié)合到組織培養(yǎng)皿有關(guān)。目前不可能在這兩種可能性之間作出區(qū)分。
實(shí)例VIII活體外抗體成熟這個(gè)實(shí)例展示了對(duì)抗體可變區(qū)的克隆、含有被克隆的可變區(qū)的變體的Fab庫(kù)的合成、及用以鑒別具有改進(jìn)的親合性的變體的篩檢。
LH13和LH11238的DNA排序展示出兩種抗體的H鏈和L鏈與人胚系序列高度同源。LH11238 VH與胚系序列DP-63(VH4.21)相同而LH13 VH與DP-10/hv1051(Vh1-69)相同。而且，LH11238 VL與胚系序列DPK21/humkv328h5相同而LH13 VL與DPL16/VL3.1高度同源，在V-J連接處含有單核苷酸變化?？贵w和胚系序列之間的高度同源表明抗體可能沒(méi)有在細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行明顯的親合性成熟。為了通過(guò)蛋白質(zhì)工程快速提高LH13和LH11238抗體的物理屬性，如下所述將抗體克隆到細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中。
如下文來(lái)克隆抗體VH和VL可變區(qū)域。從每一克隆體的5×107個(gè)細(xì)胞分離出總RNA而且制備出第一股cDNA。由PCR使用下組與人信號(hào)序列同源的5′引子和對(duì)應(yīng)于人CH1的3′引子(5′-AGACGAGGGGGAAAAGGGTT-3′，SEQ IDNO47)來(lái)放大H鏈可變區(qū)ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGG(SEQ ID NO48)，ATGGACTGGACCTGGAG(G/C)(A/T/GJTC(SEQ ID NO49)，ATGAA(A/G)CA(C/T)CTGTGGTTCTT(SEQ ID NO50)，ATGGGGTCAACCGCCATCCTC(SEQ ID NO51)，ATGGGATGGAGCTGTATCATC(SEQ ID NO52)，ATGTCTGTCTCCTTCCTCATC(SEQ ID NO53)，及ATG(A/G)AC(C/A)TACTTTGTT(G/C)C(SEQ ID NO54)。使用一組對(duì)信號(hào)序列編碼的5′引子(CT(C/T)CT(G/C)(G/T)(G/T)(G/C)CTCCTGCT(A/G)CTCTGG，SEQ ID NO55 和CT(C/T)CT(G/C)(G/T)(G/T)(G/C)CT(C/G)CT(G/A)(C/G/A/T)T(A/G)CTCTGG，SEQ ID NO56)和對(duì)應(yīng)于恒定區(qū)氨基酸117-122的3′引子(CATCAGATGGCCGGGAAGAT，SEQ ID NO57)來(lái)放大K輕鏈可變區(qū)。類似地，使用一組編碼信號(hào)序列的5′引子(ATG(A/G)CCTG(C/G)(A/T)C(C/T)CCTCTC(C/T)T(C/T)CT(C/G)(A/T)(C/T)C，SEQ ID NO58)和對(duì)應(yīng)于恒定區(qū)氨基酸115-124的3′引子(CTCCTCAGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGAC，SEQ ID NO59)來(lái)放大λ輕鏈可變區(qū)。隨PCR放大后，在瓊脂糖凝膠上提純DNA片斷并將其克隆到pCR2.1載體(Invitrogen，Carlsbad CA)中。通過(guò)熒光二脫氧核苷酸終止法使用M13前置引子和反置引子(Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，CA)將每一個(gè)樣品的多克隆體在兩股上都進(jìn)行排序。在一個(gè)序列中的特定位置上核苷酸之間的削減用以顯示這些核苷酸在此位置上的等摩爾混合物。
為了將IgM轉(zhuǎn)換成更有用的治療性mAb，通過(guò)將H鏈可變區(qū)直接移植到γ1恒定區(qū)而使所述同型從IgM轉(zhuǎn)換到IgG1。進(jìn)行了活體外類別轉(zhuǎn)換以提高對(duì)抗體效應(yīng)物功能的控制并開發(fā)用于治療性mAb的更好特征化的表達(dá)、生產(chǎn)、及提純方法。通過(guò)雜交誘變將LH11238抗體的經(jīng)克隆的VH和VL區(qū)域克隆到構(gòu)造于人IgG CH1和KCL序列中的噬菌體載體M13IX104CS(描述于Wu等人J.Mol.Biol.294151-162(1999)和Kristensson等人，Vaccines 95.ColdSprings Harbor Laboratory Press，Cold Springs Harbor，NY第39-43頁(yè)(1995))上(描述于Rosok等人，J.Biol.Chem.27122611-22618(1996))。將LH13抗體克隆到相同的載體上，該載體中K CL已經(jīng)被λCL序列所取代。
為了在活體外快速提高抗體的親合性，同時(shí)將改變表位特異性的潛在性最小化，合成和篩檢了與母序列緊密相關(guān)的HCDR3和LCDR3變體庫(kù)。在活體內(nèi)存在多個(gè)機(jī)理，通過(guò)它們使引入HCDR3和LCDR3的多樣性程度大于抗體的其它CDR中的多樣性，其與這些在抗原識(shí)別中充當(dāng)關(guān)鍵作用的區(qū)域相一致。而且，在未經(jīng)相關(guān)的mAb的先前活體外親合性成熟過(guò)程中，通常最大數(shù)量的有利突變位于HCDR3和LCDR3中。因此，初始庫(kù)集中在H鏈和L鏈以及由單一氨基酸變化而從母序列變動(dòng)的變體的第三CDR中。
使用Kabat等人supra的編號(hào)體統(tǒng)，為誘變LH13 CDR而選擇的殘基是L鏈CDR3(LCDR3)中Asn89至Va197和H鏈CDR3(HCDR3)中Glu95至Tyr102且為誘變LH11238 CDR而選擇的殘基是LCDR3中Gln89-Thr97和HCDR3中Glu95-Tyr102。如Wu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA956037-6042(1998)所述基于有利的LCDR3和HCDR3突變來(lái)合成初始庫(kù)和組合LH13庫(kù)且示于表5中。
表5序列抗體庫(kù) 克隆體 重鏈CDR3輕鏈CDR3LH13 HCDR3 野生型EDS S G W Y H YS97G GS97T TS97N NLCDR3 野生型 NS R D S S G N P V VR91Y YR91F FV97Y YV97F F組合4DS TY4E2 TY F4H7 TF F4G11 F F3G4Y FLH1238 LCDR3 野生型 Q Q Y N N W P P Y T
Q89L LQS9G GQ89V VQS9F FQ89W HN93C CN94C CP95aFFP95aRR在這些偏倚組合庫(kù)中的抗體變體每一個(gè)含有單個(gè)突變，而且在兩個(gè)CDR的每個(gè)殘基上引入所有20個(gè)氨基酸。因此，LH11238庫(kù)含有228個(gè)(HCDR3)和190個(gè)(LCDR3)獨(dú)特的非野生型變體而LH13庫(kù)含有171個(gè)(HCDR3)和209個(gè)(LCDR3)個(gè)獨(dú)特的變體。
如Wu等人，supra(1999)中所述在大腸桿菌(E.coli)XL1-藍(lán)色細(xì)胞(Stratagene)中表達(dá)Fab而且如Watkins等人，Anal.Biochem，25337-45(1997)中所述從周緣空間分離出Fab并將其定量。在ELISA格式中篩檢可溶性Fab。用山羊抗-人λ鏈堿性磷酸酶共軛檢測(cè)了可溶性LH13 Fab對(duì)經(jīng)部分提純的LH13抗原的結(jié)合。如實(shí)例VII中所述部分地提純LH13抗原。如Watkins等人，supra(1997)所述使用經(jīng)固定的H3396腫瘤細(xì)胞來(lái)測(cè)定LH11238 Fab結(jié)合性。
如圖5中(空心環(huán))所示，經(jīng)細(xì)菌表達(dá)的LH13和LH11238 Fab在ELISA中顯示出相對(duì)低的反應(yīng)性，其說(shuō)明抗體沒(méi)有在活體內(nèi)進(jìn)行顯著性的抗體成熟作用。這些結(jié)果進(jìn)一步與IgM分子的結(jié)合很大程度上受多價(jià)驅(qū)使的觀察相一致。如圖5A和5B中的空心環(huán)與空心方塊的比較所示，偏倚組合庫(kù)的篩檢鑒別出含有單氨基酸變化的每個(gè)抗體的多個(gè)變體并顯示出比野生型抗體大差不多100倍的結(jié)合性。在HCDR3和LCDR3中鑒別出了LH13抗體的有利突變。如圖5A所示，克隆體S97N(填充環(huán))和克隆體R91Y與LH13母體相比具有提高的結(jié)合性。如圖5B所示，在包括克隆體N94C(填充方塊)、克隆體N93C(空心三角)及克隆體P95aR(填充環(huán))在內(nèi)的LH11238的LCDR3中也鑒別出多個(gè)有利突變。
將顯示出提高的結(jié)合性的變體排序以鑒別導(dǎo)致更高的親合性的突變，且其也列在表5中。顯示出最高結(jié)合活性的LH13變體(圖5A，空心方塊)在LCDR3中含有R91Y突變并具有約1.8nM的Kd。在親合性上顯示出最大增加量的LH11238突變體(圖5B，空心方塊)是LCDR3中Q89W突變的結(jié)果并具有約11nM的Ka。所述庫(kù)的有限篩檢鑒別出顯示提高大于2倍的結(jié)合性的七個(gè)LH13變體和九個(gè)LH11238變體，他們?nèi)慷剂性诒?中。在HCDR3的S97與LCDR3的R91和V97處鑒別出LH13 CDR的有利突變，而改進(jìn)的LH11238變體在LCDR3的Q89、N93、N94、及P95a處含有有利變化。這些結(jié)果說(shuō)明在LH13的LCDR3中單一氨基酸變化提高了大于50倍的親合性而LH11238的LCDR3中單一氨基酸變化提高了大于35倍的親合性。合成出在LH13的HCDR3和LCDR3中都鑒別出的有利突變的組合庫(kù)以組合個(gè)體突變和進(jìn)一步提高抗體親合性。該庫(kù)含有個(gè)體突變的每一種可能的組合或在三個(gè)CDR位置(HCDR3的S97和LCDR3的R91與V97)的每一處的野生型氨基酸，其產(chǎn)生含有36個(gè)獨(dú)特變體的庫(kù)。如圖5A中組合突變體4H7(填充方塊)與LCDR3變體R91Y(空心方塊)或HCDR3變體S97N(填充環(huán))的比較所示，很容易鑒別出比含有單氨基酸變化的變體顯示出更高親合性的組合克隆體。組合突變體4H7具有約1.1nM的Kd。組合克隆體的DNA排序表明所有克隆體含有至少兩個(gè)突變體(如表5所示)，而且兩個(gè)克隆體(克隆體4E2和4H7)含有三個(gè)突變。所有的五個(gè)組合克隆體顯示出比任何含有單一突變的變體更大的結(jié)合活性。
這個(gè)實(shí)例展示了通過(guò)在兩步驟中合成僅有416個(gè)獨(dú)特蛋白質(zhì)變體來(lái)完成的LH13的親合性成熟。如上文所陳述，第一步由篩檢171個(gè)HCDR3突變體和209個(gè)LCDR3突變體組成接著在第二步中篩檢36個(gè)組合變體。與之相反，在這項(xiàng)研究中顯示出影響活性的三個(gè)CDR殘基(LCDR3 S97、HCDR3 R91、及HCDR3 V97)的總隨機(jī)化可能需要含有193、或6,859個(gè)變體的庫(kù)表達(dá)。因此，本文所描述的結(jié)果表明親合性的逐步提高奪取了獨(dú)立突變的附加性并進(jìn)一步提供了親合性成熟的有效方法。
貫穿本申請(qǐng)案參考了多篇公開案。在本申請(qǐng)案中這些公開案的揭示內(nèi)容以引用的方式全文并入本文中以便更充分地描述本發(fā)明在所屬領(lǐng)域中的位置。
雖然已經(jīng)參考所揭示的實(shí)施例來(lái)描述了本發(fā)明，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)輕易地了解到所祥述的具體實(shí)驗(yàn)僅為本發(fā)明的例證。應(yīng)理解可作出多種修改而不背離本發(fā)明的精神。因此，本發(fā)明僅受上文所述權(quán)利要求的限制。
序列表<110>應(yīng)用分子發(fā)展公司<120>腫瘤特異性單克隆抗體<130>66797-162(IX 5518)<140>PCT/US02/37134<141>2002-11-19<150>US 09/989,901<151>2001-11-19<160>59<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>417<212>DNA<213>類人<220>
<221>CDS<222>(1)...(417)<400>1atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctc ctg gtg gca gct ccc aga tgg48Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15gtc ctg tcc cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag96Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys20 25 30cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tcc ttc144Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe35 40 45agt ggt tac tac tgg agc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg192Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60gag tgg att ggg gaa atc aat cat agt gga agc acc aac tac aac ccg240Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro65 70 75 80tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag288Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln85 90 95ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gcg gac acg gct gtg tat336Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr100 105 110tac tgt gcg aga gaa ata gca gct cgt cct cac cga tac ttt gac tac384Tyr Cys Ala Arg Glu Ile Ala Ala Arg Pro His Arg Tyr Phe Asp Tyr115 120 125tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca417Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135<210>2<211>139<212>PRT<213>類人<400>2Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys20 25 30Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe35 40 45Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro65 70 75 80Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln85 90 95Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr100 105 110Tyr Cys Ala Arg Glu Ile Ala Ala Arg Pro His Arg Tyr Phe Asp Tyr
115 120 125Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135<210>3<211>351<212>DNA<213>類人<220>
<221>CDS<222>(1)...(351)<400>3ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Set Gln Set Val Ser Set Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95cag cag tat aat aac tgg cct ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351
Leu Glu Ile Lys Arg115<210>4<211>117<212>PRT<213>類人<400>4Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>5<211>354<212>DNA<213>類人<220>
<221>CDS<222>(1)...(354)<400>5cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc48Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Serl 5 10 15tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc agc agc tat96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg144Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45gga ggg atc atc cct atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttc192Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac gaa tcc acg agc aca gcc tac240Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt288Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga gaa gat agc agt ggc tgg tat cac tac tgg ggc cag gga acc336Ala Arg Glu Asp Ser Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110ctg gtc acc gtc tcc tca354Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>6<211>118<212>PRT<213>類人<400>6Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95Ala Arg Glu Asp Ser Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>7<211>333<212>DNA<213>類人<220>
<221>CDS<222>(1)...(333)<400>7tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tet gtg gcc ttg gga cag48Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca96Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat144Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc192Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac agc agt ggt aac ccc288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt cag ccc333Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110
<210>8<211>111<212>PRT<213>類人<400>8Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser 6ly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110<210>9<211>354<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(354)<400>9cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc48Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc agc agc tat96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg144Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45gga ggg atc atc cct atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttc192Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac gaa tcc acg agc aca gcc tac240Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt288Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga gaa gat ggt agt ggc tgg tat cac tac tgg ggc cag gga acc336Ala Arg Glu Asp Gly Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110ctg gtc acc gtc tcc tca354Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>10<211>118<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組變體<400>10Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Asp Gly Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>1l<211>354<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(354)<400>11cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc48Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc agc agc tat96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg144Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45gga ggg atc atc cct atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttc192Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Ash Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac gaa tcc acg agc aca gcc tac240Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt288Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
gcg aga gaa gat act agt ggc tgg tat cac tac tgg ggc cag gga acc336Ala Arg Glu Asp Thr Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110ctg gtc acc gtc tcc tca354Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>12<211>118<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組變體<400>12Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Asp Thr Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>13<211>354<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組變體
<221>CDS<222>(1)...(354)<400>13cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc48Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc agc agc tat96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg144Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45gga ggg atc atc cct atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttc192Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac gaa tcc acg agc aca gcc tac240Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt288Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga gaa gat aat agt ggc tgg tat cac tac tgg ggc cag gga acc336Ala Arg Glu Asp Asn Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110ctg gtc acc gtc tcc tca354Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>14<211>118<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組變體<400>14Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Asp Asn Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>15<211>333<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(333)<400>15tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag48Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca96Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat144Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45
ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc192Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc tat gac agc agt ggt aac ccc288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt cag ccc 333Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110<210>16<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組變體<400>16Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110
<210>17<211>333<212>DNA<213>人工序列<220>
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<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組變體<400>18Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Phe Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110<210>19<211>333<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(333)<400>19tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag48Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca96Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat144
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc192Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac agc agt ggt aac ccc288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95gtg tat ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt cag ccc333Val Tyr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110<210>20<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組變體<400>20Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95Val Tyr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110
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<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(333)<400>21tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag48Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca96Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat144Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc192Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac agc agt ggt aac ccc288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95gtg ttt ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt cag ccc333Val Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110
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<223>重組變體<400>22Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95Val Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110<210>23<211>333<212>DNA<213>人工序列<220>
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agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat144Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc192Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc tat gac agc agt ggt aac ccc288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95gtg ttt ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt cag ccc333Val Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110<210>24<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(333)<400>25tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag48Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca96Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat144Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc192Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc ttt gac agc agt ggt aac ccc288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Phe Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95gtg ttt ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt cag ccc333Val Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110
<210>26<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(351)<400>27ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96
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<223>重組變體<400>28Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Leu Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>29<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(351)<400>29ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95ggt cag tat aat aac tgg cct ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Gly Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>30<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組變體<400>30Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gly Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>31<211>351<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(351)<400>31ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gtg cag tat aat aac tgg cct ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Val Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>32<211>117<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>重組變體<400>32Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Val Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>33<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(351)<400>33ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95ttt cag tat aat aac tgg cct ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Phe Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>34<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組變體<400>34Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95Phe Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>35<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(351)<400>35ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc age agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95tgg cag tat aat aac tgg cct ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336
Trp Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>36<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組變體<400>36Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Trp Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>37<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組變體<221>CDS
<222>(1)...(351)<400>37ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95cag cag tat tgt aac tgg cct ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Gln Gln Tyr Cys Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>38<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組變體
<400>38Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gln Gln Tyr Cys Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>39<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(351)<400>39ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95cag cag tat aat tgt tgg cct ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Gln Gln Tyr Asn Cys Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110etg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>40<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組變體<400>40Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gln Gln Tyr Asn Cys Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg
115<210>41<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(351)<400>41ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95cag cag tat aat aac tgg ttt ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351
Leu Glu Ile Lys Arg115<210>42<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組變體<400>42Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro15 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>43<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(351)<400>43ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48
Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95cag cag tat aat aac tgg cgg ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>44<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組變體<400>44Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>45<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組變體<221>CDS<222>(1)...(351)<400>45ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95cag cag tat aat aac tgg cgt ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>46<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組變體<400>46Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>47
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>47agacgagggg gaaaagggtt20<210>48<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>48atggagtttg ggctgagctg g 21<210>49<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<221>misc_feature<222>18<223>n＝g和c的摩爾混合物。
<221>misc_feature<222>19<223>n＝a，t和g的摩爾混合物。
<400>49atggactgga cctggagnnt c 21<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<221>misc_feature<222>6<223>n＝a和g的摩爾混合物.
<221>misc_feature<222>9<223>n＝c和t的摩爾混合物。
<400>50atgaancanc tgtggttctt20<210>51<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>51atggggtcaa ccgccatcct c 21<210>52<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>52atgggatgga gctgtatcat c 21<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>53atgtctgtct ccttcctcat c 21<210>54<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<221>misc_feature<222>4<223>n＝a和g的摩爾混合物。
<221>misc_feature<222>7<223>n＝c和a的摩爾混合物。
<221>misc_feature<222>17<223>n＝g和c的摩爾混合物。
<400>54atgnacntac tttgttnc 18<210>55<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<221>misc_feature<222>3<223>n＝c和t的摩爾混合物。
<221>misc_feature<222>6，9<223>n＝g和c的摩爾混合物。
<221>misc_feature<222>7，8
<223>n＝g和t的摩爾混合物。
<221>misc_feature<222>18<223>n＝a和g的摩爾混合物。
<400>55ctnctnnnnc tcctgctnct ctgg 24<210>56<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<221>misc_feature<222>3<223>n＝e c和t的摩爾混合物。
<221>misc_feature<222>6，9，12<223>n＝g和c的摩爾混合物。
<221>misc_feature<222>7，8<223>n＝g和t的摩爾混合物。
<221>misc_feature<222>15，18<223>n＝g和a的摩爾混合物。
<221>misc_feature<222>16<223>n＝c，g，a，和t的摩爾混合物。
<400>56ctnctnnnnc tnctnntnct ctgg 24<210>57<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>57catcagatgg ccgggaagat20<210>58<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<221>misc_feature<222>4<223>n＝a和g的摩爾混合物。
<221>misc_feature<222>9，24<223>n＝c和g的摩爾混合物。
<221>misc_feature<222>10，25<223>n＝a和t的摩爾混合物。
<221>misc_feature<222>12，19，21，26<223>n＝c和t的摩爾混合物。
<400>58atgncctgnn cncctctcnt nctnnnc27<210>59<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>59ctcctcagag gagggcggga acagagtgac 30
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)分離的人單克隆抗體或其功能片斷，其包含具有大體上選自由下列SEQ ID NO所組成的群組的CDR的氨基酸序列的互補(bǔ)決定區(qū)10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44，其中所述人單克隆抗體或其功能片斷特異性地結(jié)合贅生性細(xì)胞或其抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的人單克隆抗體，其中所述功能片斷選自由Fv、Fab、Fab′、或F(ab′)2組成的群組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的人單克隆抗體或功能片斷，進(jìn)一步包含標(biāo)記物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的經(jīng)分離的人單克隆抗體或功能片斷，其中所述標(biāo)記物含有細(xì)胞毒素劑或細(xì)胞抑制劑。
5.一種醫(yī)藥組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的人單克隆抗體或功能片斷和醫(yī)藥載劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的人單克隆抗體或功能片斷，其包含三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)，它們具有大體上所陳述的在選自由下列SEQ ID NO所組成的群組的序列中的10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的人單克隆抗體或功能片斷，進(jìn)一步包含生理學(xué)上可接受的化合物。
8.一種經(jīng)分離的CDR或其功能片斷，包含大體上選自由下列SEQ ID NO所組成的群組的CDR的氨基酸序列10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44，其中所述CDR或其功能片斷特異性地結(jié)合贅生性細(xì)胞或其抗原。
9.一種編碼人單克隆抗體或其功能片斷的經(jīng)分離的核酸，其包含大體上編碼如下CDR的氨基酸序列的核苷酸序列，該CDR經(jīng)選自由以下SEQ ID NO所組成的群組的核苷酸所編碼9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的經(jīng)分離的核酸，其中所述功能片斷是選自由Fv、Fab、Fab′、或F(ab′)2所組成的群組。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的經(jīng)分離的核酸，其包含大體上對(duì)所陳述的在選自由以下SEQ ID NO所組成的群組的序列中三個(gè)CDR的氨基酸序列進(jìn)行編碼的核苷酸序列9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45。
12.一種編碼CDR或其功能片斷的經(jīng)分離的核酸，其包含大體上對(duì)經(jīng)選自由以下SEQ ID NO所組成的群組的核苷酸序列編碼的CDR的氨基酸序列進(jìn)行編碼的核苷酸序列9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45。
13.一種減少贅生性細(xì)胞增生的方法，其包含向所述細(xì)胞投予有效量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的人單克隆抗體或功能片斷。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述贅生性細(xì)胞是選自由乳癌、肺癌及卵巢癌細(xì)胞所組成的群組。
15.一種檢測(cè)樣品中的贅生性細(xì)胞的方法，其包含(a)使樣品與根據(jù)權(quán)利要求1所述的人單克隆抗體或功能片斷相接觸；以及(b)檢測(cè)所述人單克隆抗體或功能片斷對(duì)所述樣品的特異性結(jié)合，其中與正常細(xì)胞相比存在或具有增高含量的所述人單克隆抗體或功能片斷在所述樣品中存在贅生性細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述贅生性細(xì)胞是選自由乳癌、肺癌及卵巢癌細(xì)胞所組成的群組。
全文摘要
本發(fā)明提供腫瘤特異性人單克隆抗體和功能片斷。還提供編碼腫瘤特異性人單克隆抗體和功能片斷的核酸。還提供了一種用于減少腫瘤細(xì)胞增生的方法。該方法由投以有效量之腫瘤特異性人單克隆抗體或功能片斷來(lái)組成。還提供了一種檢測(cè)樣品中的腫瘤細(xì)胞的方法。該方法由使細(xì)胞與腫瘤特異性單克隆抗體或功能片斷相接觸并檢測(cè)人單克隆抗體或功能片斷對(duì)樣品的特異性結(jié)合來(lái)組成。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1615315SQ02827095
公開日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2002年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月19日
發(fā)明者J·D·瓦特金斯 申請(qǐng)人:應(yīng)用分子發(fā)展公司