專利名稱：食物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用于減少伙伴動(dòng)物中核酸損傷的營養(yǎng)成分。
鑒定涉及決定種特有的壽命的機(jī)制仍然是生物衰老的未解決問題之一。
進(jìn)化論提出，壽命長的物種能夠通過更耐久的體質(zhì)為它們的壽命提供準(zhǔn)備，該體質(zhì)包括增強(qiáng)的細(xì)胞抗應(yīng)激力。正常細(xì)胞過程如呼吸和其它代謝活動(dòng)在細(xì)胞微環(huán)境中產(chǎn)生各種各樣的應(yīng)激。這些應(yīng)激包括氧化應(yīng)激、熱能和在正常生化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的離子和pH變化，已知所有這些應(yīng)激都能引起對細(xì)胞器(如線粒體、高爾基體、細(xì)胞溶膠、質(zhì)膜、細(xì)胞骨架、溶酶體和細(xì)胞核)和細(xì)胞大分子(如蛋白質(zhì)、多糖、核酸、脂質(zhì)和磷脂)的損傷。由這些應(yīng)激引起的一些損傷是不可逆的。
因此，希望能夠減少對所述細(xì)胞微環(huán)境，如細(xì)胞器或細(xì)胞大分子的一個(gè)或多個(gè)組分的損傷。
本發(fā)明提供了用于減少對核酸損傷的營養(yǎng)干預(yù)。
現(xiàn)認(rèn)為影響細(xì)胞器和細(xì)胞大分子的因素是廣泛的。它們可能包括環(huán)境影響(溫度壓力)、地理因素、表型因素和營養(yǎng)干預(yù)(飲食)。
本發(fā)明已經(jīng)確定和提供了用于減少對細(xì)胞大分子損傷的營養(yǎng)干預(yù)，該細(xì)胞大分子為核酸分子。
因此，本發(fā)明提供了維生素E、維生素C和類胡蘿卜素在制備用于減少伙伴動(dòng)物中核酸損傷的食物中的應(yīng)用。
所述核酸可以是脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
維生素E是幾種生物類似化合物的集合術(shù)語，這些化合物包括稱為生育酚和生育三烯酚的那些化合物。它們具有相同的生物活性。動(dòng)物組織中維生素E最具生物活性的生物形式(也是最活躍的抗氧化劑)是α-生育酚。維生素E在體內(nèi)不能合成。維生素E可保護(hù)細(xì)胞膜完整不受損失，該損失不利地改變細(xì)胞和細(xì)胞器的功能。
維生素E的單位可以用國際單位(IU)表示，其中1IUα-生育酚等于1mgα-生育酚。其它維生素E化合物可按照McDowell，L.R(1989)Vitamin EIn vitamins in Animal Nutrition，第四章，第96頁，Academic Press，UK.的描述，通過將它們的生物效價(jià)與α-生育酚比較來測定它們的IU。
按照本發(fā)明第一方面的所述維生素E可以呈任何形式。它可以是生育酚或生育三烯酚。它可以是α-生育酚(d-α或dl-α)、β-生育酚(d-β或dl-β)、γ-生育酚(d-γ或dl-γ)、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚或δ-生育三烯酚。優(yōu)選它為α-生育酚。
所述維生素E的來源沒有限制。優(yōu)選的維生素E來源包括乙酸維生素E，(例如乙酸生育酚)、乙酸維生素E吸附物或噴霧干燥的乙酸維生素E。盡管可以應(yīng)用天然來源，但是優(yōu)選的來源是合成的。
所述維生素E的給予形式?jīng)]有限制。它可以呈飲食、食物或補(bǔ)充物的形式。在本說明書的下文中，術(shù)語“食物”覆蓋了食物、飲食和補(bǔ)充物的全體。這些形式的任何一種可以是固體、半固體或者液體。
所述補(bǔ)充物對于補(bǔ)充不含足夠高含量的按照本發(fā)明成分中的一種或多種的飲食或食物是特別有用的。補(bǔ)充物中所述成分的濃度可以用來“裝滿”動(dòng)物飲食或食物中的所述含量。這可以通過用動(dòng)物飲食包含一定量的所述補(bǔ)充物或者通過另外地喂給動(dòng)物一定量的所述補(bǔ)充物來完成。所述補(bǔ)充物可以形成為具有特別高含量的本發(fā)明的一種或多種成分的食物，該食物在喂給動(dòng)物前需要稀釋。所述補(bǔ)充物可以呈任何形式，包括固體(例如，粉末)、半固體(例如食品樣稠度/凝膠)、液體或可替換地，它可以呈片劑或膠囊的形式?？梢苑奖愕赜檬称穼⑺鲆后w混入或者例如通過勺或通過吸移管樣裝置將液體直接喂給所述動(dòng)物。所述補(bǔ)充物可以富含本發(fā)明的一種或多種成分或者可以呈至少兩部分的組合包的形式，每部分含有所需含量的一種或多種成分。
優(yōu)選將所述維生素E加入商業(yè)寵物食品產(chǎn)品或商業(yè)飲食補(bǔ)充物中。所述寵物食品產(chǎn)品可以是干、半干、濕或液體(飲料)產(chǎn)品。濕產(chǎn)品包括以罐頭或箔制容器銷售并且具有70至90％水分含量的食品。干產(chǎn)品包括具有類似組成，但具有5至15％的水分并且作為餅干樣粗粉呈現(xiàn)的食品。優(yōu)選把飲食、食物或補(bǔ)充物包裝。這樣消費(fèi)者能從包裝上識別食物中的組分和確認(rèn)它適合被考慮的狗或貓。包裝可以是金屬(通常以罐頭或軟箔的形式)、塑料、紙或布紋紙。任何產(chǎn)品中的水分量可影響可以使用或需要的包裝類型。
按照本發(fā)明的食物包括伙伴動(dòng)物可以在它的飲食中消耗的任何產(chǎn)品。因此，本發(fā)明覆蓋標(biāo)準(zhǔn)食品、以及寵物食品點(diǎn)心(例如點(diǎn)心條、餅干和甜品)。所述食物優(yōu)選是熟食品。它可以加入肉或得自動(dòng)物的材料(如牛肉、雞肉、火雞肉、羔羊肉、血漿、骨髓等，或者其中的兩種或更多種)。為了提供蛋白質(zhì)來源，所述食物也可選擇地不含肉類(優(yōu)選包括肉類替代品如大豆、玉米面筋或大豆產(chǎn)品)。所述產(chǎn)品可含有另外的蛋白質(zhì)來源如大豆蛋白濃縮物、牛奶蛋白質(zhì)、面筋等。所述產(chǎn)品還可含有淀粉來源如一種或多種谷物(例如小麥、玉米、大米、燕麥、大麥等)或不含淀粉。典型的干商業(yè)狗和貓食品含有約30％的粗蛋白質(zhì)、約10～20％的脂肪和余下部分為碳水化合物，包括食物纖維和灰分。典型的濕的或濕潤的產(chǎn)品含有(在干物質(zhì)基礎(chǔ)上)約40％的脂肪、50％的蛋白質(zhì)和余下部分為纖維和灰分。本發(fā)明特別與在此描述的作為貓或狗的飲食、食物或補(bǔ)充物銷售的食物有關(guān)。
本發(fā)明的所述伙伴動(dòng)物沒有限制。它不涉及人?；锇閯?dòng)物包括馴養(yǎng)的貓和馴養(yǎng)的狗，以及馬、魚、鳥、兔和豚鼠。在本文中術(shù)語“馴養(yǎng)的”狗和“馴養(yǎng)的”貓意思是指狗類和貓類，尤其是家貓(Felisdomesticus)和家犬(Canis domesticus)。
可以容易地測定產(chǎn)品(固體或液體或任何其它形式)中維生素E的濃度。例如，可以用HPLC方法測定它。
優(yōu)選地，按照本發(fā)明第一方面的食物的所述維生素E的水平從25IU/400kcal飲食起。在本文中，關(guān)于每千卡濃度是指千卡總代謝能攝入。用Nutritional Requirements of Dogs(1985)National ResearchCouncil(U.S.)National Academy Press Washington DC，ISBN0-309-03496-5或Nutritional Requirements of Cats(1986)National Research Council(U.S.)National Academy PressWashington DC，ISBN0-309-03682-8可確認(rèn)卡路里密度的測定。對貓優(yōu)選的水平為從30IU/400kcal起，從35IU/400kcal起，從40IU/400kcal起，從45IU/400kcal起，從50IU/400kcal起，從55IU/400kcal起，直到約100IU/400kcal或以上。對狗優(yōu)選的水平為從30IU/400kcal起，從40IU/400kcal起，從45IU/400kcal起，從50IU/400kcal起，從55IU/400kcal起，從60IU/400kcal起，從65IU/400kcal起，直到約從100IU/400kcal或以上起。
本發(fā)明的第一方面還包括維生素C(抗壞血酸)。
維生素C是一種水溶性物質(zhì)。它在馴養(yǎng)的貓和馴養(yǎng)的狗體內(nèi)都能從頭合成。因?yàn)樗荏w內(nèi)合成，所以以前還沒有研究過維生素C補(bǔ)充物在狗和貓?bào)w內(nèi)的作用。具體地說，還沒有研究過作為潛在的抗氧化劑以及與維生素E補(bǔ)充相組合，維生素C補(bǔ)充在狗和貓?bào)w內(nèi)的作用。
按照本發(fā)明第一方面的所述維生素C可以呈任何形式。它可以是液體、半固體或固體。優(yōu)選它是一種熱穩(wěn)定形式如磷酸鈣形式。
所述維生素C的來源沒有限制。優(yōu)選的維生素C來源包括結(jié)晶抗壞血酸(任選純的)、乙基纖維素包衣的抗壞血酸、抗壞血酸的磷酸鈣鹽、抗壞血酸-2-單磷酸鹽或者具有小痕量二磷酸鹽和痕量三磷酸鹽，磷酸鈣的抗壞血酸-2-單磷酸酯、或者例如，新鮮肝臟。
可以容易地測定產(chǎn)品(固體，液體或任何其它形式)中的維生素C水平。例如，可以用HPLC方法測定它。
涉及維生素E與維生素C組合應(yīng)用的進(jìn)一步應(yīng)用點(diǎn)是它們潛在的協(xié)同作用。下面事實(shí)可以支持這一點(diǎn)維生素E是脂溶性的而維生素C是水溶性的。已知α-生育酚位于脂膜中?？箟难岷挺?生育酚，例如，在細(xì)胞膜或脂蛋白與水之間的界面相互作用?？箟难峥焖龠€原膜中的α-生育酚自由基重新生成α-生育酚。按照本發(fā)明第一方面維生素C的優(yōu)選濃度為這樣一個(gè)水平，與當(dāng)喂給所述動(dòng)物對照飲食時(shí)相比，它優(yōu)選提高動(dòng)物血漿維生素C水平高達(dá)約25％(優(yōu)選25％或更高)，以致于它的總維生素C消耗為(既對貓又對狗)5mg/400kcal飲食。本發(fā)明的第一方面還覆蓋不能實(shí)現(xiàn)這種提高的維生素C水平。按照本發(fā)明第一方面的維生素C水平包括從10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、38、40、42、48直到約50mg/400kcal飲食。對貓優(yōu)選的水平為上面從10至48mg/400kcal的選擇，對狗為上面從12至50mg/400kcal的選擇。55mg/400kcal以上的水平不會(huì)提供增加的益處，通常最好避免。
本發(fā)明的第一方面還包括類胡蘿卜素。
所述類胡蘿卜素是一組紅色、橙色和黃色的色素，這些色素主要發(fā)現(xiàn)于植物食品中，特別是水果和蔬菜中，以及吃所述植物的動(dòng)物的組織中。它們是親脂性化合物。有些類胡蘿卜素起維生素A前體的作用，有些則不能。這種性質(zhì)與它們的抗氧化活性無關(guān)。類胡蘿卜素可以起強(qiáng)抗氧化劑的作用。不同的動(dòng)物品種吸收類胡蘿卜素的程度不同?？梢詫㈩惡}卜素分成兩大組基于胡蘿卜素的那些和基于胡蘿卜醇(它們包括氧化了的化合物)的那些。普通類胡蘿卜素包括β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質(zhì)和蝦青素。現(xiàn)在沒有證明類胡蘿卜素是貓或犬飲食中的必須營養(yǎng)物。與人和狗不同，貓不能將前體β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成活性維生素A形式，因?yàn)樨埖哪c粘膜中缺乏這種轉(zhuǎn)化所必須的酶(它們不具有裂開所述胡蘿卜素分子所需的雙加氧酶)。
本發(fā)明表明，類胡蘿卜素能被馴養(yǎng)的貓和狗吸收(提供升高的血漿濃度)而且能促成DNA損傷減少。另外，本發(fā)明已經(jīng)證實(shí)，在將類胡蘿卜素混入商業(yè)產(chǎn)品后它們能被吸收。如上面所提及的，本發(fā)明第一方面的所述成分可協(xié)同起作用。維生素E能保護(hù)β-胡蘿卜素免受氧化而且可能對β-胡蘿卜素具有節(jié)約(sparing)作用。現(xiàn)在認(rèn)為維生素E能保護(hù)β-胡蘿卜素的化學(xué)鍵免受氧化。
所述類胡蘿卜素的來源沒有限制，可包括自然和合成來源。具體地說，優(yōu)選的來源為自然來源且包括金盞花粉和紫花苜蓿粉(葉黃素的來源)、番茄粉、紅棕櫚油、番茄粉、番茄渣/漿(β-胡蘿卜素和番茄紅素的來源)。來源包括類胡蘿卜素含量高的油和純制造的類胡蘿卜素如葉黃素、堇菜黃質(zhì)、隱黃質(zhì)、胭脂樹橙、玉米黃質(zhì)、apo-EE(Apo-8-胡羅卜酸乙酯(Apo-8-carotenic acid ethylester))、斑蝥黃、citranaxanthin、achinenone、番茄紅素和辣椒紅。總類胡蘿卜素的優(yōu)選含量為從0.01mg/400kcal，或從0.2mg/400kcal或從1mg/400kcal或從2mg/400kcal起。
下面類胡蘿卜素的濃度為優(yōu)選β-胡蘿卜素0.01至1.5mg/400kcal，優(yōu)選0.5至1mg/400kcal番茄紅素0.01至1.5mg/400kcal，優(yōu)選0.5至1mg/400kcal葉黃素0.05至1.5mg/400kcal，優(yōu)選0.5至1mg/400kcal。
具體地說，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面中的類胡蘿卜素的組合。
所述組合的類胡蘿卜素優(yōu)選來源包括紅棕櫚油和金盞花粉番茄粉、金盞花粉和紫花苜蓿番茄渣和金盞花粉。
可以容易地測定產(chǎn)品中的類胡蘿卜素含量。例如，可以用HPLC方法測定它。
本發(fā)明的第一方面可包括牛磺酸。
?；撬崾且环N發(fā)現(xiàn)于許多種動(dòng)物中不常見的氨基酸。對貓來說牛磺酸是一種必須營養(yǎng)物，與狗不同，貓不能從前體氨基酸合成?；撬帷，F(xiàn)認(rèn)為?；撬崮軌虮Ｗo(hù)細(xì)胞膜以免受包括氧化劑的毒性成分的影響。動(dòng)物飲食中維生素?；撬崴降奶岣撸貏e是與本發(fā)明的其它成分組合，能促成自由基減少以及因此動(dòng)物中DNA損傷減少。
按照本發(fā)明第一方面的?；撬峥梢猿嗜魏涡问?。它可以是粉末的、結(jié)晶的、半固體或液體的形式。
所述?；撬岬膩碓礇]有限制。優(yōu)選的?；撬醽碓窗ò被一撬?C2H7NO3S)。來源可以是自然或合成的。
通常在某種程度上產(chǎn)品的加工(例如，所述產(chǎn)品是干的還是罐裝的)決定了按照本發(fā)明第一方面應(yīng)用的?；撬岬暮线m濃度。要維持貓血漿牛磺酸水平在正常范圍(＞60μmol/l)，罐裝(濕的)飲食必須提供每天每千克體重至少39mg?；撬幔娠嬍潮仨毺峁┟刻烀壳Э梭w重至少19mg?；撬?。本發(fā)明的第一方面為一種不經(jīng)過高溫方法(如罐裝)的產(chǎn)品提供的優(yōu)選含量從約80mg/400kcal起，更優(yōu)選從約100起，提高到甚至更優(yōu)選從120、150、180、200、220、250、280、300、320、350、400和以上起(用mg/400kcal飲食表示)。在例如通過高溫處理的產(chǎn)品中，按照本發(fā)明的含量優(yōu)選從約380mg/400kcal起，更優(yōu)選從約400起，提高到甚至更優(yōu)選從420、450、480、500、520、550、580、600、620、650、700和以上飲食起(用mg/400kcal表示)。
可以容易地測定產(chǎn)品(固體、液體或者呈任何其它形式)中?；撬岬臐舛取＠?，可以用HPLC色譜法測定它。
如上所述，本發(fā)明包括維生素E和其它成分。所述成分的有用組合(優(yōu)選以罐裝或干的寵物食品形式)包括維生素E、維生素C、牛磺酸、紅棕櫚油和金盞花粉維生素E、維生素C、?；撬?、番茄粉、金盞花粉和紫花苜蓿維生素E、維生素C、?；撬帷⒎逊酆徒鸨K花粉維生素E、維生素C、?；撬?、番茄粉和紫花苜蓿維生素E、牛磺酸、番茄渣和金盞花粉。
本發(fā)明的一種組合是大約的活性成分mg/400kcal生產(chǎn)后(干產(chǎn)品)維生素C 20mg抗壞血酸維生素E 50IU?；撬? 200mg(在濕產(chǎn)品中500mg)葉黃素 0.17mg番茄紅素0.03mgβ-胡蘿卜素 0.01mg本發(fā)明的又一種有用組合是維生素E 50IU/400kcal維生素C 20mg/400kcal牛磺酸 500mg/400kcalβ-胡蘿卜素 0.5至1mg/400kcal番茄紅素1mg/400kcal葉黃素 0.5至1mg/400kcal按照本發(fā)明的食物的其它有用成分包括痕量無機(jī)物(不是直接的抗氧化劑，但起抗氧化金屬酶系統(tǒng)內(nèi)的輔因子的作用)、硒(抗氧化含硒酶，谷胱甘肽過氧化物酶的一個(gè)必須部分)、銅、鋅和錳(形成抗氧化金屬酶Cu-Zn-超氧化物歧化酶和Mn-超氧化物歧化酶的完整部分)。
本發(fā)明的第二方面提供了一種減少動(dòng)物中核酸損傷的方法，該方法包括給予所說的動(dòng)物包含維生素E、維生素C和類胡蘿卜素的食物。
本發(fā)明第一方面的全部優(yōu)選特征也適用于所述第二方面。
按照所述第二方面的方法，可以同時(shí)、分開或順序給予或使用所述成分。
隨著越來越多的證據(jù)提示自由基參與了氧化DNA損傷的發(fā)展，在許多變性性障礙(degenerative disorders)的病原學(xué)中已經(jīng)牽涉這種損傷的后果，因此對精確評估DNA損傷水平的需求已經(jīng)重新受到了關(guān)注。在正常人細(xì)胞中已經(jīng)檢測到顯著的DNA損傷水平，現(xiàn)認(rèn)為這是由作為正常身體過程副產(chǎn)物產(chǎn)生的自由基攻擊(例如羥基自由基)引起的。
確實(shí)存在各種各樣的防御機(jī)制來猝滅潛在引起損傷的自由基。主要的抗氧化防御包括酶類(過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶)。次要的抗氧化防御涉及消除自由基誘導(dǎo)的DNA損傷的切除和修復(fù)過程。盡管存在這些防御系統(tǒng)，但在細(xì)胞內(nèi)還發(fā)生損傷，現(xiàn)認(rèn)為未修復(fù)DNA的累積可促成各種各樣的障礙。
單細(xì)胞電泳，更常稱為彗星試驗(yàn)，是一種簡單且非常靈敏的測定核酸損傷(特別是DNA損傷)的方法，該方法具有能夠在單細(xì)胞水平上評估DNA損傷的附加優(yōu)點(diǎn)。該試驗(yàn)的基本原理是，存在于所有細(xì)胞類型中的DNA通過自由基攻擊的作用都能夠受損傷、突變或重組。DNA修復(fù)酶(例如DNA內(nèi)切核酸酶)可除去這些損傷的DNA區(qū)域。這事實(shí)上在DNA中留下了缺口或“DNA鏈斷裂”。設(shè)計(jì)彗星試驗(yàn)來檢測和定量的就是這些鏈斷裂。
目前，所述彗星試驗(yàn)已經(jīng)被用于各種各樣的應(yīng)用中，包括毒理研究(Singh N.P.，McCoy，M.T.，Tice，R.R.& Schneider，E.L.(1988).A simple technique for quantitation of low levels of DNA damagein individual cells.Exp.Cell Biol.175184-191)，運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的損傷(Hartmann，D.(1994).Free-radical theory of ageingIncreasing the functional life span.Ann.NY.Acad.Sci.7171-15)，和測定細(xì)胞生長和DNA修復(fù)機(jī)制(Duthie，S.J.& Collins，A.R.(1997).The influence of cell growth，detoxifying enzymesand DNA repair of hydrogen peroxide-mediated DNA damage(measured using the comet assay)in human cells.Free Radic.Biol.Med.22717-724)。
具有能精確測定自由基損傷的水平以及飲食干預(yù)如何能減少貓和狗中的這種損傷的能力是重要的。為包括在營養(yǎng)研究中，我們已經(jīng)開發(fā)和證實(shí)了所述彗星試驗(yàn)(由Singh等，(上文)描述的最初方法進(jìn)行改進(jìn))用于測定貓和狗血樣中由自由基攻擊誘發(fā)的DNA損傷的水平。
所述彗星試驗(yàn)基于下述原理工作自由基，如活性氧，攻擊然后引起DNA鏈斷裂，這就導(dǎo)致DNA超螺旋結(jié)構(gòu)解旋和喪失。用瓊脂糖包埋細(xì)胞如白細(xì)胞，然后在顯微鏡載玻片上分層，用去污劑溶解后在堿性條件下電泳。形成含有無核小體但還是超螺旋的DNA的擬核。存在于DNA中的任何斷裂都可引起超螺旋局部松弛然后DNA環(huán)自由伸展形成具有明顯“尾”區(qū)的彗星形狀結(jié)構(gòu)，該“尾”區(qū)由伸展和破裂的DNA環(huán)組成，當(dāng)進(jìn)行堿性電泳時(shí)該DNA環(huán)已經(jīng)從擬核“頭”遷移。
所述堿性條件還允許破裂環(huán)中的鏈解旋然后將堿不穩(wěn)定的位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA斷裂，促使彗星“頭”和“尾”的形成。
熒光染色后，染色強(qiáng)度與DNA含量有關(guān)，通過證實(shí)的目視分級系統(tǒng)和/或計(jì)算機(jī)圖像分析包確定DNA損傷的量。評估兩種DNA損傷的量度。第一，內(nèi)源性(背景)DNA損傷，它提供了細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生DNA斷裂的指征。第二，人工誘發(fā)(用過氧化氫處理細(xì)胞)的DNA損傷，它反應(yīng)對內(nèi)源性損傷的抗氧化耐受性。
內(nèi)源性和外源性DNA損傷提供了一種指征升高的損傷水平(或升高的導(dǎo)致?lián)p傷的應(yīng)激)促成繼發(fā)性疾病的發(fā)展。
所述彗星試驗(yàn)還證明具有以下益處●僅需要來自貓和狗的少量血樣，●在單細(xì)胞水平上檢測DNA損傷的靈敏性，●潛在地高通量測定，●易應(yīng)用、適應(yīng)性強(qiáng)和低成本。
所述彗星試驗(yàn)?zāi)苡脕龛b別飲食對內(nèi)源性和外源性DNA損傷的不同作用，因此可建議把它作為研究不同營養(yǎng)補(bǔ)充物對調(diào)制貓和狗DNA損傷水平的作用的簡單生物測定。
現(xiàn)描述本發(fā)明。


圖1不同濃度的過氧化氫(0-250μM/ml)對誘發(fā)DNA損傷的作用。結(jié)果為12只受試驗(yàn)貓的平均值±SEM。用不同字母表示的平均值在p＜0.001統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。
圖2不同濃度的過氧化氫(0-250μM/ml)對誘導(dǎo)DNA損傷的作用。結(jié)果為12只受試驗(yàn)狗的平均值±SEM。用不同字母表示的平均值在p＜0.001統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。
圖3貓白細(xì)胞所有DNA損傷級的尾中DNA百分?jǐn)?shù)的目視評分與計(jì)算機(jī)圖像分析之間的關(guān)系。結(jié)果為平均值±SEM(n＝100每級)。
圖4貓白細(xì)胞所有DNA損傷級的尾力矩的目視評分與計(jì)算機(jī)圖像分析之間的關(guān)系。結(jié)果為平均值±SEM(n＝100每級)。
圖5貓白細(xì)胞所有DNA損傷級的尾長的目視評分與計(jì)算機(jī)圖像分析之間的關(guān)系。結(jié)果為平均值±SEM(n＝100每級)。
圖6狗白細(xì)胞尾中DNA百分?jǐn)?shù)的目視評分與計(jì)算機(jī)圖像分析之間的關(guān)系。結(jié)果為平均值±SEM(n＝100每級)。
圖7狗白細(xì)胞所有DNA損傷級的尾力矩的目視評分與計(jì)算機(jī)圖像分析之間的關(guān)系。結(jié)果為平均值±SEM(n＝100每級)。
圖8狗白細(xì)胞所有DNA損傷級的尾長的目視評分與計(jì)算機(jī)圖像分析之間的關(guān)系。結(jié)果為平均值±SEM(n＝100每級)。
圖9貓對照組和補(bǔ)充組的內(nèi)源性DNA損傷。顯示的是每組的平均值，以及該平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差均值(SEM)。
圖10貓對照組和補(bǔ)充組的外源性DNA損傷。顯示的是每組的平均值，以及該平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差均值(SEM)。
圖11小狗對照組和補(bǔ)充組的內(nèi)源性DNA損傷。顯示的是每組的平均值，以及該平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差均值(SEM)。
圖12在補(bǔ)充前取樣，狗對照組和AOX補(bǔ)充組的內(nèi)源性和外源性DNA損傷。顯示的是每組的平均值。
圖13在補(bǔ)充后2個(gè)月取樣，狗對照組和AOX補(bǔ)充組的內(nèi)源性和外源性DNA損傷。顯示的是每組的平均值。
圖14比較狗不加補(bǔ)充物組和AOX補(bǔ)充組之間的基線和補(bǔ)充后2個(gè)月的內(nèi)源性DNA損傷結(jié)果。
圖15比較狗不加補(bǔ)充物組和AOX補(bǔ)充組之間的基線和補(bǔ)充后2個(gè)月的外源性DNA損傷結(jié)果。
圖16在補(bǔ)充前取樣，狗對照組和抗氧化劑(AOX)補(bǔ)充組的內(nèi)源性和外源性DNA損傷。顯示的是每組的平均值。結(jié)果表示為平均值(±SEM)，n＝20。未觀察到顯著差異。
圖17在補(bǔ)充后2個(gè)月取樣，狗對照組和抗氧化劑(AOX)補(bǔ)充組的內(nèi)源性和外源性DNA損傷。顯示的是每組的平均值。結(jié)果表示為平均值(±SEM)，n＝20。星號*表示p＜0.005的顯著。
現(xiàn)在參照下面的實(shí)施例描述本發(fā)明。
實(shí)施例1用于評估狗和貓白細(xì)胞中DNA損傷水平的單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)(彗星試驗(yàn))的證實(shí)。
我們在此報(bào)道了狗和貓系統(tǒng)內(nèi)彗星試驗(yàn)的開發(fā)和驗(yàn)證，該試驗(yàn)將來可用于研究營養(yǎng)補(bǔ)充可能具有的保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷的作用。
材料與方法細(xì)胞制備將所有貓和狗養(yǎng)在Waltham Centre for Pet Nutrition，條件與寵物貓和狗的條件相似，并且在整個(gè)研究期間喂給可通過商業(yè)途徑得到的完全飲食。從12只健康成年貓(7.2±4.8歲)和12只健康成年狗(4.5±2.3歲)的頸靜脈抽取小體積血樣(5ml)注入肝素鋰管中，然后用PBSa按1∶1稀釋。通過以1000g離心40分鐘在Histopaque1083梯度儀(Sigma，UK)上分離白細(xì)胞。在記數(shù)和直到需要時(shí)為止在-80℃用90％胎牛血清(Sigma)和10％二甲亞砜(Sigma)以1×106細(xì)胞/ml貯藏前，用10ml PBSa洗滌白細(xì)胞兩次然后以700g離心10分鐘。生存力(用錐蟲藍(lán)排除法評估)通常為95％左右。
過氧化氫處理通過將所述白細(xì)胞暴露給H2O2濃度(0-250μM，用PBSa稀釋)范圍離體(ex vivo)誘發(fā)DNA損傷來確定誘發(fā)DNA損傷明顯高于背景內(nèi)源性DNA損傷水平所需要的最適H2O2水平。在37℃水浴中快速解凍白細(xì)胞，用PBSa洗兩次，以700g離心15分鐘，然后用PBSa以2×105/ml重新懸浮。用0μM、10μM、50μM、100μM和250μM H2O2的PBSa溶液將細(xì)胞重新懸浮，然后在冰上培育5分鐘。在4℃以700g離心經(jīng)處理的白細(xì)胞15分鐘備用于載玻片制備。
載玻片制備制備兩層瓊脂糖。對于第一層，用吸移管將在95℃用PBSa制備的85μl 1％(w/v)高熔點(diǎn)(HMP)瓊脂糖(Sigma)吸移到充分霜凍的顯微鏡載玻片上，用18×18mm的蓋玻片覆蓋然后讓其在4℃凝固10分鐘。用PBSa將未經(jīng)處理的和經(jīng)過氧化氫處理的白細(xì)胞洗兩次，以700g離心15分鐘然后用85μl 1％(w/v)低熔點(diǎn)(LMP)瓊脂糖(Sigma)以2×105重新懸浮。然后將所述細(xì)胞懸液吸移到凝固的HMP瓊脂糖層上，用18×18mm的蓋玻片覆蓋然后讓其在4℃凝固10分鐘。移去蓋玻片后，用新制備的冷溶解液浸漬所述載玻片。
細(xì)胞溶解為了脫除細(xì)胞蛋白質(zhì)，在4℃用預(yù)先冷卻的溶解溶液(2.5M NaCl，100mM EDTA鈉，10mM Tris，用NaOH顆粒調(diào)pH至10，1％Triton X-100(v/v)，(使用前立即加入))浸漬載玻片60分鐘。
堿處理和電泳溶解后，將所述載玻片放置在凝膠電泳裝置中，在暗處4℃以25V(300mA)電泳30分鐘前，在暗處室溫下用新鮮堿性電泳緩沖液(300mMNaOH，1mM EDTA，pH13)培育40分鐘。
中和與染色電泳后，用中和緩沖液(0.4M Tris-HCl，pH7.5)浸漬所述載玻片，然后在4℃小心地洗三次5分鐘以脫除堿和去污劑。往每個(gè)載玻片中加入50微升SYBR Green(Trevigen，Gathersberg，MD)使DNA染色，然后用蓋玻片覆蓋，在觀察前置于暗處一個(gè)密閉潮濕的容器中。仿效Ward，T.H.& Marples，B.(2000)的研究SYBR Green I and theimproved sensitivity of the single-cell electrophoresis assay.Int.J.Rad.Biol.7661-65，選擇SYBR Green使損傷的DNA染色，證實(shí)了與可替代的DNA染色劑相比SYBR Green的改善的檢測靈敏性和測定分辨率。
DNA損傷評分按照Collins，A.R.，Dunsiska，M.，Gedik，C.M.& Stetina，R.(1996).Oxidative damage to DNAdo we have a reliablebiomarker？Enrion.Health Pers.104(Suppl 3)465-469和Collins，A.，Dunsiska，M.，F(xiàn)ranklin，M.，Somorovska，M.，Petrouska，H.，Duthie，S.，F(xiàn)illion，L.，Panayiotidis，M.，Raslova，K.& Vaughan，N.(1997).Comet assay in humanbiomonitoring studiesreliability，validation andapplications.Envir.Mol.Mutagen.30139-146的方案進(jìn)行DNA損傷的目視和計(jì)算機(jī)圖像分析。在Zeiss倒置熒光顯微鏡上460nm處放大250倍觀察載玻片?；谟^察到的彗星尾長遷移和彗星尾中DNA的相對比例憑視覺以0～4(即范圍從0＝?jīng)]有DNA損傷，至4＝深度DNA損傷)的任意尺度給隨機(jī)選擇的非重疊細(xì)胞賦予一個(gè)得分。通過用所述級的數(shù)值乘分配給每個(gè)損傷級的細(xì)胞數(shù)然后總計(jì)全部級數(shù)(給出最大可能得分400，對應(yīng)于4級100個(gè)細(xì)胞)推導(dǎo)出每個(gè)載玻片的總損傷得分。為確定是否目視評分與計(jì)算機(jī)圖像分析相關(guān)聯(lián)，還用KOMET4.0分析包(Kinetic Imaging，Liverpool，UK)對相同細(xì)胞進(jìn)行DNA損傷評分。進(jìn)行各種客觀測量，包括測定尾中DNA百分?jǐn)?shù)、尾長(從彗星頭的前緣起測量)和尾力矩(tail moment)。按下面公式計(jì)算尾力矩尾力矩＝尾長x％尾DNA/100統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用線性回歸分析使目視彗星得分與計(jì)算機(jī)圖像分析所得得分相關(guān)聯(lián)。為確定用來離體誘發(fā)DNA損傷的H2O2不同濃度之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，應(yīng)用兩因素ANOVA和Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。
結(jié)果本研究的目的是開發(fā)和證實(shí)彗星試驗(yàn)評估貓和狗白細(xì)胞中DNA損傷水平的應(yīng)用。用觀察到的彗星尾長和尾中DNA水平作為評分標(biāo)準(zhǔn)，從0級(無DNA損傷)到4級(深度DNA損傷)對DNA損傷進(jìn)行目視評分。為證實(shí)貓和狗白細(xì)胞對DNA損傷的敏感性，用0-250μM H2O2處理細(xì)胞懸液5分鐘。然后用目視評分系統(tǒng)評價(jià)SYBR green染色的彗星的DNA損傷。當(dāng)與未經(jīng)處理的樣品比較時(shí)，用目視評分系統(tǒng)在10～250μM H2O2范圍內(nèi)貓和狗樣品中都觀察到DNA損傷統(tǒng)計(jì)學(xué)地顯著增加(p＜0.001)。盡管相對于貓和狗二者樣品中使用的所有其它H2O2濃度，應(yīng)用250μM H2O2誘導(dǎo)了DNA損傷的顯著增加(圖1和圖2)，但當(dāng)比較貓樣品應(yīng)用10～100μM H2O2(圖1)和狗樣品應(yīng)用50-100μM H2O2(圖2)時(shí)，在DNA損傷水平之間未觀察到顯著差異。
本研究的第二個(gè)目的是將彗星的目視評分(以0～4的尺度)與尾中DNA百分?jǐn)?shù)、尾力矩和尾長的計(jì)算機(jī)圖像分析參數(shù)進(jìn)行比較。圖3、4和5表明，如用線形回歸確定的，貓白細(xì)胞彗星的目視評分與計(jì)算機(jī)圖像分析高度相關(guān)，相關(guān)性分別為尾中DNA百分?jǐn)?shù)(R2＞0.99)、尾力矩(R2＞0.95)和尾長(R2＞0.90)。當(dāng)使狗白細(xì)胞彗星的所述目視評分與計(jì)算機(jī)圖像分析相關(guān)聯(lián)時(shí)，觀察到了相似的趨勢，相關(guān)性分別為尾中DNA百分?jǐn)?shù)(R2＞0.97)、尾力矩(R2＞0.95)和尾長(R2＞0.91)，圖6、7和8。
實(shí)施例2應(yīng)用彗星試驗(yàn)評估補(bǔ)充抗氧化劑貓與對照貓中DNA損傷的水平。
動(dòng)物將所有貓養(yǎng)在Waltham Centre for Pet Nutrition，條件與寵物貓的條件相似。所述試驗(yàn)對照組由14只成年馴養(yǎng)的短毛貓(9.2±2.1歲)組成并且用可通過商業(yè)途徑得到的完全飲食飼養(yǎng)。由14只成年馴養(yǎng)的短毛貓(8.7±1.9歲)組成的抗氧化劑補(bǔ)充組用額外含有下面抗氧化補(bǔ)充物(表1)的相同商業(yè)罐裝飲食飼養(yǎng)。所有的貓用它們各自的飲食飼養(yǎng)2年以上。
表1存在于濕飲食中的抗氧化劑混合物的組分含量小體積血樣采集全血樣品注入5ml肝素鋰管中。然后純化所述白細(xì)胞組分并且將其從全血中分離用于彗星分析。
彗星試驗(yàn)按照上面實(shí)施例1中強(qiáng)調(diào)的進(jìn)行彗星試驗(yàn)。
統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用獨(dú)立的兩樣品t檢驗(yàn)比較數(shù)據(jù)組。結(jié)果顯示在圖9和圖10中。
討論盡管各種各樣的身體組織已經(jīng)被建議用于彗星試驗(yàn)，但是血白細(xì)胞被認(rèn)為是實(shí)際身體狀態(tài)的一個(gè)好標(biāo)記。因?yàn)樵诎准?xì)胞的質(zhì)膜中多不飽和脂肪酸的高百分比以及提高的作為它們正常功能部分的自由基產(chǎn)生，它們對自由基的損傷效應(yīng)更敏感。通過Fenton反應(yīng)，產(chǎn)生與DNA分子接近的高活性羥基自由基(OH·)，過氧化氫被認(rèn)為是DNA損傷、染色體變化和基因突變的最強(qiáng)的原因之一
本報(bào)告的結(jié)果證實(shí)了，與未補(bǔ)充抗氧化劑的對照貓組比較，補(bǔ)充抗氧化劑的貓組的內(nèi)源性和外源性DNA損傷水平顯著降低。這證實(shí)了補(bǔ)充抗氧化劑的貓顯著更高的抗氧化耐受性，導(dǎo)致DNA對內(nèi)源性和外源性自由基攻擊敏感性降低和暴露減少，減少加強(qiáng)DNA不穩(wěn)定性、突變和功能紊亂的損傷。
內(nèi)源性DNA損傷表明，升高的損傷水平(或者升高的引起所述損傷的氧化應(yīng)激)促成繼發(fā)性疾病的發(fā)展。這種方法可用于變性性障礙的進(jìn)展。另外，DNA損傷和突變可導(dǎo)致(a)因?yàn)镈NA損傷介導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯，免疫細(xì)胞不能增殖，(b)作為對攜帶某些突變的細(xì)胞的體內(nèi)選擇結(jié)果，增殖的速率降低可導(dǎo)致對感染最適度以下的免疫應(yīng)答，(c)由臨界水平DNA損傷觸發(fā)的升高的細(xì)胞程序死亡水平可導(dǎo)致免疫細(xì)胞類型的數(shù)目減少。
總之，通過貓?bào)w內(nèi)抗氧化劑補(bǔ)充而實(shí)現(xiàn)的內(nèi)源性和外源性DNA損傷水平的降低可能意味著，通過降低DNA對自由基損傷的敏感性以及可能升高DNA修復(fù)的水平，對變性性障礙的敏感性降低。
實(shí)施例3應(yīng)用彗星試驗(yàn)評估補(bǔ)充抗氧化劑的小狗和對照小狗中DNA損傷的水平。
兩組4只、年齡和性別配對的，拉布拉多狗同窩仔用完全均衡的飲食維持體重，該飲食從6周齡開始相應(yīng)地用補(bǔ)充物進(jìn)行調(diào)整，直到在15月齡取樣用于彗星試驗(yàn)。其中一組用抗氧化劑混合物補(bǔ)充，該混合物的組分給出在表2中。
表2.所述混合物的組分的含量小體積血樣采集全血樣品注入5ml肝素鋰管中。然后純化所述白細(xì)胞組分并且將其從全血中分離用于彗星分析。
彗星試驗(yàn)按照上面實(shí)施例1中強(qiáng)調(diào)的進(jìn)行彗星試驗(yàn)。
統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用獨(dú)立的兩樣品t檢驗(yàn)比較數(shù)據(jù)組。
結(jié)果顯示在圖11中。
討論本報(bào)告的結(jié)果證實(shí)了，與未補(bǔ)充抗氧化劑的對照小狗組比較，補(bǔ)充抗氧化劑的小狗組的內(nèi)源性DNA損傷水平降低(p＝0.150)。
總之，通過給小狗補(bǔ)充抗氧化劑而實(shí)現(xiàn)的內(nèi)源性DNA損傷水平降低，意味著通過降低DNA對自由基損傷的敏感性以及可能提高DNA修復(fù)的水平，對感染和包括通常衰老過程的變性性障礙的敏感性降低。
實(shí)施例4應(yīng)用彗星試驗(yàn)評估補(bǔ)充抗氧化劑的成年狗和對照成年狗中DNA損傷的水平。
兩組20只、年齡和性別配對的混合飼養(yǎng)的成年狗用完全均衡的飲食維持體重，該飲食用補(bǔ)充物相應(yīng)地調(diào)整16周實(shí)驗(yàn)期。在第0周和第8周進(jìn)行采樣用于彗星試驗(yàn)。一組狗用抗氧化劑混合物補(bǔ)充，該混合物的組分給出在表1中。
括號中的數(shù)字指以干飲食形式的濃度。
表1.所述混合物的組分含量小體積血樣采集全血樣品注入5ml肝素鋰管中。然后純化所述白細(xì)胞組分并且將其從全血中分離用于彗星分析。
彗星試驗(yàn)按照上面實(shí)施例1中強(qiáng)調(diào)的進(jìn)行彗星試驗(yàn)。
統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用獨(dú)立的兩樣品t檢驗(yàn)比較數(shù)據(jù)組。
結(jié)果顯示在圖12至15中。
本報(bào)告的結(jié)果證實(shí)了，與未補(bǔ)充抗氧化劑的對照狗組比較，補(bǔ)充后2個(gè)月時(shí)補(bǔ)充AOX狗組的內(nèi)源性(p＝0.001)和外源性(p＝0.003)DNA損傷水平都顯著降低(圖13)。在基線時(shí)兩組之間內(nèi)源性或外源性DNA損傷水平未觀察到顯著差異(圖12)。同樣，對照組顯示，當(dāng)將補(bǔ)充后2個(gè)月所取樣品與基線水平比較時(shí)，不管是內(nèi)源性還是外源性DNA損傷水平都沒有顯著變化(圖14和15)。當(dāng)然，當(dāng)將補(bǔ)充AOX狗組的2個(gè)月補(bǔ)充的外源性和內(nèi)源性DNA損傷水平與它們的基線值比較時(shí)，內(nèi)源性DNA損傷(p＝0.041；圖14)和外源性DNA損傷(p＝0.005；圖15)存在顯著減少。
實(shí)施例5應(yīng)用彗星試驗(yàn)評估補(bǔ)充抗氧化劑的狗和對照狗中DNA損傷的水平。
補(bǔ)充8周后，如用彗星試驗(yàn)測定的，與對照狗比較，補(bǔ)充AOX的狗還表現(xiàn)出內(nèi)源性和外源性DNA損傷兩者的顯著減少(p＜0.005)。在狗中的這些新研究結(jié)果表明，抗氧化劑補(bǔ)充發(fā)揮了DNA損傷減少的保護(hù)作用。
材料&方法動(dòng)物選擇兩組混合飼養(yǎng)的20只、年齡(平均4.4歲±1.85歲)和性別配對的成年狗用于本研究。所有狗已經(jīng)被接種過(犬瘟病毒、細(xì)小病毒和腺病毒)并且被視為是臨床上健康的。將所有狗養(yǎng)在WALTHAMCentre for Pet Nutrition，Leicestershire，英國，在那里將這些狗養(yǎng)在特意修建、環(huán)境強(qiáng)化的設(shè)施中并且按照該中心的研究倫理和英國內(nèi)政部的法規(guī)進(jìn)行處置。
研究設(shè)計(jì)給所有狗提供基礎(chǔ)飲食，該基礎(chǔ)飲食為由濕的(Pedigree()，Masterfoods，Melton Mowbray，UK)和干的(Chappie Complete，Masterfoods，Peterborough，UK)工業(yè)生產(chǎn)的飲食在能量基礎(chǔ)上按照50∶50比例配制而成的營養(yǎng)完全和均衡的飲食。在開始研究之前以每kgW0.75為460kJ預(yù)期代謝能的允許量給予動(dòng)物所述基礎(chǔ)飲食12周，目的是維持正常體重。所述對照組仍然給予基礎(chǔ)飲食度過16周試驗(yàn)期，而補(bǔ)充抗氧化劑(AOX)的組同時(shí)接受基礎(chǔ)飲食并且在每天的基礎(chǔ)上口服補(bǔ)充抗氧化劑混合物(維生素C、維生素E、?；撬?、葉黃素、番茄紅素和β-胡蘿卜素)度過16周試驗(yàn)期。根據(jù)體重的任何變化相應(yīng)地改變飲食攝入。
為分析DNA損傷，在第0周和第8周采集樣品。
為分析DNA損傷，在第0周和第8周采集小體積血樣注入肝素鋰管(LIP Ltd)中，然后用磷酸緩沖鹽水(PBSa)按1∶1稀釋。通過以1000g離心40分鐘在Histopaque 1083梯度儀(Sigma Chemical Co.，UK)上分離白細(xì)胞。在記數(shù)和用90％胎牛血清(Sigma)和10％二甲亞砜(Sigma)以1×106細(xì)胞/ml緩慢冷凍至＜-80℃直到需要時(shí)為止之前，用10ml PBSa洗白細(xì)胞兩次并且以700g離心10分鐘。生存力(用錐蟲藍(lán)排除法評估)通常為98％左右。按照實(shí)施例1用彗星試驗(yàn)進(jìn)行DNA損傷測定。用未經(jīng)處理和經(jīng)H2O2處理的分離的狗白細(xì)胞分析DNA鏈斷裂?；谧C實(shí)的應(yīng)用圖像分析軟件(KOMET 4.0分析包(KineticImaging，Liverpool，UK))的目視評分系統(tǒng)(每個(gè)樣品100個(gè)細(xì)胞)和上文Collins等1996、1997方法對彗星評分。
統(tǒng)計(jì)分析用適用Windows的SPSS(版本10.0.0，SPSS Inc.，Chicago，I11.)評價(jià)所得數(shù)據(jù)。當(dāng)在ANOVA中通過組相互作用顯著時(shí)間顯示兩組之間有差異時(shí)，通過在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)單獨(dú)進(jìn)行t-檢驗(yàn)對這些差異進(jìn)行更詳細(xì)地研究。用成對的和不成對的t-檢驗(yàn)分析DNA損傷數(shù)據(jù)。在分析前，對所有變量進(jìn)行正常態(tài)評價(jià)。在p＜0.05認(rèn)為數(shù)值顯著。數(shù)據(jù)以平均值±SEM報(bào)告。
結(jié)果DNA損傷在第0周未觀察到兩組之間內(nèi)源性或外源性DNA損傷水平顯著差異(圖16)。在補(bǔ)充8周后，與對照狗比較，補(bǔ)充AOX的狗組的內(nèi)源性(p＜0.005)和外源性(p＜0.005)DNA損傷水平都存在顯著降低(圖17)。當(dāng)將補(bǔ)充8周后所取樣品與基線水平(未顯示數(shù)據(jù))比較，狗對照組顯示不管是內(nèi)源性還是外源性DNA損傷水平都沒有顯著變化。當(dāng)然，在補(bǔ)充8周之后，當(dāng)將來自補(bǔ)充AOX的狗組的外源性和內(nèi)源性DNA損傷水平與它們自己的基線值比較時(shí)，觀察到內(nèi)源性DNA損傷(p＜0.05)(未顯示數(shù)據(jù))和外源性DNA損傷(p＜0.005)(未顯示數(shù)據(jù))顯著減少。
討論本數(shù)據(jù)證實(shí)了，在第0周(補(bǔ)充之前)兩組狗之間的DNA損傷不存在差異，但是在補(bǔ)充8周后內(nèi)源性和外源性DNA損傷都存在顯著減少。內(nèi)源性損傷的減少可以表明補(bǔ)充物中抗氧化劑保護(hù)DNA免受自由基攻擊的保護(hù)作用增加，和/或?qū)κ軗pDNA的修復(fù)速率提高。用外源性H2O2體外攻擊白細(xì)胞以誘發(fā)DNA鏈斷裂還提供了一種抗氧化保護(hù)作用或?qū)ψ杂苫鶕p傷的耐受性的指標(biāo)。
權(quán)利要求
1.維生素E、維生素C和類胡蘿卜素在制備用于減少伙伴動(dòng)物中核酸損傷的食物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1的應(yīng)用，進(jìn)一步包括?；撬?。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中所述類胡蘿卜素是β-胡蘿卜素、葉黃素或番茄紅素中的一種或多種。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述維生素E是以從25IU/400kcal飲食或以上起的濃度存在。
5.如權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述維生素C是以從10mg/400kcal或以上起的濃度存在。
6.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述類胡蘿卜素是以從0.01mg/400kcal或以上起的濃度存在。
7.如權(quán)利要求2至6中任意一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述牛磺酸是以從80mg/400kcal或以上起的濃度存在。
8.如權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述食物為一種干、濕或半干的食物。
9.一種減少動(dòng)物中核酸損傷的方法，該方法包括給予伙伴動(dòng)物一種包含維生素E、維生素C和類胡蘿卜素的食物。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中所述食物進(jìn)一步包括?；撬帷?br> 11.如權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的方法，其中所述類胡蘿卜素是β-胡蘿卜素、葉黃素或番茄紅素中的一種或多種。
12.如權(quán)利要求9至11中任意一項(xiàng)的方法，其中維生素E是以從25IU/400kcal飲食或以上起的濃度存在。
13.如權(quán)利要求9至12中任意一項(xiàng)的方法，其中維生素C是以從10mg/400kcal或以上起的濃度存在。
14.如權(quán)利要求9至13中任意一項(xiàng)的方法，其中類胡蘿卜素是以從0.01mg/400kcal或以上起的濃度存在。
15.如權(quán)利要求9至14中任意一項(xiàng)的方法，其中牛磺酸是以從80mg/400kcal或以上起的濃度存在。
16.如權(quán)利要求9至15中任意一項(xiàng)的方法，其中所述成分被同時(shí)、分開或順序給予。
17.如此前參照所述實(shí)施例中的一個(gè)或多個(gè)描述的維生素E、維生素C和類胡蘿卜素的應(yīng)用。
18.如此前參照所述實(shí)施例中的一個(gè)或多個(gè)描述的減少伙伴動(dòng)物中核酸損傷的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于減少伙伴動(dòng)物中核酸損傷的營養(yǎng)成分。所述營養(yǎng)成分為維生素E、維生素C和類胡蘿卜素。這些成分可用于減少伙伴動(dòng)物中核酸損傷的食物中。
文檔編號A61P39/06GK1549679SQ02817194
公開日2004年11月24日 申請日期2002年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月3日
發(fā)明者P·R·希頓, B·H·E·史密斯, J·M·羅林斯, E 史密斯, P R 希頓, 羅林斯 申請人:馬斯英國有限公司